CN117179054A - 一种富硒乳酸菌饮品及其制备方法 - Google Patents

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CN117179054A CN202311119836.9A CN202311119836A CN117179054A CN 117179054 A CN117179054 A CN 117179054A CN 202311119836 A CN202311119836 A CN 202311119836A CN 117179054 A CN117179054 A CN 117179054A
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李啸
王智瑄
邵之晓
杨光明
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Yichang Xiwang Food Co ltd
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Abstract

本发明涉及发酵乳制品技术领域,尤其涉及一种富硒乳酸菌饮品及其制备方法。本发明提供一种富硒乳酸菌饮品,其包括以下重量份原料组成:牛乳25‑65份,核桃肽0.1‑2份,第一发酵菌剂0.01‑0.1份,第二发酵菌剂0.08‑0.16份,其中,第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。本发明使用富硒瑞士乳酸杆菌作为载体将硒带入富硒乳酸饮品,提高了富硒乳酸饮品中硒的含量,其硒含量大于等于8.0μg/100g,远高于传统的乳制品的硒含量,同时该饮品的口感、风味、质构稳定性和货架期活菌数含量均显著提高,克服了现有乳酸菌饮料中硒的添加对发酵性能的影响。

Description

一种富硒乳酸菌饮品及其制备方法
技术领域
本发明涉及发酵乳制品技术领域,尤其涉及一种富硒乳酸菌饮品及其制备方法。
背景技术
乳酸菌饮料(yoghurt beverage)是一种发酵型的酸性含乳饮料,通常是以乳或乳制品为原料,经杀菌、冷却、接种乳酸菌发酵制得的乳液,然后加入配料调制而得的饮料,其产品蛋白含量不低于0.7g/100g或100ml。
硒是人体所必须的微量元素之一,具有抗氧化、抗菌、增强免疫力等多种作用。但人体不能自行合成,必须通过外源实物获取。市场上现有乳制品硒含量均较低,远低于中国居民膳食营养素参考摄入量(60μg/日)。然而,天然食物中的硒含量相对较低,市面上的富硒食品大多是通过额外添加或生化转化使产品达到一定硒水平。通过生物转化存在一定风险,例如将无机硒转化为有机硒不彻底,导致无机硒残留,且毒性较高。
中国专利CN 104255916 A公开了一种富硒酸奶的家庭化生产方法,包括以下步骤:(1)配制***钠水溶液;(2)对鲜奶进行灭菌,向灭菌后的鲜奶中加入***钠水溶液即得混合原料奶,***钠水溶液的加入量为1L鲜奶中含硒10—2500μg,所述鲜奶为鲜牛奶或鲜羊奶;(3)向混合原料奶中加入5-15g益生菌粉即得原料奶发酵料;(4)将原料奶发酵料置于38-43℃的条件下发酵4-10小时即得成品。该发明方法具有工艺简单、成本低廉、制备过程耗时短的优点,但添加无机的***钠,生物利用率较低,且毒性较高,有食品安全风险。
中国专利CN 107873839 A公开了一种富硒茶酸奶的制备方法,该方法将富含有机硒元素的茶叶中的硒元素精提出来得到富硒茶叶精提组分,再将富硒茶叶精提组分与预处理后的鲜牛奶进行混合后发酵得到富硒的茶酸奶。该发明中富硒茶叶精提组分的添加量为鲜牛奶重量的0.3%。该发明将茶叶用热水浸泡后冻干得到精提物,加入牛奶制作富硒酸奶,但以热水浸提的方式能从茶叶中溶出的硒元素含量较低。
另外,根据人们对健康和/或口味的要求,在乳酸菌饮料中通过添加不同风味的营养物质制造出的新型乳酸菌饮料正在成为一种发展趋势,这些乳酸菌饮料中有的添加有维生素、矿物质、果汁或是一些具有保健作用的氨基酸、肽或功能性因子等物质。
核桃蛋白通过生物酶解技术制备成不同片段大小具有生物活性的肽产品,因其具备多种生物活性引起广泛关注。研究表明,核桃肽具有多清除自由基、缓解疲劳以及提高记忆力等功效。市面上与核桃相关的乳制品典型代表是将核桃仁磨浆添加至牛奶中,接种乳酸菌发酵而成的,核桃仁直接磨浆因其含有较高的油脂不仅影响最终乳品体系的稳定性,同时,核桃浆中的核桃蛋白未经过水解,溶解性较差,不具备生物活性对产品的均一性造成一定的影响,且核桃蛋白分子量较大,不易人体的消化吸收。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种富硒乳酸菌饮品及其制备方法,为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
第一方面,本发明提供一种富硒乳酸菌饮品,其包括以下重量份的原料组成:牛乳25-65份,核桃肽0.1-2份,第一发酵菌剂0.01-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.16份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
在本发明的一个实施方式中,所述富硒乳酸菌饮品包括以下重量份的原料组成:牛乳35-65份,核桃肽0.1-2份,第一发酵菌剂0.01-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.16份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
在本发明的一个实施方式中,所述富硒乳酸菌饮品包括以下重量份的原料组成:牛乳35-40份,核桃肽0.1-1份,第一发酵菌剂0.08-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.15份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
在本发明的一个实施方式中,所述富硒瑞士乳酸杆菌通过将瑞士乳酸杆菌接种于含硒培养基中发酵培养制得;优选地,所述瑞士乳酸杆菌为瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(Lactobacillus helveticus Zhegu LBH-VI),其中,所述瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023095。
在本发明的一个实施方式中,所述富硒瑞士乳酸杆菌中有机硒含量为100-125μg/g。
在本发明的一个实施方式中,以所述富硒乳酸菌饮品的重量计,所述富硒乳酸菌饮品中硒含量≧8.0μg/100g;优选地,所述富硒乳酸菌饮品在货架期内的活菌数≥109CFU/ml。
在本发明的一个实施方式中,所述牛乳选自全脂牛乳、低脂牛乳或脱脂牛乳中的一种或两种以上。
在本发明的一个实施方式中,所述核桃肽的分子量为800-1000Da;优选地,所述核桃肽为核桃经蛋白酶酶解制得。
在本发明的一个实施方式中,所述第一发酵菌剂选自唾液链球菌嗜热亚种、德氏乳杆菌乳亚种、乳双歧杆菌、乳酸乳球菌乳亚种和副干酪乳杆菌中一种或两种以上,优选唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种,更优选以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种的质量比为2-3:1-1.5。
在本发明的一个实施方式中,所述唾液链球菌嗜热亚种为唾液链球菌嗜热亚种932(Straptococcus salivarias subsp.thermophilus 932),于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023902;
和/或,所述德氏乳杆菌乳亚种为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis Dangxiong LB VⅢ),于2023年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023396;
和/或,所述乳酸乳球菌乳亚种为乳酸乳球菌乳亚种954(Lactococcus lactissubsp.Lactis 954),于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023904;
和/或,所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌ALI Plateau LPA-Ⅰ(lactobacillusparacasei ALI Plateau LPA-Ⅰ。
在本发明的一个实施方式中,所述原料还包括甜味剂5.0-8.5份;
优选地,所述甜味剂选自蔗糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖或甜菊糖苷中的一种或两种以上,优选为蔗糖。
在本发明的一个实施方式中,所述原料还包括稳定剂0.3-0.7份;
优选地,所述稳定剂选自羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠中的一种或两种以上;
更优选地,所述羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠的质量比为0.5-1.3:1.5-2.5:0.2-0.5:0.3-0.7。
在本发明的一个实施方式中,所述原料还包括酸味剂0.11-0.6份;
优选地,所述酸味剂选自柠檬酸、乳酸和柠檬酸钠,优选柠檬酸、乳酸和柠檬酸钠的质量比为5-25:5-15:1-20。
在本发明的一个实施方式中,所述富硒乳酸菌饮品通过将包括牛乳和核桃肽的发酵基料经变温发酵制得。
第二方面,本发明还提供上述的富硒乳酸菌饮品的制备方法,包括如下步骤:
(1)将包括牛乳和核桃肽的原料混合配制成发酵基料;
(2)向步骤(1)制得发酵基料依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵制得发酵乳;
(3)对步骤(2)制得发酵乳进行调配得到富硒乳酸菌饮品。
在本发明的一个实施方式中,上述制备方法中,步骤(3)所述调配包括向步骤(2)制得富硒乳酸菌饮品中加入稳定剂和/或酸味剂进行混合、均质处理。
在本发明的一个实施方式中,上述制备方法中,所述发酵基料还包括甜味剂,优选地,所述甜味剂选自蔗糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖或甜菊糖苷中的一种或两种以上,优选为蔗糖。
在本发明的一个实施方式中,上述制备方法中,步骤(2)中所述依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵包括先接种第一发酵菌剂在40-45℃发酵,再接种第二发酵菌剂在35-39℃发酵;
优选地,先接种第一发酵菌剂在40-45℃发酵10-12h至终止酸度为90-100°T,再接种第二发酵菌剂在35-39℃发酵8-10h至终止酸度为160-180°T。
在本发明的一个实施方式中,上述制备方法中,所述制备方法还包括在接种前对发酵基料进行均质处理的步骤,优选均质温度为50-65℃,更优选均质压力为10-50MPa;
优选地,所述均质处理后还包括对发酵基料进行杀菌的步骤,优选杀菌温度为90-100℃,更优选杀菌时间为200-400s。
在本发明的一个实施方式中,上述制备方法中,还包括第一次发酵后和所述第二次发酵后均进行搅拌破乳制得发酵乳的步骤,优选搅拌转速为20-40r/min,更优选搅拌时间为10-20min。
本发明的有益效果:
1.本发明使用富硒瑞士乳酸杆菌作为载体将硒带入富硒乳酸饮品的发酵过程,提高了富硒乳酸饮品中硒的含量,制得的乳酸菌饮料中硒含量大于等于8.0μg/100g,远高于传统的乳制品的硒含量(≤0.6μg/100g),与此同时,富硒乳酸饮品的口感、风味、质构稳定性和货架期活菌数含量均显著提高,克服了现有技术乳酸菌饮料中硒的添加对发酵性能的影响;
2.本发明以牛乳与具有缓解疲劳功效的核桃肽做为发酵底料来制作乳酸菌饮料,经动物实验证明,本发明制备的乳酸菌饮料具有显著缓解疲劳的功效。
菌株说明
本发明所用的瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(Lactobacillus helveticus ZheguLBH-VI),于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023095,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:(027)-68754052。
本发明所用的唾液链球菌嗜热亚种932(Straptococcus salivariassubsp.thermophilus 932),于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCT CC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023902,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:(027)-68754052。
本发明所用的德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis Dangxiong LB VⅢ),于2023年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023396,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:(027)-68754052德氏乳杆菌乳亚种。
本发明所用的乳酸乳球菌乳亚种954(Lactococcus lactis subsp.Lactis 954)于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023904,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:(027)-68754052。
本发明所用的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1(lactobacillus paracasei AL1Plateau LPA-1),于2021年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M20211312,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,邮政编码:430072;电话:(027)-68754052。该菌株在中国申请号CN202210217216.8(公开号CN114480214A)的专利申请中已有记载。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
目前,现有富硒乳酸饮品的技术路线是将无机硒或富硒原料直接添加入牛乳中进行发酵,然而无机硒生物利用率较低,且毒性较高,额外添加富硒原料,其添加量较少,最终产品硒含量较低。另外,现有核桃乳制品将核桃直接榨汁或添加核桃蛋白于牛乳中来制作发酵乳制品,但是,核桃浆中脂肪含量较高,核桃蛋白分子量较大,溶解性较差,且不易消化吸收。因此,需要寻找更好的溶解性且易吸收的核桃制品作为配料,使制作出的发酵乳制品的在拥有良好质构的同时,保证了乳酸菌饮品原本的口感与功能特性。
第一方面,在本发明的一个具体实施方式中,本发明提供一种富硒乳酸菌饮品,包括以下重量份的原料组成:牛乳25-65份,核桃肽0.1-2份,第一发酵菌剂0.01-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.16份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
需要说明的是,所述富硒瑞士乳酸杆菌是通过将瑞士乳酸杆菌接种于含硒培养基中发酵培养制得,所述富硒瑞士乳酸杆菌的剂型可以为液体、粉剂或颗粒型,所述富硒瑞士乳酸杆菌可以通过如下步骤制得:
将甘油管中保藏的瑞士乳酸杆菌菌株进行活化,第一次活化按照1-5%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,35-40℃下培养12-36h,第二次活化按照1-3%的接种量,于35-40℃下培养6-24h。将活化好的菌液按照5-15%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,35-40℃下培养发酵,在发酵至3-5h时加入无菌***钠溶液至终浓度为30μg/mL进行富硒,继续发酵19-21h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到富硒瑞士乳酸杆菌菌泥。
冻干保护剂各成分重量百分比如下:5-15%脱脂乳粉,4-8%麦芽糊精,2-8%蔗糖,其余为纯水,将上述保护剂成分充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的富硒瑞士乳酸杆菌菌泥与冻干保护剂按照1:1-5的重量比进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉。经检测,菌粉硒含量为100-125μg/g。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含25-65重量份、30-65重量份、35-65重量份、40-65重量份、45-65重量份、50-65重量份、25-60重量份、25-55重量份、25-50重量份、25-45重量份或25-40重量份的牛乳。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含25重量份、30重量份、35重量份、35重量份、40重量份、45重量份、50重量份、55重量份、60重量份或65重量份的牛乳,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.1-2重量份、0.5-2重量份、1-2重量份、0.1-1.5重量份或0.1-1重量份的核桃肽。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.1重量份、0.5重量份、1重量份、1.5重量份或2重量份的核桃肽,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.01-0.1重量份、0.01-0.09重量份、0.01-0.08重量份、0.01-0.07重量份、0.01-0.06重量份、0.01-0.05重量份、0.02-0.1重量份、0.03-1重量份、0.04-0.1重量份或0.05-1重量份的第一发酵菌剂。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.01重量份、0.02重量份、0.03重量份、0.04重量份、0.05重量份、0.06重量份、0.07重量份、0.08重量份、0.09重量份或0.1重量份的第一发酵菌剂,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.08-0.16重量份、0.08-0.15重量份0.08-0.14重量份、0.08-0.13重量份、0.08-0.12重量份、0.09-0.16重量份、0.10-0.16重量份、0.11-0.16重量份或0.12-0.1重量份的第二发酵菌剂。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.08重量份、0.09重量份、0.10重量份、0.11重量份、0.12重量份、0.13重量份、0.14重量份、0.15重量份或0.16重量份的第二发酵菌剂,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明的一些实施方式中,所述瑞士乳酸杆菌为瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(Lactobacillus helveticus Zhegu LBH-VI),其中,所述瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023095。
在本发明的一些实施方式中,以所述富硒乳酸菌饮品的重量计,所述富硒乳酸菌饮品中硒含量≧8.0μg/100g;优选地,所述富硒乳酸菌饮品在货架期内的活菌数≥109CFU/ml。
需要说明的是,所述富硒乳酸菌饮品的货架期指的是,在2-6℃的贮藏条件下,能够保持富硒乳酸菌饮料质构稳定,同时,确保富硒乳酸菌饮品口感、感官及微生物含量处于理想状态,保留标签声明的任何营养值的时间段。本发明富硒乳酸菌饮品保质期为30天。
在本发明的一些实施方式中,本发明中所使用的牛乳主要是指应符合我国生鲜牛乳收购标准的鲜奶或复原牛奶,所述牛乳包括但不限于全脂牛乳、低脂牛乳或脱脂牛乳一种或两种以上的组合。
在本发明的一些实施方式中,所述核桃肽的分子量为800-1000Da;优选地,所述核桃肽为核桃经脱脂、蛋白酶酶解制得。所述核桃肽的制备方法包括如下步骤:(1)将核桃经脱脂处理得到脱脂核桃粕(脂肪含量≤1%),添加水配成料液,调pH至8-10,搅拌10-30min,分离去除沉淀,调节pH=4-5,搅拌10-30min,分离取沉淀得到核桃蛋白;(2)将核桃蛋白配制成分散液,调节pH=8-10,加入1-3%的蛋白酶,优选蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1-2:0.5-1.5,在45-60℃下酶解4-6h,酶解结束后经灭酶、分离和干燥得到核桃肽。
在本发明的一些实施方式中,所述第一发酵菌剂选自唾液链球菌嗜热亚种、德氏乳杆菌乳亚种、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、乳酸乳球菌乳亚种中一种或两种以上,优选为唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种,更优选唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种的质量比为2-3:1-1.5。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括甜味剂5.0-8.5份;优选地,所述甜味剂选自蔗糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖或甜菊糖苷中的一种或两种以上,优选为蔗糖。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括稳定剂0.3-0.7份;添加稳定剂能提高富硒乳酸菌饮品的稳定性和品质,优选地,所述稳定剂选自羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠中的一种或两种以上;更优选地,所述羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠的质量比为0.5-1.3:1.5-2.5:0.2-0.5:0.3-0.7。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括酸味剂0.11-0.6份;优选地,所述酸味剂选自柠檬酸和/或乳酸,优选柠檬酸和乳酸的质量比为5-25:5-15。
在本发明的一些实施方式中,所述富硒乳酸菌饮品通过将包括牛乳和核桃肽的发酵基料经变温发酵制得。
在本发明的一些实施方式中,本发明提供一种富硒乳酸菌饮品,包括以下重量百分比的原料组成:牛乳25-65%,核桃肽0.1-2%,第一发酵菌剂0.01-0.1%,第二发酵菌剂0.08-0.16%,水33-73%,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
在本发明的一些实施方式中,本发明提供一种富硒乳酸菌饮品,包括以下重量百分比的原料组成:牛乳25-40%,核桃肽0.1-2%,第一发酵菌剂0.01-0.1%,第二发酵菌剂0.08-0.16%,水50-69%,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括甜味剂5-8.5%。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括稳定剂0.3-0.7%。
在本发明的一些实施方式中,所述原料还包括酸味剂0.11-0.6%。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含25-65%、30-65%、35-65%、40-65%、45-65%、50-65%、25-60%、25-55%、25-50%、25-45%或25-40%重量百分比的牛乳。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%重量百分比的牛乳,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.1-2%、0.5-2%、1-2%、0.1-1.5%或0.1-1%重量百分比的核桃肽。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%重量百分比的核桃肽,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.01-0.1%、0.01-0.09%、0.01-0.08%、0.01-0.07%、0.01-0.06%、0.01-0.05%、0.02-0.1%、0.03-1%、0.04-0.1%或0.05-1%重量百分比的第一发酵菌剂。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%重量百分比的第一发酵菌剂,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
在本发明一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.08-0.16%、0.08-0.15%、0.08-0.14%、0.08-0.13%、0.08-0.12%、0.09-0.16%、0.10-0.16%、0.11-0.16%或0.12-0.16%重量百分比的第二发酵菌剂。在一些实施方式中,上述富硒乳酸菌饮品原料可包含0.08%、0.09%、0.10%、0.12%、0.13%、0.14%、0.15%或0.16%重量百分比的第二发酵菌剂,或者处于上述任意2个具体数值作为端点构成的数值范围内的的牛乳。应该理解的是,在具体实施方式中,任意上述范围可以与任意其他范围相结合,只要能得到本发明所需性能的富硒乳酸菌饮品即可。
第二方面,本发明还提供一种上述富硒乳酸菌饮品的制备方法,包括如下步骤:
(1)将包括牛乳和核桃肽的原料混合配制成发酵基料;
(2)向步骤(1)制得发酵基料中依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵制得发酵乳;
(3)对步骤(2)制得发酵乳进行调配得到富硒乳酸菌饮品。
在本发明的一些实施方式中,根据需要,上述步骤(3)的调配可以选择向发酵乳中加入稳定剂进行稳定、添加酸味剂酸化、用水定容以及均质处理等步骤。
在本发明的一些实施方式中,所述发酵基料还包括甜味剂。
本发明采用两段接菌和变温发酵工艺,显著提高了富硒乳酸菌饮料的风味、口感和质构稳定性,提高了货架期内活菌的数量。
在本发明的一些实施方式中,步骤(2)中所述依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵是指先接种第一发酵菌剂,在40-45℃发酵,再接种第二发酵菌剂,在35-39℃发酵;优选地,先接种第一发酵菌剂在40-45℃发酵10-12h至终止酸度为90-100°T,再接种第二发酵菌剂在35-39℃发酵8-10h至终止酸度为160-180°T。
需要说明的是,本发明中第一次发酵是指接种第一发酵菌剂在40-45℃下进行的发酵;第二次发酵是指接种第二发酵菌剂在35-39℃下进行的发酵。
本发明采用两段式接种与变温发酵工艺制备活菌型乳酸菌饮料赋予乳酸菌饮料丰富的口感与良好的组织状态,提高了乳酸菌饮料在货架期内的活菌数量。
在本发明的一些实施方式中,所述制备方法还包括在接种前对发酵基料进行均质处理的步骤,优选均质温度为50-65℃,更优选均质压力为10-50MPa;优选地,所述均质处理后还包括对发酵基料进行杀菌的步骤,优选杀菌温度为90-100℃,更优选杀菌时间为200-400s。
在本发明的一些实施方式中,在每次发酵结束后,都包括对发酵液进行搅拌破乳的步骤,破乳是为了搅散可能存在的凝乳块,使得后续加入的配料均匀混合在料液中,优选搅拌转速为20-40r/min,更优选搅拌时间为10-20min。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。
本发明中使用的原料或试剂均购自市场主流厂家,未注明生产厂商者或者未注明浓度者,均为可以常规获取的分析纯级的原料或试剂,只要能起到预期的作用,并无特别限制。
本实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
以下,利用实施例、对比例更具体说明本发明,但本发明的技术范围不限定于这些示例。需要说明的是,只要不是特别地记载,那么本发明中使用的全部的百分率、份、比率基于质量。
下面实施例中所用到各试剂和仪器来源如表1所示。
表1实施例中用到原料信息表
原料 型号/纯度 出售厂家
柠檬酸 纯度≥99.5% 武汉盛泽食品配料有限公司
乳酸 纯度≥95% 河南金丹乳酸科技股份有限公司
柠檬酸钠 纯度≥99% 武汉盛泽食品配料有限公司
羧甲基纤维素钠 低粘 厦门欧凯科技有限公司
碱性蛋白酶 AP-200A 安琪酵母股份有限公司
木瓜蛋白酶 2021070301 安琪酵母股份有限公司
果胶 低酯 厦门欧凯科技有限公司
三聚磷酸钠 纯度≥85% 武汉盛泽食品配料有限公司
蔗糖 一级 广西凤糖罗城制糖有限公司
木糖醇 纯度≥98.5% 山东福田科技集团有限公司
赤藓糖醇 纯度≥99.5% 山东福田科技集团有限公司
甜菊糖苷 RA96%,400倍 武汉盛泽食品配料有限公司
麦芽糖醇 纯度≥98% 山东福田科技集团有限公司
实施例1
1.核桃肽的制备
挑选出干燥、无霉变损伤的核桃置于0.5%的NaOH溶液中,65℃水浴浸泡30min后去皮。去皮核桃仁在烘箱中40℃低温烘干,并用粉碎机粉碎并用纱布包裹,使用小型香油液压压榨机榨油,在35Mpa下维持30min得核桃粕,将其粉碎至20目。使用超临界萃取去除核桃粕中的油脂,萃取压力35MPa,萃取温度40℃,萃取时间3h,分离釜1压力10-12MPa,温度40℃,分离釜2压力5-7MPa,温度40℃。得到去油核桃粕(脂肪含量≤1%)。
在去油核桃粕中按1:20的质量比添加蒸馏水,得到料液,使用0.1%的NaOH溶液调节料液的pH至9.0,设置转速为100r/min,搅拌10min,将处理后的料液移入离心瓶中4000r/min离心10min,收集上清溶液,0.1%的盐酸溶液调节料液pH至4.5,设置转速为100r/min,搅拌10min,将处理后的料液移入离心瓶中4000r/min离心10min,收集沉淀。
在沉淀中按1:10的质量比添加蒸馏水,使用0.1%的NaOH溶液调节料液的pH至9.0,加入2%的蛋白酶(碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶=1.5:1),将料液温度升至50℃,酶解5h,酶解结束对料液进行灭酶处理(90℃,10min),将料液2移入离心瓶中4000r/min离心10min,收集上清液,过膜后将上清液50℃旋转浓缩,将浓缩液置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的浓缩液置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到核桃多肽分子量为952.433Da。
2.瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(拉丁名Lactobacillus helveticus Zhegu LBH-VI)的筛选、鉴定方法及鉴定结果
1)取25g西藏哲古草原牧民家自制牦牛奶渣与225mL无菌生理盐水混匀,得到均匀样品液,将样品液进行梯度稀释,分别取10-3、10-4、10-5、10-6浓度的稀释液,于MRS培养基平板上涂布培养,在37℃培养48h后,MRS培养基长出菌落。
2)菌种初筛
根据瑞士乳酸杆菌的标准菌落特征,挑取单菌落进行分离纯化继续培养,连续分离纯化不少于三次,获得纯化的菌落。
培养特征:最适生长温度为37℃,兼性厌氧,生长于MRS培养基中。
3)产酸实验
将菌种初筛得到的单菌落,在含0.2%CaCO3的MRS培养基平板上进行培养,在37℃培养48h后,观察菌落周围产生无透明圈情况,选择产酸能力强透明圈大的单菌落做进一步分离纯化。
形态学特征:在MRS琼脂培养基中生长状态为:在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色菌落、圆形、边缘光滑、菌体凸起、表面粗糙。
4)革兰氏染色
对复筛得到的菌株进行革兰氏染色,革兰氏染色典型阳性,得到的该菌株为目的菌株。显微镜下观察细胞呈短杆状,无鞭毛,不产芽孢,不运动。
5)菌株的鉴定
在分离纯化的菌株为革兰氏染色阳性,H2O2接触酶阴性,产酸,不产气的菌株,进行16S rDNA基因序列测序,所得结果与NCBI GenBank数据库中进行同源性比对分析,结果显示该菌株为瑞士乳酸杆菌。该菌株的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示:
CAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGCAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATCCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTC
将该菌株命名为瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)Zhegu LBH-VI菌株,于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023095。
3.富硒瑞士乳酸杆菌的制备
将甘油管中保藏的瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(拉丁名Lactobacillushelveticus Zhegu LBH-VI)菌株进行活化,第一次活化按照3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37℃下培养24h,第二次活化按照2%的接种量,于37℃下培养12h。将活化好的菌液按照10%的接种量接种于2L的MRS肉汤培养基中,37℃下培养发酵,在发酵至4h时加入无菌***钠溶液至终浓度为30μg/mL进行富硒,继续发酵20h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到富硒瑞士乳酸杆菌菌泥,测菌泥含水率。
冻干保护剂各成分质量占比如下:10%脱脂乳粉,6%麦芽糊精,4%蔗糖。将各保护剂溶于55%的纯水中,充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的富硒瑞士乳酸杆菌菌泥与冻干保护剂按照1:3的比例进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉。经检测,菌粉硒含量为100-125μg/g。
4.唾液链球菌嗜热亚种932(Straptococcus salivarias subsp.thermophilus932)的筛选、鉴定方法及鉴定结果
1)取25g西藏哲古草原牧民家自制牦牛奶渣与225mL无菌生理盐水混匀,得到均匀样品液,将样品液进行梯度稀释,分别取10-3、10-4、10-5、10-6浓度的稀释液,于MRS培养基平板上涂布培养,在37℃培养48h后,MRS培养基长出菌落。
2)菌种初筛
根据唾液链球菌嗜热亚种标准菌落特征,挑取单菌落进行分离纯化继续培养,连续分离纯化不少于三次,获得纯化的菌落。
培养特征:最适生长温度为42℃,兼性厌氧,生长于MRS培养基中。
3)产酸实验
将菌种初筛得到的单菌落,在含0.2%CaCO3的MRS培养基平板上进行培养,在42℃培养48h后,观察菌落周围产生无透明圈情况,选择产酸能力强透明圈大的单菌落做进一步分离纯化。
形态学特征:在MRS琼脂培养基中生长状态为:在MRS琼脂培养基中生长形态为底部略带微黄色,表面为乳白色菌落、边缘不整齐、菌体凸起、表面较光滑的菌落形态。
4)革兰氏染色
对复筛得到的菌株进行革兰氏染色,革兰氏染色典型阳性,得到的该菌株为目的菌株。显微镜下观察细胞呈球杆状,无鞭毛,不产芽孢,不运动。
5)菌株的鉴定
在分离纯化的菌株为革兰氏染色阳性,H2O2接触酶阴性,产酸,不产气的菌株,进行16S rDNA基因序列测序,所得结果与NCBI GenBank数据库中进行同源性比对分析,结果显示该菌株为唾液链球菌嗜热亚种。该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.2所示:
TTAGGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTCGCCGTCACCGACTCGCAACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGATGTACCGAAGTAACTTTCTATCTCTAGAAATAGCATCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAATCCCGGAAAGGATCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTTGACAGTTTCCAAAGCGAACTATGGTTGAGCCACAGCCTTTAACTTCAGACTTATCAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTAAGCTACCGTCACAGTGTGAACTTTCCACTCTCACACCCGTTCTTGACTTACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTGCCCCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATACAACGCAGGTCCATCTTGTAGTGGAGCAATTGCCCCTTTCAAATAAATGACATGTGTCATCCATTGTTATGCGGTATTAGCTATCGTTTCCAATAGTTATCCCCCGCTACAAGGCAGGTTACCTACGCGTTACTCACCCGTTCGCAACTCATCCAAGAAGAGCAAGCTCCTCTCTTCAGCGTTCTACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCA
将该菌株命名为唾液链球菌嗜热亚种932(拉丁名Straptococcus salivari assubsp.thermophilus 932)菌株,于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023902。
5.唾液链球菌嗜热亚种932菌剂的制备
将甘油管中保藏的唾液链球菌嗜热亚种932(Straptococcus salivariassubsp.thermophilus 932)菌株进行活化,第一次活化按照3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37℃下培养24h,第二次活化按照2%的接种量,于37℃下培养12h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到唾液链球菌嗜热亚种932菌泥。
冻干保护剂各成分质量占比如下:10%脱脂乳粉,6%麦芽糊精,4%蔗糖。将各保护剂溶于55%的纯水中,充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的唾液链球菌嗜热亚种932菌泥与冻干保护剂按照1:3的比例进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到唾液链球菌嗜热亚种932冻干菌粉。
6.德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis Dangxiong LB VⅢ)的筛选、鉴定方法及鉴定结果
1)菌株富集:取5g西藏当雄县(海拔4350m)牧民家自制的奶拉样品粉碎后加入45ml无菌生理盐水分散均匀,取2ml上述分散液加入到20ml灭菌的石蕊牛乳培养基中,置于37℃培养箱静置培养,待培养基酸化
凝固并呈现粉红色时取出。
2)培养单菌落:将石蕊牛乳培养基菌液稀释到10-5倍,吸取100μl涂布于BL固体培养基平板上,置于37℃培养箱培养,待菌落形成。在BL平板上,菌落呈光滑微微凸起,湿润,边缘不光滑,无色到微白色,直径1-3mm,菌落背面为淡黄色。
3)筛选产酸菌种:将初筛得到的单菌落,在含0.2%CaCO3的BL固体培养基平板上划线培养,37℃培养箱培养36h,结束培养后观察菌落周围有无透明圈产生,选择透明圈直径大为3-3.5cm的单菌落做进一步分离纯化。
4)革兰氏染色初步鉴定:对步骤(3)的菌株进行革兰氏染色,如果菌体染色呈紫色,则为革兰氏阳性菌,留下来进行后续研究,如果染色呈现红色,该菌株是革兰氏阴性菌直接淘汰。鉴定结果显示:所得菌株为革兰氏阳性菌,不运动,无芽孢,无鞭毛,无荚膜,菌体呈细杆状,呈现单杆或成链,此菌株即为目标菌株,
5)菌株的鉴定
在分离纯化的菌株为革兰氏染色阳性,H2O2接触酶阴性,产酸,不产气的菌株,进行16S rDNA基因序列测序,所得结果与NCBI GenBank数据库中进行同源性比对分析,结果显示该菌株为德氏乳杆菌乳亚种。该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.3所示:
GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACACCATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGCAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGCGCTAGGTGTTGGGGACTTTCCGGTCCTCAGTGCCGCAGCAAACGCATTAAGCGCTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTGCGCTACACCTAGAGATAGGTGGTTCCCTTCGGGGACGCAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGTGCAGTACAACGAGAAGCGAACCCGCGAGGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCTGCTCTCAGATCGGACTGCGGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAACTGGAATCGCTAGTAATCTCGGATCACCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGCGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGTCGGTGAGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGCCTAA
将该菌株命名为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ(拉丁名Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis Dangxiong LB VⅢ),于2023年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023396。
7.德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ菌剂的制备
将甘油管中保藏的德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ菌株进行活化,第一次活化按照3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37℃下培养24h,第二次活化按照2%的接种量,于37℃下培养12h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到德氏乳杆菌乳亚种DangxiongLB VⅢ菌泥,测菌泥含水率。
冻干保护剂各成分质量占比如下:10%脱脂乳粉,6%麦芽糊精,4%蔗糖。将各保护剂溶于55%的纯水中,充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ菌泥与冻干保护剂按照1:3的比例进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ冻干菌粉。
8.富硒乳酸菌饮料的制备
1)发酵基料的配制
按照GB 19301的标准要求验收生牛乳,将检验合格的牛乳进行标准化处理,使乳蛋白为2.9g/100g;取650g标准化牛乳,升温至60℃,取20g核桃肽和65g蔗糖混合均匀,加入到上述标准化牛乳中,使用剪切乳化机3000r剪切15min,然后进行均质化处理,均质条件为60℃,均质压力为25MPa(其中低压为5MPa),均质结束后升温95℃保温300s进行杀菌,然后打入发酵罐;
2)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至42℃,加入唾液链球菌嗜热亚种932冻干菌粉和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的加入量为0.1g,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的质量比为2:1),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在42℃条件下发酵,终止酸度为100°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
3)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至37℃,加入富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,富硒瑞士乳酸杆菌的加入量为1g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在37℃条件下发酵,终止酸度为160°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
4)二次混料
取6g稳定剂加入75℃热水中溶解,其中,稳定剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠,其质量比羧甲基纤维素钠:果胶:三聚磷酸钠:柠檬酸钠=1:2:0.3:0.5,使用剪切乳化机3000r剪切15min,并对该料液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后将料液冷却至25℃,并将其与步骤3)第二次发酵后的发酵乳搅拌混合,搅拌转速30r/min,搅拌时间为20min;
5)添加酸味剂
将1.8g柠檬酸、1g乳酸和0.3g柠檬酸钠配制成固含为10%的酸液,并对该酸液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后冷却至25℃;使用无菌蒸馏水对步骤4)的料液进行定容(无菌蒸馏水的添加量为使得调整酸度后的料液重量为1000g),并使用上述配制好的无菌酸液调整料液酸度为65°T;
最后对上述料液进行均质处理,均质条件为25℃、20MPa;然后在无菌环境下进行定量灌装、封口,灌装温度15℃;灌装后转移至冷库,在6℃下冷藏。
实施例2
富硒乳酸菌饮料的制备
1)发酵基料的配制
按照GB 19301的标准要求验收生牛乳,将检验合格的牛乳进行标准化处理,使乳蛋白为2.9g/100g;取350g标准化牛乳,升温至60℃,取1g实施例1步骤1制得核桃肽和50g蔗糖混合均匀,加入到上述标准化牛乳中,使用剪切乳化机3000r剪切15min,然后进行均质化处理,均质条件为60℃,均质压力为25MPa(其中低压为5MPa),均质结束后升温95℃保温300s进行杀菌,然后打入发酵罐;
2)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至45℃,加入实施例1制得唾液链球菌嗜热亚种932冻干菌粉和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的加入量为1g,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的质量比为3:1),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在45℃条件下发酵,终止酸度为90°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
3)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至39℃,加入实施例1制得富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,富硒瑞士乳酸杆菌的加入量为0.8g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在39℃条件下发酵,终止酸度为180°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
4)二次混料
取3g稳定剂加入75℃热水中溶解,其中,稳定剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠,其质量比羧甲基纤维素钠:果胶:三聚磷酸钠:柠檬酸钠=0.5:1.5:0.2:0.3,使用剪切乳化机3000r剪切15min,并对该料液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后将料液冷却至25℃,并将其与步骤3)第二次发酵后的发酵乳搅拌混合,搅拌转速我30r/min,搅拌时间为20min;
5)添加酸味剂
将0.5g柠檬酸、0.5g乳酸和0.1g柠檬酸钠配制成固含为10%的酸液,并对该酸液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后冷却至25℃;使用无菌蒸馏水对步骤4)的料液进行定容(无菌蒸馏水的添加量为使得调整酸度后的料液重量为1000g),并使用上述配制好的无菌酸液调整料液酸度为65°T;
最后对上述料液进行均质处理,均质条件为25℃、20MPa;然后在无菌环境下进行定量灌装、封口,灌装温度15℃;灌装后转移至冷库,在6℃下冷藏。
实施例3
1.乳酸乳球菌乳亚种954(Lactococcus lactis subsp.lactis)的筛选、鉴定方法及鉴定结果
1)取25g西藏哲古草原牧民家自制牦牛奶渣与225mL无菌生理盐水混匀,得到均匀样品液,将样品液进行梯度稀释,分别取10-3、10-4、10-5、10-6浓度的稀释液,于MRS培养基平板上涂布培养,在30℃培养48h后,MRS培养基长出菌落。
2)菌种初筛
根据唾液链球菌嗜热亚种标准菌落特征,挑取单菌落进行分离纯化继续培养,连续分离纯化不少于三次,获得纯化的菌落。
培养特征:最适生长温度为30℃,兼性厌氧,生长于MRS培养基中。
3)产酸实验
将菌种初筛得到的单菌落,在含0.2%CaCO3的MRS培养基平板上进行培养,在30℃培养48h后,观察菌落周围产生无透明圈情况,选择产酸能力强透明圈大的单菌落做进一步分离纯化。
形态学特征:在MRS琼脂培养基中生长状态为:在MRS琼脂培养基中生长形态为底部略带微黄色,表面为淡黄色不透明菌落、边缘整齐、菌体低凸起、表面光滑的菌落形态。
4)革兰氏染色
对复筛得到的菌株进行革兰氏染色,革兰氏染色典型阳性,得到的该菌株为目的菌株。显微镜下观察细胞呈球杆状,无鞭毛,不产芽孢,不运动。
5)菌株的鉴定
在分离纯化的菌株为革兰氏染色阳性,H2O2接触酶阴性,产酸,不产气的菌株,进行16S rDNA基因序列测序,所得结果与NCBI GenBank数据库中进行同源性比对分析,结果显示该菌株为乳酸乳球菌乳亚种。该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.4所示:
GGAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCAACCTACTTCGGGTACTCCCAACTCCCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTAAACATCACTGTCTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCGTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCCGTGTCCCGAAGGAACTTCCTATCTCTAGGAATAGCACGAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGATACAGAGAACTTATAGCTCCCTACATCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGTGTCAGTTACAGGCCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTCCTGCACTCAAGTCTACCAGTTTCCAATGCATACAATGGTTGAGCCACTGCCTTTTACACCAGACTTAATAAACCACCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGGTAGTTACCGTCACTTGATGAGCTTTCCACTCTCACCAACGTTCTTCTCTACCAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCATCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATACAACGCGGGATCATCTTTGAGTGATGCAATTGCATCTTTCAAACTTAAAACTTGTGTTTAAAGTTTTTATGCGGTATTAGCATTCGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTCAAAGGCAGATTCCCCACGCGTTACTCACCCGTTCGCTGCTCATCCAGTCGGTACAAGTACCAACCTTCAGCGCTCAACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTC
将该菌株命名为乳酸乳球菌乳亚种954(Lactococcus lactis subsp.lactis)菌株,于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023904。
2.乳酸乳球菌乳亚种954菌剂的制备
将甘油管中保藏的乳酸乳球菌乳亚种954菌株进行活化,第一次活化按照3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37℃下培养24h,第二次活化按照2%的接种量,于37℃下培养12h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到乳酸乳球菌乳亚种954菌泥。
冻干保护剂各成分质量占比如下:10%脱脂乳粉,6%麦芽糊精,4%蔗糖。将各保护剂溶于55%的纯水中,充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的乳酸乳球菌乳亚种954菌泥与冻干保护剂按照1:3的比例进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到乳酸乳球菌乳亚种954冻干菌粉。
3.富硒乳酸菌饮料的制备
1)发酵基料的配制
按照GB 19301的标准要求验收生牛乳,将检验合格的牛乳进行标准化处理,使乳蛋白为2.9g/100g;取250g标准化牛乳,升温至60℃,取5g实施例1步骤1制得核桃肽、20g麦芽糖醇、20g木糖醇、40g赤藓糖醇和5g甜菊糖苷混合均匀,加入到上述标准化牛乳中,使用剪切乳化机3000r剪切15min,然后进行均质化处理,均质条件为60℃,均质压力为25MPa(其中低压为5MPa),均质结束后升温95℃保温300s进行杀菌,然后打入发酵罐;
2)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至40℃,加入乳酸乳球菌乳亚种954冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,乳酸乳球菌乳亚种954的加入量为0.5g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在40℃条件下发酵,终止酸度为100°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
3)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至35℃,加入实施例1制得富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,富硒瑞士乳酸杆菌的加入量为1.2g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在35℃条件下发酵,终止酸度为160°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
4)二次混料
取5g稳定剂加入75℃热水中溶解,其中,稳定剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠,其质量比羧甲基纤维素钠:果胶:三聚磷酸钠:柠檬酸钠=1.3:2.5:0.5:0.7,使用剪切乳化机3000r剪切15min,并对该料液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后将料液冷却至25℃,并将其与步骤3)第二次发酵后的发酵乳搅拌混合,搅拌转速为30r/min,搅拌时间为20min;
5)添加酸味剂
将2.5g柠檬酸、1.5g乳酸和2g柠檬酸钠配制成固含为10%的酸液,并对该酸液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后冷却至25℃;使用无菌蒸馏水对步骤4)的料液进行定容(无菌蒸馏水的添加量为使得调整酸度后的料液重量为1000g),并使用上述配制好的无菌酸液调整料液酸度为65°T;
最后对上述料液进行均质处理,均质条件为25℃、20MPa;然后在无菌环境下进行定量灌装、封口,灌装温度15℃;灌装后转移至冷库,在6℃下冷藏。
实施例4
1.副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1冻干菌粉
将甘油管中保藏的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株进行活化,第一次活化按照3%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,37℃下培养24h,第二次活化按照2%的接种量,于37℃下培养12h。将发酵完成后的菌液移入无菌离心瓶中,于5000×g,4℃下离心10min,弃去离心上清液,用无菌生理盐水洗涤菌体两次,得到副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌泥。
冻干保护剂各成分质量占比如下:10%脱脂乳粉,6%麦芽糊精,4%蔗糖。将各保护剂溶于55%的纯水中,充分搅拌混匀,于90℃恒温水浴锅中保温30min灭菌消毒备用。
将清洗干净的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌泥与冻干保护剂按照1:3的比例进行配制,将菌泥加入到灭好菌的冻干保护剂中,于无菌冻干瓶中充分混匀,置于-30℃冰箱中预冻12h,将预冻好的菌乳置于真空冷冻干燥机中冻干48h,得到副干酪乳杆菌AL1Plateau LPA-1冻干菌粉。
2.富硒乳酸菌饮料的制备
1)发酵基料的配制
按照GB 19301的标准要求验收生牛乳,将检验合格的牛乳进行标准化处理,使乳蛋白为2.9g/100g;取400g标准化牛乳,升温至60℃,取10g实施例1步骤1制得核桃肽、30g蔗糖、20g木糖醇、20g蔗糖混合均匀,加入到上述标准化牛乳中,使用剪切乳化机3000r剪切15min,然后进行均质化处理,均质条件为60℃,均质压力为25MPa(其中低压为5MPa),均质结束后升温95℃保温300s进行杀菌,然后打入发酵罐;
2)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至42℃,加入副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1的加入量为0.8g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在40℃条件下发酵,终止酸度为100°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
3)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至37℃,加入实施例1制得富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,富硒瑞士乳酸杆菌的加入量为1.5g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在37℃条件下发酵,终止酸度为160°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
4)二次混料
取7g稳定剂加入75℃热水中溶解,其中,稳定剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠,其质量比羧甲基纤维素钠:果胶:三聚磷酸钠:柠檬酸钠=1:2:0.3:0.5,使用剪切乳化机3000r剪切15min,并对该料液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后将料液冷却至25℃,并将其与步骤3)第二次发酵后的发酵乳搅拌混合,搅拌转速为30r/min,搅拌时间为20min;
5)添加酸味剂
将2g柠檬酸、1g乳酸和1g柠檬酸钠配制成固含为10%的酸液,并对该酸液进行杀菌处理,杀菌温度75℃,杀菌时间15s,杀菌后冷却至25℃;使用无菌蒸馏水对步骤4)的料液进行定容(无菌蒸馏水的添加量为使得调整酸度后的料液重量为1000g),并使用上述配制好的无菌酸液调整料液酸度为65°T;
最后对上述料液进行均质处理,均质条件为25℃、20MPa;然后在无菌环境下进行定量灌装、封口,灌装温度15℃;灌装后转移至冷库,在6℃下冷藏。
对比例1
和实施例1的区别在于,对比例1没有添加核桃肽,其他与实施例1相同。
对比例2
和实施例1的区别在于,对比例2第二次发酵没有添加富硒瑞士乳酸杆菌,其他与实施例1相同。具体制备方法如下:
1)发酵基料的配制
同实施例1
2)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至42℃,加入实施例1制得唾液链球菌嗜热亚种932冻干菌粉和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的加入量为0.1g,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的质量比为2:1),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在42℃条件下发酵,终止酸度为100°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
2)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至37℃,在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在37℃条件下发酵,终止酸度为160°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
其他步骤同实施例1。
对比例3
富硒乳酸菌饮料的制备
3)发酵基料的配制
同实施例1
4)第一次发酵
将步骤1)配制好的发酵基料降温至42℃,加入实施例1制得唾液链球菌嗜热亚种932冻干菌粉和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的加入量为0.1g,唾液链球菌嗜热亚种932和德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ的质量比为2:1)以及实施例1制得富硒瑞士乳酸杆菌冻干菌粉(其中,以菌体干物质计,富硒瑞士乳酸杆菌的加入量为1g),在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在42℃条件下发酵,终止酸度为100°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;
2)第二次发酵
将第一次发酵后的发酵乳降温至37℃,在30r/min条件下搅拌5min使其分散均匀,在37℃条件下发酵,终止酸度为160°T;发酵结束后在转速为30r/min条件搅拌15min进行破乳;降温至25℃;
其他步骤同实施例1。
对比例4
和实施例1的区别在于,富硒乳酸菌饮料的制备中第二次发酵的温度为42℃,其他与实施例1相同。
对比例5
和实施例1的区别在于,富硒乳酸菌饮料的制备中第一次发酵的温度为37℃,其他与实施例1相同。
对比例6
和实施例1的区别在于,富硒乳酸菌饮料的制备中核桃肽的用量为25g,其他与实施例1相同。
本发明的实施例1-4和对比例1-6乳酸菌饮料采用以下方法进行测试:
1.硒含量的测定
按下述方法测定实施例1-4和对比例1-6制备的乳酸菌饮料中硒的含量(μg/100g),结果如表2所示。
硒含量的测定方法:根据GB 5009.93-2017(第一法)氢化物原子荧光光谱法来检测富硒乳酸菌饮料中的硒含量。
表2实施例1-4和对比例1-6制得乳酸菌饮料中硒的含量
2.感官评价
随机选择10名参加过感官培训的乳品专业相关人员作为感官品评员,评分标准如下表3。
表3乳酸菌饮料感官评价标准
将感官品评员的评分数取平均值,并将各项指标得分相加得出总分,分数越高代表产品满意度越高,结果如表4所示。
表4乳酸菌饮料感官测试结果
3.货架期内活菌数含量测定
将实施例1-4和对比例1-6制备的乳酸菌饮料在2-6度低温条件下保存至保质期30天,分别在第1,10,20和30天取样检测乳酸菌饮料中活菌数含量(CTU/g),具体方法如下,结果如表5所示。
活菌数的检测方法:采用稀释平板法测定乳酸菌菌落总数。
表5货架期内活菌数含量
保存天数 1天 10天 20天 30天
实施例1 5.9×1010 5.8×1010 5.6×1010 5.4×1010
实施例2 7.7×109 7.5×109 7.3×109 7.1×109
实施例3 5.8×1010 5.8×1010 5.7×1010 5.6×1010
实施例4 9.3×1010 9.2×1010 9.2×1010 9.0×1010
对比例1 2.4×109 2.3×109 2.0×109 1.9×109
对比例2 7.4×107 7.1×107 6.9×107 6.7×107
对比例3 3.7×108 3.6×108 3.4×108 3.2×108
对比例4 4.4×108 4.2×108 4.1×108 3.8×108
对比例5 3.5×108 3.3×108 3.1×108 2.9×108
对比例6 5.3×1010 5.2×1010 5.0×1010 4.8×1010
4.乳酸菌饮料沉淀率
按下述测试实施例1-4和对比例1-6制备的乳酸菌饮料的沉淀率(%),检测方法为:
将乳酸菌饮料从2-6℃冰箱取出,混合均匀,称取样品10g于10mL离心管中,将样品放入离心机,3000rpm,离心10min,称量沉淀重量,根据以下公式计算乳酸菌饮料的沉淀率;
乳酸菌饮料的沉淀率=m1/m×100%
m1—沉淀的质量,单位为克(g);
m—称取样品的质量,单位为克(g);
重复三次,取平均值。
结果如表6所示。
表6实施例1-4和对比例1-6乳酸菌饮料的沉淀率
产品 乳酸菌饮料的沉淀率(%)
实施例1 0.51%
实施例2 0.70%
实施例3 0.59%
实施例4 0.62%
对比例1 1.89%
对比例2 2.23%
对比例3 4.30%
对比例4 3.20%
对比例5 3.71%
对比例6 4.96%
由表2可知,本发明实施例1-4制得乳酸菌饮料中硒的含量为8.5-9.7μg/100g,均超过8μg/100g。对比例2没有添加添加富硒瑞士乳酸杆菌,乳酸菌饮料中的硒含量仅为0.5μg/100g。且由表4可知,本发明实施例1-4制得乳酸菌饮料细腻度较好,无颗粒感或粉感,酸甜适中,口感顺滑。对比例1没有添加核桃肽,细腻度较差,稍有颗粒感或粉感,口感较稀薄;对比例2没有添加富硒瑞士乳酸杆菌,除了硒含量低外,细腻度和滋味也较差;对比例3第一发酵菌剂和第二发酵菌剂同时加入到发酵基料中进行发酵,制得乳酸菌饮料细腻度差,有颗粒感或粉感,口感也较稀薄;对比例4和对比例5均采用恒温发酵,无论是高温发酵还是低温发酵,其制得乳酸菌饮料的细腻度和滋味均不如实施例1;对比例6中核桃肽添加量较多,也导致乳酸饮料细腻度和滋味的下降。
由表5可知,本发明实施例1-4制得乳酸菌饮料保质期内活菌数均≥109(CTU/g),说明使用本发明的配方及工艺制得乳酸饮料乳酸菌含量相对较高。
由表6可知,本发明实施例1-4制得乳酸菌饮料的沉淀率均小于1%,对比例1没有添加核桃肽,沉淀率为1.89%;对比例2没有添加富硒瑞士乳酸杆菌,沉淀率为2.23%;对比例3第一发酵菌剂和第二发酵菌剂同时加入到发酵基料中进行发酵,制得乳酸菌饮料的沉淀率为4.3%;对比例4和对比例5均采用恒温发酵,无论是高温发酵还是低温发酵,其制得乳酸菌饮料的沉淀率为3.2%和3.71%;对比例6中核桃肽添加量较多,其制得乳酸菌饮料的沉淀率为4.96%。
实验例1
抗运动性疲劳动物实验
本实验对实施例1与对比例1的乳酸菌饮料抗运动性疲劳功能进行评价。从三峡大学实验动物中心购买5周龄SD大鼠48只,SPF级,雄性。试验前适应性饲养7天,每笼16只。实验分组:空白对照组(灌胃生理盐水)、实验组1(灌胃实施例1的乳酸菌饮料)、实验组2(灌胃对比例1的乳酸菌饮料)。
所有大鼠每天在跑步机上进行跑步训练,共进行四周的渐进式负荷运动,第一周20m/min的速度跑10min,第二周25m/min,持续20min,第三周30m/min,持续20min,第四周35m/min,持续30min。在跑步期间,所有大鼠均进行灌胃,经四周训练后的大鼠被迫以40m/min的速度奔跑,直至精疲力竭,记录其跑步时间,以确定其跑步耐力。当大鼠在电板上停留时间超过10s时即被确定为精疲力竭,结果如表7所示,
表7大鼠力竭跑步时间
空白对照组 实验组1 实验组2
力竭跑步时间,min 43.1±0.1 55.0±0.7 45.2±0.6
与空白对照组相比,两个实验组的跑步时间均增加,分别增加了27.9%、4.8%、表明添加核桃肽的乳酸菌饮料能延长大鼠力竭跑步时间,增强运动耐力,具有抗疲劳作用。
第四周耐力测试结束后将大鼠即刻处死,取相应组织检测相应生化指标。
(1)大鼠麻醉后心脏取血,在室温下放置2h,离心20min分离血清。取肝和腿部骨骼肌,用生理盐水清洗。所有样品均储存于-80℃冰箱;
(2)血清:检测乳酸和尿素氮含量;
(3)肌肉:取腿部骨骼肌,均质后取0.1g加入5mL 100mmol/L磷酸钾缓冲液,然后将匀浆在4℃下离心15min,取上清液,检测乳酸和糖原含量;
(4)肝脏:取0.1g冷冻肝脏匀浆,用磷酸缓冲液(pH6.8)浸泡。然后将匀浆在4℃下离心10min,取上清液,检测糖原含量。
上述检测结果如表8所示
表8疲劳相关生化指标检测结果
肝糖原和肌糖原的储量是产生疲劳的决定性因素,通常体内储备的能量越多,机体出现疲劳的时间越迟。机体长时间运动过程中会消耗大量ATP,导致有氧氧化过程无法及时提供足够的能量,机体会进行无氧糖酵解从而造成乳酸堆积会使体液pH下降,乳酸含量是准确反应机体疲劳程度的重要生化指标。尿素是蛋白质代谢的终产物,其含量范围可作为评价运动量的重要指标,是人体内蛋白质代谢的评定指标。极剧烈的运动体内的氮平衡会被打破,导致氮含量升高,所以机体内尿素氮的含量和机体的运动耐受力呈显著的负相关。
由表8可知,经过实施例1的乳酸菌饮料灌胃的大鼠血清和骨骼肌中的乳酸含量和血清中的尿素氮含量显著低于空白组。空白组肌糖原消耗殆尽,导致肝糖原参与分解供能,而实验组1肝糖原消耗较少,以消耗肌糖原为主,说明实验组1肌糖原供应充足,肝糖原作为储备供能物质,有效提高了大鼠的运动耐力。对比实验组1与实验组2的各项指标,发现实验组1的数据远远优于实验组2,而实验组2的数据与空白组差异不大,说明实验组1的乳酸菌饮料已具备了较强的抗疲劳活性。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
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Claims (20)

1.一种富硒乳酸菌饮品,其特征在于,包括以下重量份原料组成:牛乳25-65份,核桃肽0.1-2份,第一发酵菌剂0.01-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.16份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
2.根据权利要求1所述富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述富硒乳酸菌饮品包括以下重量份的原料组成:牛乳35-65份,核桃肽0.1-2份,第一发酵菌剂0.01-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.16份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
3.根据权利要求1或2所述富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述富硒乳酸菌饮品包括以下重量份的原料组成:牛乳35-40份,核桃肽0.1-1份,第一发酵菌剂0.08-0.1份,第二发酵菌剂0.08-0.15份,其中,所述第二发酵菌剂为富硒瑞士乳酸杆菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述富硒瑞士乳酸杆菌通过将瑞士乳酸杆菌接种于含硒培养基中发酵培养制得;优选地,所述瑞士乳酸杆菌为瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI(Lactobacillus helveticus Zhegu LBH-VI),其中,所述瑞士乳酸杆菌Zhegu LBH-VI于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCCNO:M 2023095。
5.根据权利要求4所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述富硒瑞士乳酸杆菌中有机硒含量为100-125μg/g。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,以所述富硒乳酸菌饮品的重量计,所述富硒乳酸菌饮品中硒含量≧8.0μg/100g;优选地,所述富硒乳酸菌饮品在货架期内的活菌数≥109CFU/ml。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述牛乳选自全脂牛乳、低脂牛乳或脱脂牛乳中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述核桃肽的分子量为800-1000Da;优选地,所述核桃肽为核桃经蛋白酶酶解制得。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述第一发酵菌剂选自唾液链球菌嗜热亚种、德氏乳杆菌乳亚种、乳双歧杆菌、乳酸乳球菌乳亚种和副干酪乳杆菌中一种或两种以上,优选唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种,更优选以菌体干物质计,唾液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌乳亚种的质量比为2-3:1-1.5。
10.根据权利要求9所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述唾液链球菌嗜热亚种为唾液链球菌嗜热亚种932(Straptococcus salivarias subsp.thermophilus 932),于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2023902;
和/或,所述德氏乳杆菌乳亚种为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LB VⅢ(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis Dangxiong LB VⅢ),于2023年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023396;
和/或,所述乳酸乳球菌乳亚种为乳酸乳球菌乳亚种954(Lactococcus lactissubsp.Lactis 954),于2023年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2023904;
和/或,所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1(lactobacillusparacaseiAL1 Plateau LPA-1)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述原料还包括甜味剂5.0-8.5份;
优选地,所述甜味剂选自蔗糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖或甜菊糖苷中的一种或两种以上,优选为蔗糖。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述原料还包括稳定剂0.3-0.7份;
优选地,所述稳定剂选自羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠中的一种或两种以上;
更优选地,所述羧甲基纤维素钠、果胶、三聚磷酸钠和柠檬酸钠的质量比为0.5-1.3:1.5-2.5:0.2-0.5:0.3-0.7。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述原料还包括酸味剂0.11-0.6份;
优选地,所述酸味剂选自柠檬酸、乳酸和柠檬酸钠,优选柠檬酸、乳酸和柠檬酸钠的质量比为5-25:5-15:1-20。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的富硒乳酸菌饮品,其特征在于,所述富硒乳酸菌饮品通过将包括牛乳和核桃肽的发酵基料经变温发酵制得。
15.权利要求1-14中任一项所述的富硒乳酸菌饮品的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将包括牛乳和核桃肽的原料混合配制成发酵基料;
(2)向步骤(1)制得发酵基料依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵制得发酵乳;
(3)对步骤(2)制得发酵乳进行调配得到富硒乳酸菌饮品。
16.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述调配包括向步骤(2)制得富硒乳酸菌饮品中加入稳定剂和/或酸味剂进行混合、均质处理。
17.根据权利要求15或16所述的制备方法,其特征在于,所述发酵基料还包括甜味剂,优选地,所述甜味剂选自蔗糖、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖或甜菊糖苷中的一种或两种以上,优选为蔗糖。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述依次接入第一发酵菌剂和第二发酵菌剂进行变温发酵包括先接种第一发酵菌剂在40-45℃发酵,再接种第二发酵菌剂在35-39℃发酵;
优选地,先接种第一发酵菌剂在40-45℃发酵10-12h至终止酸度为90-100°T,再接种第二发酵菌剂在35-39℃发酵8-10h至终止酸度为160-180°T。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括在接种前对发酵基料进行均质处理的步骤,优选均质温度为50-65℃,更优选均质压力为10-50MPa;
优选地,所述均质处理后还包括对发酵基料进行杀菌的步骤,优选杀菌温度为90-100℃,更优选杀菌时间为200-400s。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括第一次发酵后和所述第二次发酵后均进行搅拌破乳的步骤,优选搅拌转速为20-40r/min,更优选搅拌时间为10-20min。
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