CN102845313A - 狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域和森林繁育领域，特别是涉及狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法。其主要技术特征为：包括几个步骤：培养基的配制；外植体的选取与消毒；诱导培养；继代及生根培养；组培苗移栽与驯化。本发明的有益效果是：采用的叶片为外植体，取材方便、容易，仅用较少的试材，即可实现全年工厂化生产；生产周期短，从接种到组培苗移栽仅需53-65天，叶片诱导率可达93%，增殖倍数可达12-15倍，移栽生根率可达92%；提出了一种不用瓶内生根，而采用瓶外蘸根的方法，既节省了瓶内生根的时间，也降低了育苗成本；提出了一种冬季育苗时提高生根率的办法，提高了移栽成活率，使之达到95%，同时节省了育苗成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域和森林繁育领域，特别是涉及狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法。
背景技术
狗枣猕猴桃（Actinidia kolomikta (Maxim. et Rupr.) Maxim. ）属于猕猴桃科，猕猴桃属。狗枣猕猴桃果实柔软多汁，酸甜适口，气味芳香，而且营养价值高，富含维生素C(Vc)、有机酸、蛋白质、脂肪、多种糖类、果胶、三萜类、黄酮类、糖类、挥发油及大量游离氨基酸等成分；其化学成分在医药、科研、食用、绿化、工业等行业具有重要价值，是一项极具开发利用前景的自然资源。特别是其具有抗突变、抗畸变和抗肿瘤等作用，已引起国内外学者的高度重视。大力发掘其食用及药用价值，发挥“药食同源”的保健食品是大有前途的。另外，狗枣猕猴桃是猕猴桃属中最耐寒的种类。在自然条件下，狗枣猕猴桃能耐-45℃的低温。其叶色浓绿，观赏价值高，抗病虫害能力强，管理容易，具有巨大的开发潜力。
狗枣猕猴桃在离体繁殖方面研究报道较少，只有张春喜（1990）在《北方园艺》上发表的“狗枣猕猴桃叶片植株再生及无性系快速繁殖” 和兰大伟（2007）在《果树学报》上发表的“狗枣猕猴桃叶片离体培养的器官、体细胞胚形成与植株再生(英文) ”中提到利用狗枣猕猴桃叶片为外植体进行离体培养，二者均添加了玉米素（ZT）后取得诱导成功。随着狗枣猕猴桃市场前景的开发和逐渐引起的关注度增加，对狗枣猕猴桃离体繁殖技术的研究也会越来越多，既可实现资源的保存和利用，也可生产出大量优良品系的苗木满足市场的需求。
目前，由于狗枣猕猴桃属于野生生长状态，还没有在生产上进行大面积栽培，优良野生种的引种或繁殖需要采集狗枣猕猴桃的枝条进行组织培养或整株挖回进行栽植，受自然条件和距离的影响较大，需要耗费较大的人力物力。在组织培养过程中也存在需要大量的枝条进行培养，接种不易成活的问题。同时，上述两篇报道均添加玉米素后才能利用叶片诱导成功，在市场上很难买到玉米素，市场价格也非常高（1900元/克），而且两种组织培养方法均需经过外植体接种、继代培养、生根培养等步骤，跟本方法相比存在增殖倍数低，生产周期长，生产成本高等方面的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狗枣猕猴桃的离体快速繁殖技术，解决狗枣猕猴桃接种成活难、短时间内很难生产大量苗木、苗木优良无性性状不能完全保留的技术问题。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的，其特征为：
包括以下几个步骤：
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为6.5-7.5g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25-30 g/L，调整基本培养基的pH值为5.5-5.8；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为0.5-1.5mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤），使之浓度为1.5-2.0 mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为0.5-1.0 mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.0-1.5mg/L；
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗1-2小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗3-5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）诱导培养：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成小块（1厘米见方）横放在诱导培养基中，在温度24℃±2℃，光照周期12-14小时/d，光照强度2000lux±400 lux的无菌环境下培养25-30天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植到继代培养基中，培养28-35天分化形成12-15倍、芽长至4-6cm、已生根3-5cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2-3天后，将基部的培养基去掉，用浓度1000ppm的ABT生根粉药液蘸根30s后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持60%-90%的湿度至组培苗成苗，待40-50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-10cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
本发明的有益效果是：
（1） 本发明采用的叶片为外植体，取材方便、容易，仅用较少的试材，即可实现全年工厂化生产。
（2） 本发明生产周期短，从接种到组培苗移栽仅需53-65天，叶片诱导率可达93%，增殖倍数可达12-15倍，移栽生根率可达92%。
（3） 本发明提出了一种不用瓶内生根，而采用瓶外蘸根的方法，既节省了瓶内生根的时间，也降低了育苗成本。
（4） 本发明提出了一种冬季育苗时提高生根率的办法，提高了移栽成活率，使之达到92%，同时节省了育苗成本。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为7g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为28 g/L，调整基本培养基的pH值为5.8；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.0mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.8mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为0.8 mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.25mg/L；
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗1.5小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗4遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）诱导培养：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成小块（1厘米见方）横放在培养基中，在温度25℃，光照周期13小时/d，光照强度2200lux的无菌环境下培养25天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植继代培养基中，在温度25℃，光照周期13小时/d，光照强度2200lux的无菌环境下培养28天分化形成15倍、芽长至5cm、已生根5cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2.5天后，洗净根部的培养基，用1000ppm的ABT生根粉药液蘸根30s后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持70%的湿度至组培苗成苗，待40天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长8cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
按实施例1的方案进行狗枣猕猴桃的离体快速繁殖，从接种至生根仅需要53天，即可下地移栽至育苗床，诱导成活率高达97%，增值倍数15倍，远远高于普通组培方法的增殖倍数（通常3-8倍左右），移栽生根率也高达95%。
实施例2
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为7.5g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25 g/L，调整基本培养基的pH值为5.5；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.5mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为2.0mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为1.0mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.0mg/L。
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗1小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗3遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）诱导培养：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成小块横放在培养基中，在温度26℃，光照周期12小时/d，光照强度2000lux的无菌环境下培养28天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植继代培养基中，在温度26℃，光照周期12小时/d，光照强度2000lux的无菌环境下培养32天分化形成12倍、芽长至4cm、已生根3 cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2天，洗净根部的培养基，用1000ppm的ABT生根粉药液蘸根后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持60%的湿度至组培苗成苗，待45天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
按实施例2的方案进行狗枣猕猴桃的离体快速繁殖，从接种至生根需要60天，即可下地移栽至沙床，诱导成活率93%以上，增值倍数12倍，高于普通组培方法的增殖倍数（通常3-8倍左右），移栽生根率也高达92%以上。
实施例3
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为6.5g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为30g/L，调整基本培养基的pH值为5.8；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为0.5mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之1.5mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为0.5mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.5mg/L。
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗2小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）接种：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成小块横放在培养基中，在温度22℃，光照周期14小时/d，光照强度2400lux的无菌环境下培养30天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植继代培养基中，在温度22℃，光照周期14小时/d，光照强度2400lux的无菌环境下培养35天分化形成14倍、芽长至6cm、已生根4 cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗3天，洗净根部的培养基，用1000ppm的ABT生根粉药液蘸根后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持90%的湿度至组培苗成苗，待50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长10cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
按实施例3的方案进行狗枣猕猴桃的离体快速繁殖，从接种至生根需要65天，即可下地移栽至沙床，诱导成活率95%，增值倍数14倍，高于普通组培方法的增殖倍数（通常3-8倍左右），移栽生根率也高达94%。
Claims (2)
1.一种狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法，其特征为：
包括以下几个步骤：
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为6.5-7.5g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为25-30 g/L，调整基本培养基的pH值为5.5-5.8；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为0.5-1.5mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.5-2.0 mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为0.5-1.0 mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.0-1.5mg/L；
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗1-2小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗3-5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）诱导培养：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成1厘米见方的小块横放在诱导培养基中，在温度24℃±2℃，光照周期12-14小时/d，光照强度2000lux±400 lux的无菌环境下培养25-30天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植到继代培养基中，培养28-35天分化形成12-15倍、芽长至4-6cm、已生根3-5cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2-3天后，将基部的培养基去掉，用浓度1000ppm的ABT生根粉药液蘸根30s后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持60%-90%的湿度至组培苗成苗，待40-50天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长7-10cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
2.根据权利要求1所述的一种狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法，其特征为：
（一）培养基的配制：
1）基本培养基：采用常规MS培养基配方配制，其中琼脂浓度为7g/L，用白糖取代蔗糖，浓度为28 g/L，调整基本培养基的pH值为5.8；
2）诱导培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.0mg/ L；
3）继代培养基：向基本培养基中加入6-BA即6-苄氨基嘌呤，使之浓度为1.8mg/L，NAA即萘乙酸，使之浓度为0.8 mg/L及IBA即吲哚丁酸，使之浓度为1.25mg/L；
（二）外植体的选取与消毒：
1）外植体的选取：选取狗枣猕猴桃成熟植株上的离体叶片作为外植体；
2）外植体的消毒：将选取的叶片用清水冲洗1.5小时，在超净工作台上用70%酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1%升汞水溶液消毒2次，每次4分钟，然后用无菌水冲洗4遍，取出用无菌滤纸吸干水分，备用；
（三）诱导培养：将消毒好的叶片周缘切掉，然后在叶片表面割成网格状或将叶片切成1厘米见方的小块横放在培养基中，在温度25℃，光照周期13小时/d，光照强度2200lux的无菌环境下培养25天左右，诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
（四）继代及生根培养：将诱导出的初代幼芽或丛芽移植继代培养基中，在温度25℃，光照周期13小时/d，光照强度2200lux的无菌环境下培养28天分化形成15倍、芽长至5cm、已生根4cm的组培苗；
（五）组培苗移栽与驯化：将已生根的组培苗，在温室内开瓶炼苗2.5天后，洗净根部的培养基，用1000ppm的ABT生根粉药液蘸根30s后移栽至细河沙：蛭石：珍珠岩=1：1：1的基质中，浇足水，保持70%左右的湿度至组培苗成苗，待40天后，组培苗已经长出很多的毛细根系，长8cm左右，转移至营养钵中继续生长，等待出圃。
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