WO2019216675A1 - 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDF

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WO2019216675A1
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김정호
김범석
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Definitions

  • the present invention relates to epitopes of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) proteins, which are antigens present on the surface of regulatory T cells, and antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind thereto.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 proteins
  • autoimmune disease One of the most important traits of all normal individuals is their ability to recognize and eliminate non-self antigens, while not detrimentally reacting to self-constituting antigenic substances. To have. Such non-response of living body to self antigen is called immunologic unresponsiveness or tolerance. Self-tolerance occurs by removing lymphocytes that may have specific receptors for their antigens, or by inactivating their ability to react after contact with the magnetic antigens. When a problem arises in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response occurs to self antigens, and the resulting disease is called an autoimmune disease.
  • the regulatory T cells Naturally play an important role in preventing the occurrence of excessive inflammation and immune responses, but when autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases occur, the function and number of regulatory T cells are significantly reduced. Reported. Therefore, in patients with immune and inflammatory diseases, it is important that regulatory T cells are produced at normal levels, which can be one of the treatments for these diseases.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDRs mainly serve to bind antigen epitopes of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially as CDR1, CDR2 and CDR3, starting from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • One object of the present invention is to provide an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein present on the surface of regulatory T cells (Treg cells).
  • Another object of the present invention is to provide an antibody or antigen-binding fragment that can specifically bind to the epitope.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises an antibody or antigen-binding fragment which can specifically bind to the epitope.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer using an antibody or antigen-binding fragment which can specifically bind to the epitope.
  • the present invention relates to an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein or an antibody or antigen binding fragment that specifically binds to the epitope.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • the "Lrig-1 protein” is a transmembrane protein present on the surface of regulatory T cells, leucine-rich repeat (LRR) on the extracellular or lumen side and three immune-like domains. (immunoglobulin-like domains), cell membrane penetration sequences and cytoplasmic tails.
  • LRR leucine-rich repeat
  • the LRIG gene family includes LRIG1, LRIG2 and LRIG3, and the amino acids between them are highly conserved.
  • the LRIG1 gene is highly expressed in normal skin and can be expressed in the basal and hair follicle cells to control the proliferation of epithelial stem cells.
  • the Lrig-1 protein may be a protein present in human or mouse, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be a Lrig-1 protein derived from a mammal, including humans, primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, and the like.
  • the Lrig-1 protein may be a human-derived Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1, which may be encoded by a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. See Table 1).
  • the Lrig-1 protein may be a mouse-derived Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto (see Table 2).
  • an epitope of the Lrig-1 protein comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by the following Formula 1 is provided:
  • x 1 to x 3 may each independently be a neutral amino acid, an acidic amino acid, a basic amino acid or an aromatic amino acid.
  • the neutral amino acid is glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), serine (S) or threonine (threonine, T)
  • the acidic amino acid may be aspartic acid (D), glutamic acid (E), asparagine (N) or glutamine (Q)
  • the basic The amino acid may be lysine (K), arginine (R) or histidine (H), and the aromatic amino acid may be phenylalanine (F) or tyrosine (Y).
  • x 1 to x 3 are each independently asparagine (N), aspartic acid (D), serine (S), tyrosine (Y), arginine ( arginine (R), phenylalanine (F), lysine (K), histidine (H), leucine (L), valine (V), threonine (T), alanine (alanine) A), glutamine (Q), glutamic acid (E) and glycine (G) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • x 1 is asparagine (N), phenylalanine (phenylalanine (F), aspartic acid (D), lysine (lysine, K), histidine (H), valine (valine, V), arginine (arginine; R), and threonine (threonine, T) is an amino acid selected from the group consisting of,
  • x 2 is serine (S), glutamine (Q), alanine (alanine; A), asparagine (N), glutamic acid (E), aspartic acid (D), phenylalanine (F) and glycine (Glycine; G) is an amino acid selected from the group
  • the x 3 is tyrosine (Y), histidine (H), glycine (g), glycine (G), arginine (R), asparagine (N), leucine (leucine, L), lysine (lysine, K) and phenylalanine (F
  • the x 1 to x 3 are each independently asparagine (N), aspartic acid (D), aspartic acid (D), serine (S), tyrosine (tyrosine; Y ) And arginine (R) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • x 1 is asparagine (N) or aspartic acid (D)
  • x 2 is serine (S) or asparagine (N)
  • x 3 may be tyrosine (Y) or arginine (R).
  • the epitope includes a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by Formula 1, and may be composed of 10 to 20 mer, preferably 10 to 15 mer, and more preferably 11 to 14 mer.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by the formula 1 in the epitope is located 3rd to 6th, preferably 4th to 6th, more preferably 5th from the N-terminal of the epitope. Can be.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by Formula 1 may be represented by any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 to 17 in Table 3, but is not limited thereto:
  • the epitope may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or 20, but is not limited thereto.
  • an epitope of the Lrig-1 protein an epitope comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29 in Table 4 is provided.
  • nucleic acid molecule encoding the epitope provided by the present invention is provided.
  • Nucleic acid molecules of the invention include both nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of a polypeptide provided herein is translated into a polynucleotide sequence, as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences can be prepared by an open reading frame (ORF), all of which are also included in the nucleic acid molecules of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • an expression vector into which the isolated nucleic acid molecule provided in the present invention is inserted is provided.
  • the "vector” is the nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector which refers to circular double stranded DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Some vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors are episomal mammalian vectors of bacterial replication origin).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors can enter the host cell and integrate into the genome of the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors can direct the expression of the genes to which they are linked in a working dimension.
  • Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” or simply "expression vectors.”
  • expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids.
  • plasmid and vector may be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used form of the vector.
  • the expression vector in the present invention include commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vectors; Cosmid; Phages such as lambda, lambbdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It can be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto. All expression vectors known to those skilled in the art as expression vectors can be used in the present invention, and the selection of the expression vector depends on the nature of the host cell of interest.
  • the introduction of the vector into the host cell may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran controlled transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto.
  • An introduction method suitable for the expression vector and the host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and may be selected depending on whether the product is produced using a vector that does not include the selection marker.
  • the selection of the selection marker is selected by the host cell of interest, which uses methods already known to those skilled in the art and the present invention is not so limited.
  • tag sequences can be inserted and fused to an expression vector.
  • the tag may include, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag. Any tag that facilitates purification known to those skilled in the art may be used in the present invention.
  • a host cell line transfected with the expression vector provided in the present invention.
  • host cell in the present invention includes individual cells or cell cultures that may or may have been recipients of the vector (s) for incorporation of the polypeptide insert.
  • Host cells include the progeny of a single host cell, which may not necessarily be exactly the same (in morphological or genomic DNA complement) as the original parent cell because of natural, accidental or intentional mutations.
  • Host cells include cells transfected in vivo with the polypeptide (s) herein.
  • the host cell may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, for example, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Fungal cells such as yeast cells and peach pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Chinese hamster ovary cells (CHO), SP2 / 0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, bow melanoma cells, HT-1080, BHK (Baby hamster kidney cells, Baby Hamster Kidney cells), animal cells of HEK (Human Embryonic Kidney cells) or PERC.6 (human retinal cells); Or it may be a plant cell, but is not limited thereto, any cell that can be used as a host cell line known to those skilled in the art is available.
  • bacterial cells such as E. coli, Streptomy
  • an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to the epitope of the present invention is provided.
  • the antibody according to the present invention comprises an epitope comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by the above formula 1 in Lrig-1 protein present on regulatory T cells; Or specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29 to inhibit the function of the regulatory T cells, and maintain or elevate the activity of effector T cells to prevent cancer cells. Especially, the growth of solid cancer cells can be suppressed effectively.
  • the term "cancer” refers to or indicates a physiological condition characterized by unregulated cell growth in mammals.
  • the cancer to be prevented, improved or treated may be a solid tumor composed of agglomerates caused by abnormal growth of cells in a solid organ, and according to the site of the solid organ, stomach cancer, liver cancer, Glioblastoma, ovarian cancer, colon cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer and the like, but is not limited thereto.
  • the antibody is a full-length antibody or a portion of an antibody that has the ability to bind to the Lrig-1 protein and competes with all of the antibody fragments that bind to the Lrig-1 antigen determination site competitively with the binding molecule of the present invention.
  • the "antibody” refers to a protein molecule that serves as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen.
  • the antigen may be Lrig-1 protein present on the surface of regulatory T cells. Preferably, it may be to specifically recognize the Leucine Rich Region or the immunoglobulin-like domain of the Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the "immunoglobulin” has a heavy chain and a light chain, and each heavy and light chain includes a constant region and a variable region.
  • the variable regions of the light and heavy chains comprise three multivariable regions and four framework regions called complementarity determining regions (hereinafter referred to as "CDRs").
  • the CDR mainly serves to bind to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially as CDR1, CDR2 and CDR3, starting from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the "full length antibody” is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected by a heavy chain and disulfide bond, and includes IgA, IgD, IgE, IgM, and IgG.
  • the IgG subtypes thereof include IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the "antigen-binding fragment” refers to a fragment having an antigen-binding function
  • examples of the antigen-binding fragment include (i) the variable region of the light chain (VL) and the variable region of the heavy chain (VH) and the light chain.
  • the antigen binding fragment may be Fab or F when using proteolytic
  • the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a bivalent, a bispecific molecule, a minibody ( minibody, domain antibody, bispecific antibody, antibody mimetic, diabody, diabody, triabody, tetrabody or fragments thereof, but is not limited thereto.
  • the "monoclonal antibody” refers to an antibody molecule having a single molecule composition obtained from substantially the same antibody population, and exhibits a single binding specificity and affinity for a specific antigenic epitope.
  • the "chimeric antibody” is an antibody obtained by recombining a variable region of a mouse antibody and a constant region of a human antibody, and is an antibody having a greatly improved immune response compared to a mouse antibody.
  • the "humanized antibody” refers to an antibody in which the protein sequence of an antibody derived from a non-human species is modified to be similar to antibody variants naturally produced in humans.
  • the humanized antibody may be prepared by recombining a mouse-derived CDR with a human antibody-derived FR to produce a humanized variable region, which may be recombined with a constant region of a preferred human antibody to prepare a humanized antibody.
  • the "binding" or “specific binding” refers to the affinity for the antigen of the present antibody or antibody composition. “Specific binding” in antigen antibody binding can typically be distinguished from nonspecific background binding when the dissociation constant (Kd) is less than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M or less than 1 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less than 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M. Specific binding can be detected by methods known in the art, such as ELISA, surface plasmon resonance (SPR), immunoprecipitation, coprecipitation, and the like, and can detect nonspecific binding and specific binding. Include appropriate controls to distinguish.
  • Antibodies or antigen-binding fragments of the present invention may exist as multimers such as dimers, trimers, tetramers, pentamers, and the like, comprising at least a portion of the antigen-binding capacity of the monomers. Such multimers also include homomers, or heteromultimers. Since antibody multimers contain a large number of antigen binding sites, they have superior binding ability to antigens as compared to monomers. Multimers of antibodies are also easy for the production of bifunctional, trifunctional, tetrafunctional antibodies.
  • the "multifunctional” refers to an antibody or antigen-binding fragment having two or more activities or functions (eg, antigen binding ability, enzymatic activity, ligand or receptor binding ability).
  • Polypeptides having enzymatic activity can be combined, for example, luciferase, acetyltransferase, galactosidase and the like.
  • Multifunctional antibodies also include antibodies in the form of multivalent or bispecific, trispecific, and the like.
  • the antibody or antigen-binding fragment provided in the present invention comprising a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "antibody-drug conjugate (ADC)" refers to a form in which the drug and the antibody are chemically linked without degrading the biological activity of the antibody and the drug.
  • the antibody-drug conjugate is a form in which a drug is bound to an amino acid residue at the N-terminus of the heavy and / or light chain of the antibody, specifically, the N-terminal, ⁇ -amine group of the heavy and / or light chain of the antibody. This refers to the combined form.
  • the "drug” may mean any substance having a specific biological activity in a cell, which is a concept including DNA, RNA or peptides.
  • the drug may be in a form including a reactor capable of reacting and crosslinking with an ⁇ -amine group, and also including a form in which a linker including a reactor capable of reacting with and reacting with an ⁇ -amine group is connected.
  • Examples of the reactor that can be crosslinked by reacting with the ⁇ -amine group in the present invention are not particularly limited as long as the reactor can be crosslinked by reacting with an ⁇ -amine group at the N-terminal end of a heavy or light chain of an antibody. It includes all the kinds which react with known amine groups. Examples include isothiocyanate, isocyanates, acyl azides, NHS esters, sulfonyl chlorides, aldehydes, glyoxals, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryl halide, Imidoester, Carbodiimide, Anhydride and Fluorophenyl ester ester), but is not limited thereto.
  • the antibody-drug conjugate comprises an epitope of the present invention as the antibody or antigen-binding fragment, that is, an epitope comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by the above formula 1 in Lrig-1 protein; Or an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to an epitope represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29, wherein the drug is capable of treating cancer, a disease targeted by Lrig-1 antibodies.
  • the drug may be an anticancer agent.
  • the anticancer agent may be included without limitation so long as it is a drug used for the prevention, improvement or treatment of cancer, for example, nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, Zefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, conservinib, axitinib, cediranib, restautinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib , Bevacizumab, cisplatin, cetuximab, biscumalboom, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptap
  • the cancer may be a solid tumor composed of agglomerates generated by abnormal growth of cells in a solid organ, and specific examples include gastric cancer, liver cancer, glioblastoma, and ovarian cancer depending on the site of the solid organ. , Colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer and the like, but is not limited thereto.
  • the antibody or antigen-binding fragment provided in the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising an antibody-drug conjugate (Antibody-Drug Conjugate, ADC) as an active ingredient.
  • an antibody-drug conjugate Antibody-Drug Conjugate, ADC
  • the antibody-drug conjugate to which the drug is bound may comprise an epitope comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by Formula 1 in Lrig-1 protein present on regulatory T cells; Or specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29 to inhibit the function of the regulatory T cells, and to maintain or elevate the activity of effector T cells, particularly among cancer cells. It can effectively inhibit the growth of solid cancer cells.
  • the cancer may be a solid tumor composed of agglomerates generated by abnormal growth of cells in a solid organ, and specific examples include gastric cancer, liver cancer, glioblastoma, and ovarian cancer depending on the site of the solid organ. , Colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer and the like, but is not limited thereto.
  • prophylaxis may be used without limitation any action to block the symptoms of the disease, or to suppress or delay the symptoms using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include without limitation any action that improves or benefits the symptoms of the disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that the capsule, tablets, granules, injections, ointments, powder or beverage form, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • the pharmaceutical composition is not limited thereto, but may be used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. And other solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may further be included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition in the present invention is not limited to these, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration, and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg / kg per day. Or 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the antibody or antigen-binding fragment according to the invention Or an antibody-drug conjugate (Atibody-Drug Conjugate, ADC) to a subject.
  • ADC antibody-drug Conjugate
  • Antibodies or antigen binding fragments of the invention comprises an epitope comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by Formula 1 in Lrig-1 protein present on regulatory T cells; Or specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29 to inhibit the function of the regulatory T cells, and to maintain or elevate the activity of effector T cells, particularly among cancer cells. It can effectively inhibit the growth of solid cancer cells.
  • the "individual" is a subject suspected of developing cancer
  • the suspected subject of cancer refers to a mammal including a mouse, a livestock, and the like, including a human having or may have the disease
  • Individuals treatable with the antibody or antibody-drug conjugate of the invention are included without limitation.
  • the methods of the invention can include administering an antibody or antibody-drug conjugate in a pharmaceutically effective amount.
  • Suitable total daily doses may be determined by the treating physician within the scope of good medical judgment and may be administered once or in divided doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical arts, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or concurrent with the specific composition.
  • the method for preventing or treating cancer may be a combination therapy further comprising administering a compound or substance having a therapeutic activity against one or more cancer diseases.
  • the "combination” should be understood to denote simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate, the interval of administration of the secondary components should be such that the beneficial effect of the combination is not lost.
  • the dose of the antibody or antibody-drug conjugate may be about 0.0001 ⁇ g to 500 mg per kg of patient's body weight, but is not limited thereto.
  • the cancer may be a solid tumor composed of agglomerates generated by abnormal growth of cells in a solid organ, and specific examples include gastric cancer, liver cancer, glioblastoma, and ovarian cancer depending on the site of the solid organ. , Colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer and the like, but is not limited thereto.
  • the antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to the epitope of Lrig-1 protein according to the present invention specifically binds to the epitope of the present invention on regulatory T cells to inhibit the function of the regulatory T cells, By maintaining or elevating the activity of T cells, it is possible to effectively inhibit the growth of solid cancer cells, particularly among cancer cells.
  • Figure 1 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the expression level of Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the result of comparing the expression level of Lrig-1 protein in regulatory T cells and non-regulated T cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the expression of Lrig-1 protein on the surface of regulatory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the results of analyzing the binding strength of the antibody (A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 and H6) and Lrig-1 protein in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 shows Lrig-1 protein induced Stat3 phosphorylation in monoclonal antibodies specific for Lrig-1 protein (A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 and H6) and regulatory T cells in one embodiment of the present invention. Results of analysis of regulatory mechanisms are shown.
  • FIG 11 shows the design of cancer treatment experiments using monoclonal antibodies (A8, B8, D9 and H6) specific for Lrig-1 protein in one embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the cancer treatment effect using monoclonal antibodies (A8, B8, D9 and H6) specific for Lrig-1 protein in one embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows the epitope mapping results of 10 ⁇ g / ml monoclonal antibody (H6) to Lrig-1 protein using a microarray in one embodiment of the present invention.
  • Figure 14 shows the epitope mapping results of 100 ⁇ g / ml monoclonal antibody (H6) to Lrig-1 protein using a microarray in one embodiment of the present invention.
  • Figure 15 shows the epitope mapping results of monoclonal antibody (H6) to Lrig-1 protein using a microarray in one embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein or an antibody or antigen binding fragment that specifically binds to the epitope.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • an epitope of the Lrig-1 protein comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by the following Formula 1 is provided:
  • x 1 to x 3 may each independently be a neutral amino acid, an acidic amino acid, a basic amino acid or an aromatic amino acid.
  • the neutral amino acid is glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), serine (S) or threonine (threonine, T)
  • the acidic amino acid may be aspartic acid (D), glutamic acid (E), asparagine (N) or glutamine (Q)
  • the basic The amino acid may be lysine (K), arginine (R) or histidine (H), and the aromatic amino acid may be phenylalanine (F) or tyrosine (Y).
  • x 1 to x 3 are each independently asparagine (N), aspartic acid (D), serine (S), tyrosine (Y), arginine ( arginine (R), phenylalanine (F), lysine (K), histidine (H), leucine (L), valine (V), threonine (T), alanine (alanine) A), glutamine (Q), glutamic acid (E) and glycine (G) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • x 1 is asparagine (N), phenylalanine (phenylalanine (F), aspartic acid (D), lysine (lysine, K), histidine (H), valine (valine, V), arginine (arginine; R), and threonine (threonine, T) is an amino acid selected from the group consisting of,
  • x 2 is serine (S), glutamine (Q), alanine (alanine; A), asparagine (N), glutamic acid (E), aspartic acid (D), phenylalanine (F) and glycine (Glycine; G) is an amino acid selected from the group
  • the x 3 is tyrosine (Y), histidine (H), glycine (g), glycine (G), arginine (R), asparagine (N), leucine (leucine, L), lysine (lysine, K) and phenylalanine (F
  • the x 1 to x 3 are each independently asparagine (N), aspartic acid (D), aspartic acid (D), serine (S), tyrosine (tyrosine; Y ) And arginine (R) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • x 1 is asparagine (N) or aspartic acid (D)
  • x 2 is serine (S) or asparagine (N)
  • x 3 may be tyrosine (Y) or arginine (R).
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by Formula 1 may be represented by any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 to 17, but is not limited thereto.
  • an epitope of the Lrig-1 protein an epitope comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 18 to 29 in Table 4 is provided.
  • an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to the epitope of the present invention is provided.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment provided by the present invention as an active ingredient.
  • T cells In order to confirm that Lrig-1 protein is expressed only in regulatory T cells (Treg), subsets of T cells, Th0, Th1, Th2, Th17 and iTreg, were prepared.
  • the iTreg refers to cells which artificially induced differentiation in a medium containing the following composition, unlike nTreg, which is naturally isolated.
  • Subtypes of T cells were first isolated from na ⁇ ve T cells obtained from the spleen of the rat, and then RPMI1640 containing 10% fetal bovine serum (FBS; hyclone, logan, UT) (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY). To further include the components of Table 5 in the nutrient medium, differentiation was induced to each cell through 72 hours incubation in 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • the three-dimensional conformation of the extracellular domain of Lrig-1 protein was predicted to produce antibodies specific for Lrig-1 protein, the surface protein of regulatory T cells.
  • LRR1 to LRR15 existed in the Lrig-LRR domain (amino acid sequence Nos. 41 to 494) of the extracellular domain of Lrig-1 protein.
  • LRR domains consisted of 23 to 27 amino acids, with 3 to 5 leucine present.
  • Lrig-1 protein could act as a biomarker specific for regulatory T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of the mice using magnet-activated cell sorting (MACS) through CD4 beads. Thereafter, regulatory T (CD4 + CD25 + T) cells and non-regulated T (CD4 + CD25 ⁇ T) cells were separated using a fluorescent activated cell sorter (FACS) using a CD25 antibody.
  • FACS fluorescent activated cell sorter
  • Each cell and the cells differentiated in Preparation Example 1 extracted mRNA using Trizol, and genomic RNA removed gDNA by a protocol provided by a company using gDNA extraction kit (Qiagen). . gDNA removed mRNA was synthesized into cDNA through the BDsprint cDNA Synthesis Kit (Clonetech).
  • the real-time polymerase chain reaction was carried out by SYBR Green (Molecular Probes) using a protocol provided by the manufacturer for 3 minutes at 95 °C, 15 seconds at 61 °C, 40 cycles of 30 seconds each at 72 °C, Table 6 It was performed using a primer, relative gene expression was calculated using the ⁇ CT method, and normalized (HPRT) using, the results are shown in Figures 3 to 6.
  • Lrig-1 in regulatory T (CD4 + CD25 + T) cells is 18.1 times higher than non-regulated T (CD4 + CD25 - T) cells. This expression level was about 10 times higher than that of Lag3 and Ikzf4, which are known markers of regulatory T cells. Also, as shown in FIGS. 4 and 5, regulatory T cells were compared with other types of immune cells. The expression of Lrig-1 mRNA was significantly higher in naturally isolated regulatory T cells (nTreg) than in cells, particularly induced T cells (iTreg).
  • Lrig-1 expression was the highest among the Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 corresponding to the Lrig family.
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells, particularly naturally occurring regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein expressed from Lrig-1 mRNA was specifically expressed only in regulatory T cells.
  • a magnet-activated cell sorter (magnet-activated) from a mouse's spleen to CD4 beads using FOXP3-RFP-Knock-in mice incorporating a red fluorescence protein (RFP) to the FOXP3 promoter, a regulatory T cell-specific transcription factor.
  • CD4 + T cells were isolated using cell sorting (MACS). Then, using RFP protein, regulatory T (CD4 + RFP + T) cells and non-regulated T (CD4 + RFP - T) cells were obtained by fluorescence activated cell sorter (FACS). Each of the cells was purchased Lrig-1 antibody and negative control group isotype (isotype) to measure the expression level of Lrig-1 with a fluorescent active cell sorter, the results are shown in Figure 7.
  • the non-regulated T cells indicated by the dotted line showed almost the same expression level of Lrig-1 as the negative control, but there were a large number of cells having high expression levels of Lrig-1.
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein In order for Lrig-1 protein to be a target of cell therapy, it must be expressed on the surface of regulatory T cells to more effectively target the treatment. Therefore, it was confirmed whether Lrig-1 protein was expressed on the surface.
  • Each differentiated T cell subtype of Preparation Example 1 was stained with anti-CD4-APC and anti-Lrig-1-PE antibodies and surfaced to each cell using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS). The expression level of Lrig-1 at was measured, and the results are shown in FIG. 8.
  • FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter
  • Lrig-1 is expressed in an amount of 0.77 to 15.3 in activated T cells, Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, and Naive T cells, whereas differentiation was highly expressed as 83.9 in T cells (iTreg).
  • Lrig-1 protein according to the present invention is not only specifically expressed in regulatory T cells (Treg) cells, but also particularly expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Antibodies specific for the Lrig-1 protein according to the present invention were constructed. This antibody did not produce a specific antigenic determinant but produced an antibody capable of binding any site to Lrig-1 protein.
  • Lrig-1 protein cells expressing Lrig-1 protein were prepared. More specifically, the DNA fragment and pcDNA (hygro) corresponding to SEQ ID NO: 2 are cleaved with a cleavage enzyme, cultured at 37 ° C, and ligated to insert the DNA sequence of the Lrig-1 protein. Prepared pcDNA. The prepared pcDNA inserted SEQ ID NO: 2 was introduced through transfection into L cells so that Lrig-1 protein could be expressed on the surface of L cells.
  • a sequence of light and heavy chain amino acids capable of binding to Lrig-1 expressed on the cell surface was selected from the Human scFv library, and a total of eight heavy and light chains were selected.
  • the selected heavy and light chain amino acid sequences were fused with the mlgG2a Fc region to prepare a monoclonal antibody.
  • the sequence of the monoclonal antibody is shown in Table 7 below.
  • each of the antibodies of Preparation Examples 1 to 8 was applied to L cells stably expressing Lrig-1. After binding, a secondary antibody conjugated with eFlour 670 conjugated with eFlour 670 was added, and then analyzed for binding to Lrig-1 protein of the monoclonal antibody using FACS. Is shown in FIG. 9.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, A8, B8, C8, D9, E7, G3 and H6) according to the present invention all the Lrig-1 protein present on the surface of L cells Effectively recognized and combined was confirmed.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A7, C8, E7 and G3) according to the present invention was confirmed to increase the phosphorylation of Stat3 to the same level as Th17 cells .
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibodies (A8, B8, D9 and H6) according to the present invention was confirmed to maintain and reduce the phosphorylation (phosphorylation) of Stat3 to the same level as iTreg cells.
  • B16F10 melanoma cells (melanoma cell ) was subcutaneously injected in mice and the like at a dose of 3 ⁇ 10 5 cells, and then injected intraperitoneally with the antibodies of Preparation Examples 5 to 8 on the 4th, 8th and 12th days. After the melanoma cell transplantation, the tumor volume change over time was measured and the results are shown in FIG. 12.
  • Lrig-1 protein specific monoclonal antibody can inhibit the growth of various solid cancer cells, thereby effectively preventing, improving or treating it.
  • GSGSGSG linkers were stretched to the C- and N-terminals of the Lrig-1 protein to prevent peptide cleavage of the Lrig-1 protein.
  • the elongated antigen sequence was translated to 15 amino acids due to peptide-peptide duplication of 14 amino acids.
  • Microarrays of the final LRIG1 peptide identified 1,091 different peptides as duplicates and were framed by additional HA (YPYDVPDYAG, 102 spots) control peptide.
  • Wash buffer pH 7.4 with PBS, 0.05% Tween 20 (3 times 10 seconds after each incubation)
  • Blocking Buffer Rockland Blocking Buffer MB-070 (first 30 minutes ago)
  • Assay conditions adjust the concentration of antibody in culture buffer to 1 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml; Incubate at 4 ° C. for 16 hours and stir at 140 rpm
  • Control antibody mouse monoclonal anti-HA (12CA5) DyLight800 (0.5 ⁇ g / ml); Stain for 45 minutes in culture buffer at room temperature
  • Pre-staining of microarray replication of LRIG1 peptide using secondary and control antibodies in culture buffer to determine if they can interact with antigen-derived peptides that may interfere in the main assay. ) was performed. Thereafter, additional culture of microarray replication of other LRIG1 peptides was performed with the H6 monoclonal antibody (1 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml) of Preparation Example 8 in a culture buffer. And stained using control antibody. Read-out was performed with a scanning intensity of 7/7 (red / green) using the LI-COR Odyssey Imaging System. Quantification of spot intensity and peptide annotation are shown in 16-bit gray scale TIFF files. Microarray images were analyzed using a PepSlide® Analyzer. The results are shown in FIGS. 13-15, and the analyzed epitope sequences are shown in Table 8 below.
  • the monoclonal antibody (H6) that specifically binds to Lrig-1 protein present on regulatory T cells to treat cancer effectively is represented by SEQ ID NOs: 18 to 29 in Lrig-1 protein. It was confirmed that the specific function of the epitope represented by the amino acid sequence exhibits the above functions. Moreover, the epitopes represented by SEQ ID NOs: 18 and 20 have a common leucine rich repeat, specifically, the amino acid sequence of the formula 1 of the present invention at the fifth amino acid position from the N-terminal It was possible to include a consensus sequence that can be.
  • the present invention relates to epitopes of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) proteins, which are antigens present on the surface of regulatory T cells, and antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind thereto.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 proteins

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

조절 T 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중 하나는, 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비-자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 제거할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기 관용은 자기 항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기 항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자가면역질환의 치료를 위하여, 1970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 있는 억제 T 세포라는 개념을 도입하여, 처음으로 제시된 이래(R. K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37), 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다.
이에, 상기 조절 T 세포(Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
한편, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프 또는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1 단백질"은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 이들간의 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재 시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 인간 또는 마우스에 존재하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 Lrig-1 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(표 1 참조).
Figure PCTKR2019005592-appb-T000001
Figure PCTKR2019005592-appb-I000001
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 마우스 유래 Lrig-1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(표 2 참조).
서열목록 서열정보
서열번호 3 MARPGPGVLG APRLAPRLLL WLLLLLLQWP ESAGAQAGPR APCAAACTCA GDSLDCSGRG 60LATLPRDLPS WTRSLNLSYN RLSEIDSAAF EDLTNLQEVY LNSNELTAIP SLGTASIGVV 120SLFLQHNKIL SVDGSQLKSY LSLEVLDLSS NNITEIRSSC FPNGLRIREL NLASNRISIL 180ESGAFDGLSR SLLTLRLSKN RITQLPVKAF KLPRLTQLDL NRNRIRLIEG LTFQGLDSLE 240VLRLQRNNIS RLTDGAFWGL SKMHVLHLEY NSLVEVNSGS LYGLTALHQL HLSNNSISRI 300QRDGWSFCQK LHELILSFNN LTRLDEESLA ELSSLSILRL SHNAISHIAE GAFKGLKSLR 360VLDLDHNEIS GTIEDTSGAF TGLDNLSKLT LFGNKIKSVA KRAFSGLESL EHLNLGENAI 420RSVQFDAFAK MKNLKELYIS SESFLCDCQL KWLPPWLMGR MLQAFVTATC AHPESLKGQS 480IFSVLPDSFV CDDFPKPQII TQPETTMAVV GKDIRFTCSA ASSSSSPMTF AWKKDNEVLA 540NADMENFAHV RAQDGEVMEY TTILHLRHVT FGHEGRYQCI ITNHFGSTYS HKARLTVNVL 600PSFTKIPHDI AIRTGTTARL ECAATGHPNP QIAWQKDGGT DFPAARERRM HVMPDDDVFF 660ITDVKIDDMG VYSCTAQNSA GSVSANATLT VLETPSLAVP LEDRVVTVGE TVAFQCKATG 720SPTPRITWLK GGRPLSLTER HHFTPGNQLL VVQNVMIDDA GRYTCEMSNP LGTERAHSQL 780SILPTPGCRK DGTTVGIFTI AVVCSIVLTS LVWVCIIYQT RKKSEEYSVT NTDETIVPPD 840VPSYLSSQGT LSDRQETVVR TEGGHQANGH IESNGVCLRD PSLFPEVDIH STTCRQPKLC 900VGYTREPWKV TEKADRTAAP HTTAHSGSAV CSDCSTDTAY HPQPVPRDSG QPGTASSQEL 960RQHDREYSPH HPYSGTADGS HTLSGGSLYP SNHDRILPSL KNKAASADGN GDSSWTLAKL 1020HEADCIDLKP SPTLASGSPE LMEDAISTEA QHLLVSNGHL PKACDSSPES VPLKGQITGK 1080RRGPLLLAPR S
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다:
[식 1]
Lx1Lx2x3N
상기 식 1에서,
x1 내지 x3는 각각 독립적으로 중성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산일 수 있다. 여기서 상기 중성 아미노산은, 글리신(glycine; G), 알라닌(alanine; A), 발린(valine, V), 류신(leucine, L), 아이소류신(isoleucine, I), 세린(serine, S) 또는 트레오닌(threonine, T)일 수 있고, 상기 산성 아미노산은 아스파트산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E), 아스파라긴(asparagine; N) 또는 글루타민(glutamine; Q)일 수 있으며, 상기 염기성 아미노산은 라이신(lysine, K), 아르기닌(arginine; R) 또는 히스티딘(histidine; H)일 수 있고, 상기 방향족 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine; F) 또는 티로신(tyrosine; Y)일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 x1 내지 x3는 각각 독립적으로 아스파라긴(asparagine; N), 아스파트산(aspartic acid; D), 세린(serine; S), 티로신(tyrosine; Y), 아르기닌(arginine; R), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 류신(leucine, L), 발린(valine, V), 트레오닌(threonine, T), 알라닌(alanine; A), 글루타민(glutamine; Q), 글루탐산(glutamic acid; E) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 x1은 아스파라긴(asparagine; N), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 아스파트산(aspartic acid; D), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine; R) 및 트레오닌(threonine, T)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고, 상기 x2는 세린(serine; S), 글루타민(glutamine; Q), 알라닌(alanine; A), 아스파라긴(asparagine; N), 글루탐산(glutamic acid; E), 아스파트산(aspartic acid; D), 페닐알라닌(phenylalanine; F) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이며, 상기 x3는 티로신(tyrosine; Y), 히스티딘(histidine; H), 글리신(glycine; G), 아르기닌(arginine; R), 아스파라긴(asparagine; N), 류신(leucine, L), 라이신(lysine, K) 및 페닐알라닌(phenylalanine; F)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시로, 상기 x1 내지 x3는 각각 독립적으로 각각 독립적으로 아스파라긴(asparagine; N), 아스파트산(aspartic acid; D), 세린(serine; S), 티로신(tyrosine; Y) 및 아르기닌(arginine; R)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시로, 상기 x1은 아스파라긴(asparagine; N) 또는 아스파트산(aspartic acid; D)이고, 상기 x2는 세린(serine; S) 또는 아스파라긴(asparagine; N)이며, 상기 x3는 티로신(tyrosine; Y) 또는 아르기닌(arginine; R)일 수 있다.
본 발명에서 상기 에피토프는 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 10 내지 20 mer, 바람직하게는 10 내지 15 mer, 보다 바람직하게는 11 내지 14 mer로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 에피토프에서 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는, 상기 에피토프의 N-터미널로부터 3 내지 6 번째, 바람직하게는 4 내지 6 번째, 보다 바람직하게는 5 번째에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 하기 표 3의 서열번호 4 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
서열목록 서열정보
서열번호 4 LNLSYN
서열번호 5 LDLNRN
서열번호 6 LFLQHN
서열번호 7 LNLAGN
서열번호 8 LDLSLN
서열번호 9 LRLSKN
서열번호 10 LKLQRN
서열번호 11 LHLEYN
서열번호 12 LHLSNN
서열번호 13 LVLSFN
서열번호 14 LRLSHN
서열번호 15 LDLDHN
서열번호 16 LTLFGN
서열번호 17 LNLGGN
본 발명의 다른 일 예시로서, 상기 에피토프는 서열번호 18 또는 20의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 하기 표 4의 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다:
서열목록 서열정보
서열번호 18 WTRSLNLSYNKL
서열번호 19 TEVRNTCFPHGPPI
서열번호 20 RLTQLDLNRNRIR
서열번호 21 DLNRNRIRLIEGLTF
서열번호 22 NSIARIHRKGW
서열번호 23 WLPPWLIGRMLQAF
서열번호 24 RQVTFGHEGRY
서열번호 25 FGHEGRYQCVITNHF
서열번호 26 RLTVNVLPSFTKTPH
서열번호 27 RRMHVMPDDDVFF
서열번호 28 FFITDVKIDDAGVYS
서열번호 29 KGDRPLSLTERHH
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 항체는 조절 T 세포 상에 존재하는 Lrig-1 단백질 중 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩테드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암 세포 중에서도 특히 고형암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항체는 전장 항체 (full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward, E. S. et al., Nature 341: 544-546(1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5M 미만 또는 1x10-6M 미만 또는 1x10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서 상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 일컫는 것으로, 예를 들면 본 발명의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 항체-약물 결합체는 상기 항체 또는 항원 결합 단편으로 본 발명의 에피토프, 즉 Lrig-1 단백질 중 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 이때 상기 약물은 Lrig-1 항체가 표적으로 하는 질환인, 암을 치료할 수 있는 약물로 항암제일 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위해 사용되는 약물이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 예를 들면, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레로마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 구체적인 예시로 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 약학 조성물에서 유효 성분으로 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 이에 약물이 결합된 항체-약물 결합체는, 조절 T 세포 상에 존재하는 Lrig-1 단백질 중 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암 세포 중에서도 특히 고형암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 구체적인 예시로 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 항체-약물 결합체는 조절 T 세포 상에 존재하는 Lrig-1 단백질 중 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암 세포 중에서도 특히 고형암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 "개체"는 암의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 암 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 결합체로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 항체 또는 항체-약물 결합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 암의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 암 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 항체 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 구체적인 예시로 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암 세포 중에서도 특히 고형암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 항체(A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 및 H6)와 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7, G3, A8, B8, D9 및 H6)와 조절 T 세포 내에서 Lrig-1 단백질 유도 Stat3 인산화 조절 기작을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(A8, B8, D9 및 H6)를 이용한 암 치료 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(A8, B8, D9 및 H6)를 이용한 암 치료 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 마이크로어레이를 이용하여 Lrig-1 단백질에 대한 단일클론항체(H6) 10 μg/ml의 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 마이크로어레이를 이용하여 Lrig-1 단백질에 대한 단일클론항체(H6) 100 μg/ml의 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 마이크로어레이를 이용하여 Lrig-1 단백질에 대한 단일클론항체(H6)의 에피토프 맵핑 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프 또는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다:
[식 1]
Lx1Lx2x3N
상기 식 1에서,
x1 내지 x3는 각각 독립적으로 중성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산일 수 있다. 여기서 상기 중성 아미노산은, 글리신(glycine; G), 알라닌(alanine; A), 발린(valine, V), 류신(leucine, L), 아이소류신(isoleucine, I), 세린(serine, S) 또는 트레오닌(threonine, T)일 수 있고, 상기 산성 아미노산은 아스파트산(aspartic acid; D), 글루탐산(glutamic acid; E), 아스파라긴(asparagine; N) 또는 글루타민(glutamine; Q)일 수 있으며, 상기 염기성 아미노산은 라이신(lysine, K), 아르기닌(arginine; R) 또는 히스티딘(histidine; H)일 수 있고, 상기 방향족 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine; F) 또는 티로신(tyrosine; Y)일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 x1 내지 x3는 각각 독립적으로 아스파라긴(asparagine; N), 아스파트산(aspartic acid; D), 세린(serine; S), 티로신(tyrosine; Y), 아르기닌(arginine; R), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 류신(leucine, L), 발린(valine, V), 트레오닌(threonine, T), 알라닌(alanine; A), 글루타민(glutamine; Q), 글루탐산(glutamic acid; E) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 x1은 아스파라긴(asparagine; N), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 아스파트산(aspartic acid; D), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine; R) 및 트레오닌(threonine, T)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고, 상기 x2는 세린(serine; S), 글루타민(glutamine; Q), 알라닌(alanine; A), 아스파라긴(asparagine; N), 글루탐산(glutamic acid; E), 아스파트산(aspartic acid; D), 페닐알라닌(phenylalanine; F) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이며, 상기 x3는 티로신(tyrosine; Y), 히스티딘(histidine; H), 글리신(glycine; G), 아르기닌(arginine; R), 아스파라긴(asparagine; N), 류신(leucine, L), 라이신(lysine, K) 및 페닐알라닌(phenylalanine; F)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시로, 상기 x1 내지 x3는 각각 독립적으로 각각 독립적으로 아스파라긴(asparagine; N), 아스파트산(aspartic acid; D), 세린(serine; S), 티로신(tyrosine; Y) 및 아르기닌(arginine; R)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시로, 상기 x1은 아스파라긴(asparagine; N) 또는 아스파트산(aspartic acid; D)이고, 상기 x2는 세린(serine; S) 또는 아스파라긴(asparagine; N)이며, 상기 x3는 티로신(tyrosine; Y) 또는 아르기닌(arginine; R)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시로, 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 서열번호 4 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 하기 표 4의 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 5의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4 + T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 6의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 △CT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.
프라이머 서열
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3'
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3'
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3'
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3'
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3'
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3'
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3'
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3'
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3'
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3'
도 3에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포에 비하여 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.또한, 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T) 세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T) 세포를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비 조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 조절 T 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[제조예 1 내지 8] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Lright chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일클론항체의 서열은 하기 표 7과 같다.
구분 클론 위치 아미노산 서열 서열정보
제조예 1 A7 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYDMSWVRQAPGKGLEWVSLIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAGLSWAGAFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 30
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 31
제조예 2 C8 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISPGDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLYSNPNEPFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 32
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제조예 3 E7 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISPDGSNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVGLRCRYEACSYAYGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 34
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제조예 4 G3 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISPSSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLDAFWRPSFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 36
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제조예 5 A8 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQVPGKGLEWVSWISHGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLGLCKTGLCYYYDAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 38
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제조예 6 B8 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISHDSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHWTTFDYWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 40
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제조예 7 D9 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDILPCPWGRCYYDYAMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 42
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제조예 8 H6 clone 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISHGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVISNCHLGVCYYSNGMDVWGQGTLVTVSSTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 서열번호 44
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 서열번호 45
[실시예 5] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 8의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 단일클론항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, A8, B8, C8, D9, E7, G3 및 H6) 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 조절 T 세포 내 신호전달경로의 조절
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1 단백질을 통하여 조절 T 세포 내의 신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는 지를 분석하기 위하여, 상기 제조예 1 내지 8의 항체를 조절 T 세포에 처리하여 상기 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1를 자극한 뒤, 포스포티로신 면역 블롯(phosphotyrosine immunoblot)을 통하여 자극받은 조절 T 세포 내에 존재하는 Stat3 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation) 정도를 분석하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A7, C8, E7 및 G3)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 Th17 세포와 같은 수준으로 증가를 시키는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A8, B8, D9 및 H6)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 iTreg 세포와 같은 수준으로 계속하여 유지 및 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] A8, B8, D9 및 H6 항체의 암 치료 효과
상기 제조예 5 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체(A8, B8, D9 및 H6)의 고형암에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여, 도 11에서 보는 바와 같이, B16F10 흑색종 세포(melanoma cell)를 마우스 등에 3X105 세포의 양으로 피하 주사(subcutaneous injection)한 뒤, 4일, 8일, 12일 째에 상기 제조예 5 내지 8의 항체를 200 ug의 양으로 복강 내 주사하였다. 상기 멜라노마 세포 이식 후 시간의 경과에 따른 종양의 부피 변화를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(A8, B8, D9 및 H6)를 처리한 경우 항체를 처리하지 않은 음성 대조군에 비하여 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체는 다양한 고형암 세포의 성장을 억제하여, 이를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 8] 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프 결정
조절 T 세포 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질에서 각 LRR 도메인과 Ig-like 도메인에 존재하는 상기 제조예 8의 H6 항체의 결합 에피토프를 발굴하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
1. 실험 준비
(1) 마이크로어레이
Lrig-1 단백질의 펩타이드 절단을 방지하기 위하여 상기 Lrig-1 단백질의 C- 및 N-터미널에 GSGSGSG 링커를 신장시켰다. 신장된 항원 서열은 14개 아미노산의 펩타이드-펩타이드 중복으로 인하여 15개 아미노산으로 번역되었다. 최종 LRIG1 펩타이드의 마이크로어레이 결과 1,091개의 상이한 펩타이드가 듀플리케이트(duplicate)로 확인되었고, 추가적인 HA (YPYDVPDYAG, 102 spots) 컨트롤 펩타이드에 의해 프레임(framed) 되었다.
(2) 실험 재료
시료: 제조예 8의 H6 단일클론항체
세척 버퍼: PBS, 0.05% Tween 20 (각 배양 후 10초 경과하였을 때, 3회)에 의한 pH 7.4
블러킹 버퍼(Blocking Buffer): Rockland 블러킹 버퍼 MB-070 (첫 어쎄이 30분 전)
배양 버퍼: 10% 블러킹 버퍼를 추가한 세척 버퍼
어쎄이 조건: 배양 버퍼 내 항체의 농도를 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml로 조절; 4℃에서 16 시간 동안 배양하고, 140 rpm으로 교반
2차 항체: 염소 항-인간 IgG (H+L) DyLight680 (0.2 μg/ml); 상온에서 배양 버퍼 내 45분간 염색
대조군 항체: 마우스 단일클론성 항-HA (12CA5) DyLight800 (0.5 μg/ml); 상온에서 배양 버퍼 내 45분간 염색
스캐너: LI-COR Odyssey Imaging System; 스캐닝 오프세트(scanning offset) 0.65 mm, 해상도 21 μm, 7/7 (red = 700 nm/green = 800 nm)의 스캐닝 강도
2. 실험 방법
메인 어쎄이에서 간섭을 일으킬 수 있는 항원-유래 펩타이드와 상호 작용을 일으킬 수 있는 지 확인하기 위하여, 배양 버퍼 내에서 2차 항체 및 대조군 항체를 사용해 LRIG1 펩타이드의 마이크로어레이 복제의 전-염색(pre-staining)을 수행하였다. 이후, 배양 버퍼 내에서 제조예 8의 H6 단일클론항체(1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml)와 함께 다른 LRIG1 펩타이드의 마이크로어레이 복제의 추가적 배양을 수행한 뒤, 2차 항체 및 대조군 항체를 사용하여 염색하였다. LI-COR Odyssey Imaging System을 이용하여 7/7 (red/green)의 스캐닝 강도로 판독(read-out)을 수행하였다. 스팟 강도의 정량화 및 펩타이드 해독(peptide annotation)은 16-비트 회색 스케일 TIFF 파일로 나타내었다. PepSlide® Analyzer를 이용하여 마이크로어레이 이미지를 분석하였다. 그 결과는 도 13 내지 15에 나타내었고, 분석된 에피토프 서열은 하기 표 8에 나타내었다.
서열목록 서열정보
서열번호 18 WTRSLNLSYNKL
서열번호 19 TEVRNTCFPHGPPI
서열번호 20 RLTQLDLNRNRIR
서열번호 21 DLNRNRIRLIEGLTF
서열번호 22 NSIARIHRKGW
서열번호 23 WLPPWLIGRMLQAF
서열번호 24 RQVTFGHEGRY
서열번호 25 FGHEGRYQCVITNHF
서열번호 26 RLTVNVLPSFTKTPH
서열번호 27 RRMHVMPDDDVFF
서열번호 28 FFITDVKIDDAGVYS
서열번호 29 KGDRPLSLTERHH
3. 실험 결과
도 13 내지 15에서 보는 바와 같이, 조절 T 세포 상에 존재하는 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하여 암을 효과적으로 치료하는 단일클론항체(H6)는, Lrig-1 단백질 중 서열번호 18 내지 29의 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기의 기능을 발휘하는 것임을 확인할 수 있었다. 더욱이, 서열번호 18 및 20으로 표시되는 에피토프는 류신-풍부 단백질(leucine rich repeat)을 공통으로 하고 있으며, 구체적으로는 N-터미널로부터 5번째 아미노산 위치에 본 발명의 식 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있는 공통된 서열(consensus sequence)을 포함하고 있음을 수 있었다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Claims (20)

  1. 하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편:
    [식 1]
    Lx1Lx2x3N
    상기 식 1에서,
    x1 내지 x3는 각각 독립적으로 중성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 x1 내지 x3는 각각 독립적으로 아스파라긴(asparagine; N), 아스파트산(aspartic acid; D), 세린(serine; S), 티로신(tyrosine; Y), 아르기닌(arginine; R), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 류신(leucine, L), 발린(valine, V), 트레오닌(threonine, T), 알라닌(alanine; A), 글루타민(glutamine; Q), 글루탐산(glutamic acid; E) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 x1은 아스파라긴(asparagine; N), 페닐알라닌(phenylalanine; F), 아스파트산(aspartic acid; D), 라이신(lysine, K), 히스티딘(histidine; H), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine; R) 및 트레오닌(threonine, T)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고,
    상기 x2는 세린(serine; S), 글루타민(glutamine; Q), 알라닌(alanine; A), 아스파라긴(asparagine; N), 글루탐산(glutamic acid; E), 아스파트산(aspartic acid; D), 페닐알라닌(phenylalanine; F) 및 글리신(glycine; G)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이며,
    상기 x3는 티로신(tyrosine; Y), 히스티딘(histidine; H), 글리신(glycine; G), 아르기닌(arginine; R), 아스파라긴(asparagine; N), 류신(leucine, L), 라이신(lysine, K) 및 페닐알라닌(phenylalanine; F)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산인, 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 에피토프는 10 내지 20 mer으로 이루어지는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는, 상기 에피토프의 N-터미널로부터 3 내지 6 번째에 위치하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열번호 4 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서,
    하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프:
    [식 1]
    Lx1Lx2x3N
    상기 식 1에서,
    x1 내지 x3는 각각 독립적으로 중성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 방향족 아미노산이다.
  9. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서,
    서열번호 18 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는, 에피토프.
  10. 제9항의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자.
  11. 제10항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  15. 제7항의 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체.
  18. 제7항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  20. 제7항의 항체 또는 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
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