WO2023277361A1 - 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도 - Google Patents

메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023277361A1
WO2023277361A1 PCT/KR2022/007656 KR2022007656W WO2023277361A1 WO 2023277361 A1 WO2023277361 A1 WO 2023277361A1 KR 2022007656 W KR2022007656 W KR 2022007656W WO 2023277361 A1 WO2023277361 A1 WO 2023277361A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acids
represented
region represented
chain variable
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/007656
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김승구
김기태
Original Assignee
(주)이노베이션바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)이노베이션바이오 filed Critical (주)이노베이션바이오
Publication of WO2023277361A1 publication Critical patent/WO2023277361A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a mesothelin-specific antibody and its use, and more particularly, to an antibody that specifically binds to mesothelin, a chimeric antigen receptor comprising the antibody, and a CAR-expressing chimeric antigen receptor. It relates to T cells, and a pharmaceutical composition for preventing or treating mesothelin-expressing cancer or tumors containing them.
  • MSLN Mesothelin
  • Mesothelin is a 69-71 kDa precursor polypeptide that is a glycoprotein and is expressed on the cell surface to help cells adhere to each other and transmit signals. Although low expression is seen in general tissues, overexpression has been confirmed in various types of solid cancers including Mesothelioma, Pancreatic cancer, and Ovarian cancer, and anticancer target studies targeting these mesothelins are in progress. .
  • Antibody-based targeting therapies for mesothelin-expressing lung cancer, ovarian cancer and pancreatic cancer are being developed (Korean Patent Publication No. 10-2017-0036503; Chang, K, et al. , Int J Cancer , 50(3 ):373, 1992), in particular, studies on chimeric antigen receptors and CAR-T cells using mesothelin-specific antibodies are being actively conducted (Republic of Korea Patent No. 10-2070016; Zhiwei Zhang et al. , Cell Death & Disease , 10:479, 2019).
  • antibodies that bind to mesothelin are screened to establish seven novel antibodies (3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11) It was confirmed that the 7 types of antibodies selected in the present invention specifically bind to the mesothelin antigen.
  • a mesothelin-targeting chimeric antigen receptor and CAR-T cells were prepared using the mesothelin-specific antibody of the present invention, and it was confirmed that MSLN-CAR-T cells effectively kill mesothelin-overexpressing cells, completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide an antibody that specifically binds to mesothelin.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody, a vector expressing the antibody, and a recombinant cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is a chimeric antigen receptor comprising an antibody specifically binding to mesothelin, a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor, a vector comprising the same, and a chimeric antigen receptor comprising the polynucleotide or the vector. It is to provide immune effector cells that express.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumors containing immune effector cells expressing an antibody that specifically binds to the mesothelin or a chimeric antigen receptor containing the antibody.
  • the present invention provides (1) a heavy chain variable region comprising a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 3 and amino acids of SEQ ID NO: 4
  • a light chain variable region comprising a CDR1 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 5, a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 5, and a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 6;
  • a CDR1 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 41 a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 42, and a heavy chain variable region including a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 represented by amino acids a light chain variable region comprising a CDR1 region, a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 45, and a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 46;
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 51 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 52, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 represented by amino acids a light chain variable region comprising a CDR1 region, a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 55, and a CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 56;
  • An antibody or fragment thereof that specifically binds to mesothelin composed of a light chain variable region including a CDR1 region, a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 65, and a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 66 is provided. .
  • the antibody may be a monoclonal antibody, preferably scFv (Single-chain variable fragment).
  • the (1) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 8,
  • the (2) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 18,
  • the (3) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 27 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 28,
  • the (4) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 37 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 38,
  • the (5) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 47 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 48;
  • the (6) antibody comprises a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 57 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 58,
  • the antibody (7) may be composed of a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 67 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 68.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding an antibody specifically binding to the mesothelin.
  • the present invention provides a vector comprising a polynucleotide encoding an antibody that specifically binds to the mesothelin.
  • the present invention provides a recombinant cell that produces an antibody or fragment thereof that specifically binds to mesothelin transformed with the vector.
  • the present invention is a mesothelin-binding domain; transmembrane domain; costimulatory domain; And a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an intracellular signal transduction domain,
  • the mesothelin-binding domain may be selected from the mesothelin-specific antibodies or fragments thereof of the present invention.
  • the transmembrane domain may be derived from a protein selected from the group consisting of CD8 ⁇ , CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.
  • the costimulatory domain may be derived from a protein selected from the group consisting of CD28, 4-1BB, OX-40 and ICOS, and the signaling domain may be derived from CD3 ⁇ .
  • it may further include a hinge region located between the C terminus of the mesothelin-binding domain and the N terminus of the transmembrane domain, wherein the hinge region is It may be from CD8 ⁇ .
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the vector may be a plasmid, retroviral vector or lentiviral vector.
  • the present invention provides an immune effector cell comprising a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor (CAR) or a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor (CAR) and expressing the chimeric antigen receptor (CAR). do.
  • the immune effector cells may be T cells.
  • the present invention is an immune effector cell expressing a chimeric antigen receptor targeting mesothelin;
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumors comprising an antibody or fragment thereof that specifically binds to mesothelin is provided.
  • the cancer or tumor may be a cancer or tumor in which mesothelin is overexpressed compared to normal cells.
  • the cancer or tumor is squamous cell cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, mesothelial cancer, peritoneal cancer, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioma, cervical cancer , ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatocellular cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, leukemia and other lymphoproliferative disorders , and various types of head and neck cancer.
  • 7 novel antibodies (3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11) were established by screening antibodies that bind more specifically to mesothelin, and the novel antibodies are mesothelin and specific binding was confirmed.
  • the mesothelin-targeted chimeric antigen receptor (CAR) and CAR-T cells prepared using the above-established antibody effectively recognized mesothelin and activated the CAR-T cells. Since it was confirmed that the overexpressing cells are effectively killed, the mesothelin-specific antibody of the present invention and the chimeric antigen receptor and CAR-T cells prepared using the same can be applied to the prevention or treatment of cancer or tumors in which mesothelin is overexpressed.
  • 1 is data confirming the binding ability of the 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11 antibodies selected in the present invention to mesothelin-overexpressing mesothelioma cells (NCI-H2052) by flow cytometry.
  • MSLN-CAR chimeric antigen receptor
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method for preparing cells expressing MSLN-CAR using a lentivirus expressing MSLN-CAR.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing (A) a method for transfecting a HEK293 cell line with a lentivirus expressing MSLN-CAR, and (B) a method for confirming the binding ability of the transformed HEK293 cells to mesothelin peptides.
  • 5a and 5b are data confirming the level of MSLN-CAR expression in HEK293FT cells transfected with lentivirus expressing MSLN-CAR.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a method for preparing MSLN-CART cells using a lentivirus expressing MSLN-CAR.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing (A) a method for preparing MSLN-CART cells using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and (B) a method for confirming the binding ability of the prepared MSLN-CART cells to mesothelin peptides.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 8a to 8d are data confirming the mesothelin peptide binding ability of MSLN-CAR-T cells prepared using 3A8, 4G11, 6G5 and 7C3 antibodies, respectively.
  • 9a to 9d show the degree of IFN ⁇ expression by MSLN-CAR-T cells in the presence of target cells in order to confirm the activation of MSLN-CAR-T cells prepared using 3A8, 4G11, 6G5 and 7C3 antibodies, respectively. This is verified data.
  • the present invention is an antibody or fragment thereof that specifically binds to mesothelin,
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 1 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 3 and amino acids represented by SEQ ID NO: 4
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 31 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 32, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 33 and amino acids represented by SEQ ID NO: 34
  • a CDR1 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 41 a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 42, and a heavy chain variable region including a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 represented by amino acids
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 51 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 52, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 represented by amino acids
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 61 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 62, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 represented by amino acids It relates to an antibody or fragment thereof that specifically binds to mesothelin, including a light chain variable region including a CDR1 region, a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 65, and a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 66.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the term "monoclonal antibody” is also called a monoclonal antibody or a monoclonal antibody, and is an antibody produced by a single antibody-forming cell, characterized by a uniform primary structure (amino acid sequence). Recognizes only one antigenic determinant, and is generally produced by culturing a hybridoma cell in which cancer cells and antibody-producing cells are fused. can also produce
  • the antibody may be used by humanizing the rest of the antibody except for the CDR portion, if necessary.
  • CDR complementary metal-oxide-semiconductor determining region
  • antibody can be used not only in its complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, but also fragments of antibody molecules.
  • a fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least a peptide tag (epitope) binding function, and includes scFv, Fab, F(ab'), F(ab') 2 , single domain, and the like.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' is different from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • the F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv is the smallest antibody fragment that has only the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • the double-chain Fv has the heavy chain variable region and the light chain variable region connected by a disulfide bond, and the single-chain Fv (scFv) is generally a peptide linker
  • the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain are covalently linked via.
  • the monoclonal antibody specifically binding to mesothelin of the present invention can be prepared using all or a partial peptide of mesothelin protein as an immunogen (or antigen). More specifically, first, a fusion protein containing mesothelin protein or a carrier containing mesothelin protein as an immunogen is combined with an adjuvant, an immune enhancer, as needed, subcutaneously or muscle of mammals other than humans. , immunization is performed by intravenous, balboloxal, or intraperitoneal injection one or more times.
  • Mammals other than humans are preferably mice, rats, hamsters, marmots, chickens, rabbits, cats, dogs, pigs, goats, sheep, donkeys, horses or cows (transgenic mice that produce human antibodies). (including transgenic animals engineered to produce antibodies derived from other animals such as), more preferably mice, rats, hamsters, marmots, chickens or rabbits.
  • 1 to 4 immunizations are performed about every 1 to 21 days from the first immunization, and about 1 to 10 days after the final immunization, antibody-producing cells can be obtained from immunosensitized mammals. The number of immunizations and time intervals can be appropriately changed depending on the characteristics of the immunogen to be used.
  • Preparation of a hybridoma secreting a monoclonal antibody can be performed according to the method of Keira and Mirstein et al. (Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) and a method similar thereto. Any one selected from the group consisting of spleen, lymph node, bone marrow, or tonsil collected from animals other than humans immunosensitized as described above, preferably derived from a mammal that does not have the ability to produce an antibody and an antibody-producing cell contained in the spleen.
  • a hybridoma can be prepared by cell fusion of myeloma cells.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus or a method using an electric pulse is used.
  • a fusion medium containing a fusion promoter antibody-producing cells and mammalian-derived cells capable of immortal growth are used. is suspended at a ratio of about 1:1 to 1:10, and incubated in this state at about 30 to 40°C for about 1 to 5 minutes.
  • the fusion medium for example, MEM medium, RPMI1640 medium, and Iscove's Modified Dulbecco's Medium may be used, and serum types such as bovine serum are preferably excluded.
  • the method for screening hybridoma clones producing the monoclonal antibody is, first, transfer the fused cells obtained as described above to a selection medium such as HAT medium, and incubate at about 30 to 40 ° C. for about 3 days to 3 weeks Cells other than hybridomas are killed. Subsequently, after culturing the hybridomas in a microtiter plate, etc., the part with increased reactivity between the immunogen used for the immune response of animals other than humans described above and the culture supernatant was prepared as RIA (radioactive substance-marked immunoassay). antibody) or an immunoassay method such as ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). In addition, the clone producing the monoclonal antibody found above shows specific binding ability to the immunogen.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing such a hybridoma in vitro or in vivo.
  • a conventional method for culturing mammalian cells is used, and for collecting a monoclonal antibody from a culture or the like, a conventional method in this field for purifying an antibody in general is used.
  • a conventional method in this field for purifying an antibody in general is used.
  • each method for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, centrifugation, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-speed liquid chromatography, gel electrophoresis and isoelectric point electrophoresis. These are applied in combination as needed.
  • the purified monoclonal antibody is then concentrated and dried to be in a liquid or solid state depending on the application.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes DNA encoding heavy chain and light chain variable regions, respectively, and known DNA encoding heavy and light chain constant regions (eg, Japan 2007-252372 (Refer to Publication No.) and each ligated gene are synthesized by the PCR method or chemical synthesis, and transplanted into a known expression vector (pcDNA 3.1 (sold by Invitrogen)) or the like that enables the expression of the gene to obtain a transformant. It can be obtained by preparing and expressing in a host such as CHO cells or Escherichia coli to produce an antibody, and purifying the antibody from this culture solution using a Protein A or G column or the like.
  • pcDNA 3.1 sold by Invitrogen
  • a hybridoma producing a mesothelin protein is prepared and screened to obtain an antibody (scFv) that specifically binds to mesothelin. Seven species were selected, and they were named 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11, respectively.
  • the 3A8 antibody includes a CDR1 region (GYSFTGYT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region (INPYNGGT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region (ARVGGSSWYFDV) represented by amino acids of SEQ ID NO: 3.
  • a heavy chain variable region and a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 4
  • a CDR2 region WAS
  • QQGNTLPWT CDR3 region
  • the 3A8 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 8, wherein the heavy chain variable region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region is It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 was encoded.
  • the 4G11 antibody includes a CDR1 region (GYSFTGYY) represented by amino acids of SEQ ID NO: 11, a CDR2 region (ISCYNGAT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 12, and a CDR3 region (ARWDRDWFAY) represented by amino acids of SEQ ID NO: 13
  • a CDR2 region (WAS) represented by amino acids of SEQ ID NO: 15
  • a CDR3 region QQYSSYPFT
  • the 4G11 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 17 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 18, wherein the heavy chain variable region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, and the light chain variable region is It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 was encoded.
  • the 5A9 antibody includes a CDR1 region (GFSITSSSYC) represented by amino acids of SEQ ID NO: 21, a CDR2 region (ICYEGSI) represented by amino acids of SEQ ID NO: 22, and a CDR3 region (SRENRLLKDAMDY) represented by amino acids of SEQ ID NO: 23.
  • a heavy chain variable region and a CDR1 region QSLLSSRTRKNY
  • a CDR2 region WAS
  • KQSYNLRT CDR3 region
  • the 5A9 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 27 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 28, wherein the heavy chain variable region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29, and the light chain variable region is It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 was encoded.
  • the 6G5 antibody includes a CDR1 region (GYSFTGYT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 31, a CDR2 region (INPYNGGT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 32, and a CDR3 region (ARVGGSSWYFDV) represented by amino acids of SEQ ID NO: 33.
  • the 6G5 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 37 and a light chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 38, the heavy chain variable region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, and the light chain variable region It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40 was encoded.
  • the 7C3 antibody includes a CDR1 region (GYTFSAYW) represented by amino acids of SEQ ID NO: 41, a CDR2 region (ILPGSGST) represented by amino acids of SEQ ID NO: 42, and a CDR3 region (ARGDYYAMDY) represented by amino acids of SEQ ID NO: 43.
  • the 7C3 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 47 and a light chain variable region represented by amino acids of SEQ ID NO: 48, wherein the heavy chain variable region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49, and the light chain variable region is It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 was encoded.
  • the 9E8 antibody includes a CDR1 region (GYSFTGYT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 51, a CDR2 region (INPYNGGT) represented by amino acids of SEQ ID NO: 52, and a CDR3 region (ARVGGSSWYFDV) represented by amino acids of SEQ ID NO: 53.
  • a heavy chain variable region and a CDR1 region QSLLYSSNQKNY
  • a CDR2 region WAS
  • QQYYSYPTWT CDR3 region
  • the 9E8 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 57 and a light chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 58, the heavy chain variable region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59, and the light chain variable region It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60 was encoded.
  • the 9E11 antibody includes a CDR1 region (GYSITSDYA) represented by amino acids of SEQ ID NO: 61, a CDR2 region (ISYSGST) represented by amino acids of SEQ ID NO: 62, and a CDR3 region (ARGAAGFAY) represented by amino acids of SEQ ID NO: 63.
  • the 9E11 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 67 and a light chain variable region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 68, the heavy chain variable region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69, and the light chain variable region It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 70 was encoded.
  • the mesothelin-specific antibody of the present invention is preferably a scFv (single chain variable fragment), which can be prepared through genetic recombination technology so that the heavy chain variable region and the light chain variable region can be connected by a linker.
  • the linker may preferably be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72, but is not limited thereto.
  • the 3A8 antibody When linked by light chain variable region-linker-heavy chain variable region, the 3A8 antibody has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73 or the base sequence of SEQ ID NO: 74, the 4G11 antibody has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75 or the base sequence of SEQ ID NO: 76, the 5A9 antibody is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 78, the 6G5 antibody is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 80, and the 7C3 antibody is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 82 As such, the 9E8 antibody may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84, and the 9E11 antibody may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85 or the nucleo
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding an antibody that specifically binds to the mesothelin.
  • polynucleotide generally refers to nucleic acid molecules, deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof, isolated of any length.
  • the polynucleotides of the invention can be used for (1) in-vitro amplification, such as polymerase chain reaction (PCR) amplification; (2) cloning and recombination; (3) purification such as digestion and gel electrophoretic separation; (4) It can be produced through synthesis such as chemical synthesis, and preferably the isolated polynucleotide is produced by recombinant DNA technology.
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acids for encoding antibodies or antigen-binding fragments thereof are prepared by various methods known in the art, including but not limited to, restriction fragment operation of synthetic oligonucleotides or application of SOE PCR. can be manufactured.
  • the present invention relates to a vector comprising a polynucleotide encoding an antibody that specifically binds to mesothelin, and a recombinant cell transformed with the vector.
  • the term "expression vector” is a gene product containing essential regulatory elements such as a promoter so that a target gene can be expressed in an appropriate host cell.
  • Vectors may be selected from one or more of plasmids, retroviral vectors and lentiviral vectors. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome or, in some cases, can integrate into the genome itself.
  • vectors may contain expression control elements that allow for correct expression of the coding region in a suitable host.
  • regulatory elements are well known to those skilled in the art and include, for example, promoters, ribosome-binding sites, enhancers and other regulatory elements for regulating gene transcription or mRNA translation. can do.
  • the specific structure of the expression control sequence may vary depending on the function of the species or cell type, but generally includes 5' ratios that participate in transcription initiation and translation initiation, such as TATA boxes, capped sequences, CAAT sequences, etc., respectively. -contains a transcribed sequence, and a 5' or 3' non-translated sequence.
  • a 5' non-transcribed expression control sequence can include a promoter region that can include promoter sequences for transcribing and regulating functionally linked nucleic acids.
  • promoter refers to a minimal sequence sufficient to direct transcription.
  • promoter constructs sufficient to allow expression of a regulatable promoter dependent gene induced by cell type specific or external signals or agents may be included, and such constructs may be located on the 5' or 3' portion of the gene. . Both conserved promoters and inducible promoters are included. Promoter sequences may be of prokaryotic, eukaryotic or viral origin.
  • the term "transformant” refers to a cell transformed by introducing a vector having a polynucleotide encoding one or more target proteins into a host cell, and preparing a transformant by introducing an expression vector into a host cell.
  • the calcium phosphate method or the calcium chloride/rubidium chloride method described in the literature (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989) , electroporation, electroinjection, chemical treatment methods such as PEG, methods using a gene gun, and the like.
  • antibody protein When the transformant expressing the vector is cultured in a nutrient medium, antibody protein can be produced and isolated in large quantities.
  • Media and culture conditions can be appropriately selected and used according to the host cell. Conditions such as temperature, medium pH, and incubation time should be appropriately adjusted so as to be suitable for cell growth and mass production of proteins during culture.
  • the vector according to the present invention can be transformed into a host cell, preferably a mammalian cell, for antibody production.
  • Suitable host cells capable of expressing fully glycosylated proteins include COS-1 (eg ATCC CRL 1650), COS-7 (eg ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (eg ATCC CRL-10), CHO (eg ATCC CRL 1610) and BSC-1 (eg ATCC CRL-26) cell lines, Cos-7 cells, CHO cells, hep G2 cells, P3X63Ag8.653, SP2/0 -Agl4, 293 cells, HeLa cells, etc., and these cells are readily available, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC, USA).
  • COS-1 eg ATCC CRL 1650
  • COS-7 eg ATCC CRL-1651
  • HEK293, BHK21 eg ATCC CRL-10
  • CHO eg ATCC CRL 1610
  • BSC-1 eg
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the mesothelin-binding domain includes (1) a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 3, a heavy chain variable region and a sequence
  • An antibody that specifically binds to mesothelin comprising a light chain variable region comprising a CDR1 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 4, a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 5, and a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 6, or a fragment thereof;
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 31 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 32, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 33 and amino acids represented by SEQ ID NO: 34
  • a CDR1 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 41 a CDR2 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 42, and a heavy chain variable region including a CDR3 region represented by amino acids of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 represented by amino acids
  • a CDR1 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 51 a CDR2 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 52, and a heavy chain variable region including the CDR3 region represented by the amino acids of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 represented by amino acids
  • chimeric antigen receptor generally refers to a fusion protein containing an antigen and an extracellular domain that has the ability to bind one or more intracellular domains.
  • a CAR is a key part of a chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) and can include an antigen (eg, mesothelin) binding domain, a transmembrane domain, a co-stimulatory domain and an intracellular signaling domain.
  • a CAR can be combined with a T cell receptor-activating intracellular domain based on the antibody's antigenic specificity. Genetically modified CAR-expressing T cells can specifically identify and eliminate target antigen-expressing malignant cells.
  • the term "mesothelin-binding domain” generally refers to a domain capable of specifically binding to a mesothelin protein.
  • the mesothelin-binding domain may contain an anti-mesothelin antibody or fragment thereof capable of specifically binding to a mesothelin polypeptide or fragment thereof overexpressed in cancer or tumor cells.
  • binding domain includes “extracellular domain”, “extracellular binding domain”, “antigen-specific binding domain” and “Extracellular antigen-specific binding domain” may be used interchangeably and refers to a CAR domain or fragment having the ability to specifically bind to a target antigen (eg, mesothelin). refers to
  • the anti-mesothelin antibody or fragment thereof is the aforementioned anti-mesothelin antibody, which is a monoclonal antibody, preferably a single chain variable fragment (scFv).
  • scFv single chain variable fragment
  • it can be prepared using the mesothelin-specific 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11 antibodies of the present invention, preferably using the 3A8, 4G11, 5A9, 6G5 and 7C3 antibodies in the present invention did
  • a signal peptide may be further included at the N-terminus of the mesothelin-binding domain, and the "signal peptide” generally refers to a peptide chain for guiding protein transmission do.
  • the signal peptide may be a short peptide having a length of 5 to 30 amino acids, and may be preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.
  • it may further include a hinge region located between the C-terminus of the mesothelin-binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain, and the hinge region is derived from CD8 ⁇ , preferably sequence It can be represented by the amino acid sequence of number 95.
  • the "hinge region” generally refers to the junction region between an antigen-binding region and an immune cell Fc receptor (FcR)-binding region.
  • transmembrane domain generally refers to a domain of a CAR that passes through a cell membrane and is connected to an intracellular signaling domain to play a role in signal transduction.
  • the transmembrane domain may be derived from a protein selected from the group consisting of CD8 ⁇ , CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1, and may preferably be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96.
  • costimulatory domain generally refers to an intracellular domain capable of providing immune stimulatory molecules, which are cell surface molecules required for effective response of lymphocytes to antigens.
  • the costimulatory domain described above may include a costimulatory domain of CD28, and may include a costimulatory domain of the TNF receptor family, such as the costimulatory domains of OX40 and 4-1BB, preferably SEQ ID NO: It may be 4-1BB represented by the amino acid sequence of 97.
  • intracellular signal transduction domain generally refers to a domain located inside a cell and capable of transmitting a signal.
  • the intracellular signaling domain is an intracellular signaling domain of a chimeric antigen receptor.
  • the intracellular signaling domain can be selected from CD3 ⁇ intracellular domain, CD28 intracellular domain, CD28 intracellular domain, 4-1BB intracellular domain and OX40 intracellular domain, preferably amino acids of SEQ ID NO: 98 It may be CD3 ⁇ represented by the sequence.
  • the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor (MSLN-CAR) of the present invention can be prepared as shown in the schematic diagram shown in FIG.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor (MSLN-CAR).
  • the polynucleotide encoding the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor is a polynucleotide encoding a mesothelin-binding domain; polynucleotides encoding transmembrane domains; polynucleotides encoding co-stimulatory domains; And it may include a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain.
  • the polynucleotide encoding the mesothelin-binding domain is a polynucleotide encoding the mesothelin-specific 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11 antibodies, preferably 3A8, 4G11, 6G5 and 7C3 antibodies of the present invention. It may be, in the form of an scFv in which the light chain variable region and the heavy chain variable region are linked by a linker, and the specific base sequence is as described above.
  • transmembrane domain represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 90;
  • 4-1BB (co-stimulatory domain) represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 91;
  • CD3 ⁇ intracellular signaling domain
  • a polynucleotide encoding a hinge region may be further included, preferably a CD8 hinge region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 89 can be
  • the present invention relates to a vector comprising a polynucleotide encoding the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor (MSLN-CAR).
  • MSLN-CAR mesothelin-targeting chimeric antigen receptor
  • the vector is a recombinant viral vector, preferably a lentiviral vector, comprising an operably linked EF1 ⁇ promoter; polynucleotides encoding signal peptides; a polynucleotide encoding a mesothelin-binding domain; polynucleotides encoding transmembrane domains; It includes a polynucleotide encoding an intracellular signaling domain, and may further include a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) to increase protein expression (FIG. 3).
  • WPRE woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element
  • the EF1 ⁇ promoter may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87, and if necessary, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87 , or sequences that are at least 99% identical.
  • the promoter is operably linked to drive expression of a mesothelin-binding domain, an anti-mesothelin antibody (scFv).
  • scFv an anti-mesothelin antibody
  • Biological methods for introducing polynucleotides into host cells include the use of DNA and RNA vectors.
  • Viral vectors, and particularly retroviral vectors are the most widely used method for inserting genes into mammalian, eg human, cells.
  • Other viral vectors may be derived from lentiviruses, poxviruses, herpes simplex viruses, adenoviruses and adeno-associated viruses, and the like.
  • Chemical means for introducing polynucleotides into host cells include colloidal dispersion systems such as macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes.
  • colloidal dispersion systems such as macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes.
  • Exemplary colloidal systems for use as delivery vehicles in vitro and in vivo are liposomes (eg, artificial membrane vesicles).
  • Other methods are available for state-of-the-art targeted delivery of nucleic acids, eg, delivery of polynucleotides using targeted nanoparticles or other suitable sub-micrometer sized delivery systems.
  • an exemplary delivery vehicle is a liposome.
  • lipid formulations is contemplated for the introduction (in vitro, ex vivo or in vivo) of nucleic acids into host cells.
  • a nucleic acid can be associated with a lipid.
  • Nucleic acids associated with lipids may be encapsulated in the aqueous interior of liposomes, interspersed within the lipid bilayer of liposomes, attached to liposomes via linking molecules associated with both liposomes and oligonucleotides, entrapped within liposomes, complexed with liposomes, or , dispersed in a lipid-containing solution, mixed with a lipid, combined with a lipid, contained as a suspension in a lipid, contained or complexed with a micelle, or otherwise associated with a lipid.
  • the lipid, lipid/DNA or lipid/expression vector associated composition is not limited to any particular structure in solution.
  • the present invention provides a vector comprising a polynucleotide encoding the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor (MSLN-CAR) or a polynucleotide encoding the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor. Including, it relates to an immune effector cell expressing a chimeric antigen receptor targeting the mesothelin.
  • MSLN-CAR mesothelin-targeting chimeric antigen receptor
  • the immune effector cells may be mammalian-derived cells, preferably T cells, B cells, natural killer (NK) cells, dendritic cells, bone marrow cells, monocytes, or macrophages, more preferably may be a T cell.
  • mammalian-derived cells preferably T cells, B cells, natural killer (NK) cells, dendritic cells, bone marrow cells, monocytes, or macrophages, more preferably may be a T cell.
  • immune effector cells expressing the MSLN-CAR can be prepared by introducing the MSLN-CAR expression vector of the present invention into immune effector cells, for example, T cells or NK cells.
  • the MSLN-CAR expression vector may be introduced into cells by methods known in the art, such as electroporation and lipofectamine (lipofectamine 2000, Invitrogen).
  • immune effector cells can be transfected with a lentiviral vector to integrate the viral genome carrying the CAR molecule into the host genome, ensuring long-term and stable expression of the target gene.
  • a transposon can be used to introduce a CAR carrier plasmid (transposon) and a transposase carrier plasmid into a target cell.
  • CAR molecules can be added to the genome by gene editing methods (such as CRISPRCas9).
  • a lentiviral vector into which a polynucleotide encoding MSLN-CAR was inserted was prepared, and the prepared vector was transformed into T cells to obtain MSLN-CAR-T Cells were prepared (FIGS. 6 and 7).
  • the prepared MSLN-CAR-T cells express the mesothelin-targeting chimeric antigen receptor of the present invention.
  • Immune effector cells for production of immune effector cells expressing a chimeric antigen receptor (CAR) can be obtained from a subject, wherein the "subject” is a living organism (eg, mammal) capable of eliciting an immune response. includes Examples of subjects include humans, dogs, cats, mice, rats, and transgenic species thereof.
  • T cells can be obtained from a number of sources, including peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, lymph node tissue, umbilical cord blood, thymus tissue, tissue from sites of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors.
  • the T cells can be obtained from a unit of blood collected from a subject using any of a number of techniques known to those skilled in the art, such as FicollTM separation.
  • Cells from blood are obtained by apheresis, and the apheresis product typically contains T cells, monocytes, granulocytes, lymphocytes including B cells, other nucleated leukocytes, red blood cells, and platelets.
  • T cells are isolated from peripheral blood lymphocytes by lysing red blood cells and depleting monocytes, eg, by centrifugation over a PERCOLLTM gradient or by countercurrent centrifugation.
  • MSLN-CAR lentivirus is applied to T cells. was transduced to prepare MSLN-CAR-T cells, and specifically, MSLN-CAR-T cells were prepared using 3A8, 4G11, 6G5 and 7C3 antibodies, respectively.
  • the level of IFN ⁇ expression by MSLN-CAR-T cells in the presence of target cells was confirmed.
  • FIGS. 9A to 9D while T cells were not activated in H28 cells that did not express mesothelin, in the presence of H2052 cells that overexpress mesothelin, T cells were activated and IFN ⁇ expression increased. confirmed that
  • MSLN-CAR-T cells are specific for H2052 cells overexpressing mesothelin. It was confirmed that it exhibited an effective killing effect.
  • the antibody selected in the present invention specifically recognized mesothelin-overexpressing cancer or tumor cells, it effectively induces cytotoxicity or death by immune cells/macrophages by suppressing immune evasion of mesothelin-overexpressing cancer or tumor cells. can do. Furthermore, since it was confirmed that the MSLN-CAR-T cells prepared in the present invention showed mesothelin-overexpressing cell-specific killing effects, the anti-mesothelin antibody of the present invention and CAR-T cells using the same were used to treat diseases related to mesothelin overexpression. , In particular, it can be usefully utilized as a composition for preventing or treating cancer or tumor.
  • composition for preventing or treating diseases mediated by mesothelin overexpression Composition for preventing or treating diseases mediated by mesothelin overexpression
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or tumors, comprising an immune effector cell expressing an antibody that specifically binds to mesothelin or a chimeric antigen receptor that targets mesothelin. .
  • the cancer or tumor is a cancer or tumor in which mesothelin is overexpressed compared to a normal control group or normal cells, specifically, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung , mesothelial cancer, peritoneal cancer, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatocellular cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, leukemia and other lymphoproliferative disorders, and various types of head and neck cancer.
  • squamous cell carcinoma small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung , meso
  • the composition may further include a therapeutic agent for mesothelin-overexpressing cancer or tumor, wherein the therapeutic agent is covalently bound to the heavy chain and/or light chain of an antibody that specifically binds to mesothelin, or , Can be administered in combination with the mesothelin-specific antibody or MSLN-CAR-T cells of the present invention
  • the therapeutic agent may be an anticancer agent.
  • Anti-cancer agents reduce the proliferation of cancer cells and include non-peptidic (i.e., non-proteinaceous) compounds, including cytotoxic agents and cytostatic agents.
  • Non-limiting examples of anticancer agents include alkylating agents, nitrosoureas, antimetabolites, antitumor antibiotics, plant (vinca) alkaloids and steroid hormones. Peptidic compounds may also be used.
  • the immune effector cell expressing an antibody specifically binding to mesothelin or a chimeric antigen receptor targeting mesothelin may be the only active ingredient in the therapeutic or diagnostic composition, or, for example, anti-T cell , other antibody components such as anti-IFN ⁇ or anti-LPS antibodies, or other active ingredients including non-antibody components such as xanthines.
  • the pharmaceutical composition preferably comprises a therapeutically effective amount of an antibody of the present invention.
  • therapeutically effective amount means the amount of a therapeutic agent required to treat, ameliorate, or prevent the target disease or condition, or to produce an appreciable therapeutic or prophylactic effect.
  • the therapeutically effective dose can be determined initially by cell culture assays or animal models, usually rodents, rabbits, dogs, pigs or primates. Animal models can also be used to determine appropriate concentration ranges and routes of administration. This information can be used to determine useful dosages and routes for human administration.
  • an effective dosage is 0.01 to 50 mg/kg, preferably 0.1 to 20 mg/kg, more preferably about 15 mg/kg.
  • Compositions may be administered to a patient individually or in combination with other agents, drugs or hormones.
  • the dosage at which an antibody of the invention is administered depends on the nature of the condition being treated, the grade of the malignant lymphoma or leukemia, and whether the antibody is being used to prevent disease or to treat an existing condition.
  • the frequency of administration depends on the half-life of the antibody molecule and the persistence of the drug effect. If the antibody molecule has a short half-life (eg, 2 to 10 hours), it may be necessary to give one or more doses per day. Alternatively, if the antibody molecule has a long half-life (eg, 2 to 15 days), it may be necessary to give a dose once a day, once a week, or once every 1 or 2 months.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier for administration of the antibody.
  • the carrier must not itself induce the production of antibodies harmful to the subject to which the composition is administered, and must be non-toxic.
  • Suitable carriers can be slowly metabolized macromolecules such as proteins, polypeptides, liposomes, polysaccharides, polylactic acid, polyglycolic acid, amino acid polymers, amino acid copolymers and inactive viral particles.
  • salts are, for example, mineral acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate and sulfate, or acetic acid, propionic acid. Salts of organic acids such as malonic acid and benzoic acid may be used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers in therapeutic compositions may additionally include liquids such as water, saline, glycerol and ethanol. Additionally, auxiliary substances such as wetting agents, emulsifying agents or pH buffering substances may be present in such compositions.
  • the carrier may be formulated as tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries and suspensions for ingestion of the pharmaceutical composition by a patient.
  • Preferred forms for administration include forms suitable for parenteral administration, eg by injection or infusion (eg bolus injection or continuous infusion).
  • parenteral administration eg by injection or infusion (eg bolus injection or continuous infusion).
  • the product may take the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous vehicle, which may contain such prescriptive agents as suspending agents, preservatives, stabilizing and/or dispersing agents.
  • the antibody molecule may be in anhydrous form and reconstituted with an appropriate sterile solution prior to use.
  • compositions of the present invention can be administered directly to a patient.
  • the patients to be treated may be animals. However, it is preferred that the compositions are tailored for administration to human patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, transcutaneous (see eg WO 98/20734), subcutaneous, It may be administered by any route including intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, intravaginal or rectal routes.
  • a hypospray may be used to administer the pharmaceutical composition of the present invention.
  • therapeutic compositions may be prepared as injectables, either as liquid solutions or suspensions.
  • solid forms suitable for solution or suspension in liquid excipients may be prepared prior to injection.
  • Direct delivery of the composition may generally be by injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, or may be delivered into the interstitial space of a tissue.
  • the composition may be administered to a wound site. Dosage treatment can be a single dose schedule or a multiple dose schedule.
  • the active ingredient in the composition may be an antibody molecule. As such, it can be susceptible to degradation within the gastrointestinal tract. Thus, if the composition is administered by a route using the gastrointestinal tract, the composition will need to contain an agent that protects the antibody from degradation but releases the antibody once absorbed from the gastrointestinal tract.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing or monitoring mesothelin-overexpressing cancer or tumor, comprising an antibody that specifically binds to mesothelin.
  • the mesothelin overexpressing cancer or tumor is a cancer or tumor in which mesothelin is overexpressed compared to a normal control group or normal cells, specifically, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, medium skin cancer, peritoneal cancer, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatocellular cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, leukemia and other lymphoproliferative disorders, and various types of head and neck cancer.
  • squamous cell carcinoma small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, medium
  • Antibodies specifically binding to the mesothelin may be directly or indirectly labeled.
  • An indirect label includes a secondary antibody comprising a detectable label, wherein the secondary antibody binds to an antibody that specifically binds mesothelin.
  • Other indirect labels include biotin, wherein antibodies that specifically bind to biotinylated mesothelin can be detected using avidin or streptavidin containing a detectable label.
  • Suitable detectable labels include any composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means.
  • Suitable labels include, but are not limited to, magnetic beads, fluorescent dyes (eg, fluorescein isothiocyanate, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein, yellow fluorescent protein, etc.), radioactive labels (eg, 3 H, 125 I, 35 S, 14 C or 32 P), enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)) commonly used ones) and colorimetric labels such as colloidal gold or colored glass or plastic (eg polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads.
  • fluorescent dyes eg, fluorescein isothiocyanate, Texas red, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein, yellow fluorescent protein, etc.
  • radioactive labels eg, 3 H
  • the antibody may be labeled with a fluorescent protein, and may contain a contrast agent or radioactive isotope.
  • the antibody specifically binding to mesothelin of the present invention is used in a diagnostic kit
  • the antibody is immobilized on a support
  • the support may be a microplate, microarray, chip, glass, bead or particle, or membrane.
  • Example 1 Production and screening of antibodies that specifically bind to mesothelin
  • a hybridoma producing an antibody that binds to mesothelin was prepared and the antibody was selected.
  • splenocytes were extracted by immunization with mesothelin protein (Acrobiosystems, cat# MSN-H5223), and hybridoma cells were prepared through cell fusion with mouse myeloma cells.
  • mesothelin protein Acrobiosystems, cat# MSN-H5223
  • HGPRT HypoxanthineGuanidine-Phosphoribosyl-Transferase
  • a limiting dilution method was used to select hybridomas producing antibodies that bind to mesothelin among the proliferated hybridomas.
  • the number of cells per 96 well was less than 1, and then it was confirmed by ELISA whether the antibodies obtained from clones grown from one cell bind to mesothelin, and clones that bind to mesothelin were selected.
  • hybridomas producing antibodies that bind to mesothelin were selected. In this way, 7 types of antibodies binding to mesothelin were obtained.
  • the seven antibodies were named 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11, respectively, and their nucleotide and amino acid sequences were analyzed. Sequence information for the heavy chain variable region and the light chain variable region of each antibody according to the sequencing results is shown in Tables 1 to 7 below, and the underlined portions in Tables 1 to 7 below are complementarity determining regions (CDRs). ) means
  • 3A8 antibody sequence information 3A8 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYSFTGYT SEQ ID NO: 1 heavy chain variable region CDR2 INPYNGGT SEQ ID NO: 2 heavy chain variable region CDR3 ARVGGSSWYFDV SEQ ID NO: 3 light chain variable region CDR1 QSLLYSSNQKNY SEQ ID NO: 4 light chain variable region CDR2 WAS SEQ ID NO: 5 light chain variable region CDR3 QQYYSYPTWT SEQ ID NO: 6 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 7 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSPSSLAVSVGEKVIMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQQ
  • 4G11 antibody sequence information 4G11 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYSFTGYY SEQ ID NO: 11 heavy chain variable region CDR2 ISCYNGAT SEQ ID NO: 12 heavy chain variable region CDR3 ARWDRDWFAY SEQ ID NO: 13 light chain variable region CDR1 QDVGIA SEQ ID NO: 14 light chain variable region CDR2 WAS SEQ ID NO: 15 light chain variable region CDR3 QQYSSYPFT SEQ ID NO: 16 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLQQSGPELVKTGDSVKISCKAS GYSFTGYY MHWVKQSHGKSLEWIGY ISCYNGAT SYSQKFKGKATFTVDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYC ARWDRDWFAY WGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 17 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKAS QDVGIA VAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRHTGVPD
  • 5A9 antibody sequence information 5A9 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GFSITSSSYC SEQ ID NO: 21 heavy chain variable region CDR2 ICYEGSI SEQ ID NO: 22 heavy chain variable region CDR3 SRENRLLKDAMDY SEQ ID NO: 23 light chain variable region CDR1 QSLLSSRTRKNY SEQ ID NO: 24 light chain variable region CDR2 WAS SEQ ID NO: 25 light chain variable region CDR3 KQSYNLRT SEQ ID NO: 26 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLEESGPAVIKPSQSLSLTCIVS GFSITSSSYC WHWIRQPPGKGLEWMGR ICYEGSI YYSPSIKSRFTISRDTSLNKFFIQLSSVTNEDTAMYYC SRENRLLKDAMDY WGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 27 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSS QSLLSSRTRKNY LAWYQQKPGQSPKLLIY WA
  • 6G5 antibody sequence information 6G5 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYSFTGYT SEQ ID NO: 31 heavy chain variable region CDR2 INPYNGGT SEQ ID NO: 32 heavy chain variable region CDR3 ARVGGSSWYFDV SEQ ID NO: 33 light chain variable region CDR1 QSLLYSSNQKNY SEQ ID NO: 34 light chain variable region CDR2 WAS SEQ ID NO: 35 light chain variable region CDR3 QQYYTYPTWT SEQ ID NO: 36 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 37 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQQK
  • 7C3 antibody sequence information 7C3 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYTFSAYW SEQ ID NO: 41 heavy chain variable region CDR2 ILPGSGST SEQ ID NO: 42 heavy chain variable region CDR3 ARGDYYAMDY SEQ ID NO: 43 light chain variable region CDR1 QSLLYSNGKTY SEQ ID NO: 44 light chain variable region CDR2 LVS SEQ ID NO: 45 light chain variable region CDR3 VQGTHFPFT SEQ ID NO: 46 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLQQSGAELMRPGASVKISCKAT GYTFSAYW IEWVKQRPGHGLEWIGE ILPGSGST KYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARGDYYAMDY WGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 47 light chain variable region amino acid sequence DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSS QSLLYSNGKTY LNWLLQRPGQSPKRLIY L
  • 9E8 antibody sequence information 9E8 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYSFTGYT SEQ ID NO: 51 heavy chain variable region CDR2 INPYNGGT SEQ ID NO: 52 heavy chain variable region CDR3 ARVGGSSWYFDV SEQ ID NO: 53 light chain variable region CDR1 QSLLYSSNQKNY SEQ ID NO: 54 light chain variable region CDR2 WAS SEQ ID NO: 55 light chain variable region CDR3 QQYYSYPTWT SEQ ID NO: 56 Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 57 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSPSSLAVSVGEKVIMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQ
  • 9E11 antibody sequence information 9E11 sequence information sequence number heavy chain variable region CDR1 GYSITSDYA SEQ ID NO: 61 heavy chain variable region CDR2 ISYSGST SEQ ID NO: 62 heavy chain variable region CDR3 ARGAAGFAY SEQ ID NO: 63 light chain variable region CDR1 QTIGTW SEQ ID NO: 64 light chain variable region CDR2 AAT SEQ ID NO: 65 light chain variable region CDR3 QQLYSTPWT SEQ ID NO: 66 Heavy chain variable region amino acid sequence QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDYA WNWIRQFPGNKLEWMGY ISYSGST RYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYC ARGAAGFAY WGQGTLVTVSA SEQ ID NO: 67 light chain variable region amino acid sequence DIVMTQSPASQSASLGESVTITCLAS QTIGTW LAWYQQKPGKSPQLLIY AAT SLADGVP
  • the mesothelin peptide was dispensed into a 96-well plate to be 100 ng/well, and then reacted overnight at 4°C. Then, after treatment with 1 X PBST containing 3% BSA, it was blocked for 30 minutes at room temperature.
  • 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8, and 3 ⁇ l of the hybridoma cell culture of each clone producing the 9E11 antibody were treated in each well, reacted at room temperature for 2 hours, and washed three times with 1 X PBST did
  • the secondary antibody (anti-HRP, 1:10,000) was treated and reacted at room temperature for 30 minutes, washed three times with 1 X PBST, and then treated with TMB for color development and reacted at room temperature for 5 minutes. Finally, the reaction was terminated by treatment with a stop solution of 1N H 2 SO 4 , and absorbance was measured at 450 nm.
  • Example 3 Confirmation of specificity of selected antibodies for mesothelin - flow cytometer
  • NCI-H2052 (4 x 10 5 cells), a mesothelioma cell line overexpressing mesothelin, and 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 and 9E11 antibodies (1 ⁇ g) were reacted for 30 minutes, respectively. , after staining the surface with a secondary antibody, was measured by flow cytometry.
  • a mesothelin antibody (APC anti-human Mesothelin; R&D Systems, cat#FAB32652A, 5 ⁇ l) was used as a positive control, and PE-conjugated anti-mouse IgG antibody (PE-conjugated goat anti -mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, USA, 5 ⁇ l) was used.
  • Example 4 Construction of a chimeric antigen receptor (MSLN-CAR) expression vector targeting mesothelin
  • a lentiviral vector (MSLN-CAR lentivirus) expressing a mesothelin-targeting chimeric antigen receptor was prepared using the 3A8, 4G11, 6G5, and 7C3 antibodies prepared in Example 2 above.
  • polynucleotides encoding mesothelin-binding domains (SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82);
  • polynucleotide encoding CD3 ⁇ (intracellular signaling domain) (SEQ ID NO: 92);
  • CAR DNA composed of a polynucleotide (SEQ ID NO: 93) encoding WPRE was synthesized in vitro and inserted into a third-generation lentiviral vector.
  • Lentiviral vector DNA (0.5 ⁇ g) was transferred to HEK293FT cells (5 ⁇ 10 5 cells/500 ⁇ l), and 293HEK cells expressing the MSLN-CAR gene were constructed.
  • Lipofectamine 3000 transfection kit (Invitrogen, cat# L3000-015) was used to transfer the gene to 293HEK cells, and cultured in Opti-MEM (gibco, cat# 51985-034) medium for 4 hours.
  • anti-MSLN antibodies (3A8, 4G11, 6G5, and 7C3 antibodies)-based MSLN-CAR-T cells were prepared by transfecting T cells with the MSLN-CAR lentiviral vector prepared in Example 4, respectively.
  • T cell activation beads (Miltenyl Biotec, cat# 130- 091-441) was used to activate T cells.
  • MSLN-CAR-T cells were prepared by transducing the MSLN-CAR lentivirus prepared in Example 4 into the activated T cells.
  • the mesothelin peptide binding ability of MSLN-CAR-T cells was confirmed by flow cytometry.
  • the MSLN-CAR-T cells prepared above were sorted into CD3, CD4, or CD8-activated MSLN-CAR-T cells using anti-CD3, anti-CD4, or anti-CD8 antibodies, respectively, and then mesothelin (FITC -MSLN) After reacting with the peptide, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer.
  • CD3, CD4, or CD8 activated MSLN-CAR-T cells all bind to mesothelin peptides.
  • the degree of IFN ⁇ expression by MSLN-CAR-T cells in the presence of target cells was confirmed.
  • H28 cells that do not express mesothelin
  • H2052 cells mesothelioma cell line
  • MSLN-CAR-T cells were mixed 1:2, 1:1 and 1:0.5 ratio, after reacting for a certain period of time, stained with surface & intra antibody and measured by flow cytometry (INF-r, CD3, CD4, CD8 staining).
  • T cells were not activated in H28 cells that did not express mesothelin, whereas T cells were activated in the presence of H2052 cells that overexpress mesothelin, and IFN ⁇ expression increased. Confirmed.
  • Example 7 Confirmation of killing effect of MSLN-CAR-T cells on mesothelin-expressing cells
  • the killing effect of target cells by the anti-mesothelin antibody-based MSLN-CAR-T cells prepared in Example 5 was confirmed.
  • H28 cells that do not express mesothelin and H2052 cells that overexpress mesothelin were used, and the target cells and MSLN-CAR-T cells were 1:20, 1:10, 1:4, 1:2, 1 They were mixed in a ratio of: 1 and incubated for 8 hours, and then luminescence (CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay, Promega, cat. NO G9291) was measured. The degree of cell death was calculated using Equation 1 below with the measured value.
  • Target Spontaneous Luminescence value derived from the target cell only medium
  • Target Maximum Luminescence value derived from 100% lysis of target cells (using Lysis Reagent)
  • the 7 mesothelin-specific antibodies (3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8, and 9E11) selected in the present invention specifically bind to the mesothelin antigen and have a chimeric antigen receptor (CAR) targeting mesothelin. ) and CAR-T cells (MSLN-CAR-T cells) were confirmed to be possible.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the MSLN-CAR-T cells prepared in the present invention activate MSLN-CAR-T cells in the presence of the mesothelin antigen and effectively kill cells overexpressing mesothelin
  • the mesothelin-specific Antibodies and chimeric antigen receptors and CAR-T cells prepared using the same can be applied to the prevention or treatment of cancer or tumors in which mesothelin is overexpressed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 메소텔린(mesothelin) 특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-T 세포, 및 이들을 포함하는 메소텔린 발현 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 선별한 메소텔린에 특이적인 항체 7종(3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11)은 메소텔린 항원과 특이적으로 결합하고, 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR-T 세포(MSLN-CAR-T 세포)의 제조가 가능함을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 제조한 MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린 항원 존재하에 MSLN-CAR-T 세포가 활성화되고, 메소텔린을 과발현하는 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체 및 이를 이용하여 제조한 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

Description

메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
본 발명은 메소텔린(mesothelin) 특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-T 세포, 및 이들을 포함하는 메소텔린 발현 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
메소텔린(mesothelin, MSLN)은 69~71kDa 전구체 폴리펩티드로서 당단백질(glycoprotein)이고, 세포표면에 발현하여 세포와 세포가 달라 붙어 신호를 전달할 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 일반 조직에서는 낮은 발현을 보이지만 중피암(Mesothelioma), 췌장암(Pancreatic cancer), 난소암(Ovarian cancer)을 비롯한 여러 종류의 고형암에서 과발현이 확인되었으며, 이러한 메소텔린을 표적으로 하는 항암표적 연구가 진행 중이다.
메소텔린을 발현하는 폐암, 난소암 및 췌장암을 대상으로 하는 항체 기반의 표적화 치료법이 개발되고 있으며(대한민국공개특허10-2017-0036503호; Chang, K, et al., Int J Cancer, 50(3):373, 1992), 특히, 메소텔린 특이적 항체를 이용한 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다 (대한민국등록특허 제10-2070016호; Zhiwei Zhang et al., Cell Death & Disease, 10:479, 2019).
이에, 본 발명에서는 메소텔린에 보다 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위해 메소텔린에 결합하는 항체를 스크리닝 하여 신규한 항체 7종(3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11)을 확립하였으며, 본 발명에서 선별한 7종의 항체는 메소텔린 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 메소텔린 특이적인 항체를 이용하여 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포를 제조하였으며, MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린 과발현 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 항체를 발현하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 키메라 항원 수용체 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 암 또는 종양에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (1) 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
(2) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
(3) 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
(4) 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
(5) 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
(6) 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는
(7) 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성된 메소텔린(mesothelin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체, 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (1) 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
상기 (2) 항체는 서열번호 17의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
상기 (3) 항체는 서열번호 27의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 28의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
상기 (4) 항체는 서열번호 37의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 38의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
상기 (5) 항체는 서열번호 47의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위,
상기 (6) 항체는 서열번호 57의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 58의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
상기 (7) 항체는 서열번호 67의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 68의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성될 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 메소텔린-결합 도메인; 막관통 도메인(transmembrane domain); 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
상기 메소텔린-결합 도메인은 본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체 또는 이의 단편 중에 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성된 군에서 선택되는 단백질 유래일 수 있고, 상기 신호전달 도메인은 CD3ζ 유래일 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 메소텔린-결합 도메인의 C 말단 및 막경유 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 힌지 부위는 CD8α 유래일 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid), 레트로바이러스(retroviral) 벡터 또는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하고, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포일 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 메소텔린을 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포; 또는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 암 또는 종양은 정상세포에 비해 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 또는 종양은 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 중피암, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 메소텔린에 보다 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하여 신규한 항체 7종(3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11)을 확립하였고, 상기 신규한 항체들이 메소텔린과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 확립된 항체를 이용하여 제조한 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR-T 세포는 메소텔린을 효과적으로 인식하여 CAR-T 세포의 활성화가 이루어진 것을 확인하였으며, 메소텔린을 과발현하는 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체 및 이를 이용하여 제조한 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체의 메소텔린을 과발현하는 중피종(mesothelioma)세포(NCI-H2052)에 대한 결합력을 유세포분석으로 확인한 데이터이다.
도 2는 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(MSLN-CAR)를 나타낸 모식도이다.
도 3은 MSLN-CAR를 발현하는 렌티바이러스를 이용한 MSLN-CAR 발현 세포 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 (A) HEK293 세포주에 MSLN-CAR 발현 렌티바이러스를 형질전환시키는 방법 및 (B) 형질전환된 HEK293 세포의 메소텔린 펩타이드에 대한 결합능을 확인하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5a 및 도 5b는 MSLN-CAR를 발현하는 렌티바이러스로 형질전환된 HEK293FT 세포에서 MSLN-CAR 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 MSLN-CAR를 발현하는 렌티바이러스를 이용한 MSLN-CART 세포 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 7은 (A) 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 이용한 MSLN-CART 세포 제조방법 및 (B) 제조된 MSLN-CART 세포의 메소텔린 펩타이드에 대한 결합능을 확인하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8a 내지 도 8d는 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체 각각을 이용하여 제조한 MSLN-CAR-T 세포의 메소텔린 펩타이드 결합능을 확인한 데이터이다.
도 9a 내지 도 9d는 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체 각각을 이용하여 제조한 MSLN-CAR-T 세포의 활성화를 확인하기 위해, 표적 세포의 존재하에 MSLN-CAR-T 세포에 의한 IFNγ 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 10은 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체 각각을 이용하여 제조한 MSLN-CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 사멸효과를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체
본 발명은 일관점에서, 메소텔린(mesothelin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편으로서,
(1) 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(2) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(3) 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(4) 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(5) 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(6) 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 또는
(7) 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산되지만, 확보된 항체 유전자 서열을 이용하여 다른 재조합 단백질 발현 숙주세포를 이용하여 생산할 수도 있다. 또한, 상기 항체는 필요에 따라 CDR 부분을 제외한 나머지 부분을 인간화시켜 사용할 수도 있다.
본 발명에서, 용어 "CDR", 즉 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비근접(non-contiguous) 항원 결합 부위를 의미하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 부위(hinge region)를 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 부위의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각이며, 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 수득하거나, 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 메소텔린 단백질 전체 또는 일부 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 메소텔린 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 메소텔린 단백질을 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1~21일 마다 1~4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작 된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
또한, 본 발명의 단클론 항체는, 중쇄(重鎖) 및 경쇄(輕鎖) 가변영역을 코딩하는 DNA를 각각, 중쇄 및 경쇄의 정상영역을 코딩하는 기지의 DNA(예를 들면, 일본 2007-252372호 공보 참조)와 각각 연결한 유전자를, PCR법, 또는, 화학 합성에 의해 합성하고, 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 공지의 발현 벡터(pcDNA 3.1(Invitrogen 사 판매) 등에 이식하여 형질 전환체를 제조하고, CHO 세포나 대장균 등의 숙주 중에서 발현시킴으로써 항체를 생산하고, 이러한 배양액으로부터, 프로테인 A 또는 G(Protein A 또는 G) 컬럼 등을 이용해서 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해, 메소텔린 단백질을 생산하는 하이브리도마를 제조 및 스크리닝 하여, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체(scFv) 7종을 선별하였으며, 이를 각각 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11로 명명하였다.
(1) 상기 3A8 항체는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYSFTGYT), 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(INPYNGGT) 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARVGGSSWYFDV)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLLYSSNQKNY), 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(WAS) 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(QQGNTLPWT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 3A8 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(2) 상기 4G11 항체는 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYSFTGYY), 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(ISCYNGAT) 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARWDRDWFAY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QDVGIA), 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(WAS) 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(QQYSSYPFT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 4G11 항체는 서열번호 17의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 19의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 20의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(3) 상기 5A9 항체는 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GFSITSSSYC), 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(ICYEGSI) 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(SRENRLLKDAMDY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLLSSRTRKNY), 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(WAS) 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(KQSYNLRT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 5A9 항체는 서열번호 27의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 28의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 29의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 30의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(4) 상기 6G5 항체는 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYSFTGYT), 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(INPYNGGT) 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARVGGSSWYFDV)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLLYSSNQKNY), 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(WAS) 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(QQYYTYPTWT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 6G5 항체는 서열번호 37의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 38의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 39의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 40의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(5) 상기 7C3 항체는 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYTFSAYW), 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(ILPGSGST) 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARGDYYAMDY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLLYSNGKTY), 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(LVS) 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(VQGTHFPFT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 7C3 항체는 서열번호 47의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 49의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 50의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(6) 상기 9E8 항체는 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYSFTGYT), 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(INPYNGGT) 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARVGGSSWYFDV)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLLYSSNQKNY), 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(WAS) 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(QQYYSYPTWT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 9E8 항체는 서열번호 57의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 58의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 59의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 60의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
(7) 상기 9E11 항체는 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYSITSDYA), 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(ISYSGST) 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARGAAGFAY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QTIGTW), 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(AAT) 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(QQLYSTPWT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 9E11 항체는 서열번호 67의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 68의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 69의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 70의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체는 바람직하게 scFv(single chain variable fragment)로, 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위가 링커로 연결될 수 있도록 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 상기 링커는 바람직하게 바람직하게 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 72의 염기서열로 표시될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결된 경우 3A8 항체는 서열번호 73의 아미노산 서열 또는 서열번호 74의 염기서열로, 4G11 항체는 서열번호 75의 아미노산 서열 또는 서열번호 76의 염기서열로, 5A9 항체는 서열번호 77의 아미노산 서열 또는 서열번호 78의 염기서열로, 6G5 항체는 서열번호 79의 아미노산 서열 또는 서열번호 80의 염기서열로, 7C3 항체는 서열번호 81의 아미노산 서열 또는 서열번호 82의 염기서열로, 9E8 항체는 서열번호 83의 아미노산 서열 또는 서열번호 84의 염기서열로, 9E11 항체는 서열번호 85의 아미노산 서열 또는 서열번호 86의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 핵산 분자(nucleic acid molecule), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동 분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 분리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미하고, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 항체 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 항체의 생산을 위해 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 형질전환 시킬 수 있다. 완벽한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들 세포는 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 용이하게 이용가능하다.
메소텔린을 표적으로 하는 키메라항원 수용체(Chimeric antigen receptor)
본 발명은 다른 관점에서,
메소텔린-결합 도메인;
막관통 도메인(transmembrane domain);
공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는, 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
상기 메소텔린-결합 도메인은 (1) 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(2) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(3) 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(4) 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(5) 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
(6) 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 또는
(7) 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이다.
본 발명에서, 용어 "키메릭 항원 수용체 (CAR)"는 일반적으로 항원 및 하나 이상의 세포 내 도메인과 결합하는 능력을 갖는 세포 외 도메인을 함유하는 융합 단백질을 지칭한다. CAR는 키메릭 항원 수용체 T 세포(CAR-T)의 핵심 부분이며, 항원(예를 들어, 메소텔린) 결합 도메인, 막 관통 도메인, 공동 자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. CAR는 항체의 항원 특이성에 기초하여 T 세포 수용체-활성화 세포 내 도메인과 조합될 수 있다. 유전자가 변형된 CAR-발현 T 세포는 표적 항원-발현 악성 세포를 특이적으로 식별하고 제거할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "메소텔린-결합 도메인(mesothelin-binding domain)"은 일반적으로 메소텔린 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 메소텔린-결합 도메인은 암 또는 종양세포에서 과발현된 메소텔린 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결합 도메인(binding domain)"은 "세포 외 도메인(extracellular domain)", "세포 외 결합 도메인(extracellular binding domain)", "항원-특이적 결합 도메인(antigenspecific binding domain)" 및 "세포 외 항원-특이적 결합 도메인(extracellular antigen-specific biding domain)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 표적 항원(예를 들어, 메소텔린)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR 도메인 또는 단편을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편은 상술한 항-메소텔린 항체로, 단클론 항체(monoclonal antibody), 바람직하게는 scFv(single chain variable fragment)이다. 구체적으로, 본 발명의 메소텔린에 특이적인 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체를 이용하여 제조할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 3A8, 4G11, 5A9, 6G5 및 7C3 항체를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 메소텔린-결합 도메인의 N 말단에 신호 펩타이드(signal peptide)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 "신호 펩타이드(signal peptide)"는 일반적으로 단백질 전달을 안내하기 위한 펩타이드 사슬을 지칭한다. 신호 펩타이드는 5 내지 30 개의 아미노산 길이를 갖는 짧은 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게 서열번호 94의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 메소텔린-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 위치된 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 힌지 부위는 CD8α 유래로, 바람직하게는 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 상기 "힌지 부위(hinge region)"는 일반적으로 항원-결합 영역과 면역 세포 Fc 수용체 (FcR)-결합영역 사이의 연결 영역을 지칭한다.
본 발명에 있어서, "막관통 도메인(transmembrane domain)"은 일반적으로 세포막을 통과하고 세포 내 신호전달 도메인에 연결되어 신호전달의 역할을 하는 CAR의 도메인을 지칭한다. 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 96의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, "공동 자극 도메인(costimulatory domain)"은 일반적으로 림프구의 항원에 대한 효과적인 반응에 필요한 세포 표면 분자인 면역 자극 분자를 제공할 수 있는 세포 내 도메인을 지칭한다. 상기 기재된 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28의 공동 자극 도메인을 포함할 수 있고, OX40 및 4-1BB의 공동 자극 도메인과 같은 TNF 수용체 패밀리의 공동 자극 도메인을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 97의 아미노산 서열로 표시되는 4-1BB일 수 있다.
본 발명에 있어서, "세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)"은 일반적으로 세포 내부에 위치하고 신호를 전달할 수 있는 도메인을 지칭한다. 본 발명에서, 세포 내 신호전달 도메인은 키메라 항원 수용체의 세포 내 신호전달 도메인이다. 예를 들어, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, 4-1BB 세포 내 도메인 및 OX40 세포 내 도메인으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 98의 아미노산 서열로 표시되는 CD3ζ일 수 있다.
본 발명의 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(MSLN-CAR)는 바람직하게 도 2에 나타낸 모식도와 같이 제조될 수 있다.
키메릭 항원 수용체 코딩 폴리뉴클레오타이드 및 키메릭 항원 수용체 발현 벡터
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(MSLN-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(MSLN-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 메소텔린-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 공동 자극 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 세포 내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 메소텔린-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 메소텔린에 특이적인 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체, 바람직하게는 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 경쇄가변부위 및 중쇄가변부위가 링커로 연결된 scFv 형태로, 구체적인 염기서열은 상술한 바와 같다.
바람직하게, 본 발명의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는,
서열번호 88의 염기서열로 표시되는 신호 펩타이드;
서열번호 74의 염기서열로 표시되는 3A8 항체, 서열번호 76의 염기서열로 표시되는 4G11 항체, 서열번호 80의 염기서열로 표시되는 6G5 항체 또는 서열번호 82의 염기서열로 표시되는 7C3 항체;
서열번호 90의 염기서열로 표시되는 막관통 도메인;
서열번호 91의 염기서열로 표시되는 4-1BB(공동자극 도메인); 및
서열번호 92의 염기서열로 표시되는 CD3ζ(세포 내 신호전달 도메인)로 구성될 수 있다.
또한, 메소텔린-결합 도메인를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 막관통 도메인 사이에, 힌지 부위(hinge region)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 포함될 수 있으며, 바람직하게 서열번호 89의 염기서열로 표시되는 CD8 힌지 부위일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(MSLN-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 벡터는 재조합 바이러스 벡터로, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이며, 작동가능하게 연결된 EF1α 프로모터; 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 메소텔린-결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 세포 내 신호전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질 발현을 증가시키기 위해 WPRE(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)를 추가로 포함할 수 있다 (도 3).
상기 EF1α 프로모터는 서열번호 87의 염기서열로 표시될 수 있으며, 필요에 따라 상기 서열번호 87의 염기서열과 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 프로모터는 메소텔린-결합 도메인인 항-메소텔린 항체(scFv)의 발현을 유도하도록 작동 가능하게 연결되어 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술의 표적화된 전달, 예를 들어, 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용 가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주세포 내로의 핵산의 도입(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다.
키메릭 항원 수용체(CAR) 발현 면역 이펙터 세포
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(MSLN-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 포유동물 유래 세포 일 수 있으며, 바람직하게는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵세포, 또는 대식세포, 더 바람직하게는 T 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 MSLN-CAR를 발현하는 면역 이펙터 세포는 본 발명의 MSLN-CAR 발현 벡터를 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 도입시켜 제조할 수 있다.
구체적으로, MSLN-CAR 발현 벡터는 전기천공법, 리포펙타민(lipofectamine 2000, Invitrogen) 등과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 렌티바이러스 벡터에 의해 형질 감염되어 CAR 분자를 운반하는 바이러스 게놈을 숙주 게놈에 통합시켜 표적 유전자의 장기적이고 안정적인 발현을 보장할 수 있다. 다른 예를 들어, 전이인자(transposon)는 CAR 운반 플라스미드(transposon) 및 전이효소 운반 플라스미드를 표적 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 다른 예를 들어, CAR 분자는 유전자 편집방법 (예컨대 CRISPRCas9)에 의해 게놈에 첨가될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 MSLN-CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 렌티바이러스 벡터를 제조하였으며, 제조된 벡터를 T 세포에 형질전환 시켜 MSLN-CAR-T 세포를 제조하였다 (도 6 및 도 7). 제조된 MSLN-CAR-T 세포에서는 본 발명의 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현하게 된다.
키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포 제조를 위한 면역 이펙터 세포는 대상체로 부터 수득할 수 있으며, 상기 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함한다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
상기 T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 많은 기술, 예를 들면, 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 혈액으로부터 세포는 분리반출술에 의해 수득되며, 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다.
분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로 부터 활성화된 T 세포를 분리한 다음, MSLN-CAR 렌티바이러스를 T 세포에 형질도입시켜 MSLN-CAR-T 세포를 제조하였으며, 구체적으로 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체를 이용하여 MSLN-CAR-T 세포를 각각 제조하였다.
제조된 MSLN-CAR-T 세포의 메소텔린-펩타이드 결합능을 확인하기 위해, CD3, CD4 또는 CD8이 활성화된 MSLN-CAR-T 세포에 대한 메소텔린 펩타이드에 대한 결합능을 확인하였다. 도 8a 내지 도 8d에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제조한 MSLN-CAR-T 세포가 메소텔린 펩타이드와 결합하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, MSLN-CAR-T 세포의 활성화를 확인하기 위해, 표적 세포의 존재하에 MSLN-CAR-T 세포에 의한 IFNγ 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 메소텔린을 발현하지 않은 H28 세포에서는 T 세포가 활성화되지 않은 반면, 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포의 존재하에 T 세포가 활성화되어 IFNγ 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, MSLN-CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 사멸효과를 확인한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포 특이적인 사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 선별한 항체는 메소텔린 과발현 암 또는 종양세포를 특이적으로 인식하였으므로, 메소텔린 과발현 암 또는 종양 세포의 면역회피를 억제하여 면역세포/대식세포에 의한 세포 독성 또는 사멸을 효과적으로 유도할 수 있다. 나아가, 본 발명에서 제조한 MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린 과발현 세포 특이적 사멸효과를 보이는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 항-메소텔린 항체, 이를 이용한 CAR-T 세포는 메소텔린 과발현과 관련된 질환, 특히, 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
메소텔린 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 메소텔린을 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포를 포함하는, 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암 또는 종양은 정상대조군, 또는 정상 세포에 비해 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양으로, 구체적으로 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 중피암, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 메소텔린 과발현 암 또는 종양의 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 치료제는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 공유결합된 상태로 존재하거나, 본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체 또는 MSLN-CAR-T 세포와 병용투여할 수 있다
또한, 상기 치료제는 항암제일 수 있다. 항암제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성 약제 및 세포 증식 억제제를 아우르는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질계) 화합물을 포함한다. 항암제의 비제한적인 예는 알킬화제, 니트로소요소, 항대사물질, 항종양 항생물질, 식물 (빈카) 알칼로이드 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 펩타이드성 화합물 또한 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물에서 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 메소텔린을 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 이펙터 세포는 치료 또는 진단용 조성물 내에서 유일한 활성성분이거나, 또는 예를 들면, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체와 같은 다른 항체성분들, 또는 크산틴과 같은 비항체 성분들을 포함하는 다른 활성성분들과 함께 사용 가능하다.
약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질환상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01 ~ 50mg/kg, 바람직하게는 0.1 ~ 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다. 조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체가 투여되는 투여량은 치료될 상태의 성질, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 항체가 질환 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다.
투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다. 만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2 ~ 10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2 ~ 15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 투여량을 제공할 필요가 있다.
또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 안되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩타이드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)(예를 들면, 환괴(bolus) 주사 또는 연속적 주입)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예, WO 98/20734 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 어떤 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 데 하이포스프레이(hypospray)가 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
조성물내의 활성성분은 항체분자일 수 있다. 그 자체로, 위장관내에서 분해에 민감할 수 있다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되면, 조성물은, 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 위장관으로부터 흡수된 항체를 방출시키는 제제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약제학적으로 허용가능한 담체의 완벽한 논의는 레밍톤 약제학지(Remington's Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Company, NJ, 1991)를 이용할 수 있다.
메소텔린 과발현 암 또는 종양의 진단 또는 모니터링
본 발명은 또 다른 관점에서, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 메소텔린 과발현 암 또는 종양의 진단 또는 모니터링용 조성물에 관한 것이다.
상기 메소텔린 과발현 암 또는 종양은 정상대조군, 또는 정상 세포에 비해 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양으로, 구체적으로 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 중피암, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적 표지는 검출가능 표지를 포함하는 2차 항체를 포함하는데, 여기서 2차 항체가 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체에 결합한다. 다른 간접적 표지는 바이오틴을 포함하는데, 여기서 바이오티닐화된 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 검출가능 표지를 포함하는 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다.
적절한 검출가능 표지는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 모든 조성물을 포함한다. 적절한 표지는, 비제한적으로, 자석 비드, 형광염료(예를 들어, 플루오레세인이소티오시안산염, 텍사스 레드, 로다민, 초록 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼린 포스파타아제, 루시퍼라아제 및 효소-연결 면역흡착검사(ELISA)에 일반적으로 사용되는 것들) 및 콜로이드성 골드 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 표색계 표지를 포함한다.
또한, 진단 또는 모니터링을 위해 상기 항체는 형광 단백질로 표지될 수 있으며, 조영제 또는 방사선 동위원소를 포함할 수 있다.
본 발명의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체를 진단 키트에 이용하는 경우, 상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인 일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 제조 및 선별
메소텔린(mesothelin) 특이적인 항체를 선별하기위해, 메소텔린과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하여 항체를 선별하였다.
먼저, 메소텔린 단백질(Acrobiosystems, cat#MSN-H5223)을 면역하여 비장세포를 적출하고 마우스 골수증세포와 세포 융합을 통하여 하이브리도마 세포를 제작하였다.
세포 융합에 이용하는 마우스 골수종 세포는 HGPRT(HypoxanthineGuanidine-Phosphoribosyl-Transferase)를 가지고 있지 않기 때문에 HAT 배지에서는 생존할 수 없으나, 하이브리도마는 비장세포와 융합함으로써 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 이를 이용하면 하이브리도마만을 증식시킬 수 있으므로, 통상 하이브리도마를 확립시킬때까지 HAT 배지에서 증식시켰다.
증식된 하이브리도마 중에서 메소텔린과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하기 위해 한계희석법을 사용하였다. 우선 96웰당 1개 세포 이하가 되도록 한 다음, 1개의 세포로부터 증식된 클론에서 얻어진 항체가 메소텔린과 결합하는지를 ELISA로 확인하고 메소텔린과 결합하는 클론을 선별하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 메소텔린과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 이와 같은 방법으로 메소텔린에 결합하는 7종의 항체를 수득하였다.
상기 7종의 항체는 각각 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11로 명명하였으며, 이들의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 각 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 1 내지 표 7에 나타내었으며, 하기 표 1 내지 7에서 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3A8 항체 서열정보
3A8 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYSFTGYT 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 INPYNGGT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARVGGSSWYFDV 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 QSLLYSSNQKNY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 WAS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 QQYYSYPTWT 서열번호 6
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS 서열번호 7
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVIMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYSYPTWT FGGGTKLEIK 서열번호 8
중쇄가변부위 염기서열 gaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtggtactagctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagggtgggcggtagtagctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca 서열번호 9
경쇄가변부위 염기서열 gacattgtgatgacccagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttattatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatagctatcctacgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa 서열번호 10
4G11 항체 서열정보
4G11 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYSFTGYY 서열번호 11
중쇄가변부위 CDR2 ISCYNGAT 서열번호 12
중쇄가변부위 CDR3 ARWDRDWFAY 서열번호 13
경쇄가변부위 CDR1 QDVGIA 서열번호 14
경쇄가변부위 CDR2 WAS 서열번호 15
경쇄가변부위 CDR3 QQYSSYPFT 서열번호 16
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQSGPELVKTGDSVKISCKAS GYSFTGYY MHWVKQSHGKSLEWIGY ISCYNGAT SYSQKFKGKATFTVDTSSSTAYMQFNSLTSEDSAVYYC ARWDRDWFAY WGQGTLVTVSA 서열번호 17
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKAS QDVGIA VAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC QQYSSYPFT FGSGTKLEIK 서열번호 18
중쇄가변부위 염기서열 taggtccagctgcaacagtctggacctgagctagtgaagactggggattcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggttactacatgcactgggtcaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggatatattagttgttacaatggtgctactagctacagccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagttcaacagcctgacatctgaagactctgcggtctattactgtgcaagatgggacagggactggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca 서열번호 19
경쇄가변부위 염기서열 tacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgggtattgctgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaactactgatttactgggcatccacccggcacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccattagcaatgtgcagtctgaagacttggcagattatttctgtcagcaatatagcagctatccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa 서열번호 20
5A9 항체 서열정보
5A9 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GFSITSSSYC 서열번호 21
중쇄가변부위 CDR2 ICYEGSI 서열번호 22
중쇄가변부위 CDR3 SRENRLLKDAMDY 서열번호 23
경쇄가변부위 CDR1 QSLLSSRTRKNY 서열번호 24
경쇄가변부위 CDR2 WAS 서열번호 25
경쇄가변부위 CDR3 KQSYNLRT 서열번호 26
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLEESGPAVIKPSQSLSLTCIVS GFSITSSSYC WHWIRQPPGKGLEWMGR ICYEGSI YYSPSIKSRFTISRDTSLNKFFIQLSSVTNEDTAMYYC SRENRLLKDAMDY WGQGTSVTVSS 서열번호 27
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSS QSLLSSRTRKNY LAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC KQSYNLRT FGGGTKLEIK 서열번호 28
중쇄가변부위 염기서열 caggtgcagctggaggagtctggacctgctgtcatcaagccatcacagtcactgtctctcacctgcatagtctctggattctccatcacaagtagtagttattgctggcactggatccgccagcccccaggaaaggggttagagtggatggggcgcatatgttatgaaggttcaatatactatagtccatccatcaaaagccgcttcaccatctccagagacacatctctgaacaaattctttatccagctgagctctgtgacaaatgaggacacagccatgtactactgttccagggaaaaccgcctactgaaggacgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca 서열번호 29
경쇄가변부위 염기서열 aacattgtgatgacccagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgctcagcagtagaacccgaaagaactacttggcttggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaaacaatcttataatcttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa 서열번호 30
6G5 항체 서열정보
6G5 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYSFTGYT 서열번호 31
중쇄가변부위 CDR2 INPYNGGT 서열번호 32
중쇄가변부위 CDR3 ARVGGSSWYFDV 서열번호 33
경쇄가변부위 CDR1 QSLLYSSNQKNY 서열번호 34
경쇄가변부위 CDR2 WAS 서열번호 35
경쇄가변부위 CDR3 QQYYTYPTWT 서열번호 36
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS 서열번호 37
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYTYPTWT FGGGTKLEIK 서열번호 38
중쇄가변부위 염기서열 aaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtggtactagttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagggtgggcggtagtagctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca 서열번호 39
경쇄가변부위 염기서열 tacattgtgatgacccagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttactatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatacctatcctacgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa 서열번호 40
7C3 항체 서열정보
7C3 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFSAYW 서열번호 41
중쇄가변부위 CDR2 ILPGSGST 서열번호 42
중쇄가변부위 CDR3 ARGDYYAMDY 서열번호 43
경쇄가변부위 CDR1 QSLLYSNGKTY 서열번호 44
경쇄가변부위 CDR2 LVS 서열번호 45
경쇄가변부위 CDR3 VQGTHFPFT 서열번호 46
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQSGAELMRPGASVKISCKAT GYTFSAYW IEWVKQRPGHGLEWIGE ILPGSGST KYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARGDYYAMDY WGQGTSVTVSS 서열번호 47
경쇄가변부위 아미노산서열 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSS QSLLYSNGKTY LNWLLQRPGQSPKRLIY LVS KLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC VQGTHFPFT FGSGTKLEIK 서열번호 48
중쇄가변부위 염기서열 taggtccagctgcaacagtctggagctgagctgatgaggcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtgcctactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaagtggtagtactaaatacaatgagaagttcaagggcaaggccacattcactgcagatacatcctccaacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagaggggattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca 서열번호 49
경쇄가변부위 염기서열 aatgttttgatgacccaaactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctctatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttatatagtaatggaaaaacctatttgaattggttattacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcaggaacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattactgcgtgcaaggtacacattttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa 서열번호 50
9E8 항체 서열정보
9E8 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYSFTGYT 서열번호 51
중쇄가변부위 CDR2 INPYNGGT 서열번호 52
중쇄가변부위 CDR3 ARVGGSSWYFDV 서열번호 53
경쇄가변부위 CDR1 QSLLYSSNQKNY 서열번호 54
경쇄가변부위 CDR2 WAS 서열번호 55
경쇄가변부위 CDR3 QQYYSYPTWT 서열번호 56
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKAS GYSFTGYT MNWVKQSHGKNLEWIGL INPYNGGT SYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARVGGSSWYFDV WGAGTTVTVSS 서열번호 57
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVIMSCKSS QSLLYSSNQKNY LAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYSYPTWT FGGGTKLEIK 서열번호 58
중쇄가변부위 염기서열 gaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagccatggaaagaaccttgagtggattggacttattaatccttacaatggtggtactagctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggagctcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagggtgggcggtagtagctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca 서열번호 59
경쇄가변부위 염기서열 gacattgtgatgacccagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaaggttattatgagctgcaagtccagtcagagccttttatatagtagcaatcaaaagaactacttggcctggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactgctgatttactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgtcagcaatattatagctatcctacgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa 서열번호 60
9E11 항체 서열정보
9E11 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYSITSDYA 서열번호 61
중쇄가변부위 CDR2 ISYSGST 서열번호 62
중쇄가변부위 CDR3 ARGAAGFAY 서열번호 63
경쇄가변부위 CDR1 QTIGTW 서열번호 64
경쇄가변부위 CDR2 AAT 서열번호 65
경쇄가변부위 CDR3 QQLYSTPWT 서열번호 66
중쇄가변부위 아미노산서열 QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDYA WNWIRQFPGNKLEWMGY ISYSGST RYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYC ARGAAGFAY WGQGTLVTVSA 서열번호 67
경쇄가변부위 아미노산서열 DIVMTQSPASQSASLGESVTITCLAS QTIGTW LAWYQQKPGKSPQLLIY AAT SLADGVPSRFSGSGSGTEFSFKISSLQAEDFVSYYC QQLYSTPWT FGGGTKLEIK 서열번호 68
중쇄가변부위 염기서열 gaggtgcagctgaaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttcgcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggctacataagctacagtggaagcactaggtacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagaggggctgcgggctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca 서열번호 69
경쇄가변부위 염기서열 tacattgtgatgacccagtctcctgcctcccagtctgcatctctgggagaaagtgtcaccatcacatgcctggcaagtcagaccattggtacatggttagcatggtatcagcagaaaccagggaaatctcctcagctcctgatttatgctgcaaccagcttggcagatggggtcccatcaaggttcagtggtagtggatctggcacagaattttctttcaagatcagcagcctacaggctgaagattttgtaagttattactgtcaacaactttacagtactccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa 서열번호 70
실시예 2 : 선별한 항체의 메소텔린에 대한 특이성 확인 - ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체의 메소텔린에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, 메소텔린 펩타이드를 코딩하기 위해, 메소텔린 펩타이드를 100 ng/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체 생산하는 각 클론의 하이브리도마 세포 배양액 3 ㎕를 각 웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HRP, 1:10,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
ELISA reader Infinite F50
Measurement Filter 450 nm
Measurement Mode Single Point Photo
Antigen Coating 100 ng/well
2 nd Antibody (Anti-mIgG -HRP) 1:10,000 dilution
Substrate TMB
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
3A8 1.270
4G11 1.352
5A9 1,487
6G5 1.424
7C3 1.518
9E8 0.758
9E11 1.640
그 결과, 표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 항체가 모두 메소텔린에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 선별한 항체의 메소텔린에 대한 특이성 확인 - 유세포분석(flow cytometer)
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체의 메소텔린에 대한 특이성을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
먼저, 메소텔린을 과발현하는 주중피종(mesothelioma)세포주인 NCI-H2052(4 x 105개)와 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체(1 ㎍) 각각을 30분간 반응시킨 다음, 2차 항체로 표면을 염색한 후, 유세포분석기로 측정하였다.
양성 대조군(positive control)으로 메소텔린 항체(APC anti-human Mesothelin; R&D Systems, cat#FAB32652A, 5㎕)를, 2차 항체로는 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(PE-conjugated goat anti-mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, 미국, 5㎕)를 사용하였다.
유세포분석 결과
항체 종류 Count Median Mean
3A8 10094 704 861
4G11 10132 1116 1256
5A9 10120 58.5 63.2
6G5 10056 560 705
7C3 10111 444 528
9E8 10090 56.2 77.7
9E11 10123 69.1 81.4
양성대조군(positive) 10101 53.4 57.8
2차 항체만 처리(2nd Ab alone) 10120 55.1 62.7
무처리(none) 10080 13.7 14.1
그 결과, 도 1 및 표 10에 나타난 바와 같이 3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11 항체 모두 메소텔린을 발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 4 : 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(MSLN-CAR) 발현 벡터 제작
본 발명에서는 상기 실시예 2에서 제조한 3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체를 이용하여, 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터(MSLN-CAR 렌티바이러스)를 제조하였다.
도 3의 모식도에 나타난 바와 같이,
EF1α 프로모터(서열번호 87);
시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 88);
메소텔린-결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 80, 서열번호 82);
CD8 힌지 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 89);
막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 90);
4-1BB(공동자극도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 91);
CD3ζ(세포 내 신호전달 도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 92); 및
WPRE를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 93)로 구성된 CAR DNA를 생체외 (in vitro)에서 합성하여 3세대 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다.
렌티바이러스 벡터 DNA(0.5 ㎍)를 HEK293FT 세포(5×105cells/500㎕)로 전달하고, MSLN-CAR 유전자를 발현하는 293HEK 세포를 제작하였다. 293HEK 세포로 유전자를 전달하기 위하여 Lipofectamine 3000 transfection kit(Invitrogen, cat# L3000-015)를 사용하였으며, Opti-MEM (gibco, cat# 51985-034) 배지에서 4시간 동안 배양하였다.
렌티바이러스 벡터 DNA로 형질전환된 HEK293FT에서 MSLN 특이적인 CAR가 정상적으로 발현되고 MSLN 펩타이드와 결합하는지 유세포분석(Flow Cytometry) 방법을 통해 확인한 결과(도 4), 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, MSLN-CAR는 정상적으로 발현(expression)되어 MSLN 펩타이드와 결합(binding)하는 것을 확인하였다
실시예 5 : MSLN-CAR-T 세포 제조
본 발명에서는 상기 실시예 4에서 제조한 MSLN-CAR 렌티바이러스 벡터를 T 세포에 형질전환시켜 항-MSLN 항체(3A8, 4G11, 6G5 및 7C3 항체) 기반 MSLN-CAR-T 세포를 각각 제조하였다.
구체적으로, 도 6 및 도 7에 나타낸 모식도와 같이, 혈액에서 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 다음, T 세포활성화비드(T cell activation bead; Miltenyl Biotec, cat# 130-091-441)를 사용해 T 세포를 활성화시켰다. 활성화된 T 세포에 상기 실시예 4에서 제조한 MSLN-CAR 렌티바이러스를 T 세포에 형질 도입시켜 MSLN-CAR-T 세포를 제조하였다.
MSLN-CAR-T 세포의 메소텔린 펩타이드 결합능은 유세포분석(Flow Cytometry) 방법을 통해 확인하였다. 상기에서 제조한 MSLN-CAR-T세포를 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8 항체를 이용하여 CD3, CD4 또는 CD8이 활성화된 MSLN-CAR-T 세포로 각각 분류한 다음, 메소텔린(FITC-MSLN) 펩타이드와 반응시킨 후, 유세포분석기를 이용해 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 도 8a 내지 도 8d에 나타난 바와 같이, CD3, CD4 또는 CD8이 활성화된 MSLN-CAR-T 세포 모두 메소텔린 펩타이드와 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 메소텔린 발현 세포에서 MSLN-CAR-T 세포 활성화 확인
본 발명에서는 상기 실시예 5에서 제조한 MSLN-CAR-T 세포가 메소텔린 발현 세포 특이적으로 활성화되는지 확인하기 위해, 표적세포의 존재 하에 MSLN-CAR-T 세포에 의한 IFNγ 발현 정도를 확인하였다.
표적세포는 메소텔린을 발현하지 않는 H28 세포(mesothelioma cell line) 및 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포(mesothelioma cell line)를 이용하였으며, 표적세포와 MSLN-CAR-T 세포를 1:2, 1:1 및 1:0.5 비율로 일정시간 반응시킨 후 surface & intra antibody로 염색하여 유세포분석기로 측정하였다 (INF-r, CD3, CD4, CD8 염색).
그 결과 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 메소텔린을 발현하지 않은 H28 세포에서는 T 세포가 활성화되지 않은 반면, 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포의 존재하에 T 세포가 활성화되어 IFNγ 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 7 : 메소텔린 발현 세포에 대한 MSLN-CAR-T 세포의 사멸 효과 확인
본발명에서는 상기 실시예 5에서 제조한 항-메소텔린 항체 기반 MSLN-CAR-T세포에 의한 표적세포의 사멸효과를 확인하였다.
표적세포는 메소텔린을 발현하지 않는 H28 세포 및 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포를 이용하였으며, 표적세포와 MSLN-CAR-T 세포가 1:20, 1:10, 1:4, 1:2, 1:1 비율이 되도록 각각 혼합하여 8시간 동안 배양한 다음, 루미네센스 (CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay, Promega, cat. NO G9291)를 측정하였다. 측정한 값으로 하기 수학식 1을 이용하여 세포 사멸 정도를 계산하였다.
[수학식 1]
% Cytotoxicity = [(Experimental - Effector Spontaneous - Target Spontaneous) / (Target Maximum - Target Spontaneous)] X 100
Experimental: 표적세포 및 CAR-T 세포 복합 배양의 배지로부터 도출된 발광(Luminescence)값
Effector Spontaneous: CAR-T 세포만의 배지로부터 도출된 발광값
Target Spontaneous: 표적세포만의 배지로부터 도출된 발광값
Target Maximum: 표적세포의 100% 용해(용해시약 (Lysis Reagent) 이용)로부터 도출된 발광값
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 항-메소텔린 항체(3A8 및 4G11) 기반 MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린을 과발현하는 H2052 세포를 특이적으로 사멸시키는 것을 확인하였다.
본 발명에서 선별한 메소텔린에 특이적인 항체 7종(3A8, 4G11, 5A9, 6G5, 7C3, 9E8 및 9E11)은 메소텔린 항원과 특이적으로 결합하고, 메소텔린을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR-T 세포(MSLN-CAR-T 세포)의 제조가 가능함을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 제조한 MSLN-CAR-T 세포는 메소텔린 항원 존재하에 MSLN-CAR-T 세포가 활성화되고, 메소텔린을 과발현하는 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 메소텔린에 특이적인 항체 및 이를 이용하여 제조한 키메라 항원 수용체 및 CAR-T 세포는 메소텔린이 과발현된 암 또는 종양의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.

Claims (16)

  1. (1) 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    (2) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    (3) 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    (4) 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    (5) 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
    (6) 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는
    (7) 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성된 메소텔린(mesothelin)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
    상기 (2) 항체는 서열번호 17의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 18의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
    상기 (3) 항체는 서열번호 27의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 28의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
    상기 (4) 항체는 서열번호 37의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 38의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
    상기 (5) 항체는 서열번호 47의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 48의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위,
    상기 (6) 항체는 서열번호 57의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 58의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로,
    상기 (7) 항체는 서열번호 67의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 68의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되는 것을 특징으로 하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 또는 제2항의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  5. 제4항의 벡터로 형질전환된 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포.
  6. 제1항 또는 제2항의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 중피암, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항의 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 메소텔린 과발현 암 또는 종양의 진단 또는 모니터링용 조성물.
  9. 메소텔린(mesothelin)-결합 도메인;
    막관통 도메인(transmembrane domain);
    공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
    세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
    상기 메소텔린-결합 도메인은 (1) 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    (2) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 13의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 14의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 15의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 16의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    (3) 서열번호 21의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 22의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 23의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 25의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 26의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    (4) 서열번호 31의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 32의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 33의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 34의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 35의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 36의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    (5) 서열번호 41의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 42의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 43의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 45의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 46의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편;
    (6) 서열번호 51의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 52의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 53의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 54의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 55의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 56의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 또는
    (7) 서열번호 61의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 62의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 63의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 64의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역, 서열번호 65의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역 및 서열번호 66의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 및 PD1로 구성된 군에서 선택되는 단백질이며,
    공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성된 군에서 선택되는 단백질이고,
    상기 신호전달 도메인은 CD3ζ인 것을 특징으로 하는 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 메소텔린-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단 사이에 힌지 부위(hinge region)가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 메소텔린을 표적으로 하는 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  15. 제14항의 면역 이펙터 세포를 포함하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 중피암, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PCT/KR2022/007656 2021-06-30 2022-05-30 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도 WO2023277361A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0085569 2021-06-30
KR1020210085569A KR20230005001A (ko) 2021-06-30 2021-06-30 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023277361A1 true WO2023277361A1 (ko) 2023-01-05

Family

ID=84692820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/007656 WO2023277361A1 (ko) 2021-06-30 2022-05-30 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230005001A (ko)
WO (1) WO2023277361A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116925226A (zh) * 2023-03-09 2023-10-24 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用
US11981745B2 (en) 2021-10-06 2024-05-14 Link Immunotherapeutics, Inc. Anti-mesothelin antigen-binding molecules and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100093033A (ko) * 2007-10-01 2010-08-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 메소텔린에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
KR20160098259A (ko) * 2013-12-19 2016-08-18 노파르티스 아게 인간 메조텔린 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
KR20170036503A (ko) * 2015-09-24 2017-04-03 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물
KR20180055824A (ko) * 2015-08-21 2018-05-25 카르스젠 테라퓨틱스 리미티드 항 메소텔린 완전 인간 항체 및 메소텔린을 타겟팅하는 면역효과 세포
KR102070016B1 (ko) * 2019-01-21 2020-01-29 (주)녹십자셀 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100093033A (ko) * 2007-10-01 2010-08-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 메소텔린에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
KR20160098259A (ko) * 2013-12-19 2016-08-18 노파르티스 아게 인간 메조텔린 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
KR20180055824A (ko) * 2015-08-21 2018-05-25 카르스젠 테라퓨틱스 리미티드 항 메소텔린 완전 인간 항체 및 메소텔린을 타겟팅하는 면역효과 세포
KR20170036503A (ko) * 2015-09-24 2017-04-03 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물
KR102070016B1 (ko) * 2019-01-21 2020-01-29 (주)녹십자셀 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11981745B2 (en) 2021-10-06 2024-05-14 Link Immunotherapeutics, Inc. Anti-mesothelin antigen-binding molecules and uses thereof
CN116925226A (zh) * 2023-03-09 2023-10-24 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用
CN116925226B (zh) * 2023-03-09 2024-03-19 上海迪诺信安生物科技有限公司 抗msln抗体、方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230005001A (ko) 2023-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018124766A2 (ko) 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 자연 살해 세포
WO2020111913A1 (en) Anti-4-1bb antibody and use thereof
WO2023277361A1 (ko) 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
WO2021235696A1 (ko) Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2019098682A1 (ko) 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
WO2021256724A1 (ko) Bcma를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2019225787A1 (ko) 항-b7-h3 항체 및 그 용도
WO2015058573A1 (zh) 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2019112347A2 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2017023138A1 (ko) 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
WO2020032784A1 (ko) Hla-dr에 결합하는 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포
WO2017030370A1 (ko) 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2020005003A1 (ko) Lag-3에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2021210939A1 (ko) 항-her2 어피바디 및 이를 스위치 분자로 이용하는 스위처블 키메라 항원 수용체
WO2019125070A1 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2021060914A1 (ko) 항-클라우딘-3 키메라 항원 수용체
WO2021235697A1 (ko) Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2022145739A1 (en) Humanized antibody specific for cd22 and chimeric antigen receptor using the same
WO2022124765A1 (ko) Gpc3에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2022216014A1 (ko) 항-cntn4 항체 및 그의 용도
WO2022124866A1 (ko) 항-pd-1 항체 및 이의 용도
WO2022124764A1 (ko) Cd47에 특이적인 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22833417

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE