WO2022216014A1 - 항-cntn4 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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cntn4
antigen
seq
binding fragment
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전부남
정주연
문수정
김현욱
차미영
정준호
진준영
김수현
채지수
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주식회사 지놈앤컴퍼니
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Definitions

  • the present invention relates to anti-CNTN4 antibodies or antigen-binding fragments thereof, pharmaceutical compositions comprising them, and their use for activating T cells, such as for the treatment of cancer.
  • the human body has a defense system that protects itself from external invaders (viruses, toxins, etc.) and harmful internal changes (cancer cell mutations).
  • cancer cells Unlike normal cells, cancer cells have specific antigens on their surface and are destroyed by the immune system in the early stage of cancer development. Afterwards, when the balance between the cancer cells that want to proliferate indefinitely and the immune cells that try to attack them are out of balance, the cancer cells begin to multiply. As cancer cells grow further, the body's immune system is disturbed. At this time, some cancer cells use the immune checkpoint of immune cells to evade immunity. .
  • Immune checkpoint inhibitors are drugs that attack cancer cells by activating T cells by blocking the activation of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression, and include CTLA-4, PD-1, and PD-L1 inhibitors.
  • Representative drugs currently on the market include ipilimumab (brand name: YERVOY®) as a CTLA-4 monoclonal antibody, nivolumab (brand name: OPDIVO®) as a PD-1 monoclonal antibody, pembrolizumab (brand name: KEYTRUDA®), etc.
  • PD -L1 monoclonal antibody includes atezolizumab (trade name: TECENTRIQ®) and durvalumab (trade name: IMFINZI®).
  • the present invention is to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the CNTN4 protein and neutralizes the immune evasion mechanism of CNTN4.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating diseases caused by decreased T cell activity, such as cancer, by activating T cells by blocking the immune evasion mechanism of CNTN4 using the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a composition for analysis or detection of CNTN4 protein using the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the CNTN4 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to a CNTN4 protein, such as a human or mouse CNTN4 protein, and neutralizes the immune evasion mechanism of CNTN4. Accordingly, the antibody or antigen-binding fragment of the present invention can increase the activity of T cells, such as CD4+ T cells or CD8+ T cells, that were inhibited by CNTN4.
  • the present invention provides
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70;
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88;
  • a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116;
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58;
  • a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89;
  • a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115;
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a.
  • the present invention provides
  • heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a.
  • the present invention provides
  • a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156;
  • heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a.
  • the antigen-binding fragment of the invention is a Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, single chain antibody scFv, (Fab')2 fragment, single domain antibody, diabody (dAb), or linear antibody. It may be an antibody fragment selected from the group consisting of, and the antibody may be a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding said antibody or antigen-binding fragment thereof and a recombinant expression vector comprising said nucleic acid molecule.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be used in combination with additional anticancer agents, such as immune checkpoint inhibitors or chemotherapeutic agents, or may be used in combination with radiation therapy.
  • the present invention also provides a composition for analyzing or detecting a CNTN4 protein, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • the present invention provides a method of preventing or treating cancer comprising administering to a subject an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof; And it provides a method for preventing or treating cancer comprising administering to the subject an effective amount of an additional anticancer agent.
  • an additional anticancer agent for example, an immune checkpoint inhibitor or a chemotherapeutic agent may be used.
  • the novel anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention activates T cells by blocking the immune evasion mechanism of CNTN4, and thus can be effectively used for the prevention or treatment of diseases, particularly cancer, caused by decreased T cell activity. Accordingly, when the anti-CNTN4 antibody of the present invention is used, an excellent anticancer effect can be exhibited against a cancer that could not achieve a therapeutic effect with the existing immunotherapy.
  • 1 and 2 show the amino acid sequences of the light and heavy chain variable regions of scFv antibody fragments selected through a phage display library. Sequences indicated by solid and dashed lines indicate the CDR sequences of each region.
  • Figure 3 shows the amino acid sequence of the variable region used to prepare the anti-CNTN4 humanized antibody.
  • the present invention provides an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the CNTN4 protein.
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises:
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70;
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:88;
  • a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116;
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58;
  • a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:89;
  • a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115;
  • Table 1 shows the CDR sequences of each light and heavy chain variable region for the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be one comprising a pair of each light chain variable region and heavy chain variable region mentioned in Tables 4 and 5.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (S1).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:3; And it may include a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (S2).
  • Other antibodies or antigen-binding fragments thereof may also comprise two pairs of light and heavy chain variable regions in the same manner.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be one comprising each pair of light chain variable regions and/or heavy chain variable regions mentioned in Table 12.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159 (LAH2).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159 (L1H2).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 158; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159 (L2H2).
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156; and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159.
  • the light chain or heavy chain variable region includes a specific amino acid sequence, it means that it includes the entire amino acid sequence, has the entire amino acid sequence, or consists of the corresponding amino acid sequence.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; a light chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO:88; a light chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89; and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain CDR1 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; a light chain CDR2 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO:88; a light chain CDR3 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; a heavy chain CDR1 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; a heavy chain CDR2 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO:89; and a heavy chain CDR3 consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88; light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116; heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58; heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89; and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156 a variable region and a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and a heavy chain variable region consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or the amino acids of SEQ ID NO: 156 and a light chain variable region consisting essentially of the sequence and a heavy chain variable region consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 156 region and a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising an enumerated amino acid sequence may comprise, whether essential or not, an additional unlisted amino acid sequence.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof consisting essentially of the enumerated amino acid sequences may comprise substitutions of one or more amino acid residues that do not substantially affect the properties of the antibody or fragment thereof.
  • CDR complementarity determining region
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may comprise a sequence in which the framework region of the scFv is fully or partially humanized.
  • a partially humanized sequence it may be at least about 60%, at least about 70%, at least about 80% humanized compared to a fully humanized sequence, and some of the fully humanized sequences (eg, 1, 2, 3). dog, 4 or 5, etc.) may be back mutated.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the humanized sequence may have the same or substantially no significant difference in binding ability to CNTN-4 even when compared to a non-humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the term “antibody” refers to an immune system capable of specifically binding to a target, e.g., carbohydrate, polynucleotide, lipid, polypeptide, protein, etc., via at least one antigen recognition site located in the variable region of an immunoglobulin molecule. It is a globulin molecule.
  • the term “antibody” herein refers to an intact polyclonal or monoclonal antibody, as well as an antigen binding fragment thereof, an antibody fragment, a fusion protein comprising any other modified arrangement of an immunoglobulin molecule comprising an antigen recognition site.
  • immunoglobulin (Ig)M immunoglobulin (Ig)M, IgD, IgG, IgA, and IgE, each of which contains heavy chains made from heavy chain constant region genes ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
  • the light and heavy chains of an antibody are divided into a variable region having a different amino acid sequence and a constant region having the same amino acid sequence for each antibody, and the heavy chain constant regions include CH1, H (hinge), CH2, CH3 domains. This exists Each domain consists of two ⁇ -sheets, and an intramolecular disulfide bond is connected between them.
  • A-01 an antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is referred to as "A-01".
  • L1H2 an antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159.
  • An antibody of the invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which the variable region sequences are from one species and the constant region sequences are from another species, e.g., the variable region sequences are from a mouse or chicken antibody, and the constant region
  • the sequence refers to an antibody derived from a human antibody.
  • humanized antibody refers to an antibody in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, for example, mouse or chicken, have been inserted into human framework sequences.
  • the framework sequence may be further modified, for example, through back mutation.
  • human antibody refers to an antibody comprising variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from human immunoglobulin sequences.
  • the constant regions of antibodies are also derived from human immunoglobulin sequences.
  • antibody fragment refers to antigen-binding fragments that typically comprise at least a portion of the antigen-binding or variable region (eg, one or more CDRs) of a parent antibody and analogs of an antibody. it means. Antibody fragments retain at least some of the binding specificity of the parent antibody. Examples of antibody fragments that may be used herein are Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, single chain antibody scFv, (Fab')2 fragment, single domain antibody, diabody (dAb), or linear antibody, It is not limited.
  • a Fab fragment refers to a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains.
  • Fab' fragments differ from Fab fragments in that a few residues are added at the carboxy terminus of the CH1 domain, including one or more cysteines from the antibody hinge region.
  • Fab'-SH refers to Fab' in which the cysteine residues of the constant domain bear a free thiol group.
  • F(ab')2 antibody fragments are produced as pairs of Fab' fragments via hinge cysteines between the Fab' fragments.
  • Fv is the smallest antibody fragment containing a complete antigen recognition site and antigen binding site. This fragment consists of a dimer in which one heavy chain variable region and one light chain variable region are tightly non-covalently associated. These two regions fold to form six hypervariable loops (3 loops each from the heavy and light chains), which provide amino acid residues for antigen binding and confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable region has the ability to recognize and bind antigen, although with a lower affinity than the entire binding site.
  • Single chain antibody scFvs are antibody fragments comprising VH and VL antibody domains linked by a single polypeptide chain.
  • the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • scFv antibody fragment antigen binding fragment scFv, scFv antibody, antibody scFv, or simply scFv.
  • Diabodies consist of a short linker (approximately 5-10) between the VH and VL domains such that intrachain, but not interchain, pairing of the V domain is achieved to produce a bivalent fragment, i.e., a fragment with two antigen binding sites. dog residues) to construct an scFv fragment.
  • Bispecific diabodies are heterodimers consisting of two “bridged” scFv fragments in which the VH and VL domains of the two antibodies are in different polypeptide chains.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may specifically bind to a CNTN4 protein, preferably a human or mouse CNTN4 protein.
  • the term “specifically binds to” or “specific for” refers to being deterministic for the presence of a target in the presence of a heterogeneous population of molecules, including biological molecules Refers to measurable and reproducible interactions such as binding between antibodies.
  • a specific target eg, an epitope
  • an antibody that specifically binds to a specific target binds to that target with greater affinity, greater avidity, more readily, and/or with a longer duration than it binds another target. means an antibody that
  • the term "specifically binding to human CNTN4 protein” refers to an antibody that binds to human CNTN4 protein with a dissociation constant (Kd) of 5 ⁇ 10 -7 M or less, preferably 1 ⁇ 10 -7 M or less. can do. Accordingly, the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may bind to human CNTN4 protein with a dissociation constant (Kd) of 5 X 10 -7 M or less, preferably, with a Kd of 1 ⁇ 10 -7 M or less. have.
  • Kd refers to the equilibrium dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction, said constant having units of M.
  • the Kd value for an antibody can be determined using methods well established in the art.
  • a preferred method for measuring the Kd value of an antibody is a method using surface plasmon resonance (SRP), preferably a biosensor system such as a Biacore® system.
  • SRP surface plasmon resonance
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention is monospecific and specifically binds to a single epitope, ie, the CNTN4 protein.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention is a multispecific, such as a bispecific or trispecific antibody molecule.
  • a multispecific antibody molecule comprises a plurality of variable regions, each variable region having binding specificity for a different epitope.
  • the first variable region of the bispecific antibody molecule has a first binding specificity for a first epitope, e.g., a CNTN4 protein
  • the second variable region is a target protein other than a second epitope, e.g., a CNTN4 protein.
  • has a second binding specificity for eg, including but not limited to, CTLA-4, PD-1 or PD-L1).
  • the bispecific antibody molecule is CNTN4; and specifically binds to any one of CTLA-4, PD-1 or PD-L1.
  • any combination of said molecules comprises a multispecific antibody molecule, e.g., a first binding specificity for CNTN4, and a second binding specificity for two or more of CTLA-4, PD-1 or PD-L1. and a trispecific antibody comprising a third binding specificity.
  • Multispecific antibody molecules of the invention can be constructed using standard molecular biological techniques known to those of skill in the art (eg, recombinant DNA and protein expression technology).
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention is capable of forming an antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • M an antibody molecule
  • L an optional linker or linker unit
  • D a suitable drug or prodrug
  • n an integer from about 1 to about 20.
  • the drug included in the ADC may be appropriately selected according to therapeutic or diagnostic use, etc. as long as it does not interfere with the specific binding of the antibody of the present invention.
  • the drug includes, but is not limited to, a cytotoxic agent (eg, a chemotherapeutic agent), a prodrug converting enzyme, a radioactive isotope or compound, or a toxin.
  • a cytotoxic agent eg, a chemotherapeutic agent
  • a prodrug converting enzyme e.g., a radioactive isotope or compound
  • a toxin e.g., a cytotoxic agent, eg, a chemotherapeutic agent
  • Drugs and linkers that may be included in the ADC and methods for preparing the same may be according to methods known in the art.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention contains 5 nM or less, preferably 3 nM or less, more preferably 2 nM or even more preferably 1 nM or less as measured by ELISA assay. Binds to CNTN4 protein (eg human or mouse CNTN4 protein) with an EC50.
  • CNTN4 protein eg human or mouse CNTN4 protein
  • EC50 is a term related to in vitro or in vivo assays using antibodies, and refers to the concentration of antibody that induces 50% of the maximal response, i.e., a response intermediate between the maximal response and the baseline (baseline). do.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleic acid molecule encoding an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention.
  • the nucleic acid may be present in whole cells or in cell lysates, or may be specifically present in purified or substantially pure form. Nucleic acids can be separated from other cellular components or other contaminants such as other cellular nucleic acids or proteins by standard techniques such as alkaline/SDS treatment, CsCl banding, column chromatography, agarose gel electrophoresis and other sugars. An "isolated” or “substantially pure isolated” nucleic acid when purified and removed by methods well known in the art.
  • a nucleic acid of the invention may be, for example, DNA or RNA, and may or may not contain intron sequences.
  • the nucleic acid is a cDNA molecule.
  • the nucleic acid molecule of the invention encodes a light chain region, a heavy chain region, or both light and heavy chain regions of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention, preferably a light chain variable region, a heavy chain variable region, or both light and heavy chain variable regions.
  • the nucleic acid molecule of the invention encodes a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 156, or encodes a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 159 .
  • a nucleic acid molecule of the invention encodes antibody A-01 or antibody L1H2.
  • DNA fragments encoding the VL and/or VH regions can be further manipulated, for example, by standard recombinant DNA techniques, resulting in the variable region genes being converted to full-length antibody chain genes, Fab fragments. gene or scFv gene.
  • the VL- or VH-encoding DNA fragment is operable on other proteins, such as antibody constant regions, such as the hIgG1 Fc region (hFc) or hC ⁇ region, or other DNA fragments encoding flexible linkers.
  • the term "operably linked" means when two DNA fragments are joined such that the amino acid sequence encoded by the two DNA fragments remains in-frame. .
  • the isolated DNA encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operably linking the VH-encoding DNA to other DNA molecules encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3).
  • the heavy chain constant region may be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region.
  • the VH-encoding DNA may be operably linked to another DNA molecule encoding only the heavy chain CH1 constant region.
  • VL- and VH-encoding DNA fragments can be operably linked to a flexible linker such as other fragments encoding the amino acid sequence (Gly4-Ser)3, resulting in VL and
  • the VH sequence can be expressed as a continuous single-chain protein with VL and VH regions joined by a flexible linker.
  • Nucleic acid sequences of the invention can be isolated from a variety of sources, genetically engineered, amplified and/or recombinantly expressed. Any recombinant expression system can be used, including insect or mammalian systems, in addition to bacteria such as yeast. For example, nucleic acid manipulations such as subcloning into expression vectors, labeling probes, sequencing and hybridization can be performed as known in the art.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • vector refers to a DNA molecule capable of self-replication in prokaryotic and/or eukaryotic cells, used interchangeably with recombinant vectors, cloning vectors, and expression vectors, which generally refers to the transfer of a gene or DNA fragment into a cell. It is used as an intermediate carrier for delivery to, etc.
  • a vector is usually an origin of replication capable of replication in prokaryotic and/or eukaryotic cells, a selectable marker gene capable of conferring resistance to specific conditions/substances such as antibiotic-degrading enzymes, a promoter capable of transcription of the gene in eukaryotic or prokaryotic cells, Translatable sequences include, but are not limited to.
  • vector refers to a circular double standard DNA loop into which additional DNA fragments can be spliced.
  • viral vector in which additional DNA fragments can be spliced into the viral genome.
  • Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • the present invention also provides a host cell comprising the vector.
  • Host cells include, but are not limited to, cells of mammalian, plant, insect, fungal or bacterial origin.
  • Bacterial cells include Gram-positive bacteria or Gram-negative bacteria, such as cells from several species of the genus Escherichia, such as E. coli and Pseudomonas.
  • yeast cells can be used.
  • Expression in yeast can use yeast strains such as, inter alia, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae and Hansenulapolymorpha.
  • insect cells such as cells derived from Drosophila and Sf9, can be used as host cells.
  • mammalian cells such as Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, Simian COS cells, BHK cells, NSO cells or Bowes melanoma cells
  • mammalian cells such as Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, Simian COS cells, BHK cells, NSO cells or Bowes melanoma cells
  • the host cells in this case may be human cells, such as HeLa, 911, AT1080, A549, 293 and HEK293 cells.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be prepared according to a conventionally known method.
  • an antibody such as a monoclonal antibody, of the invention expresses an antibody having the desired sequence or functional properties after injection of a CNTN4 antigen into a test subject (eg, a mouse) according to methods known in the art. It can be prepared by isolating the hybridoma.
  • DNA encoding the monoclonal antibody is immediately isolated using conventional methods (eg, by using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the monoclonal antibody) and are sequenced Hybridoma cells serve as a preferred source of such DNA.
  • the DNA is placed into an expression vector and then transfected into host cells such as E. coli cells, Simian COS cells, CHO cells, or myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin proteins to host a recombinant host. Synthesis of monoclonal antibodies in cells can be obtained.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention can be prepared using antibody display technology, such as phage library technology.
  • the antibody phage library is cloned in the form of fusion of the phage surface protein (pIII) in the phagemid vector in the heavy and light chain variable region genes of the human antibody, expressed in E. coli, and then infected with M13 helper phage, and the phage Prepare an antibody library in which antibody fragments (scFv or Fab) having various combinations of sequences of heavy and light chain variable regions are displayed on the surface of . From this library, a fragment of an antibody that binds to a specific antigen is isolated from this library using the panning method, and the characteristics of the isolated antibody fragment are identified, then converted into a whole IgG form and expressed in large quantities in animal cells to express a specific human monoclonal antibody. Produces raw antibodies
  • phagemid vector is a plasmid DNA having a phage origin of replication, and typically has an antibiotic resistance gene as a selection marker.
  • the gIII gene or a part thereof of M13 phage is included, and the ScFv gene is ligated to the 5' end of the gIII gene and expressed through a transformant.
  • helper phage is a phage that provides the necessary genetic information for the phagemid to assemble into phage particles. Since gIII or only a part of the phage gene exists in the phagemid, the host cell (transformant) transformed with the phagemid is infected with a helper phage to supply the remaining phage genes. There are types such as M13K07 or VCSM13, and most transformants infected with helper phage including antibiotic resistance genes such as kanamycin can be selected. In addition, since there is a defect in the packaging signal, the phagemid gene is selectively assembled into the phage particle rather than the helper phage gene.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention restores an immune response suppressed by binding of the CNTN4 protein. It has been found that CNTN4 protein inhibits proliferation of T cells, particularly CD4+ T cells and CD8+ T cells.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention increases T cell activity, particularly, CD4+ T cell or CD8+ T cell activity by specifically binding to CNTN4 protein, and thus can be used to treat diseases related to immune suppression.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention increases T cell activity. Accordingly, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may activate T cells, in particular, CD4+ T cells or CD8+ T cells. In one embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may increase the proliferation of T cells that have been inhibited by CNTN4. The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has excellent CNTN4 neutralizing ability.
  • the present invention relates to induction of T cell activation using an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a method of inducing or enhancing T cell activation comprising administering to a subject an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen binding fragment thereof for inducing or enhancing T cell activation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inducing or enhancing T cell activation, comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention relates to the prevention, improvement or treatment of diseases related to immunosuppression using an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a method of preventing, ameliorating or treating an immune suppression-related disease, comprising administering to a subject an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention, amelioration or treatment of a disease associated with immunosuppression.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating a disease related to immunosuppression, comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • subject means a human and non-human animals.
  • Non-human animals include all vertebrates, including mammals and non-mammals, including non-human primates, sheep, dogs, cats, cattle, horses, chickens, amphibians and reptiles, for example
  • mammals such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cattle and horses are preferred.
  • a preferred subject is a human in need of activation or enhancement of an immune response.
  • the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can activate T cells by blocking the binding of CNTN4 protein and/or enhance an immune response against cancer cells in a cancer patient, so that cancer cells in vivo By inhibiting the growth of cells, it can be usefully used to prevent, improve or treat cancer.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • the present invention provides a method of preventing or treating cancer comprising administering to a subject an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof; And it provides a method for preventing or treating cancer comprising administering to the subject an effective amount of an additional anticancer agent.
  • the additional anticancer agent may be an immune checkpoint inhibitor or a chemotherapeutic agent, and the immune checkpoint inhibitor may be one or more selected from the group consisting of an anti-CTLA-4 antibody, an anti-PD-1 antibody, and an anti-PD-L1 antibody. .
  • said effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof; and the effective amount of the additional anticancer agent may be administered to the subject simultaneously as one agent, or may be administered to the subject simultaneously or sequentially as separate agents.
  • cancers for which growth can be inhibited when the antibody of the present invention is used include cancers that normally respond to immunotherapy.
  • cancers of the invention include melanoma (eg, metastatic malignant melanoma), kidney cancer (eg, clear cell carcinoma), prostate cancer (eg, hormone refractory prostate adenocarcinoma), breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer and lung cancer (eg, non-small cell lung cancer).
  • the treatment target of the present invention includes refractory or recurrent malignant tumors whose growth can be inhibited when the antibody of the present invention is used.
  • Examples of other cancers that can be treated using the methods of the present invention include bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin and intraocular malignant melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, stomach cancer, testicular cancer , cervical cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, female vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine system cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, chronic and acute leukemias such as acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, solid tumors in children, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, Pelvic carcinoma, ne
  • the cancer may be a cancer that expresses CNTN4.
  • the cancer may be refractory or resistant to an existing immune checkpoint inhibitor (eg, resistant to a PD-1 pathway inhibitor, a PD-L1 pathway inhibitor, or a CTLA-4 pathway inhibitor).
  • an existing immune checkpoint inhibitor eg, resistant to a PD-1 pathway inhibitor, a PD-L1 pathway inhibitor, or a CTLA-4 pathway inhibitor.
  • the antibodies or antigen-binding fragments of the present invention may be used alone or in combination with other anti-cancer therapies.
  • Other anti-cancer therapies include, for example, standard cancer therapy (eg, chemotherapy, radiation therapy, or surgery); or to other anticancer agents, for example, cytotoxic agents, cytostatic agents, anti-angiogenic or antimetabolic agents, tumor targeting agents, immune stimulating or immune modulators or cytotoxic agents, cytostatic agents, or other toxic agents antibodies, immune checkpoint inhibitors, and the like.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the present invention can be used in combination therapy with other anti-cancer agents, such as immune checkpoint inhibitors, chemotherapeutic agents, or radiation therapy.
  • the immune checkpoint inhibitor is, for example, an anti-CTLA-4 antibody (eg, ipilimumab), an anti-PD-1 antibody (eg, pembrolizumab, nivolumab), or an anti-PD-L1 antibody (eg, atezolizumab, avelumab, durvalumab).
  • the chemotherapeutic agents include alkylating agents, antimetabolites, kinase inhibitors, spindle toxic plant alkaloids, cytotoxic/antitumor antibiotics, topoisomerase inhibitors, photosensitizers, antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs), antiprogesterone, estrogen receptor down-regulators (ERDs), estrogen receptor antagonists, luteinizing hormone releasing hormone agonists, anti-androgens, aromatase inhibitors, EGFR inhibitors, VEGF inhibitors, antisense oligonucleotides that inhibit expression of genes implicated in abnormal cell proliferation or tumor growth, but , but not limited thereto.
  • SERMs selective estrogen receptor modulators
  • ESDs estrogen receptor down-regulators
  • estrogen receptor antagonists luteinizing hormone releasing hormone agonists
  • anti-androgens aromatase inhibitors
  • aromatase inhibitors EGFR inhibitors
  • VEGF inhibitors antisense oli
  • chemotherapeutic agent of the present invention include gemcitabine, vinorelbine, etoposide (VP-16), platinum analogues such as cisplatin or carboplatin, taxoids such as paclitaxel, albumin -including conjugated paclitaxel, docetaxel, and the like.
  • probiotics exhibiting an anticancer effect such as Lactococcus lactis GEN3013 strain (KCTC13426BP), Lactococcus lactis GEN3033 strain (KCTC13684BP), Bifidobacterium bifidum MG731 (Bifidobacterium bifidum MG731) strain (KCTC13452BP) and the like.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the present invention When used together with other anticancer agents, they may be administered separately or may be applied in the form of a combination product in which a plurality of active ingredients are present in one pharmaceutical formulation. When they are administered as separate agents, the two agents may be administered sequentially or simultaneously. For simultaneous administration, they are given together to the patient. In the case of sequential administration, the time lag may be provided on a not-long-term basis, such as administration to the patient within a period of 12 hours or less, or 6 hours or less.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating or treating an immunosuppression-related disease, such as cancer, comprising administering to the subject an effective amount of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment in combination with an additional anticancer agent.
  • an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment is simultaneously administered by including an additional anticancer agent in one composition, as well as a composition comprising each of them separately administered simultaneously or sequentially to a patient in need thereof.
  • the present invention provides the use of an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof in combination with an additional anti-cancer agent for the prevention, amelioration or treatment of an immunosuppression-associated disease, such as cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition or combination for preventing, ameliorating or treating an immunosuppression-related disease, such as cancer, comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof, and an additional anticancer agent.
  • a pharmaceutical composition or combination comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof, and an additional anticancer agent is used not only when the two components are physically together in the form of one formulation, but also simultaneously or sequentially as separate formulations. or sequential administration, wherein the two drugs may be provided separately or together in one kit.
  • the present invention provides a kit for preventing, ameliorating or treating an immunosuppression-related disease, such as cancer, comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof, and an additional anticancer agent.
  • the additional anticancer agent is preferably an immune checkpoint inhibitor, more preferably an anti-CTLA-4 antibody (eg ipilimumab), an anti-PD-1 antibody (eg pembrolizumab, nivolumab), or an anti-PD-L1 antibody (eg, atezolizumab, avelumab, durvalumab).
  • an anti-CTLA-4 antibody eg ipilimumab
  • an anti-PD-1 antibody eg pembrolizumab, nivolumab
  • an anti-PD-L1 antibody eg, atezolizumab, avelumab, durvalumab.
  • Another preferred additional anticancer agent is a chemotherapeutic agent such as gemcitabine, vinorelbine, etoposide (VP-16), platinum analogues such as cisplatin or carboplatin, taxoids such as paclitaxel , albumin-binding paclitaxel, or docetaxel.
  • chemotherapeutic agent such as gemcitabine, vinorelbine, etoposide (VP-16), platinum analogues such as cisplatin or carboplatin, taxoids such as paclitaxel , albumin-binding paclitaxel, or docetaxel.
  • Another preferred additional anti-cancer therapy used in combination with the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention includes radiation therapy.
  • the present invention also provides a method for detecting the presence of a CNTN4 protein in a sample using the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, or a method for measuring the amount of the anti-CNTN4 antibody.
  • the method includes contacting the antibody or antigen-binding fragment thereof with a sample and a control sample under conditions in which the antibody or antigen-binding fragment thereof can bind to a CNTN4 protein to form a complex. Thereafter, it is detected whether the complex is formed.
  • the difference in the degree of complex formation between the samples compared to the control sample is evidence that the human blood antigen is present in the sample (eg, blood).
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising the anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • compositions comprising an anti-CNTN4 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the composition may contain an inactive ingredient, ie, a pharmaceutically acceptable excipient (see Handbook of Pharmaceutical Excipients et al.).
  • Compositions of therapeutic and diagnostic agents can be prepared by mixing with physiologically acceptable carriers, excipients or stabilizers, for example in the form of lyophilized powders, slurries, aqueous solutions or suspensions.
  • Suitable routes of administration include parenteral administration, eg, intramuscular, intravenous, or subcutaneous administration.
  • Administration of the antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention or used to practice the method of the present invention is carried out by various conventional methods such as topical application or dermal, subcutaneous, intraperitoneal, parenteral, intraarterial or intravenous injection. can do.
  • the antibody of the invention is administered intravenously or subcutaneously.
  • Example 1 CNTN4 specific binding scFv antibody selection
  • the 15 chickens were divided into 3 groups of 5 each, and the first group was inoculated with mouse CNTN4, the second group with human CNTN4, and the third group with mouse CNTN4 and human CNTN4 were inoculated for a total of 4 times to generate antibodies.
  • Antigen immunization dose was 20ug/chicken for each group in the first round, 10ug/chicken at the second round after 3 weeks, 10ug/chicken at the third round after 2 weeks, and 10ug/chicken at the fourth round after 2 weeks.
  • blood was collected with a syringe and antibody production was confirmed through ELISA in which serum binds to antigen.
  • variable regions of the antibody light and heavy chains and the scFv fragment linking them with a linker were obtained, cloned into a phagemid vector pComb3X with restriction enzyme Sfi I for phage display, and F' capable of infecting M13 helper phage pili-bearing E. coli ER2738 was electroporated.
  • the complexity of the scFv library was confirmed as shown in Table 2.
  • Anti-chicken CNTN4 scFv library (Number of the binding clones) Chicken number 1-3 1-4 3-2 3-5 Whole blood 1.5 x 10 8 4.0 x 10 8 1.4 x 10 9 9.3 x 10 8 bone marrow - 4.7 x 10 8 9.3 x 10 8 1.5 x 10 9 Spleen 3.5 x 10 8 - - 9.2 x 10 8 Bursa Fabricius 1.2 x 10 9 - - 1.3 x 10 9
  • phage is mixed with 50 ⁇ L of protein A and immunoglobulin complex and incubated at 37°C for 1 hour to remove non-specific binding (Fc binder) (Pre-clearing), PBS (pH 7.4) as a binding buffer, or Competitive elution was performed with antigen in the condition of incubation at 37°C for 4 hours using 50 mM sodium acetate (pH 5.5), and in the elution step, washed with 0.5% tween20 in PBS, and then 100 ⁇ L of anti-CNTN4 chicken serum was added.
  • Fc binder Pre-clearing
  • PBS pH 7.4
  • Competitive elution was performed with antigen in the condition of incubation at 37°C for 4 hours using 50 mM sodium acetate (pH 5.5), and in the elution step, washed with 0.5% tween20 in PBS, and then 100 ⁇ L of anti-CNTN4 chicken serum was added.
  • a total of four conditions were set through a combination of conditions for adding elution (Table 3). It proceeded from round 1 to round 3 or 5 (antigen 20 ⁇ g ⁇ 1 ⁇ g) while controlling the stringency of the phage binding condition for each condition.
  • Phage ELISA was first coated with an antigen (mouse CNTN4 or human CNTN4) on a plate overnight at 4°C, followed by blocking with 3% BSA in PBS for 1 hour. Then, 50 ⁇ L of phage was placed on the antigen-coated plate and incubated for 2 hours.
  • ABTS was added to develop color, and absorbance was measured at 405 nm.
  • ELISA screening was performed on a total of 950 colonies from Chicken Numbers 1-4 and 3-2 libraries and 380 colonies from Chicken Numbers 1-3 and 3-5 libraries, and 138 each as positive clones binding to the antigen CNTN4. And 306 were selected and 26 and 35 unique scFv sequences were selected through sequencing to confirm the scFv sequence, respectively.
  • scFv antibody selected in Example 1.1 For functional evaluation of the scFv antibody selected in Example 1.1, cloning was performed in the form of scFv or human IgG4 (S228P) labeled with constant human kappa (hCk), which is a fusion protein, and transient transfection was performed in Expi293F cells. After binding scFv-hCk or IgG secreted in the culture medium to kappa select, it was purified by pH elution, and after changing to PBS buffer through dialysis, the protein was quantified to obtain scFv-hCk or IgG.
  • S228P human IgG4
  • hCk constant human kappa
  • SEQ ID NO: 1 S1 light chain variable region (VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGSSYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSKSGSTNTLTITGVRAEDEAVYFCGGYDSSIDAFGAGTTLTVL
  • SEQ ID NO: 2 S1 heavy chain variable region (VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
  • SEQ ID NO: 3 S2 light chain variable region (VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSTYYGWYQQKSPGSAPVTVIYNNNNRPSDIPSRFSGSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGGYDGSTDVFGAGTTLTVL
  • SEQ ID NO: 2 S2 heavy chain variable region (VH)
  • Human CNTN4 antigen was expressed on the cell membrane through transient transfection in 293FT cells, and anti-CNTN4 scFv-hCk or Anti-CNTN4 IgG was bound at a concentration of 40 ⁇ g/mL. The dot shift was confirmed by detecting anti-CNTN4 bound to the antigen with anti-hCk-PE or anti-hFc-PE using FACS.
  • Example 2 Anti-CNTN4 chicken-human chimeric IgG4 antibody production and binding affinity confirmation
  • An ELISA test was performed for A-01 prepared in Example 2.1. 200 ng of antigen (human CNTN4-10xHis or mouse CNTN4-10xHis) was coated on an ELISA plate. For antibody binding, serial dilution of A-01 at a maximum of 1 ⁇ M was diluted to 0.0001 nM and bound to antigen. Anti-human Fc-HRP was used as a secondary antibody for antibody detection. The color was developed using ABTS, a color developing reagent, and absorbance at 405 nm was measured. The binding capacity thereof is shown in Table 10.
  • CM5 chip in order to bind anti-human IgG Fc (capture antibody) using amine coupling, a CM5 chip was installed, a running buffer was flowed to activate the chip, and then a capture antibody was attached. After inactivation of dextrin to which no capture antibody was attached using ethanolamine, regeneration was performed using 3M magnesium chloride to remove analytes except for the capture antibody. A-01 prepared at a concentration of 0.05 ⁇ g/mL was flowed for 30 seconds at a rate of 10 ⁇ L/min for binding.
  • human CNTN4 400nM ⁇ 0.78nM prepared by sequential dilution as an antigen was flowed at a rate of 30 ⁇ L/min for 3 minutes to bind and dissociate for 5 minutes. Thereafter, regeneration was performed by flowing a regeneration solution (3M magnesium chloride) at a rate of 20 ⁇ L/min for 30 seconds to remove all analytes attached to the capture antibody. The sequence of A-01 binding, antigen binding, dissociation, and regeneration was repeated for each concentration of antigen. The results are shown in Table 11.
  • the antibody of the present invention binds to human CNTN4 protein with high affinity.
  • Humanized antibody was prepared using A-01.
  • VLA and VHA variable region original sequence
  • VL1 and VH1 a sequence in which the framework region was completely replaced with a human framework region in the variable region original sequence (VLA and VHA) of A-01
  • VL2 and VH2 a sequence that left some of the original sequence of A-01 in VL1 and VH1
  • VL1 and VH1 a sequence that left some of the original sequence of A-01 in VL1 and VH1
  • VL2 and VH2 VH2
  • VH2 and VH2 fully humanized antibody
  • the LAH2, L1H2, and L2H2 antibodies prepared in Example 3.1 were subjected to an ELISA test together with A-01. 200ng of antigen (human CNTN4-10xHis or mouse CNTN4-10xHis) was coated on an ELISA plate. For antibody binding, serial dilution of the antibody at a maximum of 1 ⁇ M was diluted to 0.0001 nM and bound to the antigen. Anti-human Fc-HRP was used as a secondary antibody for antibody detection. The color was developed using ABTS, a color developing reagent, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • the binding capacity thereof is shown in Table 13.
  • Table 13 In the case of the most humanized L1H2, it was confirmed that the difference in binding ability with the CNTN4 protein was within 3 times compared to the A-01 origin.
  • the SPR test was performed on L1H2, which was the most humanized with about 98%. More specifically, in order to bind anti-human IgG Fc (capture antibody) using amine coupling, a CM5 chip was installed, a running buffer was flowed to activate the chip, and then a capture antibody was attached. Dextrin to which no capture antibody was attached was inactivated using ethanolamine, and then regeneration was performed using 3M magnesium chloride to remove analytes except for the capture antibody. L1H2 prepared at a concentration of 0.05 ⁇ g/mL was flowed for 30 seconds at a rate of 10 ⁇ L/min for binding.
  • L1H2 prepared at a concentration of 0.05 ⁇ g/mL was flowed for 30 seconds at a rate of 10 ⁇ L/min for binding.
  • human CNTN4 400nM ⁇ 0.78nM prepared by sequential dilution as an antigen was flowed at a rate of 30 ⁇ L/min for 3 minutes to bind and dissociate for 5 minutes. Thereafter, regeneration was performed by flowing a regeneration solution (3M magnesium chloride) at a rate of 20 ⁇ L/min for 30 seconds to remove all analytes attached to the capture antibody. For each concentration of antigen, the sequence of L1H2 binding, antigen binding, dissociation, and regeneration was repeated.
  • the A-01 antibody has a sufficiently high binding affinity to the CNTN4 protein even when it is 98% humanized.
  • Example 4 CNTN4 neutralizing ability test using human T cells of A-01 and L1H2 antibodies
  • a final 50 mL of a-CD3 antibody at a concentration of 4 mg/mL and CNTN4 recombinant protein at a concentration of 150 nM were put into a 96-well plate and incubated at 37° C. for about 16 hours.
  • the PBMC cells obtained in the above experiment were resuspended by adding 1,000 ⁇ L of MACS buffer per 2 X 10 8 cells. The solution was divided in half, and one half was put in a CD4 tube and one half in a CD8 tube. For each group of PBMC 1 X 10 8 , 50 ⁇ L of antibody cocktail was added, resuspended, and stored at room temperature for 10 minutes. 100 ⁇ L of anti-biotin microbead per PBMC 1 X 10 8 was added, resuspended, and stored at room temperature for 10 minutes. Meanwhile, the MACS magnetic field was sterilized and placed in a clean bench to install two LS columns (for CD4 and for CD8).
  • the incubated plate was washed twice with 200 ⁇ l of PBS, and 1.5 mM and 3 mM, respectively, of A-01 and L1H2 were added to a final 50 mL of CNTN4-treated wells into a 96-well plate. Incubated at 37° C. for about 4 hours.
  • the incubated plate was washed twice with 200 mL of PBS, and 200 mL of T cells were added to each well, and then stored in a 5% CO 2 incubator at 37° C. for 3 days. After 3 days, T cells were obtained and transferred to a FACS tube, and the degree of CFSE-stained cell differentiation was observed using a FACS instrument.
  • the CNTN4 antibody of the present invention effectively neutralized CNTN4 and suppressed its T cell inhibitory function.

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Abstract

본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 세포-매개성 면역 반응을 상향조절하는 T 세포를 활성화하기 위한 이의 용도, 예컨대 암 치료용 용도에 관한 것이다.

Description

항-CNTN4 항체 및 그의 용도
본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 T 세포를 활성화하기 위한 이의 용도, 예컨대 암 치료용 용도에 관한 것이다.
인체는 외부의 침입자(바이러스, 독소 등)와 내부의 해로운 변화(암세포 돌연변이)로부터 스스로를 보호하는 방어체계를 갖추고 있다. 암세포는 정상세포와 달리 표면에 특이항원이 존재하여 암 발생 초기 단계에서는 면역체계에 의해서 파괴된다. 이후 무한 증식하고자 하는 암세포와 이를 공격하려는 면역세포의 힘이 균형이 무너지게 되면 암세포가 본격적인 증식을 개시한다. 암세포가 더 성장하게 되면 체내 면역시스템을 교란하는데 이때 일부 암세포는 면역세포의 면역 관문을 활용하면서 면역을 회피하는데, 면역 관문 억제제가 면역 관문을 억제하면 면역세포의 힘이 증강되어 암세포가 사멸하게 된다.
면역 관문 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서 CTLA-4, PD-1, PD-L1 억제제 등이 있다. 현재 시판 중인 대표적 약제로는, CTLA-4 단클론항체로 ipilimumab (상품명: YERVOY®)가 있고, PD-1 단클론항체로 nivolumab (상품명: OPDIVO®), pembrolizumab (상품명: KEYTRUDA®) 등이 있으며, PD-L1 단클론항체로 atezolizumab (상품명: TECENTRIQ®), durvalumab (상품명: IMFINZI®)등이 있다.
그러나 여전히 기존 면역 관문 억제제로는 치료되지 않는 암종이 있으므로, 새로운 항암 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다. 특히 본 발명은 CNTN4 단백질과 결합하여 CNTN4의 면역 회피 기전을 중화하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하여, CNTN4의 면역 회피 기전을 차단해 T 세포를 활성화시킴으로써, T 세포 활성 저하로 인한 질병, 예컨대 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하여, CNTN4 단백질의 분석 또는 검출용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 CNTN4 단백질, 예컨대 인간 또는 마우스 CNTN4 단백질과 특이적으로 결합하여 CNTN4의 면역 회피 기전을 중화시킨다. 이에 따라 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 CNTN4에 의해 억제되었던 T 세포, 예컨대 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성을 증가시킬 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은
서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명은
서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명은
서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명의 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, 단일 쇄 항체 scFv, (Fab')2 단편, 단일 도메인 항체, 디아바디 (dAb), 또는 선형 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 단편일 수 있고, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 추가 항암제, 예컨대 면역 관문 억제제 또는 화학요법제와 함께 사용되거나, 또는 방사선 치료요법과 함께 사용될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, CNTN4 단백질의 분석 또는 검출용 조성물을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 유효량의 추가 항암제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 추가 항암제로서는 예컨대 면역 관문 억제제 또는 화학요법제가 사용될 수 있다.
본 발명의 신규한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, CNTN4의 면역 회피 기전을 차단해 T 세포를 활성화시킴으로써, T 세포 활성 저하로 인한 질병, 특히 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 항-CNTN4 항체를 사용시, 기존의 면역항암제로 치료 효과를 달성할 수 없었던 암에 대해 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
도 1 및 2는 phage display library를 통해 선별된 scFv 항체 단편의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 실선 및 파선 표시된 서열은 각 영역의 CDR 서열을 나타낸다.
도 3은 anti-CNTN4 인간화 항체를 제조하기 위해 사용된 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4은 본 발명의 항체 A-01 및 L1H2가 CNTN4 단백질을 효과적으로 중화시켜 T 세포를 증식시킴을 보여준다.
항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편
본 발명은 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
을 포함한다.
표 1은 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 각 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR 서열을 나타낸다.
Figure PCTKR2022004890-appb-T000001
Figure PCTKR2022004890-appb-I000001
Figure PCTKR2022004890-appb-I000002
Figure PCTKR2022004890-appb-I000003
또다른 구체적 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 4 및 표 5에 언급된 각 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 쌍(pair)를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다(S1). 유사하게, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다(S2). 다른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 역시 동일한 방식으로 2개의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 쌍(pair)를 포함할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 구체적 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 12에 언급된 각 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 쌍(pair)를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다(LAH2). 유사하게, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다(L1H2). 다르게는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다(L2H2).
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에서 경쇄 또는 중쇄 가변 영역이 특정 아미노산 서열을 포함한다는 것은, 해당 아미노산 서열 전체를 포함하는 경우, 해당 아미노산 서열 전체를 갖는 경우, 또는 해당 아미노산 서열로 이루어진 경우를 모두 의미한다.
일례에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 서열번호 116의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함한다.
또다른 예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 70의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 88의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 116의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 경쇄 CDR3; 서열번호 58의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 89의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 115의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함한다.
또다른 예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1; 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2; 서열번호 116의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3; 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1; 서열번호 89의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 115의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함한다.
또다른 예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 156의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 159의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 156의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 159의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 예로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 서열번호 156의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 서열번호 159의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는", "포함하다", 또는 이의 변형된 어구는 개방적인 의미를 나타낸다. 일 예로서, 열거된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 본질적이든 그렇지 않은 간에, 열거되지 않은 추가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "~으로 본질적으로 이루어진다" 또는 이의 변형된 어구는 임의의 언급된 요소들을 포함하며, 그 실시 형태의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소들의 존재를 허용한다. 일 예로서, 열거된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 항체 또는 그의 단편의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "~로 이루어진다" 또는 이의 변형된 어구는 각각의 구성요소가 실시 형태의 그 설명에서 언급되거나 나열되지 않은 어떠한 요소도 허용하지 않는 경우를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역"(CDR; CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 영역은 전형적으로, CDR1, CDR2, 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 scFv의 프레임워크 영역이 완전히 또는 부분적으로 인간화된 서열을 포함할 수 있다. 부분적으로 인간화된 서열의 경우, 완전히 인간화된 서열과 비교하여 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 인간화된 것일 수 있으며, 완전히 인간화된 서열 중 일부(예컨대 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 등)가 back mutation된 것일 수 있다. 상기 인간화된 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 인간화되지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 비교하더라도, CNTN-4에의 결합능이 동등하거나 또는 실질적으로 크게 차이가 나지 않는 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 중에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예를 들어 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 단백질 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서의 "항체"라는 용어는 온전한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 그의 항원 결합 단편, 항체 단편, 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
항체에는 immunoglobulin(Ig)M, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변 영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있으며, 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-sheet로 구성되어 있고 이들 사이에 intramolecular disulfide bond가 연결되어 있다.
본원에서 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 "A-01"로 지칭한다.
또한 본원에서 서열번호 156의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 159의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 "L1H2"로 지칭한다.
본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열은 하나의 종으로부터 유래하고, 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래하는 항체, 예를 들어, 가변 영역 서열은 마우스 또는 닭 항체로부터 유래하고, 불변 영역 서열은 인간의 항체로부터 유래하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "인간화된 항체"는 다른 포유 동물 종 예를 들어, 마우스 또는 닭의 생식 계열로부터 유래하는 CDR 서열이 인간의 frame work 서열에 삽입된 항체를 의미한다. Frame work 서열은 추가로, 예컨대 back mutation 방식을 통해 재변형될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는, frame work 및 CDR 영역이 모두 인간 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 항체의 불변 영역 역시 인간의 면역글로불린 서열로부터 유래한다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 전형적으로 적어도 모 항체의 항원 결합의 적어도 일부 또는 가변 영역(예를 들면, 하나 이상의 CDR)을 포함하는 항원 결합 단편 및 항체의 유사체를 의미한다. 항체 단편은 모 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 보유한다. 본원에서 사용될 수 있는 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, 단일 쇄 항체 scFv, (Fab')2 단편, 단일 도메인 항체, 디아바디 (dAb), 또는 선형 항체이나, 이로 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편을 지칭한다.
Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기가 추가된 점에서 Fab 단편과 상이하다.
Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다.
F(ab')2 항체 단편은 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 통해 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성된다.
Fv는 완전한 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역이 단단하게 비-공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 이들 2개 영역이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (중쇄 및 경쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 영역일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
단일 쇄 항체 scFv는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결되어 있는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 본원에서는 scFv 항체 단편, 항원 결합 단편 scFv, scFv 항체, 항체 scFv, 또는 간단히 scFv로 지칭되기도 한다.
디아바디(diabody)는 V 도메인의 사슬간이 아닌 사슬내 쌍형성이 달성되어 2가 단편, 즉, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록, VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 사용하여 scFv 단편을 구성함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "가교" scFv 단편으로 이루어진 이종이량체이다.
본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CNTN4 단백질, 바람직하게는 인간 또는 마우스 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "~ 에 특이적으로 결합하다" 또는 "~ 에 특이적인" 이란, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종 집단의 존재 하에서 표적의 존재에 대해 결정력이 있는 것을 의미하는 것으로, 표적과 항체 사이의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 특정 표적(예: 에피토프)에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 표적에 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 더 큰 결합력으로, 더 손쉽게 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "인간 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는"이란, 인간 CNTN4 단백질과 해리 상수 (Kd) 5Х10-7 M 이하로 결합하거나, 바람직하게는 1Х10-7 M 이하로 결합하는 항체를 의미할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 5 X 10-7 M 이하의 해리 상수 (Kd)로, 바람직하게는, 1Х10-7 M 이하의 Kd로 인간 CNTN4 단백질에 결합하는 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하며, 상기 상수는 M의 단위를 갖는다. 항체에 대한 Kd값은 당 업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 항체의 Kd값을 측정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명법(SRP; surface plasmon resonance), 바람직하게는 바이오센서 시스템 예를 들어, 바이어코어(Biacore)® 시스템을 사용하는 방법이 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일 특이적이며, 단일 에피토프, 즉, CNTN4 단백질에 특이적으로 결합한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다중특이적, 예컨대 이중특이적 또는 삼중특이적 항체 분자이다. 다중특이적 항체 분자는 복수개의 가변 영역을 포함하며, 각각의 가변 영역은 서로 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 일 구현예에서, 이중특이적 항체 분자의 제1 가변 영역은 제1 에피토프, 예컨대, CNTN4 단백질에 대해 제1 결합 특이성을 가지며, 제2 가변 영역은 제2 에피토프, 예컨대, CNTN4 단백질 이외의 목표 단백질(예를 들어, CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1을 포함하나, 이로 제한되지 않음)에 대해 제2 결합 특이성을 가진다. 일 구체적 실시예에서, 이중특이적 항체 분자는 CNTN4; 및 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1 중 어느 하나에 특이적으로 결합한다. 또다른 구체예에서, 상기 분자의 임의의 조합은 다중특이적 항체 분자, 예를 들어 CNTN4에 대한 제1 결합 특이성, 및 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1 중 2종 이상에 대한 제2 및 제3 결합 특이성을 포함하는 삼중특이적 항체로 제조될 수 있다. 본 발명의 다중특이적 항체 분자는 당업자에게 공지된 표준 분자 생물학적 기법 (예로, 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술학)을 사용하여 제작될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체-약물　컨쥬게이트(ADC)를 형성할 수 있다.　본원에 사용된 용어 "항체-약물　컨쥬게이트(antibody-drug　conjugate)"또는 "ADC"는 식 M-[L-D]n으로 표시될 수 있는데, 여기서 M은 항체 분자, 즉, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 나타내고, L은 선택적인(optional) 링커 또는 링커 단위이고, D는 적합한　약물　또는 전구약물이고, n은 약 1에서 약 20까지의 정수이다. ADC에 포함되는 약물은 본 발명의 항체의 특이적 결합을 방해하지 않는 한, 치료 또는 진단 용도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약물은 세포독성제(예를 들어, 화학요법제), 프로드러그 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. ADC에 포함될 수 있는 약물 및 링커와 이의 제조 방법에 대해서는 당업계에 공지된 방법에 따를 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 ELISA assay로 측정시 5 nM 이하, 바람직하게는 3 nM 이하, 더욱 바람직하게는 2 nM, 더더욱 바람직하게는 1 nM 이하의 EC50으로 CNTN4 단백질(예컨대 인간 또는 마우스 CNTN4 단백질)에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "EC50"은 항체를 사용하는 시험관내 또는 생체내 분석과 관련된 용어로서, 최대 반응의 50 %, 즉 최대 반응과 베이스라인(기준선)의 중간 반응을 유도하는 항체의 농도를 의미한다.
핵산 분자 및 벡터
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산은 전 세포나 세포 용해물 중에 존재할 수 있거나, 또는 구체적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 기타 세포 성분 또는 기타 오염 물질 예를 들어, 기타 세포 핵산 또는 단백질이 표준적인 기술 예를 들어, 알칼리성/SDS 처리법, CsCl 밴드 형성법(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동법 및 기타 당업계에 널리 알려진 방법에 의해 정제되어 제거되었을 때의, "분리된" 또는 "실질적으로 순수하게 단리된" 핵산이다.
본 발명의 핵산은 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
일 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 영역, 중쇄 영역, 또는 경쇄 및 중쇄 영역 모두를 암호화하며, 바람직하게는, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 또는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두를 암호화한다. 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 18 또는 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하거나, 서열번호 2 또는 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 다르게는, 본 발명의 핵산 분자는 항체 A-01 또는 항체 L1H2를 암호화한다.
일단 VL 및/또는 VH 영역을 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 이와 같은 DNA 단편은 예를 들어, 표준적인 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작되어, 그 결과 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환할 수 있다. 이와 같은 조작 과정에 있어서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 다른 단백질 예를 들어, 항체 불변 영역, 예컨대 hIgG1 Fc 영역(hFc) 또는 hCκ 영역, 또는 가요성 링커를 암호화하는 기타 DNA 단편에 작동 가능하도록 결합된다. 본원에서 사용된 용어 "작동가능하도록 결합된"이란, 2개의 DNA 단편들이 결합되어, 2개의 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame) 상태로 남아있게 되는 경우를 의미한다.
VH 부위를 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)를 암호화하는 기타 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다.
Fab 단편 중쇄 유전자에 있어서, VH-암호화 DNA는 오로지 중쇄 CH1 불변영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하도록 결합될 수 있다.
scFv 유전자를 생산하기 위해서, VL- 및 VH-암호화 DNA 단편은 가요성 링커 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 암호화하는 기타 단편에 작동 가능하도록 결합될 수 있으며, 그 결과, VL 및 VH 서열은, 가요성 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 부위를 가지는 연속 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열, 예컨대 RNA 또는 DNA는 다양한 공급원으로부터 분리되고, 유전공학처리되고, 증폭되고/되거나 재조합에 의해 발현될 수 있다. 세균, 예를 들면, 효모 이외에 곤충 또는 포유동물 시스템을 포함한 임의의 재조합 발현 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터로의 서브클로닝, 표지 프로브, 서열분석 및 하이브리드화와 같은 핵산 조작은 당업계에 알려진 바에 따라 수행될 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 재조합 벡터, 클로닝 벡터, 발현 벡터와 상호교환적으로 사용되는, 원핵 및/또는 진핵 세포에서 자가 복제가 가능한 DNA 분자를 일컫는 것으로, 일반적으로 유전자 또는 DNA 단편을 세포 등으로 전달하기 위한 중간 전달체로 사용된다. 벡터는 통상 원핵 및/또는 진핵세포에서 복제할 수 있는 복제원점, 항생제 분해 효소와 같은 특정 조건/물질에 저항성을 부여할 수 있는 선별 마커 유전자, 진핵 또는 원색 세포에서의 유전자의 전사가 가능한 프로모터, 번역이 가능한 서열을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
벡터의 한 유형은 "플라스미드"로, 이는 추가의 DNA 단편이 접합될 수 있는 원형 이중 표준 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또다른 유형은 추가의 DNA 단편이 바이러스 게놈에 접합될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터들은 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예를 들면, 세균성 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터).
본 발명은 또한 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 포유류, 식물, 곤충, 진균 또는 박테리아 기원의 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 박테리아 세포는 그람(Gram)-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아, 예를 들어, Escherichia 속의 몇몇 종, 예를 들어, E. coli 및 Pseudomonas 유래의 세포를 포함한다. 진균 세포 군에서, 바람직하게는 효모 세포가 사용될 수 있다. 효모에서의 발현은 효모 균주, 예를 들어, 특히, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae 및 Hansenulapolymorpha를 사용할 수 있다. 또한, 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 Sf9 유래의 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
또한, 포유류 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 시미안 COS 세포, BHK 세포, NSO 세포 또는 Bowes 흑색종 세포를 이용한 발현 시스템을 이용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 궁극적으로 인간에게 투여될 것이므로, 완전한 인간 발현 시스템이 특히 바람직할 수 있다. 이 경우 숙주 세포는 인간 세포, 예컨대 HeLa, 911, AT1080, A549, 293 및 HEK293 세포일 수 있다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종래 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 항체, 예컨대 모노클로날 항체는 당업계에 달려진 방법에 따라 시험 대상체(예: 마우스)에게 CNTN4 항원을 주입시킨 후, 목적하는 서열 또는 기능적 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리시킴으로써 제조할 수 있다.
모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법(예를 들면, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 즉시 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터 내로 위치시킨 후, 숙주 세포, 예를 들면, E. coli 세포, 시미안 COS 세포, CHO 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체디스플레이 기술, 예컨대 파지 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
항체의　파지 라이브러리는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를　파지미드 벡터(phagemid vector) 안에 파지 표면 단백질(pIII)에 융합시킨 형태로 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 후, M13 helper　phage를 감염시켜,　파지의 표면에 다양한 조합의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 갖는 항체 절편(scFv　또는　Fab)이 디스플레이된 항체 라이브러리(library)를 제조한다.　이 라이브러리로부터 패닝(panning)　방법을 이용하여 특정 항원에 결합하는 항체의 절편을 분리하고,　분리된 항체 절편의 특성을 규명한 후,　whole IgG　형태로 전환하여 동물세포에서 대량 발현시킴으로써 특정한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
본원에서 사용된 용어 "파지미드 벡터"는 파지복제시작점(phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이며, 통상적으로 항생제내성유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지 디스플레이에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 또는 그 일부가 포함되어 있으며, ScFv 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 형질전환체를 통해 발현된다.
"헬퍼 파지(helper phage)"는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 헬퍼 파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 또는 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파지에 감염된 형질전환체를 선택할 수 있도록 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.
용도 및 방법
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CNTN4 단백질의 결합에 의해 억제된 면역 반응을 회복시킨다. CNTN4 단백질은 T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제함이 밝혀졌다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합함으로써 T 세포 활성, 특히 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성을 증가시켜, 면역 억제와 관련된 질병 치료에 사용될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 T 세포 활성을 증가시킨다. 이에 따라 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 T 세포, 특히, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 활성화시키는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CNTN4에 의해 억제되었던 T 세포의 증식을 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 우수한 CNTN4 중화능을 갖는다.
이에 따라 본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 T 세포 활성화 유도에 관한 것이다. 일 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, T 세포 활성화의 유도 또는 강화하는 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 T 세포 활성화의 유도 또는 강화를 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, T 세포 활성화의 유도 또는 강화를 위한 약학 조성물을 제공한다.
이에 따라 본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 면역 억제 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료에 관한 것이다.
일 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 억제 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 면역 억제 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료를 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 면역 억제 관련 질병의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.본원에서 사용된 용어 "대상체"는, 인간과 비-인간 동물을 모두 포함하는 의미이다. 비-인간 동물로서는 모든 척추 동물, 예를 들어, 포유동물과 비-포유 동물 예를 들어, 인간 이외의 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하나, 예를 들어, 인간 이외의 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유동물이 바람직하다. 바람직한 대상체로는 면역 반응 활성화 또는 강화가 요구되는 인간이다.
바람직하게는, 본 발명의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CNTN4 단백질의 결합을 차단함으로써 T 세포를 활성화시키고/거나, 암환자 내 암 세포에 대한 면역 반응을 강화할 수 있어, 생체 내에서 암 세포의 성장을 억제하여, 암을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 유효량의 추가 항암제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 추가 항암제는 면역 관문 억제제 또는 화학요법제일 수 있고, 상기 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 상기 유효량의 추가 항암제는 하나의 제제로 동시에 대상체에 투여되거나, 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하였을 때 성장이 억제될 수 있는 바람직한 암으로서는 통상적으로 면역 요법에 반응을 나타내는 암을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 암에는 흑색종(예를 들어, 전이 악성 흑색종), 신장 암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선 암(예를 들어, 호르몬 난치성 전립선 선암종), 유방암, 대장암, 직장암, 결장암 및 폐암(예를 들어, 비-소형 세포 폐암)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 치료 대상은 본 발명의 항체를 사용할 때 성장이 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성 종양을 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 또다른 암의 예로서는 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 및 안구 내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환 암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 여성 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장 암, 내분비 시스템 암, 갑상선 암, 부갑상선 암, 부신 암, 연조직 육종, 요도 암, 음경암, 만성 및 급성 백혈병 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 어린이 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물 형성증, 1차 CNS 림프종, 종양 신생 혈관 형성, 척수 축 종양, 뇌간 교세포종, 뇌하수체 선암종, 카포시 육종, 표피양 암, 편평 상피 세포 암, T 세포 림프종, 환경에 의해 유발되는 암 예를 들어, 석면에 의해 유발되는 암과, 이들 암의 조합을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 암은 CNTN4를 발현하는 암일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 암은 기존의 면역 관문 억제제에에 불응성이거나 또는 내성을 나타내는 것일 수 있다(예를 들어, PD-1 경로 억제제, PD-L1 경로 억제제 또는 CTLA-4 경로 억제제에 내성).
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단독으로 또는 다른 항암 요법과 함께 사용될 수 있다. 다른 항암 요법으로는, 예를 들어, 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선 치료요법 또는 수술); 또는 기타 항암제, 예를 들어, 세포독성제, 세포증식억제제, 항-혈관형성 또는 항대사산물제, 종양표적제, 면역 자극 또는 면역 조절제 또는 세포독성제, 세포증식억제제, 또는 기타 독성제에 접합된 항체, 면역 관문 억제제 등을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다른 항암제, 예컨대 면역 관문 억제제, 화학요법제, 또는 방사선 치료요법과 함께 병용 요법으로 사용될 수 있다. 상기 면역 관문 억제제는 예를 들어, 항-CTLA-4 항체(예: ipilimumab), 항-PD-1 항체(예: pembrolizumab, nivolumab), 또는 항-PD-L1 항체(예: atezolizumab, avelumab, durvalumab)일 수 있다. 상기 화학요법제에는 알킬화제, 항대사물질, 키나제 억제제, 스핀들 독성 식물 알칼로이드, 세포 독성/항종양 항생제, 토포아이소머라제 억제제, 감광제, 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM), 항프로게스테론, 에스트로겐 수용체 하향 조절제(ERD), 에스트로겐 수용체 길항제, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작용제, 항안드로겐, 아로마타제 억제제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 비정상 세포 증식 또는 종양 성장에 연루된 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 화학요법제의 구체적인 일례로는, 젬시타빈, 비노렐빈, 에토포시드 (VP-16), 백금유사체, 예를 들어, 시스플라틴 또는 카보플라틴, 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀, 알부민-결합 파클리탁셀, 도세탁셀 등을 포함한다. 또다른 암 치료제로서, 항암 효과를 나타내는 프로바이오틱스, 예컨대 락토코커스 락티스 GEN3013 (Lactococcus lactis GEN3013) 균주 (KCTC13426BP), 락토코커스 락티스 GEN3033 (Lactococcus lactis GEN3033) 균주 (KCTC13684BP), 비피도박테리움 비피덤 MG731 (Bifidobacterium bifidum MG731) 균주 (KCTC13452BP) 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 다른 항암제와 함께 사용될 때, 이들은 별도 투여하거나 복수의 활성 성분들이 하나의 약학적 제제에 존재하는 조합 제품의 형태로 적용될 수 있다. 이들이 별도의 제제로 투여되는 경우, 두 제제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 동시 투여의 경우, 이들은 환자에 함께 제공된다. 순차 투여의 경우, 길지 않은 시간으로 시간차를 투어 제공될 수 있으며, 예컨대 12시간 이하, 또는 6시간 이하의 기간 내로 환자에게 투여될 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 항원 결합 단편을 추가 항암제와 병용하여 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 억제 관련 질환, 예컨대 암의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 실시태양은 항-CNTN4 항체 또는 항원 결합 단편을 추가 항암제를 하나의 조성물에 함께 포함하여 동시에 투여하는 것은 물론, 이들 각각이 별개로 포함된 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 동시에 또는 순차로 투여하는 것을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 면역 억제 관련 질병, 예컨대 암의 예방, 개선 또는 치료를 위해, 추가 항암제와 병용하기 위한 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가 항암제를 포함하는, 면역 억제 관련 질병, 예컨대 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 조합물을 제공한다. 본원에서 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가 항암제를 포함하는 약학 조성물 또는 조합물은 두 성분이 물리적으로 함께 하나의 제제 형태로 존재하는 경우뿐 아니라, 동시에 또는 순차적으로 별도의 제제로 동시에 또는 순차로 투여되는 경우를 포함하며, 이 때 두 약물은 개별적으로 제공될 수도 있고 또는 하나의 키트에 함께 제공될 수도 있다. 이에 따라 본 발명은, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 추가 항암제를 포함하는, 면역 억제 관련 질병, 예컨대 암의 예방, 개선 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 추가 항암제는 바람직하게는, 면역 관문 억제제, 더욱 바람직하게는, 항-CTLA-4 항체(예: ipilimumab), 항-PD-1 항체(예: pembrolizumab, nivolumab), 또는 항-PD-L1 항체(예: atezolizumab, avelumab, durvalumab)일 수 있다.
또다른 바람직한 추가 항암제로는, 화학요법제, 예컨대, 젬시타빈, 비노렐빈, 에토포시드 (VP-16), 백금유사체, 예를 들어, 시스플라틴 또는 카보플라틴, 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀, 알부민-결합 파클리탁셀, 또는 도세탁셀일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 함께 사용되는 또다른 바람직한 추가 항암 요법으로서, 방사선 치료요법을 들 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 사용하여 시료 중 CNTN4 단백질의 존재를 검출하는 방법, 또는 항-CNTN4 항체의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 CNTN4 단백질과 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 시료 및 대조군 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이후, 상기 복합체가 형성되었는지 여부를 검출하는데, 여기서, 대조군 시료에 비하여, 시료 사이의 복합체 형성 정도에 차이가 있는 것은 곧, 시료(예컨대 혈액) 중 인간 피 항원이 존재한다는 증거가 된다.
이에 따라 본 발명은 상기 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.
약학 조성물
본 발명은 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 비활성 성분, 즉, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다[Handbook of Pharmaceutical Excipients 등 참조]. 치료학적 및 진단 제제의 조성물은 예를 들면, 냉동건조된 분말, 슬러리, 수성용액 또는 현탁액의 형태로 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합합으로써 제조할 수 있다.
적합한 투여 경로는 비경구 투여, 예를 들면, 근육내, 정맥내, 또는 피하내 투여를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 사용되거나 또는 본 발명의 방법을 실행하기 위해 사용된 항체의 투여는 국소 적용 또는 피부, 피하, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사와 같은 각종 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 일 실시태양에서, 본 발명의 항체는 정맥내 또는 피하내 투여된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이하의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들로 한정되지는 않는다.
실시예 1: CNTN4 특이적 결합 scFv 항체 선별
1.1 scFv 항체 라이브러리 제작 및 항체 선별
(1) Chicken scFv 항체 라이브러리 제작
Chicken 15마리를 5마리씩 세 그룹으로 나누어 제1그룹은 mouse CNTN4, 제2그룹은 human CNTN4, 제3그룹은 mouse CNTN4와 human CNTN4를 번갈아 가며 총 4차에 걸쳐 접종하여 항체를 생성시켰다. 항원 접종량은 최초 1회차에 각 그룹에 대해 20ug/chicken, 3주 뒤 2회차에 10ug/chicken, 2주 뒤 3회차에 10ug/chicken, 2주 뒤 4회차에 10ug/chicken으로 면역하였다. 각 회차의 항원 접종 전에 주사기로 채혈하여 serum을 항원에 결합시키는 ELISA를 통하여 항체 생성 여부를 확인하였다. 3차 접종 후 human CNTN4와 mouse CNTN4에 대해 ELISA에서 모두 반응성을 보이는 항체 생성이 확인된 총 4마리를 선정하였는데, 구체적으로는, 제1그룹의 3rd Chicken(이하 1-3이라 지칭함; 이하 동일), 1-4, 3-2, 3-5가 선정되었다. sacrifice후 blood, spleen, bone marrow, bursa fabricius를 적출하고, total RNA를 추출하였다. 주 RNA인 28S rRNA가 잘 확인되었으며 면역 항체 라이브러리 PCR을 위하여 추출한 RNA를 template로 SuperScriptTM IV First-Strand Synthesis System (Invitrogen, # 18091050) 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR을 통해 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역 부분과 이를 linker로 연결한 scFv fragment를 확보하고 phage display를 위하여 restriction enzyme Sfi I으로 phagemid vector인 pComb3X에 cloning 하고, M13 helper phage를 infection 할 수 있는 F' pili 를 가지고 있는 E.coli ER2738에 electroporation하였다. scFv library의 complexity를 표 2와 같이 확인하였다.
Anti-chicken CNTN4 scFv library
(Number of the binding clones)
Chicken number 1-3 1-4 3-2 3-5
Whole blood 1.5 x 108 4.0 x 108 1.4 x 109 9.3 x 108
Bone marrow - 4.7 x 108 9.3 x 108 1.5 x 109
Spleen 3.5 x 108 - - 9.2 x 108
Bursa Fabricius 1.2 x 109 - - 1.3 x 109
(2) scFv 항체 선별
표 2의 Chicken Number 1-3, 1-4, 3-2, 및 3-5에 대하여 각각 pooling 하고 phage amplification하여 biopanning을 진행하였다. 보다 구체적으로 phage를 50μL의 protein A 및 immunoglobulin complex와 섞어서 37℃에서 1시간 동안 incubation을 하여 non-specific binding (Fc binder)을 제거하는 조건 (Pre-clearing), binding buffer로서 PBS (pH 7.4) 또는 50mM sodium acetate (pH 5.5)를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 incubation하는 조건, 및 elution 단계에서 항원으로 competition elution을 진행하고 0.5% tween20 in PBS로 세척 후, 100μL의 anti-CNTN4 chicken serum을 첨가하여 elution을 추가하는 조건의 조합을 통한 총 4가지 조건 (A-D)을 설정하여 수행하였다(표 3). 각 조건 별 항원에 대한 phage 결합조건의 stringency를 조절하면서 1 round에서 3 round 또는 5 round까지 진행하였다 (항원 20μg~ 1μg).
Phage display strategy
조건 A B C D
Pre-clearing Yes No No No
Binding buffer PBS (pH 7.4) PBS (pH 7.4) PBS (pH 7.4) 50mM Sodium acetate (pH 5.5)
Elution 항원 & Serum 항원 & Serum 항원 항원 & Serum
후보항체 선별을 위하여 3 또는 5 round의 output colony에서 phage rescue 후, 예를 들어 single colony를 배지에 찍어 넣고 OD600nm 0.7~0.8까지 배양하여 helper phage infection 후 overnight 배양하고 원심 분리하여 phage 배양액을 얻은 후, phage ELISA를 진행하였다. Phage ELISA는 먼저 plate에 항원 (mouse CNTN4 또는 human CNTN4)을 4℃에서 overnight coating 한 후 3% BSA in PBS 로 1시간 동안 blocking 하였다. 이후 phage 50μL를 항원이 coating된 plate에 넣고 2시간 동안 incubation하였다. 2차 항체인 anti-HA-HRP와 1시간 동안 incubation 후 ABTS를 넣고 발색시켜 405nm에서 흡광도를 측정하였다. Chicken Number 1-4와 3-2 library로부터 총 950개, 그리고 Chicken Number 1-3과 3-5 library로부터 총 380개의 colonies에 대한 ELISA screening을 진행하여 항원인 CNTN4에 결합하는 positive clone으로서 각 138개 및 306개를 selection하고 scFv 서열을 확인하기 위한 sequencing을 통해 각 26개 및 35개의 unique scFv sequence가 선별되었다.
1.2 scFv의 발현 및 정제
실시예 1.1에서 선별된 scFv 항체의 기능적 평가를 위하여 fusion protein형태인 constant human kappa (hCk)로 표지된 scFv또는 human IgG4(S228P) 형태로 cloning하고 Expi293F cell에 transient transfection을 진행하였다. 배양액에 secretion된 scFv-hCk 또는 IgG를 kappa select에 결합시킨 후 pH elution하여 정제하였고 dialysis를 통해 PBS buffer로 변경한 후 단백질을 정량하여 scFv-hCk 또는 IgG를 확보하였다.
그 결과 총 25개의 scFv-hCk와 총 27개의 IgG4가 발현됨이 확인되었고, 발현된 각 scFv의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도 1 및 도 2, 표 4 및 표 5에 나타내었다(도 1 및 도 2에서 실선 및 파선 표시된 서열은 각 영역의 CDR 서열을 나타낸다.)
서열번호 영역 서열
서열번호 1 S1 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGSSYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSKSGSTNTLTITGVRAEDEAVYFCGGYDSSIDAFGAGTTLTVL
서열번호 2 S1 중쇄 가변 영역(VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 3 S2 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSTYYGWYQQKSPGSAPVTVIYNNNNRPSDIPSRFSGSGSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGGYDGSTDVFGAGTTLTVL
서열번호 2 S2 중쇄 가변 영역(VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 4 S3 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGSSYGWYQQKAPGSAPVTLIYDNTNRPSNIPSRFSGSTSGSTGTLTITGVRAEDEAVYFCGGYDGSTDAFGAGTTLTVL
서열번호 2 S3 중쇄 가변 영역(VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 5 S4 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGESVKITCSGGGSSYYGWYQQKSPGSAPVTLIYQNTNRPSNIPSRFSGSGSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGGYDGSTDVFGAGTTLTVL
서열번호 6 S4 중쇄 가변 영역(VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYASAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 7 S6 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVKITCSGGSGNYGWYQQKSPGSAPVTVIYNGNNRPSDIPSRFSGSGSGSTNTLAITGVQAEDEAVYFCGGYDGTIDAFGAGTTLTVL
서열번호 2 S6 중쇄 가변 영역(VH) AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 8 S7 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVEITCSGGSGSYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSGSDSTGTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSIEVIFGAGTTLTVL
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서열번호 8 S9 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVEITCSGGSGSYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSGSDSTGTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSIEVIFGAGTTLTVL
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서열번호 8 S24 경쇄 가변 영역(VL) ALTQPSSVSANPGETVEITCSGGSGSYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSGSDSTGTLTITGVQADDEAVYYCGSYDSIEVIFGAGTTLTVL
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1.3 선별된 scFv 항체의 CNTN4 결합능력 확인
(1) ELISA에 따른scFv의 항원 단백질에 대한 결합능 확인
실시예 1.2에서 발현이 확인된 총 25개의 scFv-hCk와 총 27개의 IgG에 대한 ELISA 시험을 진행하였다. 200 ng의 항원 (human CNTN4-rabbit Fc 또는 mouse CNTN4-rabbit Fc)을 ELISA plate에 coating 하였다. Tagging protein에 대한 negative control (human antigen-rabbit Fc) 200 ng을 사용하였다. 항체 binding을 위하여 Anti-CNTN4 scFv-hCk의 경우 최고 1 μM에서 1/10x씩 serial dilution 하여 0.001 nM까지 희석하고 Anti-CNTN4 IgG의 경우 최고 10 nM에서 1/10x씩 serial dilution 하여 0.00001 nM까지 희석하여 항원에 결합시켰다. 항체 detection을 위한 2차 항체로 anti-human kappa-HRP 또는 anti-human IgG Fc-HRP를 사용하였다. 발색 시약인 ABTS를 사용하여 발색시키고, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이 대부분 항원에 대한 반응성이 좋았으며 human 및 mouse 항원 모두에 유사한 반응성을 보이는 클론이 다수 존재하였다.
EC50, nM Negative control Human CNTN4 Mouse CNTN4
S1 N/A 4.44 1.53
S2 N/A 0.12 0.10
S4 N/A 2.60 1.15
S6 N/A 0.37 1.85
S7 N/A 1.51 1.20
S8 N/A 1.10 1.53
S9 N/A 0.08 0.09
S10 N/A 1.82 7.00
S11 N/A 1.44 2.39
S15 N/A 1.35 2.12
S24 N/A 1.12 2.07
S30 N/A 1.15 1.12
S46 N/A 1.22 1.20
S99 N/A 8.34 3.64
S129 N/A 0.55 0.37
S130 N/A 0.81 0.46
S131 N/A 0.74 0.56
S132 N/A 1.16 0.72
S134 N/A 0.75 0.75
S135 N/A 1.06 0.71
S137 N/A 0.41 0.52
S138 N/A 2.37 1.06
EC50, nM Negative control Human CNTN4 Mouse CNTN4
A13WB2 N/A 0.01 0.01
A13WB4 N/A 0.01 0.01
A13WB7 N/A 0.01 0.01
A13WB24 N/A 0.01 0.01
A13WB25 N/A 0.01 0.01
A13WB73 N/A 0.01 0.01
A13SF1 N/A 0.01 0.02
A13SF2 N/A 0.01 0.01
A13SF7 N/A 0.01 0.01
A13SF8 N/A 0.01 0.01
A13SF16 N/A 0.01 0.01
A13SF19 N/A 0.01 0.01
A13SF20 N/A 0.01 0.01
A13SF21 N/A 0.01 0.01
A13SF74 N/A 0.11 0.12
A35WB1 N/A 0.02 0.01
A35WB27 N/A 0.01 0.01
A35SF3 N/A 0.01 0.01
A35SF5 N/A 0.01 0.01
A35SF8 N/A 0.01 0.02
A35SF13 N/A 0.01 0.02
A35SF14 N/A 0.01 0.01
A35SF37 N/A 0.01 0.01
A35SF38 N/A 0.01 0.01
A35SF39 N/A 0.01 0.01
A35SF75 N/A 0.21 0.20
A35SF90 N/A 0.01 0.01
(3) FACS에 따른 scFv의 세포 표면에 발현된 항원에 대한 결합능 확인
293FT cell에 transient transfection을 통해 cell membrane에 human CNTN4 항원을 발현시키고 anti-CNTN4 scFv-hCk 또는 Anti-CNTN4 IgG를 40 μg/mL의 농도로 결합시켰다. FACS를 이용하여 anti-hCk-PE또는 anti-hFc-PE로 항원에 결합된 anti-CNTN4를 detection하여 dot shift를 확인하였다.
그 결과는 표 8 및 9에 나타난 바와 같이 human CNTN4에 결합능을 보이는 hCk형태의 scFv클론 중 2, 4, 99, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 137, 138이 dot shift가 많이 되는 상위 (>15.0%)에 속하였고 IgG형태의 anti-CNTN4는 모두 75%이상의 우수한 결합능을 나타내었다.
Shift % Un-transfected cell Human CNTN4 transfected cell
Secondary antibody only 1.11 0.48
S1 0.21 13.8
S2 0.26 15.1
S3 0.18 13.9
S4 0.20 15.4
S6 0.22 14.7
S7 0.20 6.42
S8 0.21 12.9
S9 0.22 4.09
S10 0.21 6.95
S11 0.20 5.29
S15 0.23 6.66
S24 0.28 5.63
S30 0.24 6.87
S46 0.19 8.19
S83 0.13 5.27
S96 0.25 1.69
S99 3.75 20.5
S129 0.20 16.0
S130 0.19 16.4
S131 0.24 16.6
S132 0.18 16.1
S134 0.15 18.0
S135 0.14 18.2
S137 0.19 15.3
S138 0.18 15.8
Shift % Un-transfected cell Human CNTN4 transfected cell
Second antibody only 0.81 1.25
A13WB2 7.74 86.6
A13WB4 1.13 84.7
A13WB7 5.47 86.4
A13WB24 1.6 85.1
A13WB25 0.65 82.4
A13WB73 0.72 86.4
A13SF1 0.52 83.8
A13SF2 4.24 83.5
A13SF7 0.42 83.2
A13SF8 17.6 90.4
A13SF16 6.23 84.8
A13SF19 0.77 79.6
A13SF20 0.42 82.2
A13SF21 0.36 80.4
A13SF74 1.11 84.1
A35WB1 3.93 83.9
A35WB27 9.39 88.2
A35SF3 0.75 81.9
A35SF5 0.39 82.6
A35SF8 0.55 80.4
A35SF13 1.59 82.1
A35SF14 0.58 81.6
A35SF37 5.96 86.6
A35SF38 0.72 77.9
A35SF39 3.87 80
A35SF75 0.39 84.8
A35SF90 0.49 82.8
실시예 2: anti-CNTN4 chicken-human chimeric IgG4 항체 제조 및 결합력 확인
2.1 anti-CNTN4 chicken-human chimeric IgG4-S228P, A-01의 제조
Human chimeric IgG 형태의 항체 생산을 위해, 실시예 1을 통해 결합력이 확인된 S129를 선택하여 이의 경쇄와 중쇄 영역을 bicistronic expression vector에 cloning하였다. DNA를 Expi293F cell에 transient transfection하여 viability 50%까지 배양하여 IgG 발현을 진행하였고, 배양액을 Kappa select resin (kappa region capture)에 결합시켜 IgG를 elution하여 1차 정제하였다. 이후 경쇄 불순물 제거를 위하여 Mabselect (Fc region capture)에 결합시키고 IgG를 elution하여 2차 정제를 하여 SEC-HPLC상 순도 72.4%의 anti-CNTN4 129 chimeric IgG4-S228P(이하 "A-01"로 지칭함)를 제조하였다.
2.2 ELISA에 따른 A-01의 항원 단백질에 대한 결합능 확인
실시예 2.1에서 제조된 A-01 대한 ELISA 시험을 진행하였다. 200 ng의 항원(human CNTN4-10xHis 또는 mouse CNTN4-10xHis)을 ELISA plate에 coating하였다. 항체 binding을 위하여 A-01를 최고 1μM에서 serial dilution 하여 0.0001 nM까지 희석하여 항원에 결합시켰다. 항체 detection을 위한 2차 항체로 anti-human Fc- HRP를 사용하였다. 발색 시약인 ABTS를 사용하여 발색 시키고, 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그에 따른 결합능을 표 10에 나타내었다.
EC50, nM Human CNTN4 Mouse CNTN4
A-01 0.011 0.011
2.3 SPR (surface plasmon resonance)에 따른 A-01의 항원 단백질에 대한 결합능 확인
실시예 2.1에서 제조된 A-01에 대한 SPR 시험을 진행하였다.
구체적으로 Amine coupling을 이용한 anti-human IgG Fc (capture antibody)를 결합시키기 위하여 CM5 chip을 장착하고 running buffer를 흘려주어 chip을 활성화한 후 capture antibody를 붙였다. capture antibody가 붙지 않은 dextrin을 ethanolamine을 이용하여 비활성화 시킨 후 3M magnesium chloride를 이용하여 regeneration을 진행하여 capture antibody를 제외한 analyte를 제거하였다. 0.05μg/mL의 농도로 준비된 A-01을 결합을 위하여 10 μL/min의 속도로 30초간 흘려주었다. 이후 항원으로서 순차적으로 dilution하여 준비된 human CNTN4 (400nM ~ 0.78nM)를 30 μL/min의 속도로 3분간 흘려주어 결합시키고 5분 동안 해리를 진행하였다. 이후 capture antibody에 붙은 모든 analyte를 제거하기 위하여 regeneration 용액 (3M magnesium chloride)을 20 μL/min의 속도로 30초간 흘려주어 regeneration을 진행하였다. 각 농도의 항원에 대해 A-01의 결합, 항원의 결합, 해리, 및 regeneration의 순서로 반복하였다. 그 결과를 표 11에 나타내었다.
항원 해리 상수 Kd
인간 CNTN-4 단백질 3.365 X 10-8 M
이로부터 본 발명의 항체는 human CNTN4 단백질에 높은 친화도로 결합함을 확인하였다.
실시예 3 : anti-CNTN4 인간화 항체 제조 및 결합력 확인
3.1 anti-CNTN4 인간화 항체 제조
A-01을 이용하여 인간화 항체를 제조하였다.
구체적으로 A-01의 가변영역 original 서열(VLA 및 VHA)에서 frame work 영역을 인간 frame work 영역으로 완전히 바꾼 서열(VL1 및 VH1), 및 VL1 및 VH1에 일부 A-01의 original 서열을 남겨둔 서열(VL2 및 VH2)과 조합하였다(표 12 및 도 3). A-01과 완전히 인간화된 항체(fully humanized antibody; VL1 및 VH1)를 비교할 때 78% 정도의 인간화를 보였다. 완전히 인간화된 항체(VL1 및 VH1)를 일부 back mutation 서열을 가지고 있는 VL2 및 VH2 조합의 항체와 비교할 때는 96% 이상의 서열이 일치하였다. A-01 (LAHA)를 제외한 총 8개 (LAH1, LAH2, L1HA, L1H1, L1H2, L2HA, L2H1, 및 L2H2)의 인간화 항체를 IgG4 형태로 제조하기 위하여 DNA를 Expi293F 세포에 transient transfection 하고 배양하였을 때, 중쇄가변영역이 완전히 인간화된 VH1을 가진 항체(LAH1, L1H1, 및 L2H1)는 모두 발현이 되지 않았다. 이후 VH2를 가지고 있는 항체인 LAH2, L1H2, 및 L2H2를 정제하여 각각 4 mg, 11 mg, 및 12 mg을 확보하였다.
서열번호 영역 서열
서열번호 18 VLA ALTQPSSVSANLGETVKITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTLIYDNTNRPSDIPSRFSGSGSGSTGTLTITGVRAEDEAVYYCGGYDGSTDVFGAGTTLTVL
서열번호 2 VHA AVTLDESEGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEYVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSADTWSYGAATIDAWGHGTEVIVSS
서열번호 156 VL1 ELTQDPAVSVALGQTVRITCSGSSGSYGWYQQKPGQAPVLVIYDNTNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGGYDGSTDVFGGGTKLTVL
서열번호 157 VH1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVSEISGGGGSTWYAPAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSADTWSYGAATIDAWGQGTLVTVSS
서열번호 158 VL2 ELTQDPAVSVALGQTVRITCSGSSGSYGWYQQKPGQAPVTLIYDNTNRPSGIPDRFSGSSSGSTGSLTITGAQAEDEADYYCGGYDGSTDVFGGGTKLTVL
서열번호 159 VH2 EVQLLESEGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEWVAEISGGGGSTWYAPAVKGRATISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSADTWSYGAATIDAWGQGTLVTVSS
3.2 ELISA에 따른 인간화 항체의 항원 단백질에 대한 결합능 확인
실시예 3.1에서 제조된 LAH2, L1H2, 및 L2H2 항체를 A-01과 함께 ELISA 시험을 진행하였다. 200ng의 항원 (human CNTN4-10xHis 또는 mouse CNTN4-10xHis)을 ELISA plate에 coating 하였다. 항체 binding을 위하여 항체를 최고 1 μM에서 serial dilution 하여 0.0001 nM까지 희석하여 항원에 결합시켰다. 항체 detection을 위한 2차 항체로 anti-human Fc- HRP를 사용하였다. 발색 시약인 ABTS를 사용하여 발색 시키고, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그에 따른 결합능을 표 13에 나타내었다. 가장 많이 인간화되어 있는 L1H2의 경우에도 A-01 origin과 비교하여 CNTN4 단백질과의 결합력의 차이가 3배 이내임을 확인하였다.
EC50, nM Human CNTN4 Mouse CNTN4
A-01 0.011 0.011
LAH2 0.017 0.017
L1H2 0.028 0.029
L2H2 0.018 0.019
3.3 SPR (surface plasmon resonance)에 따른 인간화 항체의 항원 단백질에 대한 결합능 확인
실시예 3.1에서 제조된 항체 중 약 98%로 가장 많이 인간화가 이루어진 L1H2에 대한 SPR 시험을 진행하였다. 보다 구체적으로 Amine coupling을 이용한 anti-human IgG Fc (capture antibody)를 결합시키기 위하여 CM5 chip을 장착하고 running buffer를 흘려주어 chip을 활성화한 후 capture antibody를 붙였다. capture antibody가 붙지 않은 dextrin을 ethanolamine을 이용하여 비활성화시킨 후 3M magnesium chloride를 이용하여 regeneration을 진행하여 capture antibody를 제외한 analyte를 제거하였다. 0.05 μg/mL의 농도로 준비된 L1H2를 결합을 위하여 10 μL/min의 속도로 30초간 흘려주었다. 이후 항원으로서 순차적으로 dilution하여 준비된 human CNTN4 (400nM ~ 0.78nM)를 30 μL/min의 속도로 3분간 흘려주어 결합시키고 5분 동안 해리를 진행하였다. 이후 capture antibody에 붙은 모든 analyte를 제거하기 위하여 regeneration 용액 (3M magnesium chloride)을 20 μL/min의 속도로 30초간 흘려주어 regeneration을 진행하였다. 각 농도의 항원에 대해 L1H2의 결합, 항원의 결합, 해리, 그리고 regeneration의 순서로 반복하였다.
그 결과를 표 14에 나타내었다.
항원 해리 상수 Kd
인간 CNTN-4 단백질 9.319 X 10-8 M
이로부터 A-01 항체가 98% 인간화되는 경우에도 CNTN4 단백질에 충분히 높은 결합력을 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 4: A-01 및 L1H2 항체의 human T 세포를 이용한 CNTN4 중화능력 시험
4 mg/mL 농도의 a-CD3 antibody와 150 nM 농도의 CNTN4 재조합단백질을 최종 50 mL로 만들어 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 약 16 시간 동안 인큐베이션하였다.
공여자 1명당 50 mL의 혈액 (sodium heparin이 처리된 채혈 튜브에 담김)과 PBS를 1:1로 섞은 뒤 50 mL 튜브에 미리 15 mL Ficoll을 담아두고 그 위에 희석된 혈액 30 mL을 조심스럽게 올려서 Ficoll과 blood 층이 분리되도록 쌓았다. 1,800 rpm, 20℃의 조건으로 25분 동안 원심분리 (Acceleration과 Deceleration 속도는 0으로 설정)하고 하얀색 buffy층이 올라오지 않도록 상층액을 제거하였다. Buffy층을 새로운 50 mL 튜브에 옮겨 담고 PBS로 50 mL까지 채워준 뒤 1,800 rpm, 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리하였다. 1X RBC lysis buffer를 10 mL 넣어주고 잘 풀어준 후 5분간 상온에 방치하였다. PBS로 50 mL까지 채워준 뒤 1,800 rpm, 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 PBS로 풀어준 뒤 현미경을 통해 세포 (PBMC)를 관찰하고 수를 계산하였다.
상기 실험에서 수득한 PBMC 세포 2 X 108 개당 1,000 μL의 MACS 버퍼를 넣어 재현탁하였다. 상기 용액을 2등분하여 2분의 1은 CD4 튜브에 2분의 1은 CD8 튜브에 담았다. 각 그룹의 PBMC 1 X 108 개당 50 μL의 antibody cocktail을 넣어 재현탁하고 10분 동안 실온에 보관하였다. PBMC 1 X 108 개당 100 μL의 anti-biotin microbead를 넣어 재현탁하고 10분 동안 실온에 보관하였다. 한편, MACS magnetic field를 소독하고 클린벤치 안에 넣어 2개의 LS 컬럼 (CD4용 및 CD8용)을 설치하였다. 상기 각 컬럼에 3 mL의 MACS 버퍼를 흘린 후, 각 컬럼을 지나온 버퍼는 버렸다. 상기 반응이 끝난 각 그룹의 세포를 magnetic field에 장착된 2개의 LS 컬럼에 각각 로딩하였다. 더이상 아래로 떨어지는 세포 용액이 없을 때, 3 mL의 MACS 버퍼를 각 컬럼에 흘려보냈다. 이후, 현미경을 통해 각 컬럼에서 떨어진 용액 속 세포를 관찰하고 수를 계산하였다.
50 μg의 CFSE에 18 μL의 DMSO를 넣고 파이펫팅하여 5 mM의 농도로 만들어 사용하였다. 상기 실험에서 수득한 CD4 세포 및 CD8 세포에 1 mL의 MTM media를 넣고 CFSE를 최종 5 μM의 농도가 되도록 넣어주고 현탁한 뒤 37℃의 워터 배스 (water bath)에서 10분 동안 보관하였다. 상기 용액을 1,800 rpm, 4℃의 조건에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이후, MTM media 1 mL을 넣어 재현탁후 다시 1,800 rpm, 4℃의 조건에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 마지막으로 실험에 사용될 각 웰 당 2 X 105 세포/200 μL가 되도록 MTM media로 재현탁하였다.
이후, 인큐베이션한 플레이트를 200 ㎕의 PBS로 2회 세척하고 CNTN4가 처리된 웰에 각각 1.5 mM 및 3 mM의 A-01 및 L1H2를 최종 50 mL로 만들어 96 웰 플레이트에 넣었다. 37℃에서 약 4 시간 동안 인큐베이션하였다.
그 후 인큐베이션한 플레이트를 200 mL의 PBS로 2회 세척하고 각 웰 당200 mL의 T 세포를 넣어준 뒤 37℃의 온도로 5% CO2 인큐베이터에서 3일 동안 보관하였다. 3일 뒤 T 세포를 수득하여 FACS 튜브로 옮긴 뒤 FACS 기기를 이용하여 CFSE 염색된 세포분화 정도를 관찰하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, CNTN4 재조합단백질이 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식을 억제함을 확인하였다. CNTN4에 의해 억제되었던 T 세포의 증식은 처리된 A-01 및 L1H2의 농도에 따라 증가됨을 관찰하였다. 이는 본 발명의 A-01 및 L1H2가 매우 우수한 CNTN4 중화능을 나타냄을 보여준다.
이로부터 본 발명의 CNTN4 항체가 CNTN4를 효과적으로 중화하여 이의 T 세포 억제 기능을 억제하였음을 확인하였다.

Claims (28)

  1. 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
    서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 마우스 CNTN4 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1 X 10-7 M 이하의 해리 상수 (Kd)로 인간 CNTN4 단백질에 결합하는 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성을 증가시키는 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, 단일 쇄 항체 scFv, (Fab')2 단편, 단일 도메인 항체, 디아바디 (dAb), 및 선형 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 다중 특이적 항체인 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 약물과 컨쥬게이션된 형태인 것인, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 CNTN4를 발현하는 암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 추가 항암제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 추가 항암제는 면역 관문 억제제 또는 화학요법제인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 추가 항암제는 하나의 제제로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 추가 항암요법과 함께 사용되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 추가 항암요법은 면역 관문 억제제, 화학요법제 및 방사선 치료요법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 암의 예방 또는 치료를 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  23. 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 유효량의 추가 항암제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 추가 항암제는 면역 관문 억제제 또는 화학요법제인 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 유효량의 항-CNTN4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 유효량의 추가 항암제는 하나의 제제로 동시에 대상체에 투여되거나, 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 대상체에 투여되는 것인, 방법.
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