WO2019143077A1 - 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법 - Google Patents

식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법 Download PDF

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WO2019143077A1
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김재연
부티엔반
시반칼리아니벨루
트란밀티
김지해
성연우
정세정
김현정
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경상대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing gene editing efficiency based on homologous recombination in plants.
  • HR homologous recombination
  • HDR homology-directed DNA repair
  • the HDR-based genome correction / editing technology is a technology that can actually change the DNA sequence of DNA, such as target-specific insertion of a foreign gene, cleavage of a specific DNA fragment, or substitution with similar DNA. And the fact that it is greatly increased by HDR is a very important step in HDR research. However, even though DSB induction greatly improves the efficiency of HDR, HDR efficiency is still about 1/100 that of NHEJ, which is far from practical use. Thus, much effort has been devoted to improving the plant HDR technology by DSB, a notable advance being made using viral replicons.
  • Dielectric correction technology is advancing more rapidly in animal systems than plants, and for mammals such as mice and humans, HDR occurs at a higher efficiency than plants, which can partially transfer many molecules into cells in the form of oligonucleotides Can be attributed to the characteristics of animal systems.
  • One of the most efficient systems known to date for improving HDR efficiency in plant somatic cells is the use of viral replicons to provide HDR or to simultaneously express and regulate a variety of factors to enhance the efficiency of additional HDR It is expected to be necessary. However, if you put these factors into replicons, you will need to try to overcome them because the size of replicons increases and the number of copies decreases and becomes unstable.
  • HDR efficiency has been reported by treating a variety of small chemicals.
  • a number of chemical inhibitors have been identified that inhibit the NHEJ pathway competing with HDR, including SCR7 pyrazine (2,3-Dihydro-6,7-diphenyl-2-thioxo -4 (1H) -pteridinone) treatment has been reported to increase HDR by about 2-19 fold.
  • SCR7 pyrazine (2,3-Dihydro-6,7-diphenyl-2-thioxo -4 (1H) -pteridinone
  • RS-1 RAD51-stimulatory compound 1
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2017-0081268 discloses a plant cell comprising a nucleic acid sequence construct encoding a single guide RNA (sgRNA) mediating sequence-specific cleavage of a Tobacco Strain Virus (TRV) sequence and a target sequence of a target genome And a nucleic acid editing nucleic acid construct for its genetic editing use.
  • sgRNA single guide RNA
  • TRV Tobacco Strain Virus
  • the present invention has been made in view of the above needs, and the inventors of the present invention have found that, in order to innovatively enhance the efficiency by combining homologous recombination technology, which has been studied only at an experimental level with low efficiency in plants,
  • the efficiency of homologous recombination in tomato plants can be enhanced by combining gene scissors systems and plant tissue culture conditions and HDR-based DNA repair mechanisms, activators or inhibitors of various molecules associated with the use of multiple replicons
  • the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention provides a gene editing method of a plant using a gene scissors system, which comprises optimizing temperature and photoperiod conditions during tissue culture of plant cells, using multiple replicons, the present invention provides a method for increasing the homologous recombination-based gene editing efficiency in a plant comprising a homology-directed DNA repair pathway or a non-homologous end joining (NHEJ) pathway.
  • a gene scissors system which comprises optimizing temperature and photoperiod conditions during tissue culture of plant cells, using multiple replicons
  • the present invention provides a method for increasing the homologous recombination-based gene editing efficiency in a plant comprising a homology-directed DNA repair pathway or a non-homologous end joining (NHEJ) pathway.
  • NHEJ non-homologous end joining
  • the method according to the present invention can replace the existing Indel-based or base editor-based CRISPR genome editing technology by allowing a free dielectric correction technique, and can precisely perform the introduction of alleles useful in crops, it is possible to use it as a technique to pyramid a gene introduced at the time of genetically modified crop development to a specific chromosome specific position, so that it can be utilized in various breeding techniques of various crops. In addition, it can be used for tagging of various proteins and engineering of in planta protein in basic science.
  • Figure 1 shows the result (A) showing the effect of HDR efficiency according to temperature treatment conditions, the reporter construct model (B) used to measure HDR efficiency, and the SCR7 Pyrazine inhibitor inhibiting the NHEJ pathway, (C) showing an increase in efficiency, and a figure (D) of an tomato plant that overproduces anthocyanin by HDR.
  • FIG. 2 is a graph showing the HDR efficiency uptake strategy of the present invention. From the low HDR efficiency of the initial plant somatic cells, it is shown that the double helix cutting, the increase of the HDR template copy number using replicons, the transfection / CRISPR gene scissors, , NHEJ pathway blockade, increased activity through the expression of HDR pathway enzymes, and the use of multiple replicons.
  • FIG. 3 is a diagram summarizing the results of determination of culture conditions for increasing HDR efficiency using tomato.
  • Seed germination 25 ° C, 3-4 day dark conditions and 3-4 day light treatment; Pre-culture: 25 ° C, 1 day in dark conditions; Main culture: 25 ° C, 2 days in dark condition; Subsequent cultivation: Agrobacterium was removed by washing twice with 500 mg / L timentin or cefotaxim, dried with sterilized Watman's paper, and incubated in the same selective medium under the light / dark cycle, 25-31 Lt; 0 > C for 5 days and subsequently cultured at intervals of 10-12 days.
  • Figure 4 shows an anthocyanin overproducing tomato plant obtained through HDR-based gene correction obtained through an initial search.
  • HR ex 6-light / -dark is the serial number (6th) of the HR experiment and means incubation for 10 days light (dark) or dark (dark) conditions.
  • Figure 5 shows the simplest structure of a CRISPR / Cpf1 based HDR construct.
  • Figure 6 shows a dCRISPR / Cpf1 based HDR construct upgrade and control construct.
  • Figure 7 shows the HDR efficiency per cell with CRISPR construct at different temperature conditions. *: p ⁇ 0.05, ns: no significantly different.
  • Figure 8 shows the HDR efficiency per cell with CRISPR construct in different photoperiods.
  • Figure 9 shows an HDR event plant using a CRISPR / Cpf1 based construct.
  • Figure 10 shows HDR efficiency changes by treatment with NHEJ inhibitor (SCR7 pyrazine).
  • Figure 11 shows the CRISPR / Cpf1 and dCas9-sun constructs that induce overexpression of the HDR pathway factor.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing the structure of BeYDV-derived replicons.
  • Figure 13 shows the DNA configuration in the ANT1 HDR template.
  • Fig. 14 shows the results of PCR analysis of the release of each viral vector from genomic DNA isolated from cultured cotyledons transformed with Agrobacterium containing the BeYDV vector pLSL.R.GGFP using a specific primer amplifying the junction of the LIR region This is a result.
  • Figure 16 shows the results of analysis of the kinetic patterns of the viral replicative release of BeYDV vectors pLSL.R.GGFP and pLSL.GFP.R.
  • Figure 17 shows the separation of multiple replicon systems and replicons separated therefrom. It consists of three LIRs and three SIRs to make three replicons. Only the HDR template consists of one replicon, and various HDR promoters, including genomic DNA and Cpf1 expression construct, are expressed in different replicons.
  • the method according to one embodiment of the present invention is a method for regulating the temperature and photoperiod conditions during tissue culture of plant cells, using multiple replicons, and modulating the HDR pathway or NHEJ pathway, Based gene editing efficiency.
  • the optimized temperature condition of the tissue culture is incubated at 29-33 ° C. for 4 to 6 days after cocultivation of the plant tissue, then 26 ° C. for 4 to 6 days To 30 ⁇ ⁇ , preferably, culturing at 31 ⁇ ⁇ for 5 days and then culturing at 28 ⁇ ⁇ for 5 days, but the present invention is not limited thereto.
  • the optimized photoperiod condition may be, but is not limited to, a short day of 6 to 10 hours of lightness and 14 to 18 hours of darkness, preferably 8 hours of lightness and 16 hours of darkness, The optimized conditions may be different depending on the type of the gas.
  • the replicon is a geminivirus-based replicon
  • the germinavirus according to the present invention may be BeYDV (Bean Yellow Dwarf virus) It is not limited.
  • the HDR template, gRNA and expression gene associated with the modulation of the HDR pathway are introduced into a multiple replicon system with three LIRs (large intergenic regions) and three SIRs (small intergenic regions) To maximize the number of copies of the HDR template and to simultaneously express various factors (FIG. 17).
  • the replicon according to the present invention may be more specifically composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.
  • the modulation of the HDR pathway is carried out by using RPA1A (replication protein A), RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B (RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DMC1 (DNA Meiotic Recombinase 1 XRCC1, XRCC2, XRCC3, ATM (Serine / Threonine Kinase), XRS2 / NBS (MRN / X), Mre11 (MRN / X), RAD52-1, RAD52-2, RAD54, XRCC1 ), rad50 (MRN / X), Brca1 (BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP / Com1 / Sae2 or exo1 to activate the HDR pathway, Activating the HDR pathway and modulating the NHEJ pathway may inhibit expression of any one or more selected from the group consisting of
  • the gene scissors system may be selected from the group consisting of Cas9 (CRISPR associated protein 9), Cpf1 (CRISPR associated protein 12a), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), ZFN A functional analogue thereof, and a guide RNA capable of inducing the nucleic acid hydrolase to a target genomic region to be edited, as an active ingredient.
  • CRISPR associated protein 9 Cas9
  • Cpf1 CRISPR associated protein 12a
  • TALEN transcription activator-like effector nuclease
  • ZFN A functional analogue thereof a guide RNA capable of inducing the nucleic acid hydrolase to a target genomic region to be edited, as an active ingredient.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the nucleic acid hydrolase is characterized in that an AtTrp1 ( Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein) intron consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is inserted at 3 'of the coding sequence .
  • AtTrp1 Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein
  • the nucleic acid hydrolase is SpCas9 ( Streptococcus pyogenes Cas9)
  • the AtTrp1 intron sequence is located at a position 117 nt from the A base of the ATG of the SpCas9 coding sequence
  • the nucleic acid hydrolase is LbCpf1 ( Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1)
  • the AtTrp1 intron sequence can be inserted at the 138 nt base position from the A base of the ATG of the LbCpf1 coding sequence.
  • HDR homology-directed DNA repair
  • HDR is dependent on the number of copies of HDR templates, so it is a challenge to achieve stable replication of virus replicas.
  • the present invention provides a step-by-step optimization strategy and technique.
  • DNA double helix cleavage is one of the key factors in increasing HDR efficiency.
  • human codon-optimized SpCas9 SEQ ID NO: 30
  • LbCpf1 SEQ ID NO: 31
  • SpCas9 and LbCpf1 CDS enhancer AtTrp1 that has a function (Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein) in the intron (SEQ ID NO: 1) is inserted was reduced the stability of the RNA that gene expression and expression.
  • Both SpCas9 and LbCpf1 work well in inducing tomato HDR and their working efficiency is sensitive to gRNA selection.
  • AtUBQ1 Arabidopsis thaliana ubiquitin extension protein 1 (SEQ ID NO: 2) having an enhancer function was inserted into 5 'UTR of 35S promoter to induce stable expression.
  • Bean dwarf mosaic virus replicons were loaded into T-DNA and introduced into plant cells using Agrobacterium. At this time, it is known that as the size of replicons increases, the stability and transgenic ability are lowered and the number of replicons is decreased in plant cells. When the size of the replicon is excessively large due to the need for expression of various factors, two independent Agrobacterium strains containing different replicon T-DNAs can be used to infect the same plant cell at the same time, The present inventors used a multiple replicon system because the efficiency is lower than that of the LiMe system. One T-DNA with multiple replicons can be transfected and separated into two or more replicons in the cell, thereby contributing to the improvement of HDR efficiency.
  • the multiple replicon system of the present invention has three LIRs and three SIRs, and has a characteristic of separating up to three replicons when injected into cells (FIG. 17).
  • Plant cells unlike animal cells, have a thick cell wall.
  • Agrobacterium is used to transfer genes, and Agrobacterium is required to efficiently transfer gene scissors parts into plant cells. From the transferred T-DNA, Cone formation, replication, and expression of various gene scissors tools must be optimized.
  • HDR high-efficiency HDR
  • the number of copies of the gene expression or replicon may be affected.
  • the factors associated with the HDR pathway (RPA1A, RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B (RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DNA Meiotic Recombinase 1 (DMC1), RAD52-1, RAD52-2, RAD54 XRCC1, XRCC2, XRCC3, ATM (Serine / Threonine Kinase), XRS2 / NBS (MRN / X), Mre11 (MRN / X), rad50 (MRN / X), Brca1 BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP / Com1 / Sae2, exo1) were selected as the target genes of SlMRE11, RAD51D, XRRC2, BRCA2, RAD54, ATM, RAD51, RAD51, RAD51, RAD51, RAD51, DNA Meiotic Recombinase 1 (DMC
  • the dCas9-sun tag binds to the promoter by the gRNA and the sun tag promotes transcription through binding with the scAb (single chain Antibody) -VP64 activation effector.
  • a binding motif of pumilio protein or other RNA-binding protein may be attached to the gRNA to direct activation effector including VP64 in pumilio, or an amplification system of pumilio-sun tag // scAb-VP64 expression can be used.
  • the pumilio protein can be replaced with an RNA-binding protein such as MS2 (MS2 bacteriophage capsid RNA-binding protein) or dCsy4 (catalytically inactive Csy4), and VP64 can be replaced by various activation effectors.
  • an RNA-binding protein such as MS2 (MS2 bacteriophage capsid RNA-binding protein) or dCsy4 (catalytically inactive Csy4)
  • VP64 can be replaced by various activation effectors.
  • a method that can be used simultaneously or separately with the approach is to activate the HDR pathway regulatory protein using chemical factors.
  • RS-1 which acts as an activator of RAD51, it was confirmed that the HDR efficiency is increased about 3 times.
  • HDR optimization through genetic control of the NHEJ pathway or HDR-inhibiting factors, which compete with the HDR pathway
  • KU70 (XRCC6), KU80 (XRCC5) and LIG4 are well known proteins in the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which compete with the HDR pathway.
  • NHEJ non-homologous end joining
  • genes such as SMC6B, AtMMS21 (SMC5 / 6 component), ABO4, FAS1, RFC1, INO80, RecQ4a, FANCM, RecQ4b and RTEL1 whose genetic mutations are known to promote HDR.
  • the materials and reagents used in the present invention source source source Plant materials Reagents Tomato variety Cultivar Hongkwang Local company Plant hormones; Acetosyringone; Hydrocarbon; ⁇ -D Glucuronide (X-Gluc); Chemicals for plant tissue culture; MS salts and vitamins; MS salts and B5 vitamins, PhytoAgar, Maltose. Sigma, USA; DUCHEFA Biochemie B.V., The Netherlands Bacteria Escherichia coli 10-beta NEB, USA Agrobacterium tumefaciens GV3101 :: pMP90 GNU.
  • composition and PCR amplification conditions of the PCR reaction product used in the present invention are shown in Tables 3 and 4 below.
  • PCR reaction conditions step Temperature (°C) time Number of cycles One 94-95 4-5 minutes One Degeneration 2 94-95 20-60 seconds 20-40 denaturalization 3 Primer Tm 20-60 seconds Combination 4 72 ⁇ 1 minute / kb kidney 5 72 1-10 minutes One Final height 6 4-15 ⁇ - keep
  • the Agrobacterium tumefaciens GV3101 :: pMP90 strain was transformed with each HDR vector.
  • Agrobacterium mediated transient expression in tomato leaves was performed by pressure infiltration method.
  • Agrobacterium cultures were cultured at 600 nm until absorbance reached 1.0, and 200 ⁇ M acetosyringone was treated one hour prior to infiltration.
  • the chopped pieces were placed in a pre-culture medium (MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 2.0 mg / l of Zeatin trans-isomer, 0.1 mg / l of indolyl acetic acid (IAA), 1 mM of putrescine, / l of glucose, pH 5.8).
  • the plate was pretreated for 1 day.
  • the pre-cultured meal was pierced with a sharp point and transformed with Agrobacterium tumefaciens GV3101 :: pMP90 containing the HDR construct. Subsequently, the meal pieces were transferred to a co-culture medium and cultured under dark conditions at 25 ⁇ for 2 days.
  • the meal pieces were transferred to a non-selective medium, cultured for 5 days, and subcultured with the selection medium. Subculture was performed at 10 day intervals to obtain the best regeneration efficiency.
  • the stem was fully grown (1.5-3.0 cm), it was transferred to rooting medium to induce complete plant growth.
  • the plants grown from the rooting medium were transferred to a vermiculite pot and purified and transferred to soil in a greenhouse maintained at a temperature of 26 ⁇ 2 ° C and a light period of 16 hours / 8 hours.
  • BeYDV circular replicon emission To analyze the mechanical tendency of BeYDV circular replicon emission, single-constituent BeYDV vectors pLSL.GFP.R, pLSL.R.GGFP and non-viral vector pAGM4723 were used.
  • the main vector used in the present invention Construct name Application pLSL.GFP.R (Cermak et al. 2015) Virus Circularization detection pLSL.R.GGFP Virus Circularization detection pAGM4723
  • Non-viral vector, replicon detection control pTC147 (Cermak et al. 2015) 35S: ANT1 expressing, non-replicating T-DNA transformation efficiency control pTC217 (Cermak et al. 2015) BeYDV ANT1-GT T-DNA vector with Cas9 / gRNA1b in the replicon
  • Tomato cotyledon was transformed with Agrobacterium containing each of the above vectors and two cotyledons were collected from each group after 2, 5, 9, 12, 16 and 30 days after transformation, and 400 mg / Washed with timentin and stored at -80 ° C. Then, genomic DNA was extracted from each sample using CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) method, and PCR was performed using the primers shown in Table 6 below. The PCR product was loaded on a 1% (w / v) agarose gel and the band intensity was calculated using the Image J program (imagej.nih.gov/ij/) and standardized using GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) Respectively.
  • CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
  • Example 1 Analysis of homologous recombination efficiency using anthocyanin marker
  • the 35S promoter through HDR was inserted into the upstream promoter position of the transcription initiation site of the ANT1 gene, which is a transcription factor that regulates anthocyanin synthesis, to induce anthocyanin overexpression upon activation of the ANT1 gene Purple callus formation.
  • the HDR template (SEQ ID NO: 29) was designed to have resistance to kanamycin at the time of HDR event by inserting pNos-NPTII-OCSt at the nucleotide sequence of the 35S promoter and upstream thereof. At this time, the upper sequence having homology was 1,043 bp, and the lower base sequence was 592 bp. In addition, two TALEN binding sites or dSaCas9 (D10A, N580A) / gRNA binding sites were added at the top.
  • the DNA double helix cleavage was performed using SpCas9 ( Streptococcus pyogenes Cas9) / gRNA, LbCpf1 ( Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1) / gRNA1 or LbCpf1 / gRNA1 / gRNA2 and the gRNA (guide RNA) complementary sequence in the HDR template was a spot- (site-specific mutation) to prevent cleavage by Cas9 or Cpf1.
  • the simplest form of genetic scissors replicons consists of SpCas9 / LbCpf1, 1-2 gRNA and ANT1 HR templates, and further constitutes a dCas9 (dead Cas9) based transcription activation system and a dCas9 based HDR template integration system.
  • the callus or plant in which HDR was successfully produced showed an overcorrection of anthocyanin purple.
  • the HDR efficiency obtained by dividing the HDR efficiency by 35S-ANT1 vector was about 20% and the HDR event efficiency was obtained by using 30 cotyledons.
  • temperature, light condition, etc. are variously modified to increase HR efficiency.
  • pTC147 indicates the number of callus that transformed T-DNA per cotyledon into anthocyanin
  • pTC217 indicates the number of callus due to HDR per cotyledon.
  • HDR efficiency was analyzed using CRISPR / Cpf1 system and its upgrade system.
  • the HDR event was successfully detected in the initial construct version using the CRISPR / Cpf1 system.
  • 7711-1 and 7721-1 are control groups without Rep and gRNA, respectively (Table 9).
  • the upgrade version of CRISPR / Cpf1 optimizes the orientation at the time of the level 2 production in the GoldenGate assembly to minimize the RNAi effect of the original construct in the initial version, and the CRISPR / Cpf1 based construct (See Table 10), as well as a higher HR effect than the CRISPR / Cas9-based constructs published by other research groups.
  • Example 2 Increase in the frequency of plant homologous recombination by treatment with SCR7 pyrazine
  • Virus replicons tend to be released in a circular form from linear T-DNA that is transferred to the nucleus of plant cells and are amplified by hundreds to thousands of copies per cell by rolling circle replication.
  • Kinetic information on maximized replicon release can provide information on the optimal timing of applying small molecules to tissue culture systems.
  • cotyledons were transformed with Agrobacterium containing the BeYDV vector pLSL.GFP.R (Cermak et al., 2015) and pLSL.R.GGFP and the nonviral vector pAGM4723 .
  • Viral prototypes were detected by PCR analysis using specific primers amplifying the junctions of the two LIR regions in genomic DNA isolated from infected cotyledons. Stable presence of BeYDV replicon was reported from 2 to 8 weeks for pLSL.GFP.R containing tomato cotyledons infected with Agrobacterium. However, the maximum time to release a replica of a virus has not been reported.

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Abstract

본 발명은 식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하거나, 다중 레플리콘(multiple replicon)을 이용하여 HDR(homology-directed DNA repair) 필요 인자 및 효율증대 인자를 발현하거나, HDR 경로 또는 NHEJ(non-homologous end joining) 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합(homologous recombination) 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법
본 발명은 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
식물시스템에서 상동재조합(homologous recombination, HR) 또는 상동성 기반 DNA 수선(homology-directed DNA repair, HDR)을 이용한 유전체 교정 기술을 상용화하는 기술의 개발은 식물생명공학의 성배로 여겨지는 영역이었다. HR은 반수체를 만드는 생식세포의 감수분열에서는 잘 일어나지만, 체세포의 유사분열에서는 거의 일어나지 않는다. HDR은 비-동종 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ)과 함께 DNA가 손상되었을 때 일어나는 수선경로이나, HDR은 NHEJ의 1/1,000의 빈도로 일어난다고 보고되었다. 담배종 ( Nicotiana species) 식물에서 이중가닥절단 (double strand break, DSB)이 HDR을 증가시킨다는 사실은 1990년대 초에 보고되었으며, DSB를 유도하여 유전체를 변형시키는 유전자가위 또는 유전체교정/편집 기술은 20년 전에 알려졌으나, 식물 시스템에서 유전체교정/편집 기술의 사용은 매우 제한적이었고, 최근 3세대 CRISPR/Cas9 시스템의 도입으로 HDR 효율을 증진시키려는 연구가 활성화되고 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 유전체의 특정 위치 유전자에 DSB를 만들면, 체세포에서 우세한 DNA 수선경로인 NHEJ 경로를 통해 DNA 수선이 일어날 때 종종 부정확한 수선으로 다양한 종류의 삽입결실 (insertion-deletion, Indel) 돌연변이가 생성된다. 그러나 이 기술은 무작위 Indel 돌연변이를 얻는 데는 유용하지만 진정한 의미의 유전체교정/편집 기술은 아니다. 외래 유전자의 표적 특이적 삽입, 특정 DNA 조각의 절단 또는 유사 DNA로 대체하는 등 실제 자유자재로 DNA 염기서열을 바꿀 수 있는 기술이 바로 HDR 기반 유전체교정/편집 기술이며, HDR의 효율이 DSB의 유도에 의해 대폭 증가된다는 사실은 HDR 연구의 매우 중요한 단초로 작용했다. 하지만, DSB 유도가 HDR의 효율을 대폭 향상시킴에도 불구하고 HDR 효율은 NHEJ보다 여전히 약 1/100 수준으로 매우 낮아 실질적인 활용과는 거리가 멀었다. 따라서 DSB에 의한 식물 HDR 기술을 개선하기 위한 많은 노력을 기울여왔고, 그 중에서 주목할 만한 진보는 바이러스 레플리콘 (viral replicon)을 사용하면서 이루어졌다.
Baltes 등(2014, Plant Cell 26(1):151-163)은 기존에 DSB를 유도하는 ZFN (Zinc Finger Nuclease)과 게미니바이러스 (geminivirus) 기반의 바이러스 레플리콘을 사용하여 HDR 주형을 증폭시킴으로써 담배 식물에서 HDR 효율이 획기적으로 증가함을 보여주었다. ZFN와 HDR 주형을 포함하는 게미니바이러스 레플리콘은 T-DNA에 탑재되었고 아그로박테리움을 통해 담배에 주입된 후, 롤링 서클 복제를 통해 원형의 레플리콘을 만들고 ZFN을 발현시켜 결함있는 GUS 표적 유전자에 DSB를 유도하면 레플리콘에 탑재된 HDR 주형에 의해 HDR이 일어나게 되는 것이다. 이 기술은 최근에 토마토에서 TALENs (Transcription activator-like effector nucleases)과 Cas9 (CRISPR associated protein 9)이 함께 사용될 때, 잘 작용하는 것으로 보고되었다(Cermak et al., 2015, Genome Biology 16(1):232). 이 논문에서 저자들은 HDR에 의해 안토시안이 과축적된 캘러스 수 기준으로 사용된 떡잎 당 약 10-13%의 HDR 효율을 보고하였는데, 이는 같은 조건에서 T-DNA가 게놈에 삽입된 이벤트 수를 기준으로 환산하면 1-1.5%, 그리고 일시적으로 TALEN 및 Cas9을 발현하는 세포기준으로 환산하면 0.1-0.15% 수준으로 여전히 낮다. 이는 기존 DSB만을 이용하는 T-DNA 시스템과 비교할 때 최소 5-10배 증가된 것으로 판단된다. 하지만 HDR 이벤트를 갖는 캘러스 기준이므로 HDR이 일어난 식물을 얻는데는 또 다른 손실이 발생하여 1,000개당 1개 정도가 기대되는 수준이고, 이마저 안토시아닌 축적에 따른 리포터 사용 및 제초제 저항성이나 항생제 저항성의 특성을 이용해야하기 때문에, HDR 기반 유전체교정/편집 기술의 상용화에는 거리가 먼 수준이다. 가장 최근에 발표된 결과로 벼에서 WDV (Wheat dwarf virus) 레플리콘을 사용하여 T 0 형질전환체 기준 HDR 넉인 (knock-in) 효율을 19.4%까지 증대하였으나, 이 경우 Cas9이 기 발현된 캘러스를 이용할 뿐만 아니라 HDR 주형에 항생제 내성 유전자인 NPTⅡ 컨스트럭트를 삽입하여, 항생제를 통한 선별을 통해 가능한 결과로 역시 외부 유전자가 삽입되지 않고 목표 유전자의 염기서열만 교정하는 신육종유전자 기술의 완성과는 거리가 있다(Wang et al. 2017, Mol Plant. 10(7):1007-1010). 그러므로 HDR 캘러스 획득 효율의 추가적인 증진은 물론이고 이런 캘러스로부터 HDR 식물을 얻는 과정의 최적화도 매우 중요한 단계로 남아있다.
유전체교정 기술은 식물보다 동물시스템에서 더 빠른 진보를 보이고 있고, 생쥐나 인간과 같은 포유류의 경우 HDR은 식물에 비해 높은 효율로 일어나는데, 이는 부분적으로 올리고뉴클레오티드 형태로 다수의 분자를 세포로 전달할 수 있는 동물시스템의 특성에서 기인할 수 있다. 식물 체세포에서 HDR 효율을 증진시키기 위해서 사용된 것 중 현재까지 알려진 가장 효율이 좋은 시스템은 바이러스 레플리콘을 사용하여 HDR을 제공하는 것이나 추가적인 HDR의 효율 증진을 위해서는 다양한 인자를 동시에 발현하고 조절하는 것이 필요할 것으로 예상된다. 하지만 이런 인자들을 레플리콘에 넣게 되면 레플리콘의 크기가 커져 복제수가 줄어들고 불안정해지는 단점이 있어 이를 극복하기 위한 노력이 필요해 보인다.
추가로 다양한 작은 화학물질을 처리하여 HDR 효율이 증가하는 현상이 보고되었다. 이 중 HDR과 경쟁관계에 있는 NHEJ 경로를 저해하는 다수의 화학물질 저해제가 알려졌고 이 중 리가제 (ligase) IV를 저해한다고 알려진 SCR7 pyrazine (2,3-Dihydro-6,7-diphenyl-2-thioxo-4(1H)-pteridinone) 처리는 HDR을 약 2-19배 증가시킨다고 보고되었다. 추가로 재조합효소 (recombinase) RAD51의 활성을 증가시킨다고 보고된 RS-1 (RAD51-stimulatory compound 1)의 처리도 쥐에서 HDR 효율을 증가시킨다고 보고되었으나 식물시스템에서 작용하는지는 보고되지 않았다.
대부분의 식물조직배양은 22-25℃에서 수행되는 반면 CRISPR/Cas9은 이 온도에서 잘 일어나는지 알려지지 않았다. 최근 애기장대 시스템에서 37℃ 온도에서 Cas9 기능이 활성화되어 Indel 돌연변이의 빈도가 증가된다는 사실이 보고되었다(LeBlanc et al., 2018, Plant J. 93(2):377-386). 하지만 Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 효소의 경우에는 이런 보고가 없으며 또한 식물 HDR에서 활용은 보고된 바 없다.
HDR의 효율을 실용적으로, 산업적으로 활용할 수 있는 정도로 높이는 것은 매우 가치있는 일이나, 현재 세포수준에서 HDR의 효율은 매우 낮은 수준에 머물고 있으며 이 세포를 가지고 식물 개체를 만드는 것으로 계산한다면, 항생제 또는 제초제 저항성을 활용하지 않는 한 아직까진 산업적인 활용이 어려운 실정이다. 그러므로 식물에서 HDR 효율을 더욱 획기적으로 높일 수 있는 시스템 구축이 절실한 상황이다.
한편, 한국공개특허 제2017-0081268호에는 담배 얼룩 바이러스(TRV) 서열과 대상 게놈의 타겟 서열에 서열 특이적인 절단을 매개하는 단일한 가이드 RNA(sgRNA)를 코딩하는 핵산 서열 구조체를 포함하는 식물세포 및 이의 유전자 편집 용도에 관한 '게놈 편집용 핵산 구조체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 식물체에서 낮은 효율로 실험적인 수준에서만 연구가 되었던 상동재조합기술을 유전자가위 및 조직배양 기술과 접목하여 그 효율을 혁신적으로 높이기 위해서, CRISPR 유전자 가위 시스템과 식물 조직 배양 조건 및 HDR 기반의 DNA 수선 기작, 다중 레플리콘(multiple replicon)의 사용과 연관된 다양한 분자들의 활성화제 또는 저해제를 조합하여, 토마토 식물체에서 상동재조합의 효율을 증진시킬 수 있는 최적의 조건을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유전자가위 시스템을 이용한 식물체의 유전자 편집 방법으로서, 식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하거나, 다중 레플리콘(multiple replicon)을 이용하거나, HDR(homology-directed DNA repair) 경로 또는 NHEJ(non-homologous end joining) 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합(homologous recombination) 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은, 자유로운 유전체교정 기술이 가능함으로써 기존의 Indel 기반 또는 base editor 기반 CRISPR 게놈 편집 기술을 대체할 수 있을 것으로 사료되며, 작물에 유용한 대립유전자의 도입을 매우 정확하게 수행할 수 있으며 GM(genetically modified) 작물 개발시에 도입된 유전자를 특정 염색체의 특정위치에 피라미딩하는 기법으로 사용이 가능하여 다양한 작물의 신육종 기법에 활용가능할 것으로 판단된다. 또한, 기초과학에서도 다양한 단백질의 태깅이나 in planta 단백질 엔지니어링에 활용가능할 것으로 판단된다.
도 1은 온도 처리 조건에 따른 HDR 효율의 영향을 보여주는 결과(A)와, HDR 효율을 측정하는데 사용된 리포터 컨스트럭트 모식도(B), NHEJ 경로을 저해하는 SCR7 Pyrazine 저해제를 처리하여 HDR 기반 유전자교정 효율이 증진됨을 보여주는 결과(C), 및 HDR에 의해 안토시아닌을 과량생산하는 토마토 식물체의 모습(D)을 보여준다.
도 2는 본 발명의 HDR 효율 상승 전략을 보여주는 도면으로, 초기 식물 체세포의 낮은 HDR 효율로부터, 이중나선 절단, 레플리콘을 사용한 HDR 주형 카피 수 증가, 형질전환/CRISPR 유전자가위 또는 HDR 경로 활성 증대, NHEJ 경로 차단, HDR 경로 효소 발현을 통한 활성 증대 및 다중 레플리콘의 사용 등을 통해 HDR 효율을 상승시킬 수 있는 전략을 보여준다.
도 3은 토마토를 사용한 HDR 효율 증대를 위한 배양 조건 결정의 결과를 정리한 도면이다. 씨앗 발아: 25℃, 3-4일 암조건 및 3-4일 광조건 처리; 전-배양: 암조건에서 25℃, 1일; 본배양: 암조건에서 25℃, 2일; 후속배양: 500mg/ℓ 티멘틴(timentin) 또는 세포탁심(cefotaxim)에서 2번 세척을 통해 아그로박테리움을 제거하고, 멸균된 왓트만 종이로 건조후 동일한 선택배지에서 명/암 주기, 25-31℃ 조건으로 5일간 배양하고 10-12일 간격으로 후속배양함.
도 4는 초기 탐색을 통해 얻은 HDR 기반 유전자교정을 통해 얻은 안토시아닌 과량 생산 토마토 식물을 보여준다. HR ex 6-light/-dark는 HR 실험의 일련번호(6번째)이고 10일간의 light(명) 또는 dark(암) 조건의 배양을 의미합니다.
도 5는 CRISPR/Cpf1 기반 HDR 컨스트럭트의 가장 단순한 구조를 나타낸다.
도 6은 dCRISPR/Cpf1 기반 HDR 컨스트럭트 업그레이드 및 대조구 컨스트럭트를 나타낸다.
도 7은 다른 온도 조건에서 CRISPR 컨스트럭트를 갖는 세포당 HDR 효율을 보여주는 결과이다. *: p<0.05, ns: no significantly different.
도 8은 다른 광주기에서 CRISPR 컨스트럭트를 갖는 세포당 HDR 효율을 보여주는 결과이다.
도 9는 CRISPR/Cpf1 기반 컨스트럭트를 사용한 HDR 이벤트 식물을 보여준다.
도 10은 NHEJ 저해제(SCR7 pyrazine) 처리에 의한 HDR 효율 변화를 보여준다.
도 11은 HDR 경로 인자의 과발현을 유도하는 CRISPR/Cpf1 및 dCas9-sun 컨스트럭트를 보여준다.
도 12는 BeYDV-유래 레플리콘의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 13은 ANT1 HDR 주형 내 DNA 구성을 보여준다.
도 14는 BeYDV 벡터 pLSL.R.GGFP를 함유하는 아그로박테리움으로 형질전환된 자엽으로부터 배양 기간별 분리된 게놈 DNA에서 각 바이러스 벡터의 방출을 LIR 영역의 접합부를 증폭시키는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 분석한 결과이다.
도 15는 BeYDV 벡터 pLSL.GFP.R을 함유하는 아그로박테리움으로 형질전환된 자엽으로부터 배양 기간별 분리된 게놈 DNA에서 각 바이러스 벡터의 방출을 LIR 영역의 접합부를 증폭시키는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 분석한 결과이다.
도 16은 BeYDV 벡터 pLSL.R.GGFP 및 pLSL.GFP.R의 바이러스 복제본 방출의 동역학 패턴을 분석한 결과이다.
도 17은 다중 레플리콘 시스템과 이로부터 분리된 레플리콘의 분리를 보여준다. 3개의 LIR 및 3개의 SIR로 구성되어 3개의 레플리콘을 만든다. 단지 HDR 주형이 하나의 레플리콘으로 구성되어 게노믹 DNA 및 Cpf1 발현 컨스트럭트를 포함하는 다양한 HDR 촉진 인자들은 다른 레플리콘에서 발현된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
유전자가위 시스템을 이용한 식물체의 유전자 편집 방법으로서,
식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하거나, 다중 레플리콘(multiple replicon)을 이용하거나, HDR(homology-directed DNA repair) 경로 또는 NHEJ(non-homologous end joining) 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합(homologous recombination) 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법은, 식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하고, 다중 레플리콘을 이용하며, HDR 경로 또는 NHEJ 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 조직배양의 최적화된 온도 조건은 식물조직의 공배양(cocultivation) 후 4~6일간은 29~33℃로 배양하고, 이후 4~6일간은 26~30℃로 배양하는 것일 수 있고, 바람직하게는 5일간은 31℃로 배양하고, 이후 5일간은 28℃로 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 최적화된 광주기 조건은 6~10시간의 명기 및 14~18 시간의 암기, 바람직하게는 8시간의 명기 및 16시간의 암기로 이루어진 단일조건(short day)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 식물체의 종류에 따라 최적화된 조건이 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 레플리콘은 게미니바이러스(geminivirus) 기반 레플리콘으로, 본 발명에 따른 상기 게미니바이러스는 BeYDV(Bean Yellow Dwarf virus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 HDR 경로의 조절과 관련된 HDR 주형, gRNA 및 발현유전자를 3개의 LIR(large intergenic region)과 3개의 SIR(small intergenic region)을 갖는 다중 레프리콘 시스템을 구축하여 HDR 주형의 카피수를 최대화하고 다양한 인자들을 동시에 고발현하는 것을 특징으로 한다(도 17). 본 발명에 따른 레플리콘은 보다 구체적으로는 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 HDR 경로의 조절은 RPA1A(replication protein A), RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B(RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DMC1(DNA Meiotic Recombinase 1), RAD52-1, RAD52-2, RAD54, XRCC1(X-Ray Repair Cross Complementing 1), XRCC2, XRCC3, ATM(ATM Serine/Threonine Kinase), XRS2/NBS(MRN/X), Mre11(MRN/X), rad50(MRN/X), Brca1(BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP/Com1/Sae2 또는 exo1의 발현을 조절(유도 또는 저해)하여 HDR 경로를 활성화시키거나, HDR 경로의 활성화제(activator)를 처리하여 HDR 경로를 활성화시키는 것일 수 있고, 상기 NHEJ 경로의 조절은 KU70(XRCC6), KU80(XRCC5) 및 LIG4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현을 저해하거나, 이들의 저해제를 처리하여 NHEJ 경로를 저해시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 유전자가위 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR associated protein 12a), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산가수분해효소 및 상기 핵산가수분해효소를 편집하고자 하는 표적 게놈 자리로 유도할 수 있는 가이드 RNA를 유효성분으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 핵산가수분해효소는 코딩 서열의 3'에 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtTrp1 ( Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein) 인트론이 삽입된 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로는 상기 핵산가수분해효소가 SpCas9 ( Streptococcus pyogenes Cas9)인 경우 AtTrp1 인트론 서열은 SpCas9 코딩 서열의 ATG의 A 염기로부터 117 nt 염기 위치에, 상기 핵산가수분해효소가 LbCpf1 ( Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1)인 경우 AtTrp1 인트론 서열은 LbCpf1 코딩 서열의 ATG의 A 염기로부터 138 nt 염기 위치에 삽입될 수 있다.
현재까지 식물 시스템에서 구현된 HDR(homology-directed DNA repair) 효율은 극도로 낮아 유전체교정 기술로 산업적으로 사용하기에는 부적합하다. HDR 효율을 높이기 위해 해결해야 했던 문제점은 다음과 같다:
1) 이중나선 절단은 HDR의 효율을 높인다고 알려졌으므로, 대상 유전자 부위에서 DNA 이중나선 절단을 효율적으로 유도하기 위한 Cas9 또는 Cpf1 등의 핵산가수분해효소의 안정적인 발현을 구현하는 과제.
2) HDR은 HDR 주형의 카피 수에 의존적이므로 바이러스 레플리콘의 안정적인 복제를 구현하는 과제.
3) 아그로박테리움을 이용한 식물세포 내로 유전자가위 부품의 효율적인 전달을 위한 형질전환 최적화 과제.
4) Cas9 및 Cpf1 등이 식물 시스템에서 작동할 때 높은 활성으로 작용할 수 있게 만들어 주어야 하는 과제.
5) HDR에 사용되는 다수의 바이오부품의 클로닝 어셈블리(cloning assembly) 최적화를 통한 발현 최적화 구현 과제.
6) HDR에 참여하는 관련인자 발현 최적화를 위한 유전학적 및 화학적인 환경 구축 과제.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 단계별 최적화 전략 및 기법을 제공한다.
I. DNA 이중나선 절단에 따른 HDR 효과
DNA 이중나선 절단은 HDR 효율을 높이는데 핵심적인 요소 중의 하나이다. 본 발명에서는 타겟 위치의 이중나선 절단을 위해 인간코돈 최적화된 SpCas9(서열번호 30) 또는 LbCpf1(서열번호 31)을 사용하였다. SpCas9 및 LbCpf1 CDS 내에 인핸서(enhancer) 기능을 갖고 있는 AtTrp1 ( Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein) 인트론(서열번호 1)이 삽입되어 유전자 발현 및 발현되는 RNA의 안정성을 도모하였다. SpCas9 및 LbCpf1은 모두 토마토 HDR을 유도하는데 있어서 잘 작동하였으며 그 작동효율은 gRNA 선정에 따라 민감하게 반응하였다. LbCpf1을 가지고 한 실험에서 하나의 gRNA를 이용한 이중나선절단보다 50-nt 정도 거리를 둔 2개의 gRNA가 더 좋은 HDR 효과를 보였다. 또한 SpCas9 또는 LbCpf1의 안정적인 발현을 구현하기 위해 35S 프로모터의 5' UTR에 인핸서 기능을 갖는 AtUBQ1 ( Arabidopsis thaliana ubiquitin extension protein 1) 1번 인트론(서열번호 2)을 넣어 안정적인 발현을 유도하였다.
Ⅱ. HDR 효율 증대를 위한 레플리콘 제작
HDR은 HDR 주형의 카피 수에 의존적이므로 Bean dwarf mosaic virus 레플리콘의 안정정인 복제 최적화를 위해 Rep 유전자의 시작 코돈 앞에 Kozak consensus 서열(서열번호 3)을 삽입하여 Rep 번역의 효율증진을 도모하였다.
Ⅲ. HDR 효율 증대를 위한 레플리콘-T-DNA 분리 제작
Bean dwarf mosaic virus 레플리콘은 T-DNA 내에 탑재되었고 아그로박테리아를 사용하여 식물세포로 도입되었다. 이때 레플리콘은 그 크기가 증가함에 따라 안정성, 형질전환성 등이 떨어지고 식물세포에서 복제수가 감소하게 된다고 알려졌다. 다양한 인자의 발현이 필요하여 레플리콘의 크기가 과도하게 커질 경우, 각기 다른 레플리콘 T-DNA를 포함하는 독립된 2개의 아그로박테리아를 이용하여 동시에 동일 식물세포를 감염시킬 수 있으나 이는 단일 아그로박테리움 방식에 비해 효율이 떨어지므로 본 발명자는 다중 레플리콘(multiple replicon) 시스템을 사용하였다. 다중 레플리콘을 탑재한 하나의 T-DNA를 형질전환하여 세포내에서 2개 이상의 레플리콘으로 분리하여 작동하게 함으로써 HDR 효율 향상에 기여할 수 있다. 본 발명의 다중 레플리콘 시스템은 3개의 LIR과 3개의 SIR을 가지고 있어 세포로 주입되면 최대 3개의 레플리콘으로 분리되는 특성을 갖는다(도 17).
IV. 아그로박테리움에 의한 형질전환 후 식물 세포의 배양 조건 최적화
식물세포는 동물세포와 달리 두꺼운 세포벽이 있어 일반적으로 아그로박테리움을 사용하여 유전자를 전달하는데 아그로박테리움을 이용한 식물세포 내로의 유전자가위 부품의 효율적인 전달이 필요되고, 전달된 T-DNA로부터 레플리콘의 형성, 복제, 다양한 유전자가위 도구의 발현 등이 최적화되어야 한다.
이를 위해 아그로박테리움에 의한 식물세포의 형질전환을 최적화하기 위해 호르몬 등 식물세포 배양을 위한 배지 조건이 최적화되어야 하고, 이외에 온도 및 광주기(빛 처리) 조건이 최적화되어야 한다. 본 발명에서는 19, 25, 28 및 31℃의 온도 조건이 시험되었다. 온도가 높아짐에 따라 SpCas9 및 LbCpf1을 사용한 시스템 모두에서 HDR 효율이 상승하였다. 하지만 높은 농도에서 장시간 처리는 HDR 이벤트는 증가시킬지라도 HDR 이벤트가 발생한 식물체로의 재분화율이 낮아 28 및 31℃ 처리의 최적화 시간이 결정되었고, 본 발명에서는 5일/5일간의 28℃/31℃ 처리가 선택되었다. 또한 암조건, 단일처리 및 장일처리 등의 암광 주기 조건에서 HDR 효율을 조사한 결과, 서로 다른 광주기 조건에서 SpCas9 시스템은 HDR 효율에 있어 유의미한 차이를 보이지 않았으나, LbCpf1 시스템의 경우 암주기 처리보다 광주기 처리에서 더 높은 HDR 효율을 나타내었다. 또한, 단일처리는 장일처리에 비해 HDR 효율이 더 높았다.
V. 레플리콘 내 다양한 바이오부품 카세트 배치 최적화 필요
고효율의 HDR을 달성하기 위해서는 HDR에 사용되는 다수의 바이오부품의 클로닝 어셈블리 최적화를 통한 발현 최적화가 요구된다. 프로모터, 터미네이터 위치, 방향 등에 따라 유전자 발현 또는 레플리콘의 복제수에 영향을 미칠 수 있다. 특히 HDR 주형으로 사용하는 DNA가 어떤 프로모터를 갖고 있는지 살펴보고 RNA 이중나선이 만들어지지 않도록 하여야한다.
VI. HDR 경로의 유전학적인 최적화
HDR에 참여하는 관련인자 발현 최적화를 위한 유전학적인 발현조절을 위해 먼저 토마토에에 존재하는 HDR 경로 유전자를 조사하였다. HDR 경로와 연관된 인자들 (RPA1A (replication protein A), RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B (RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DMC1 (DNA Meiotic Recombinase 1), RAD52-1, RAD52-2, RAD54, XRCC1 (X-Ray Repair Cross Complementing 1), XRCC2, XRCC3, ATM (ATM Serine/Threonine Kinase), XRS2/NBS(MRN/X), Mre11(MRN/X), rad50(MRN/X), Brca1 (BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP/Com1/Sae2, exo1)의 발현 분석을 통해 SlMRE11, RAD51D, XRRC2, BRCA2, RAD54, ATM, RAD51, RAD52-1, RAD51B 유전자를 타겟 유전자로 선정하였고, 그 프로모터 부위를 인지하는 1개 또는 2개의 gRNA를 U6 프로모터를 사용하여 발현되도록 설계하고 동시에 35S 프로모터-5' UTR UBQ1 인트론을 사용하여 dCas9-sun tag//scAb-VP64를 발현시켰다. 이 경우 dCas9-sun 태그가 gRNA에 의해 프로모터에 결합하고 sun 태그는 scAb(single chain Antibody)-VP64 activation effector와 결합을 통해 전사를 촉진한다. 또 다른 방식으로 gRNA에 pumilio 단백질 또는 다른 RNA 결합단백질의 결합 모티프를 붙여 pumilio에 VP64 등을 포함한 activation effector를 직접 모집하거나 pumilio-sun tag//scAb-VP64 식의 증폭시스템을 사용할 수 있다. 이때 pumilio 단백질은 MS2 (MS2 bacteriophage capsid RNA-binding protein)나 dCsy4 (catalytically inactive Csy4) 등 RNA 결합단백질로 대체될 수 있으며 VP64도 다양한 activation effector에 의해 대체될 수 있다.
HDR 경로와 연관된 인자들에 대한 gRNA
gRNA1HDR (서열번호) strand gRNA2HDR strand
1 SlMRE11 ATCAAGTTAACGTTTATCTT (4) m ATTAGAGATTATAAATTTAA (5) m
2 RAD51D tttacaataatatatagtaa (6) p aagttgttagctagagtttc (7) p
3 XRRC2 TTTTAAAAGAAAAAATTAAA (8) m atacatatttatgtttgtta (9) p
4 BRCA2 tgcccaactaacgctcaaaa (10) p tgataataacaaaaatgacg (11) p
5 RAD54 AAAAAAATTTGTATGTTGTT (12) m tattattttatgttattgtt (13) p
6 ATM tagcatatgaccaaaataaa (14) p taacaaaacagaaaaagaag (15) p
7 RAD51 atgtgacccaatactttaag (16) p tatacccttaaactatattc (17) p
8 RAD52-1 TTCTATGCATAAATAATTAA (18) m gagagaaagaagcctcctca (19) p
9 RAD51B AGCTCTAAATGATAAAGTTG (20) m
* m: minus strand; p: plus strand
Ⅶ. HDR 경로의 화학적, 유전학적인 최적화
상기 VI. 접근방법과 동시에 또는 별개로 활용될 수 있는 방법은 HDR 경로 조절 단백질을 화학적인 인자를 사용하여 활성화시키는 방법이다. RAD51의 활성화제(activator)로 작용하는 RS-1을 사용한 결과 HDR 효율이 약 3배 증가함을 확인하였다.
Ⅷ. HDR 경로와 경쟁관계인 NHEJ 경로 또는 HDR을 억제하는 인자의 유전학적인 조절을 통한 HDR 최적화
HDR 경로와 경쟁관계인 NHEJ (non-homologous end joining) 경로에서 잘 알려진 단백질은 KU70 (XRCC6), KU80 (XRCC5) 및 LIG4 등이 있다. 또한 그 유전적인 돌연변이가 HDR을 촉진한다고 알려진 SMC6B, AtMMS21 (SMC5/6 component), ABO4, FAS1, RFC1, INO80, RecQ4a, FANCM, RecQ4b, RTEL1 등 다양한 유전자가 있다.
본 발명에서는 HDR 경로와 경쟁하는 NHEJ 경로의 리가제 IV의 저해제인 Scr7 Pyrazine 화학물질을 사용하여 NHEJ 경로를 차단하여 HDR 효율을 올리는 방법이 사용되었다. Scr7 Pyrazine의 경우 비교 대조군에 비해 4배까지 HDR 효율을 증가시킬 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 실험 재료
본 발명에 사용된 재료 및 시약 등은 하기 표 2와 같다.
본 발명에 사용된 재료 및 시약
출처 출처
Plant materials Reagents
Tomato variety Cultivar Hongkwang Local company Plant hormones; Acetosyringone; Hydrocarbon; β-D Glucuronide (X-Gluc); Chemicals for plant tissue culture; MS salts and vitamins; MS salts and B5 vitamins, PhytoAgar, Maltose. Sigma, USA; DUCHEFA Biochemie B.V., The Netherlands
Bacteria
Escherichia coli 10-beta NEB, USA
Agrobacterium tumefaciens GV3101::pMP90 GNU. Korea
DNA vectors
pTC147 Addgene, USA
pTC217
Golden Gate tool kit
MoClo Tool kit
Reagents
dNTPs Fermentas, Lithuania H 2O Treated with Millipore system (USA)
Phusion TaqDNA polymerase Kits
PfuDNA polymerase RevertAid™ H minus reverse transcriptase (1 stcDNAstrandsynthesis) Fermentas, Lithuania
T4 DNA ligase NEB, USA FirstChoice ® RLM-RACE (5 RACE) Invitrogene (Life Technology)
Restriction enzymes (BpiI, BsaI and others) CloneJE TM PCR cloning Fermentas, Lithuania
T7E1 endonuclease Plasmid DNA isolation kit (mini and midi); DNA extraction kit BIOFACT, Korea; Qiagen, Germany
Total genomic DNA isolation kit (mini preps); Total RNA extraction kit Qiagen, Germany
2. PCR을 통한 DNA 증폭
본 발명에서 사용된 PCR 반응물의 조성 및 PCR 증폭 조건은 하기 표 3 및 4와 같다.
PCR 반응물 조성
성분 농도 사용양 (㎕)
반응 버퍼 10X 2
dNTPs 2.5mM 2
정방향 프라이머 10μM 1
역방향 프라이머 10μM 1
주형 DNA 1-10ng 1
Taq 중합효소 1U/㎕ 1
증류수 - up to 20
PCR 반응 조건
단계 온도(℃) 시간 사이클 수
1 94-95 4-5 분 1 전변성
2 94-95 20-60 초 20-40 변성
3 프라이머 Tm 20-60 초 결합
4 72 ~1분/kb 신장
5 72 1-10 분 1 최종 신장
6 4-15 ∞ - 보관
3. 아그로-인필트레이션
아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101::pMP90 균주를 각각의 HDR 벡터로 형질전환하였다. 토마토 잎에서의 아그로박테리움 매개 일시적 발현(transient expression)은 압력 침투(pressure infiltration) 방법을 통해 수행하였다. 아그로박테리움 배양액은 600nm에서 흡광도가 1.0에 이를때까지 배양한 후, 인필트레이션 한시간 전에 200μM 아세토시린곤 (acetosyringone)을 처리하였다.
4. 토마토 형질전환 및 바이러스 도전감염
In vitro 조건에서 배양한 홍광 품종 유래 토마토 자엽 외식편을 HDR 컨스트럭트를 포함하고 있는 아그로박테리움을 사용하여 형질전환하였다. 홍광 품종의 멸균된 종자를 30g/ℓ의 수크로스를 함유한 1/2 MS 배지(pH 5.8)에서 25±2℃의 온도 조건, 16시간 명/8시간 암 조건으로 배양하였다. 7일령의 유묘를 수집하고, 이의 자엽을 0.2-0.3cm 크기로 세절하였다. 세절된 조각(외식편)을 전-배양 배지(MS basal salts, Gamborg B5 vitamins, 2.0 mg/ℓ of Zeatin trans-isomer, 0.1 mg/ℓ of indolyl acetic acid (IAA), 1 mM of putrescine, 30 g/ℓ of glucose, pH 5.8)를 포함하는 플레이트에 두어 1일 동안 전처리하였다. 전-배양된 외식편을 뾰족한 것으로 찌르고 HDR 컨스트럭트를 포함하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101::pMP90으로 형질전환하였다. 그 후, 외식편을 공배양 배지로 옮긴 후, 25℃에서 2일 동안 암조건으로 배양하였다. 그 후, 외식편을 비-선별 배지로 옮겨 5일간 배양한 후, 선별 배지로 계대배양하였다. 계대배양은 최고의 재생 효율을 얻기 위해 10일 간격으로 수행되었다. 줄기가 충분히 생장하였을 때(1.5-3.0cm), 발근배지(rooting medium)로 옮겨 완전한 식물체의 생장을 유도하였다. 발근배지로부터 성장한 식물체는 버미큘라이트(vermiculite) 포트로 옮겨 순화시킨 후, 26±2℃의 온도 조건, 16시간 명/8시간 암의 광주기로 유지되는 온실의 토양으로 옮겼다.
5. BeYDV 레플리콘 방출의 PCR 기반 검출
BeYDV 원형 레플리콘 방출의 역학적 경향을 분석하기 위해, 단일-구성 BeYDV 벡터 pLSL.GFP.R, pLSL.R.GGFP 및 비-바이러스성 벡터 pAGM4723를 사용하였다.
본 발명에 사용된 주요 벡터
Construct name Application
pLSL.GFP.R(Cermak et al. 2015) Virus Circularization detection
pLSL.R.GGFP Virus Circularization detection
pAGM4723 Non-viral vector, replicon detection control
pTC147 (Cermak et al. 2015) 35S:ANT1 expressing, non-replicatingT-DNA transformation efficiency control
pTC217 (Cermak et al. 2015) BeYDV ANT1-GT T-DNA vector with Cas9/gRNA1b in the replicon
토마토 자엽을 상기 각각의 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움으로 형질전환하고, 형질전환 후 2, 5, 9, 12, 16, 30일 후에 각 그룹에서 2개의 자엽을 수거하여, 400 ㎎/ℓ의 티멘틴(timentin)으로 세척한 후 -80℃에 보관하였다. 그 후, 각 시료로부터 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 게노믹 DNA를 추출하고, 하기 표 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 1%(w/v) 아가로스 겔에 로딩하여 밴드 강도를 Image J 프로그램(imagej.nih.gov/ij/)을 사용하여 계산하였고, GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 표준화하였다.
레플리콘 형성 조사를 위한 프라이머
프라이머 서열정보(5'→3') (서열번호) 산물 크기 응용
GR-F1 TTGAGATGAGCACTTGGGATAG (21) 545 bp virus circularization detection in pLSL.GFP.R
35S-R5 CGTAAGCCTCTCTAACCATCTG (22)
GR-F1 TTGAGATGAGCACTTGGGATAG 537 bp virus circularization detection in pLSL.R.GGFP
tOCS-R1 GTTCTGTCAGTTCCAAACGTAAA (23)
pVS1-F1 ATCTCGCGGTACATCCAATC (24) 521 bp To detect vector Backbone from Agrobacterium in tomato
pVS1-R1 TTCGTTCCGATGCTCTATGAC (25)
GADPH-F CCATAACCTAATTTCTCTCTC (26) 1208 bp internal control
GADPH-R GTCATGAGACCCTCAACAAT (27)
6. HDR 빈도 측정
Cas9의 HDR 빈도를 측정하기 위해서, 아그로박테리움 감염 21일 후에 pTC217 (BeYDV with Cas9/gRNA1b) 바이러스 레플리콘으로 감염된 자엽과, pTC147 (35S:ANT1 T-DNA) 대조구 벡터로 형질전환된 자엽에서 보라색 스폿을 계산하였다. HDR 빈도율은 pTC217에서 생성된 캘러스에서 계산된 총 보라색 스폿의 수를 pTC217에서 생성된 캘러스에서 계산된 총 보라색 스폿의 수로 나누어 산출하였다.
실시예 1. 안토시아닌 마커 활용 상동재조합 효율 분석
토마토 작물에서 HDR 기반 유전자가위의 효율성을 조사하기 위해 안토시아닌 합성을 조절하는 전사인자인 ANT1 유전자의 전사시작 위치의 상류 프로모터 위치에 HDR을 통한 35S 프로모터를 삽입하여 ANT1 유전자의 활성화에 따른 안토시아닌 과발현을 통해 자주색 캘러스 형성을 유도하였다.
HDR 주형(서열번호 29)은 35S 프로모터 염기서열과 그 상류에 pNos-NPTⅡ-OCSt가 삽입되어 HDR 이벤트시 카나마이신 저항성을 갖도록 설계하였다. 이때 상동성을 갖는 상부 염기서열은 1,043bp 였고 하부 염기서열은 592bp 였다. 또한 그 상부에는 두 TALEN 결합부위 또는 dSaCas9(D10A, N580A)/gRNA 결합부위를 추가하였다. DNA 이중나선 절단은 SpCas9( Streptococcus pyogenes Cas9)/gRNA, LbCpf1( Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1)/gRNA1 또는 LbCpf1/gRNA1/gRNA2 등이 사용되었으며 HDR 주형에서 gRNA(guide RNA) 상보 염기서열은 자리-특이적 돌연변이 (site-specific mutation)를 통해 Cas9 또는 Cpf1에 의해 절단이 일어나지 않도록 설계되었다. 가장 단순한 형태의 유전자가위 레플리콘은 SpCas9/LbCpf1, 1-2개의 gRNA, ANT1 HR 주형으로 구성되며 추가로 dCas9 (dead Cas9) 기반 전사활성화 시스템, dCas9 기반 HDR 주형 집적시스템을 구성하였다. HDR이 성공적으로 일어난 캘러스 또는 식물은 안토시아닌의 과축적으로 자주색을 보였다. 현재까지 얻어진 HDR 효율은 35S-ANT1 벡터를 기준으로 나눈 값으로 약 20% 정도의 HDR 이벤트 효율을 보였고 30여개의 떡잎을 사용했을 때 1개의 HDR 식물을 얻는데 성공하였다.
또한, HR 효율 증대를 위해 온도, 광조건 등을 다양하게 변형시켰다.
토마토 홍광 F 1을 이용한 HDR 효율 증대를 위한 초기 온도 및 광조건 탐색
No Construct HDR ex325℃ HDR ex332℃ HDR ex5(30dpt, light, 28℃) HDR ex5(30dpt, dark, 28℃)
1 pTC147 289/29* 282/32 413/54 411/52
2 pTC217 5/31 13/33 10/69 28/60
* 보라색 캘러스 수/자엽수pTC147은 자엽당 T-DNA가 형질전환되어 안토시아닌을 만든 캘러스 수를 나타내며, pTC217은 자엽당 HDR에 의한 캘러스 수를 나타냄.
다른 온도 조건에서 HDR 효율 조사 (배양 후 21일차의 결과)
No 온도(℃) Construct 총 외식편 * TPS 1 HRE 2 HRC 3
1 19 pTC147 111 2164
pTC217 157 19 11.97±6.39 0.54±0.25
2 25 pTC147 131 2008
pTC217 149 30 22.08±8.86 1.57±0.71
3 28 pTC147 113 1714
pTC217 150 60 47.62±31.40 2.72±1.59
4 31 pTC147 116 1428
pTC217 141 57 44.85±15.54 3.84±1.10
[*; 실험은 동일 조건으로 4반복 수행함,TPS; 보라색 스폿의 총 수, HRE; 총 외식편에 대한 HDR 효율의 평균(%), HRC; 대조구인 pTC147의 보라색 스폿의 총 갯수로 표준화한 HDR 효율 평균.]
상기 표 8을 통해 확인할 수 있듯이, 고온으로 처리될수록 HDR 효율이 상승하였다. 또한, 높은 표준오차는 형질전환 21일 후에 미성숙 토마토 줄기에서 안토시아닌의 생산으로 인해 실제 유전자편집과 혼동이 온 것으로 예측되었다.
또한, CRISPR/Cpf1 시스템 및 이의 업그레이드 시스템을 사용한 경우의 HDR 효율을 분석하였다. 그 결과, CRISPR/Cpf1 시스템을 사용한 초기 컨스트럭트 버전에서 HDR 이벤트가 성공적으로 발견되었다. 7711-1 및 7721-1은 각각 Rep과 gRNA를 갖지 않는 대조군이다(표 9). 또한, CRISPR/Cpf1 업그레이드 버전은 초기 버전에서 자체 컨스트럭트에서 생기는 RNAi 효과를 최소화하기 위해 골든게이트 어셈블리 (goldengate assembly)시 레벨 2 제작시 방향성을 최적화하여 기존 초기 버전의 CRISPR/Cpf1 기반 컨스트럭트 보다 효과가 상향되었을 뿐만 아니라 타 연구그룹에 의해 발표된 CRISPR/Cas9 기반의 컨스트럭트에 비해 더 향상된 HR 효과를 보였다(표 10).
CRISPR/Cpf1 시스템을 사용한 HDR 효율 측정
No Construct 총 외식편 TPS HRE HRC
1 7711-1 320 1 0.48±0.48 0.03±0.03
2 7721-1 233 1 0.46±0.46 0.03±0.03
3 7731-1 315 58 17.67±7.86 1.01±0.44
CRISPR/Cpf1 업그레이드 시스템을 사용한 HDR 효율 측정
No. construct 온도상* 총 외식편 TPS HRE HRC
1 pTC147 5.31-5.25 63 1073
5.31-5.28 63 1154
10.31 65 1084
2 pTC217 5.31-5.25 43 23 53.46±1.09 3.58±0.74
5.31-5.28 69 37 54.80±6.19 3.16±0.64
10.31 70 47 67.80±14.29 3.92±0.75
3 8161-1 5.31-5.25 71 58 76.12±18.96 4.51±0.74
5.31-5.28 68 52 77.55±5.84 4.43±0.64
10.31 59 45 75.40±3.97 4.44±0.75
4 7731-1 5.31-5.25 70 28 40.78±3.21 2.62±0.55
5.31-5.28 75 25 32.25±2.71 1.82±0.27
10.31 75 22 29.32±4.80 1.68±0.09
5 82611-2 5.31-5.25 24 1 4.17 0.34
5.31-5.28 28 3 10.71 0.67
10.31 23 1 4.35 0.26
6 8131-4 5.31-5.25 67 14 21.03±6.22 1.35±0.44
5.31-5.28 76 11 14.27±6.40 0.81±0.41
10.31 52 7 12.97±12.97 0.77±0.77
7 8141-2 5.31-5.25 66 6 10.50±4.76 0.76±0.45
5.31-5.28 73 4 6.35±2.72 0.37±0.18
10.31 77 4 4.53±2.27 0.27±0.14
8 8151-1 5.31-5.25 68 10 14.0±5.60 0.81±0.25
5.31-5.28 66 5 8.99±4.50 0.48±0.25
10.31 68 3 3.33±3.33 0.16±0.16
[* 5.31-5.25, 공배양(cocultivation) 후 외식편을 31℃에서 5일간 처리 후 25℃에서 5일간 처리; 5.31-5.28, 공배양 후 외식편을 31℃에서 5일간 처리 후 28℃에서 5일간 처리; 10.31, 공배양 후 외식편을 31℃에서 10일간 처리.]
또한, CRISPR/Cpf1 업그레이드 버전을 이용한 형질전환 후의 광주기에 따른 HDR 효율을 분석한 결과는 하기 표 11과 같다. 하기 표를 통해 확인할 수 있듯이, CRISPR/Cpf1 기반 컨스트럭트는 DD 조건에 비해 L/D 조건에서, 특히 단일 조건(short day)에서 효율이 약 2배 상승하는 것을 알 수 있었다.
형질전환 후 사용된 광주기에 따른 HDR 효율 비교
No. Construct 광주기 총 외식편 TPS HRE HRC
1 pTC147 DD 55 1147
8L/16D 56 1116
16L/8D 62 1260
2 pTC217 DD 33 20 60.61 2.90
8L/16D 41 32 78.05 3.61
16L/8D 34 20 58.82 2.68
3 8161-1 DD 57 54 102.78±30.56 4.94±1.49
8L/16D 59 124 206.82±11.59 9.44±0.66
16L/8D 58 100 171.88±3.88 7.91±0.10
4 8253-2 DD 52 33 57.42±39.25 2.75±1.87
8L/16D 73 46 58.84±33.84 2.70±1.58
16L/8D 63 10 14.30±4.30 0.66±0.19
5 82611-2 DD 23 7 30.43 1.47
8L/16D 12 5 41.67 1.87
16L/8D 22 3 13.64 0.63
[DD, 공배양(cocultivation) 후 외식편을 31℃, 암조건에서 10일간 처리; 8L/16D, 공배양 후 외식편을 31℃, 8시간 명/16시간 암 주기에서 10일간 처리; 16L/8D, 공배양 후 외식편을 31℃, 16시간 명/8시간 암 주기에서 10일간 처리.]
실시예 2. SCR7 pyrazine 처리에 의한 식물 상동성재조합 빈도 증대
대부분의 DNA 수선은 NHEJ 경로에 의해 발생하며, HDR 기반 수선은 매우 부분적으로 일어난다. 포유류에서 기존의 연구는 NHEJ 경로 차단이 HDR 효율을 높일 수 있다고 보고하였다. 포유류 리가제 IV의 억제제인 SCR7 pyrazine은 마우스에서 약 19배, 인간 세포주에서 5배까지 HDR을 향상시키는 것으로 보고되었다. 식물에서 Nishizawa-Yokoi 등(2016, Plant Physiol. 170(2):653-666)은 리가제 IV가 벼에서 NHEJ 경로에 중요한 역할을 한다고 제안했다. 그러나 SCR7 pyrazine이 식물 HDR에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 Cas9 구조 pTC217 (Cas9/gRNA1b를 갖는 BeYDV)을 사용하여 상이한 배양 기간(0, 1, 2 및 3 일), 상이한 SCR7 pyrazine 농도(0, 1, 10 μM)의 처리 효과를 분석하였다. 그 결과, HDR 빈도는 SCR7 pyrazine 처리 시간(기간)과 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 확인되었다(표 12-표 14).
NHEJ 저해제 처리에 의한 HDR 효율 변화 (tomato cv. Tom-Heart, 21 dpi)
Construct pTC147 (T-DNA) pTC217 편집 효율*
NHEJ 저해제-SCR7 (2nd 처리) 농도 조건 온도 총 자엽수 Purple spot/자엽(평균) Purple spots(합계) Purple spot/자엽(평균) Purple spots(합계)
0 16L/8D 25℃ 52 27.1 1409 0.88 46 3.2
1μM 16L/8D 25℃ 52 22.2 1154 1 52 4.5
10μM 16L/8D 25℃ 52 21.8 1137 2.61 136 11.9
[편집 효율 : total purple spots(pTC217)/ total purple spots(pTC147) x 100]
Figure PCTKR2019000501-appb-img-000001
[광주기 조건 : 10일 동안 암처리(DD) 후 16시간 명/8시간 암 처리]
NHEJ 저해제 처리기간별 HDR 효율 변화 2 (tomato cv. Hong-Kwang, 21 dpi)
Construct pTC147 (T-DNA) pTC217 편집효율*
SCR7 처리농도 SCR7처리 기간 광주기 조건 온도 총 자엽 수 Purple spot/자엽(평균) Purple spots(합계) Purple spot/자엽(평균) Purple spots(합계)
0 DD→16L/8D 28℃ 35 20.9 732 0.90 31 4.23
1μM 1일 DD→16L/8D 28℃ 35 26.0 912 1.96 68 7.45
2일 DD→16L/8D 28℃ 35 17.9 627 1.29 45 7.17
3일 DD→16L/8D 28℃ 35 18.9 663 1.44 50 7.54
10μM 1일 DD→16L/8D 28℃ 35 22.9 802 2.60 91 11.34
2일 DD→16L/8D 28℃ 35 21.5 754 2.91 102 13.52
3일 DD→16L/8D 28℃ 35 18.8 660 2.85 100 15.15
실시예 3. BeYDV 복제 replicon 방출의 동역학 패턴
본 발명자는 아그로박테리움 감염 토마토 자엽(cotyledon) 시스템에서 원형 BeYDV 레플리콘의 최대 방출에 대한 최적의 시점을 발견했다. 바이러스 레플리콘은 식물 세포의 핵으로 전달되는 선형 T-DNA로부터 원형 형태로 방출되는 경향이 있으며 롤링 서클 복제에 의해 세포 당 수백 내지 수천 카피로 증폭된다. 최대화된 레플리콘 방출에 대한 동역학적인 정보는 조직 배양 시스템에 작은 분자를 적용하는 최적 시기에 대한 정보를 제공할 수 있다. 레플리콘 방출의 동역학 패턴을 연구하기 위하여, BeYDV 벡터 pLSL.GFP.R(Cermak et al., 2015) 및 pLSL.R.GGFP 및 비 바이러스 벡터 pAGM4723을 함유하는 아그로박테리움으로 자엽을 형질전환시켰다. 바이러스 원형은 감염된 자엽으로부터 분리된 게놈 DNA에서 두 개의 LIR 영역의 접합부를 증폭시키는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 분석에 의해 검출되었다. 아그로박테리움에 감염된 토마토 자엽을 포함하는 pLSL.GFP.R에 대해 2일에서 8주까지 BeYDV 레플리콘의 안정한 존재가 보고되었었다. 그러나, 바이러스 복제본 방출의 최대 시간은 보고된 바가 없다. 본 발명자들은 2일에서 30일까지의 샘플을 이용하여, 각 분석 시점으로부터 BeLSV 원형 형태의 pLSL.GFP.R 및 pLSL.R.GGFP가 안정하게 존재함하고 있음을 발견하였다. 감염 2일 후, 레플리콘 원형은 벡터 시스템에서 매우 낮은 수준이었고 pLSL.R.GGFP 벡터 시스템에서 5일 후 갑자기 최대로 증가했다. pLSL.GFP.R 벡터 시스템에서 감염 9일 후 점차적으로 최대값이 증가하였고, 레플리콘은 서서히 감소하였으나 감염 후 30일 동안 분석된 샘플에서 안정적으로 유지되었다. 비 바이러스성 벡터 샘플에서 레플리콘은 발견되지 않았다(도 14 내지 도 16).

Claims (9)

  1. 유전자가위 시스템을 이용한 식물체의 유전자 편집 방법으로서,
    식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하거나, 다중 레플리콘(multiple replicon)을 이용하거나, HDR(homology-directed DNA repair) 경로 또는 NHEJ(non-homologous end joining) 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합(homologous recombination) 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    식물세포의 조직배양 동안 온도 및 광주기 조건을 최적화하고, 다중 레플리콘(multiple replicon)을 이용하며, HDR(homology-directed DNA repair) 경로 또는 NHEJ(non-homologous end joining) 경로를 조절하는 단계를 포함하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조직배양의 온도 조건은 식물조직의 공배양(cocultivation) 후 4~6일간은 29~33℃로 배양하고, 이후 4~6일간은 26~30℃로 배양하는 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조직배양의 광주기 조건은 6~10시간의 명기 및 14~18 시간의 암기로 이루어진 단일조건(short day)인 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 레플리콘은 게미니바이러스(geminivirus) 기반 레플리콘인 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HDR 경로의 조절은 RPA1A(replication protein A), RPA1B, RPA1C, RPA1D, RAD51B(RAD51 paralog B), RAD51C, RAD51D, RAD51, DMC1(DNA Meiotic Recombinase 1), RAD52-1, RAD52-2, RAD54, XRCC1(X-Ray Repair Cross Complementing 1), XRCC2, XRCC3, ATM(ATM Serine/Threonine Kinase), XRS2/NBS(MRN/X), Mre11(MRN/X), rad50(MRN/X), Brca1(BRCA1, DNA repair associated), Brca2A, Brca2B, CtlP/Com1/Sae2 및 exo1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현을 조절하거나 HDR 경로의 활성화제(activator)를 처리하여 HDR 경로를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 NHEJ 경로의 조절은 KU70(XRCC6), KU80(XRCC5) 및 LIG4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현을 조절하거나 NHEJ 경로의 저해제를 처리하여 NHEJ 경로를 저해시키는 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자가위 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산가수분해효소 및 상기 핵산가수분해효소를 편집하고자 하는 표적 게놈 자리로 유도할 수 있는 가이드 RNA를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산가수분해효소는 코딩 서열 내에 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtTrp1 ( Arabidopsis thaliana telomeric repeat-binding protein) 인트론이 삽입된 것을 특징으로 하는 식물체에서 상동재조합 기반의 유전자 편집 효율을 증가시키는 방법.
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