CN114231568B - 一种提高dna修复效率的辅助蛋白及其基因编辑载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高DNA修复效率的辅助蛋白及其基因编辑载体和应用，属于基因编辑与基因治疗技术领域。本发明提供的提高DNA修复效率的辅助蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。本发明提供的辅助蛋白片段更短，相比于RAD51‑Cas9n***，同源重组效率更高，更适合转基因病毒载体包装；相比于Prime editing***，能修复多碱基与大片段DNA变异，修复功能更强。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑与基因治疗技术领域，尤其涉及一种提高DNA修复效率的辅助蛋白及其基因编辑载体和应用。
背景技术
目前人类针对遗传DNA发生序列或者结构方面的改变导致的遗传病(GeneticDiseases)，缺乏有效的治疗手段。目前的应对方法更偏重于产前诊断等预防措施，而非主动治疗。精准医学(Precision medicine)为根治复杂遗传病提供了解决方案，这是一种随着基因测序和药物基因组学的进步而发展起来的新概念，突破传统医学在个体诊断和特殊治疗方面的瓶颈，涵盖免疫炎症、癌症、心脏病等遗传病，以及糖尿病、神经退行性疾病等其他慢性疾病。基因治疗(Gene therapies)和基因编辑(Gene editing)则是通过向患者携带突变的细胞中导入正确序列的DNA片段以置换有害片段，或导入蛋白分子，激活细胞抗逆通路、关闭致病基因作用路径、协助正确DNA置换、以及对碱基进行定点修正，达到根治遗传病的目的。基因编辑技术已广泛应用于疾病的生物治疗领域，在一些遗传性疾病和罕见病，如地中海贫血症，杜氏肌营养不良症的治疗中，以及肿瘤的免疫治疗领域，已经获得了很好的临床评价。
基因编辑(Gene editing)是指在活体基因组的特定位置进行DNA片段***、删除、修改或替换。CRISPR基因编辑***于2012年由Jennifer Doudna和EmmanuelleCharpentier等团队先后阐明(Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,and Charpentier,E.(2012).A programmable dual-RNA-guidedDNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science 337,816-821.)，该***仅需1条sgRNA(single-guided RNA)和Cas(CRISPR-associated)核酸酶即可实现高效定点切割，因其简洁高效的特点已成为基因工程技术的主流。Cas9是其中具有代表性的核酸酶。Cas9核酸酶本身具有HNH和RuvC两个核酸酶结构域，它由sgRNA引导来到基因组特定位置，识别PAM(Protospacer AdjacentMotif)而稳定，进而在PAM的5’上游3bp处形成双链断裂(DoubleStrand Break,DSB)。但该***的弊端在于脱靶效应，目前可通过生物信息学优化sgRNA的设计而改善。
在Cas9等酶的切割作用下，细胞基因组被诱导发生DSB和自发的修复。细胞自发的DNA修复机制有多种，包括非同源末端连接(Non-homologous EndJoining,NHEJ)、同源重组(Homology Directed Recombination,HDR)、选择性非同源末端连接(alternative DNAEnd Joining,altEJ)和单链退火(single-strand annealing,SSA)等。在NHEJ途径中蛋白组件将断裂的双股DNA在空间上拉近，然后由DNA连接酶接合，此过程无需模板，但常常会引入随机***或缺失(indel)。HDR依赖的DNA损伤修复机制，也是DSB诱发的自发基因修复的机制之一。HDR整个过程需要DNA损伤应激蛋白的参与，包括Brac2、BARD1和Rad51等。细胞基因组通过HDR，根据内源姐妹染色体或外源基因片段提供的模板，能对Cas9切割的基因片段进行精准修复。
基因治疗的基本策略，是利用病毒(例如腺病毒AAV)载体携带Cas9蛋白、sgRNA和供体DNA模板，对机体细胞基因组的突变DNA进行基因编辑和修复。HDR方式的DNA修复是CRISPR/Cas9基因编辑过程中希望获得的基因修复方式，但它在细胞自发性的基因修复过程中比例比较低，通常不到1％。而NHEJ依赖的DNA修复在此过程中占绝大部分比例。因此，科学界的重要目标，就是提升CRISPR/Cas9基因编辑过程中依赖HDR方式的DNA修复比例，更好的实现基因精准编辑和治疗。
因此，通过基因编辑的同源重组进行基因修复，成为基因治疗的重要策略之一。为了实现更好的靶向精准基因修复，当前主要有如下几种方式：
(1)单碱基编辑。已开发出CBE(Cytosine Base Editor)和ABE(由失活Cas9与tRNA腺苷脱氨酶整合而成)对基因组特定区域脱氧核苷酸的胞嘧啶进行化学基团的催化转变，实现了单碱基编辑。目前，单碱基编辑技术获得广泛肯定，但仍被报道存在脱靶导致RNA突变的风险，也提示了研究人员还应关注转录组脱靶等方面的副作用。
(2)采用先导编辑(Prime Editing)***。将Cas9n蛋白与工程化的逆转录酶整合在一起，结合既能特异靶向又能编码目的序列的pegRNA(prime editing gRNA)，在人类细胞基因组的特定位点直接“写入”新的遗传信息。之后通过改进上述先导编辑***，通过瞬时表达MMR(DNA Mismatch Repair)抑制蛋白MLH1dn而减少了indel副产物，同时通过改造prime editor而显著提升了编辑效率，组建出兼容PE4***、PE5***和epegRNA***的PEmax架构。
(3)使用Rad51蛋白辅助胚胎基因编辑，通过激活IHR(InterHomolog Repair)途径显著提高胚胎基因敲入(Knock-In,KI)的效率。研究表明将hRad51(S208E-A209D)和Cas9n融合表达，在HEK293T细胞中获得了更高的整合效率、更低的缺失和脱靶率。
(4)通过抑制NHEJ等其他DSB修复途径，也可以达到提高目的片段***效率的目的。例如，有研究使用小分子药物NU7441和KU-0060648在多种细胞中抑制NHEJ途径的关键成员DNA-PK，提高了HDR的比例。
目前的各种精准基因编辑器(ABE/CBE，Prime editing等)序列长度太长，超出常用转基因载体的容量限制。目前基因治疗中常用的腺病毒载体(AAV)容量只有4.7kb，载体中基本框架约1200bp(包括两个ITR共290bp，hCMV约750bp，polyA约150bp)，剩下的载体容量只有3kb左右。慢病毒载体(Lentivirus)容量可以到6～6.5kb左右，剔除hCMV和PolyA,一般也不到5kb的***片段。而且***片段越大，慢病毒包装滴度就会显著下降。而Cas9基因本身就有4.1kb长度。这导致在设计基因编辑器载体***的时候，经常不得不用二元，甚至三元载体***，但这样***又会导致病毒包装的效率显著下降。
发明内容
本发明的目的在于提供筛选更短的辅助蛋白，协助基因编辑诱发的DNA修复过程，提升HDR(同源重组)方式的基因精准修复比例。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提高DNA修复效率的辅助蛋白，所述辅助蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了一种包括所述辅助蛋白的表达质粒。
优选的，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供了一种提高DNA修复效率的基因编辑载体，包括所述的辅助蛋白、DNA编辑蛋白和递送载体。
优选的，所述DNA编辑蛋白包括Cas9蛋白、CasX蛋白、CasΦ蛋白、Cas12蛋白、Cas14蛋白。
优选的，所述辅助蛋白与DNA编辑蛋白的碳端或氮端融合。
优选的，所述递送载体包括类病毒载体Lentivirus、腺病毒载体AAV、逆转录病毒载体pMSCV、pCMV克隆载体和整合缺陷型的类病毒载体。
优选的，所述整合缺陷型的类病毒载体***包括psPAX2-D64V-NC-MS2(Addgene,#122944)，pCMV-BRID-Cas9-6XMS2(质粒图谱如图14所示和质粒序列如SEQ ID NO：14所示)。
本发明还提供了一种所述辅助蛋白、表达质粒、基因编辑载体在制备提高DNA修复效率的产品中的应用。
优选的，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。
优选的，所述提高DNA修复效率的产品包括提高DNA修复效率的药物或试剂。
本发明提供的辅助蛋白片段更短，相比于RAD51-Cas9n***，同源重组效率更高，更适合转基因病毒载体包装；相比于Prime editing***，能修复多碱基与大片段DNA变异，修复功能更强。
附图说明
图1为pcDNA3.1-NLS-BARD1质粒的质粒图谱；
图2为pcDNA3-BRID质粒的质粒图谱；
图3为pcDNA3-ARD质粒的质粒图谱；
图4为pcDNA3-BRID-ARD质粒的质粒图谱；
图5为实施例2荧光显微镜观察GFP+的293T细胞的荧光密度情况；
图6为实施例2的组1通过FACS分析GFP+的293T细胞比例情况；
图7为实施例2的组2通过FACS分析GFP+的293T细胞比例情况；
图8为实施例2的组3通过FACS分析GFP+的293T细胞比例情况；
图9为实施例2的组4通过FACS分析GFP+的293T细胞比例情况；
图10为实施例2的组5通过FACS分析GFP+的293T细胞比例情况；
图11为实施例2组1～5经FACS分析GFP+的293T细胞比例柱状图；
图12为辅助蛋白BRID的电泳图；
图13为BRID-Cas9片段的电泳图；
图14为整合缺陷型的类病毒载体pCMV-BRID-Cas9-6XMS2的质粒图谱。
具体实施方式
实施例1
分别构建辅助蛋白BRID、ARD和BRID-ARD的表达质粒。
分别以辅助蛋白BRID、ARD和BRID-ARD片段作为***DNA，以pcDNA3.1-NLS-BARD1质粒作为载体骨架，构建pcDNA3-BRID、pcDNA3-ARD和pcDNA3BRID-ARD表达质粒。其中，辅助蛋白BRID、ARD和BRID-ARD的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。pcDNA3.1-NLS-BARD1质粒的质粒图谱如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
构建过程如下：分别取BRID、ARD和BRID-ARD辅助蛋白，用BamH1+Xho1内切酶(NEB公司)，在37℃双酶切2h，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)分别回收DNA产物(作为***DNA)；将pcDNA3.1-NLS-BARD1质粒也用BamH1+Xho1内切酶(NEB公司)，在37℃双酶切2h，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)分别回收DNA产物(作为载体骨架DNA)；然后用T4连接酶按照如下连接体系(表1)在25℃下反应5min以上，完成连接：
表1构建三种表达质粒的连接体系
| 组成成分 | 用量 |
| 5×T4 Ligase Buffer | 2μl |
| ***DNA | 90fmol |
| 载体骨架DNA | 30fmol |
| T4 Ligase | 1μl |
| ddH2O | 补足体系至10μl |
完成连接后，再分别将三种连接产物转化DH5感受态细菌(擎科，货号：TSC-C14)，在LB平板上挑克隆，测序鉴定得到，测序鉴定得到表达质粒pcDNA3-BRID、pcDNA3-ARD和pcDNA3-BRID-ARD。表达质粒pcDNA3-BRID的质粒图谱如图2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；表达质粒pcDNA3-ARD的质粒图谱如图3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；表达质粒pcDNA3-BRID-ARD的质粒图谱如图4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例2
荧光报告质粒pDR-GFP在CRISPR/Cas9的作用下，诱发细胞自主性的进行NHEJ途径或HDR途径的DNA修复过程。只有依赖于HDR的修复方式，细胞能正常发出绿色荧光，如果NHEJ介导的DNA连接修复，GFP荧光会比较弱或者没有荧光。
本实施例利用荧光报告质粒pDR-GFP(购自Addgene,#26475)作为HDR途径依赖的DNA修复效率的报告质粒。用于检测实施例1中构建的三种辅助蛋白的表达质粒对HDR途径的DNA修复效率。
针对荧光报告质粒pDR-GFP上的I-SceI酶切位点附近的DNA序列设计SceGFPgRNA1，通过BsmB1位点克隆进入Lenti-sgRNA-CRISPR-v2载体(购自Addgene,#52961)，得到Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR基因编辑载体。克隆方法如下：
(1)将慢病毒载体Lenti-sgRNA-CRISPR-v2，用BsmB1限制性内切酶(NEB公司)，在37℃酶切2h。用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)回收DNA片段。
(2)取如下2个引物DNA片段混合，95℃变性5分钟，20℃室温下冷却20分钟。
SceGFPsgRNA1-for:aaacaagttcagcgtgtccggcta(如SEQ ID NO:8所示)
SceGFPsgRNA1-rev:aaaatagccggacacgctgaactt(如SEQ ID NO:9所示)。
(3)将纯化的Lenti-sgRNA-CRISPR-v2酶切载体，与变性后的2个引物，混合，然后用1μl的T4连接酶(Invitrogen)25℃下反应5min以上，连接体系如表2所示：
表2构建Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR载体的连接体系
| 组成成分 | 用量 |
| 5×T4 Ligase Buffer | 2μl |
| 2个引物 | 90fmol |
| 纯化的Lenti-sgRNA-CRISPR(v2)酶切载体 | 30fmol |
| T4 Ligase | 1μl |
| ddH2O | 补足体系至10μl |
(4)将连接产物转化Stbl3大肠杆菌感受态菌株(擎科，货号TSC06)，在LB培养基上挑克隆，过夜培养后抽提DNA，用测序方法鉴定***sgRNA1的克隆，命名为Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR基因编辑载体。
将荧光报告质粒pDR-GFP和Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR基因编辑载体转染293T细胞，再分别转入表达质粒pcDNA3-BRID、pcDNA3-ARD和pcDNA3-BRID-ARD，测定三种表达质粒对HDR途径DNA修复效率的影响。并以单独转染荧光报告质粒pDR-GFP的293T细胞为空白，以转染荧光报告质粒pDR-GFP和Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR基因编辑载体的293T细胞为对照。
按6.25×104个/孔的密度，将293T细胞接种在24孔板中，在DMEM高糖培养基+10％胎牛血清FBS中，使293T细胞在37℃下贴壁生长24h。按照表3配置转染预混体系，每个组设置3个孔的重复。混合体系使DNA与Lipo8000脂质体(碧云天公司)混合均匀，室温静置10min以上。向每孔中加入对应的转染体系，轻微倾斜旋转24孔板使各孔体系混匀，然后将24孔板放入细胞培养箱中，继续用DMEM高糖培养基+10％胎牛血清FBS，在37℃下培养。
表3转染预混体系
表4培养基的成分表
| 组成成分(每50ml) | 品牌 | 用量 |
| DMEM高糖培养基 | HAKATA | 45ml |
| 胎牛血清(FBS) | Gibco | 5ml |
| 青霉素-链霉素溶液(100×) | 碧云天 | 0.5ml |
细胞培养48h，在荧光显微镜下观察荧光密度情况。然后给每孔细胞更换成含有工作浓度为2μg/mL的puromycin的完全培养基，进行短时间的药物刺激以增强质粒基因表达，在不损失细胞的前提下放大荧光信号强度。在puromycin刺激下培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光密度情况，拍照记录如图5。从图5中可以看出，组3、组4和组5荧光强度明显高于对照组组2。因此，本发明提供的三个辅助蛋白BRID、ARD、BRID-ARD都能有效提升HDR途径DNA修复效率。
拍照后，将293T细胞消化转移至流式分析试管中，用DPBS洗涤2次后使用流式分析仪，分析GFP+荧光细胞占细胞总数的比例，进行HDR依赖的DNA修复比例的定量统计，分析结果如图6～图11。从图6～图11可以看出，本发明提供的三个辅助蛋白BRID、ARD、BRID-ARD都能有效提升DNA修复效率至12％～15％。但BRID片段最小，只有96个氨基酸，适合与Cas9蛋白融合，做新的基因编辑器。
本实施例中，pDR-GFP报告载体GFP基因片段当中***了18bp的I-sce1内切酶，本发明提供的基因编辑载体能够以I-sce1位点2侧100bp的供体同源臂DNA为辅助，完整的切割掉这个18bp区段，并实现片段的完美修复。这证明了本发明提供的基因编辑***能修复多碱基的DNA变异。同理，在同源臂的引导下，以HDR依赖的DNA修复方式，也能够实现对大片段DNA的替换与修复。
实施例3
构建包括BRID、ARD或BRID-ARD的基因编辑载体
一、扩增Cas9片段
以Lenti-sgRNA-CRISPR-v2质粒(购自Addgene,#52961)为载体模板，扩增Cas9片段。
引物序列：
BARD1-Cas9-5-for2：tataggcagtgggctgtcttcagaaatggacaagaagtacagcatcggc(SEQ ID NO:10)；
BARD1-Cas9-5-rev2：taacgcgttcacttatcgtcatcgtctttgtaatcgtcgcctcccagctgagacag(SEQ ID NO:11)。
采用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增，扩增体系如表5，扩增程序如表6所示：
表5扩增Cas9片段的扩增体系
| 组成成分 | 用量 |
| 2×Phanta Max Buffer | 25μl |
| dNTP(10mMeach) | 1μl |
| Primer F(引物Cas9-5-for2) | 2μl |
| Primer R(引物Cas9-5-rev2) | 2μl |
| DNA template(plasmid，Lenti-sgRNA-CRISPR-v2) | 1ng |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(高保真DNA聚合酶) | 1μl |
| ddH2O | 补足体系至50μl |
表6扩增Cas9片段的扩增程序
用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物，得到大小为4.1kb的Cas9片段。
二、连接Cas9片段和辅助蛋白BRID
辅助蛋白BRID的电泳图如图12，大小为288bp。
以纯化的Cas9片段和辅助蛋白BRID片段为模板，采用高保真PCR试剂盒(诺唯赞，货号P505-d1)扩增BRID-Cas9片段。
引物序列为：
BARD1-Cas9-5-For1：gttctagaatgccaaagaagaagcggaag(SEQ ID NO:12)
BARD1-Cas9-5-rev2：gccgatgctgtacttcttgtccatttctgaagacagcccactgcctata(SEQ ID NO:13)。
扩增体系如表7，扩增反应程序和表6一致。
表7 BRID-Cas9片段的扩增体系
| 组成成分 | 用量 |
| 2×Phanta Max Buffer | 25μl |
| dNTP(10mM each) | 1μl |
| Primer F(引物Cas9-5-for1) | 2μl |
| Primer R(引物Cas9-5-rev1) | 2μl |
| DNA template(plasmid，BRID、Cas9片段) | 1ng |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(高保真DNA聚合酶) | 1μl |
| ddH2O | 补足体系至50μl |
用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)纯化PCR产物，得到大小为4.4kb的BRID-Cas9片段，电泳图如图13所示。
三、构建Lenti-U6-sgRNA-EF1a-BRID-Cas9基因编辑载体
将步骤二扩增纯化的BRID-Cas9片段，与Lenti-sgRNA-CRISPRv2质粒，分别用Xba1+Mlu1内切酶(NEB公司)，在37℃双酶切2小时，用试剂盒(诺唯赞，货号：DC301-01)分别纯化两DNA片段。采用T4连接酶(Invitrogen)，按如下连接体系(表8)连接，在25℃下反应5min以上得到连接产物。
表8 Lenti-U6-sgRNA-EF1a-BRID-Cas9的连接体系
| 组成成分 | 用量 |
| 5×T4 Ligase Buffer | 2μl |
| BRID-Cas9片段 | 90fmol |
| Lenti-sgRNA-CRISPRv2质粒 | 30fmol |
| T4 Ligase | 1μl |
| ddH2O | 补足体系至10μl |
将连接产物转化DH5感受态细菌(擎科，货号：TSC-C14)，在LB平板上挑克隆，测序鉴定得到Lenti-U6-sgRNA-EF1a-BRID-Cas9基因编辑载体***。
在此基因编辑载体***当中，通过U6启动子转录sgRNA，EF1a表达BRID-Cas9蛋白。能够同时在细胞中表达BRID-Cas9蛋白和sgRNA，可以同时实现对目标基因的切割和HDR方式的精准修复。该基因编辑载体***的HDR方式的DNA修复效率为16％左右，相较于传统方法同源重组HDR效率仅3％的情况，本方法可大幅提高用于疾病基因精准治疗的基因编辑效率，为基因与细胞治疗提供新的方法和思路。
按照上述构建方法，还可以得到包括辅助蛋白ARD和辅助蛋白BRID-ARD的基因编辑载体Lenti-U6-sgRNA-EF1a-ARD-Cas9和Lenti-U6-sgRNA-EF1a-BRID-ARD-Cas9。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安可来（重庆）生物医药科技有限公司
<120> 一种提高DNA修复效率的辅助蛋白及其基因编辑载体和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgccggata atcggcagcc gaggaaccgg cagccgagga tccgcaaacc taggaaaagt 60
ttgtttaatg atgcaggaaa caagaagaat tcaattaaaa tgtggtttag ccctcgaagt 120
aagaaagtca gatatgttgt gagtaaagct tcagtgcaaa cccagcctgc aataaaaaaa 180
gatccagaga agaatgaatc atcctcagct agccactgct cagtaatgaa cactgggcag 240
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<210> 2
<211> 534
<212> DNA
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tcggcctgga catcggcacc aactctgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg 1320
tgcccagcaa gaaattcaag gtgctgggca acaccgaccg gcacagcatc aagaagaacc 1380
tgatcggagc cctgctgttc gacagcggcg aaacagccga ggccacccgg ctgaagagaa 1440
ccgccagaag aagatacacc agacggaaga accggatctg ctatctgcaa gagatcttca 1500
gcaacgagat ggccaaggtg gacgacagct tcttccacag actggaagag tccttcctgg 1560
tggaagagga taagaagcac gagcggcacc ccatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg 1620
cctaccacga gaagtacccc accatctacc acctgagaaa gaaactggtg gacagcaccg 1680
acaaggccga cctgcggctg atctatctgg ccctggccca catgatcaag ttccggggcc 1740
acttcctgat cgagggcgac ctgaaccccg acaacagcga cgtggacaag ctgttcatcc 1800
agctggtgca gacctacaac cagctgttcg aggaaaaccc catcaacgcc agcggcgtgg 1860
acgccaaggc catcctgtct gccagactga gcaagagcag acggctggaa aatctgatcg 1920
cccagctgcc cggcgagaag aagaatggcc tgttcggaaa cctgattgcc ctgagcctgg 1980
gcctgacccc caacttcaag agcaacttcg acctggccga ggatgccaaa ctgcagctga 2040
gcaaggacac ctacgacgac gacctggaca acctgctggc ccagatcggc gaccagtacg 2100
ccgacctgtt tctggccgcc aagaacctgt ccgacgccat cctgctgagc gacatcctga 2160
gagtgaacac cgagatcacc aaggcccccc tgagcgcctc tatgatcaag agatacgacg 2220
agcaccacca ggacctgacc ctgctgaaag ctctcgtgcg gcagcagctg cctgagaagt 2280
acaaagagat tttcttcgac cagagcaaga acggctacgc cggctacatt gacggcggag 2340
ccagccagga agagttctac aagttcatca agcccatcct ggaaaagatg gacggcaccg 2400
aggaactgct cgtgaagctg aacagagagg acctgctgcg gaagcagcgg accttcgaca 2460
acggcagcat cccccaccag atccacctgg gagagctgca cgccattctg cggcggcagg 2520
aagattttta cccattcctg aaggacaacc gggaaaagat cgagaagatc ctgaccttcc 2580
gcatccccta ctacgtgggc cctctggcca ggggaaacag cagattcgcc tggatgacca 2640
gaaagagcga ggaaaccatc accccctgga acttcgagga agtggtggac aagggcgctt 2700
ccgcccagag cttcatcgag cggatgacca acttcgataa gaacctgccc aacgagaagg 2760
tgctgcccaa gcacagcctg ctgtacgagt acttcaccgt gtataacgag ctgaccaaag 2820
tgaaatacgt gaccgaggga atgagaaagc ccgccttcct gagcggcgag cagaaaaagg 2880
ccatcgtgga cctgctgttc aagaccaacc ggaaagtgac cgtgaagcag ctgaaagagg 2940
actacttcaa gaaaatcgag tgcttcgact ccgtggaaat ctccggcgtg gaagatcggt 3000
tcaacgcctc cctgggcaca taccacgatc tgctgaaaat tatcaaggac aaggacttcc 3060
tggacaatga ggaaaacgag gacattctgg aagatatcgt gctgaccctg acactgtttg 3120
aggacagaga gatgatcgag gaacggctga aaacctatgc ccacctgttc gacgacaaag 3180
tgatgaagca gctgaagcgg cggagataca ccggctgggg caggctgagc cggaagctga 3240
tcaacggcat ccgggacaag cagtccggca agacaatcct ggatttcctg aagtccgacg 3300
gcttcgccaa cagaaacttc atgcagctga tccacgacga cagcctgacc tttaaagagg 3360
acatccagaa agcccaggtg tccggccagg gcgatagcct gcacgagcac attgccaatc 3420
tggccggcag ccccgccatt aagaagggca tcctgcagac agtgaaggtg gtggacgagc 3480
tcgtgaaagt gatgggccgg cacaagcccg agaacatcgt gatcgaaatg gccagagaga 3540
accagaccac ccagaaggga cagaagaaca gccgcgagag aatgaagcgg atcgaagagg 3600
gcatcaaaga gctgggcagc cagatcctga aagaacaccc cgtggaaaac acccagctgc 3660
agaacgagaa gctgtacctg tactacctgc agaatgggcg ggatatgtac gtggaccagg 3720
aactggacat caaccggctg tccgactacg atgtggacca tatcgtgcct cagagctttc 3780
tgaaggacga ctccatcgac aacaaggtgc tgaccagaag cgacaagaac cggggcaaga 3840
gcgacaacgt gccctccgaa gaggtcgtga agaagatgaa gaactactgg cggcagctgc 3900
tgaacgccaa gctgattacc cagagaaagt tcgacaatct gaccaaggcc gagagaggcg 3960
gcctgagcga actggataag gccggcttca tcaagagaca gctggtggaa acccggcaga 4020
tcacaaagca cgtggcacag atcctggact cccggatgaa cactaagtac gacgagaatg 4080
acaagctgat ccgggaagtg aaagtgatca ccctgaagtc caagctggtg tccgatttcc 4140
ggaaggattt ccagttttac aaagtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg 4200
cctacctgaa cgccgtcgtg ggaaccgccc tgatcaaaaa gtaccctaag ctggaaagcg 4260
agttcgtgta cggcgactac aaggtgtacg acgtgcggaa gatgatcgcc aagagcgagc 4320
aggaaatcgg caaggctacc gccaagtact tcttctacag caacatcatg aactttttca 4380
agaccgagat taccctggcc aacggcgaga tccggaagcg gcctctgatc gagacaaacg 4440
gcgaaaccgg ggagatcgtg tgggataagg gccgggattt tgccaccgtg cggaaagtgc 4500
tgagcatgcc ccaagtgaat atcgtgaaaa agaccgaggt gcagacaggc ggcttcagca 4560
aagagtctat cctgcccaag aggaacagcg ataagctgat cgccagaaag aaggactggg 4620
accctaagaa gtacggcggc ttcgacagcc ccaccgtggc ctattctgtg ctggtggtgg 4680
ccaaagtgga aaagggcaag tccaagaaac tgaagagtgt gaaagagctg ctggggatca 4740
ccatcatgga aagaagcagc ttcgagaaga atcccatcga ctttctggaa gccaagggct 4800
acaaagaagt gaaaaaggac ctgatcatca agctgcctaa gtactccctg ttcgagctgg 4860
aaaacggccg gaagagaatg ctggcctctg ccggcgaact gcagaaggga aacgaactgg 4920
ccctgccctc caaatatgtg aacttcctgt acctggccag ccactatgag aagctgaagg 4980
gctcccccga ggataatgag cagaaacagc tgtttgtgga acagcacaag cactacctgg 5040
acgagatcat cgagcagatc agcgagttct ccaagagagt gatcctggcc gacgctaatc 5100
tggacaaagt gctgtccgcc tacaacaagc accgggataa gcccatcaga gagcaggccg 5160
agaatatcat ccacctgttt accctgacca atctgggagc ccctgccgcc ttcaagtact 5220
ttgacaccac catcgaccgg aagaggtaca ccagcaccaa agaggtgctg gacgccaccc 5280
tgatccacca gagcatcacc ggcctgtacg agacacggat cgacctgtct cagctgggag 5340
gcgacgatta caaggatgac gacgataagt gagaattcgc acatacatga ggatcaccca 5400
tgtctgcagc tcgagtctag aaaacatgag gatcacccat gtctgcagta ttcccgggtt 5460
cattagatcc taaggtacct aattgcctag aaaacatgag gatcacccat gtctgcagct 5520
cgagtctaga aaacatgagg atcacccatg tctgcagtat tcccgggttc attagatcct 5580
aaggtaccta attgcctaga aaacatgagg atcacccatg tctgcagctc gagtctagaa 5640
aacatgagga tcacccatgt gtgcaccttg tcgacctcga gtctagaggg cccgtttaaa 5700
cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 5760
ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 5820
aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 5880
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 5940
tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta 6000
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6060
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6120
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6180
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 6240
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 6300
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 6360
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat 6420
tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 6480
tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 6540
agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 6600
aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 6660
actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa 6720
gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat 6780
atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 6840
tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 6900
acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 6960
ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 7020
gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 7080
tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 7140
tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 7200
gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 7260
tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 7320
cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 7380
cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 7440
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 7500
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 7560
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 7620
agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 7680
ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 7740
ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg 7800
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 7860
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 7920
gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 7980
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 8040
aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 8100
gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 8160
agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 8220
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 8280
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 8340
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 8400
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 8460
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 8520
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 8580
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 8640
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 8700
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 8760
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 8820
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 8880
aaacaaacca ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 8940
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 9000
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 9060
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 9120
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 9180
atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 9240
cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 9300
aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 9360
cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 9420
aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 9480
ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 9540
gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 9600
ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 9660
tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 9720
tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 9780
ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 9840
tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 9900
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 9960
acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 10020
ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 10080
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 10119
Claims (10)
1.一种提高DNA修复效率的辅助蛋白，其特征在于，编码所述辅助蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
2.一种包括权利要求1中编码所述辅助蛋白的核苷酸序列的表达质粒。
3.如权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。
4.一种提高DNA修复效率的基因编辑载体，其特征在于，包括权利要求1所述的编码所述辅助蛋白的核苷酸序列、DNA编辑蛋白和递送载体。
5.如权利要求4所述的基因编辑载体，其特征在于，所述DNA编辑蛋白包括Cas9蛋白、CasX蛋白、CasΦ蛋白、Cas12蛋白和Cas14蛋白中的一种。
6.如权利要求5所述的基因编辑载体，其特征在于，编码所述辅助蛋白的核苷酸序列与DNA编辑蛋白的碳端或氮端融合。
7.如权利要求6所述的基因编辑载体，其特征在于，所述递送载体包括类病毒载体Lentivirus、腺病毒载体AAV、逆转录pMSCV病毒、pCMV克隆载体和整合缺陷型的类病毒载体中的一种。
8.如权利要求7所述的基因编辑载体，其特征在于，所述整合缺陷型的类病毒载体***包括psPAX2-D64V-NC-MS2或pCMV-BRID-Cas9-6XMS2质粒。
9.一种权利要求1所述的辅助蛋白、权利要求2或3所述的表达质粒、权利要求4～8任一项所述的基因编辑载体在制备提高DNA修复效率的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述DNA修复为同源重组方式的DNA修复。
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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Family Applications (1)
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