WO2019059504A1 - 카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법 - Google Patents

카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2019059504A1
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WO
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catechol
anionic polymer
coacervate
hyaluronic acid
mussel adhesive
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PCT/KR2018/007799
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차형준
김효정
최봉혁
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주식회사 포스코
포항공과대학교 산학협력단
(주)네이처글루텍
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    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09J189/00—Adhesives based on proteins; Adhesives based on derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a coacervate formed from a catechol-substituted anionic polymer, an adhesive comprising the same, and a method for producing the same. More particularly, the present invention relates to a cohesivate having excellent adhesion, comprising hyaluronic acid and a mussel adhesive protein into which catechol is introduced.
  • Protein-based naturally derived adhesives have excellent biocompatibility, but their use is very limited due to their very low tissue adhesion.
  • a tissue adhesive composed of a highly biocompatible synthetic polymer such as polyethylene glycol (PEG) has a limitation in that it can not have sufficient adhesive force and mechanical properties in a living tissue.
  • PEG polyethylene glycol
  • these protein adhesives need to be effective enough to have sufficient adhesion and mechanical properties within 5 minutes, so that the non-crosslinked adhesive must be washed down by the body fluids, or can not be immobilized and flow down. Also, if the treated adhesive is very different from the properties or physical properties of the tissue to be applied, there may be a reduction in tissue damage and adhesion effects due to differences in mechanical strength between the adhesive and the tissue.
  • tissue-adhered tissue adhesive capable of having a variety of mechanical properties depending on the application while exhibiting a faster and better adhesive force in the in vivo tissue.
  • Patent Document 1 KR 10-2015-0037580
  • One aspect of the present invention is to provide a coreacebate exhibiting fast and excellent adhesion.
  • Another aspect of the present invention is to provide an adhesive comprising such a coacervate.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for producing such a coacervate.
  • a coacervate formed by mixing a catechol derivative of a mussel adhesive protein and a catechol-substituted anionic polymer.
  • an adhesive comprising the coacervate of the present invention.
  • a method for preparing an anionic polymer comprising: categorizing an anionic polymer into a catechol to obtain a catechol-substituted anionic polymer; And mixing the catechol-substituted anionic polymer and a catechol derivative of the mussel adhesive protein.
  • the present invention also provides a method for producing a coacervate.
  • the content of catechol introduced into hyaluronic acid can be controlled in various ways, and the thus-synthesized catechol-hyaluronic acid can form a complex corewash with mussel adhesive protein.
  • the core sapite containing catechol-hyaluronic acid according to the present invention has excellent adhesion and closure power because it has faster crosslinking speed and better mechanical properties than conventional adhesives made of hyaluronic acid.
  • tissue adhesives having various mechanical and rheological properties can be made. New tissue adhesives with fast crosslinking times, good adhesion, and various properties are expected to be available in many clinical applications where tissue glue is currently difficult to use.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a reaction formula in which dopamine is attached to a carboxyl group through an EDC / NHS reaction in hyaluronic acid and a catechol derivative of catechol-hyaluronic acid and a mussel adhesive protein form a mixed core surfactant.
  • FIG. 2 is a graph showing the substitution rate of catechol-hyaluronic acid according to the reaction concentration, molecular weight, reaction time, and equivalent number of hyaluronic acid.
  • FIG. 3 is a result of ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis spectroscopy) analysis showing that catechol-hyaluronic acid and a catechol derivative of a mussel adhesive protein are most abundant when mixed at a specific molar ratio.
  • UV-Vis spectroscopy ultraviolet-visible spectroscopy
  • FIG. 5 shows the result of observation of coacervate or precipitation when catechol-hyaluronic acid having different substitution ratios with catechol derivatives of mussel adhesive protein were mixed with an optical microscope.
  • FIG. 7 shows the results of the adhesion test and the closing power of the core surveillance containing catechol-hyaluronic acid through the mass adhesion test and the silicon tube closure experiment, in comparison with the conventional core saponification using hyaluronic acid.
  • Figure 8 shows the results of the adhesion experiment showing that as the degree of substitution of catechol-hyaluronic acid is increased, the core seeds containing it exhibit better adhesion in wet pig skin.
  • FIG. 9 shows the results of measurement of mechanical properties and viscosity of a core sapate prepared by mixing hyaluronic acid having various molecular weights using a flow analysis system.
  • FIG. 10 is a photograph showing the difference in physical properties of core saponin according to the difference in molecular weight of hyaluronic acid.
  • a coacervate is provided that can be applied as a new tissue adhesive having a high crosslinking time, excellent adhesive force, and various physical properties.
  • the coacervate of the present invention is formed by mixing a catechol derivative of a mussel adhesive protein and an anionic polymer substituted with a catechol.
  • the mussel adhesive proteins may be those disclosed in KR10-2014-0002244, WO2006 / 107183, WO2005 / 092920 and the like, and a specific preparation process may be carried out as shown in International Patent Publication Nos. WO2006 / 107183 and WO2005 / 092920 .
  • a mussel adhesive protein modified with a catechol derivative in a mussel adhesive protein is referred to as a "modified mussel adhesive protein" or "a catechol derivative of a mussel adhesive protein” Is not particularly limited.
  • the mussel adhesive protein that can be applied at this time is a mussel-derived adhesive protein, preferably Mytilus edulis , Mytilus galloprovincialis or Mytilus coruscus , or mutants thereof.
  • the mussel adhesive protein may be selected from the group consisting of Mytilus edulis foot protein -1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp (Mytilus galloprovincialis foot protein) 2, Mgfp-3, Mgfp-4 and Mgfp-5, Mytilus coruscus foot protein-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4 and Mcfp-5 or their variants
  • a fusion protein in which a protein selected from the group consisting of fp (foot protein) -1, fp-2, fp-3, fp-4, fp-5 and fp- A protein, or a variant of such a protein.
  • the mussel adhesive proteins of the present invention include all the mussel adhesive proteins described in WO2006 / 107183 and WO2005 / 092920.
  • the mussel adhesive protein may include fusion proteins such as fp-151, fp-131, fp-353, fp-153 and fp-351.
  • the mussel adhesive protein of the present invention may include polypeptides in which the decapeptide repeated about 80 times in fp-1 is linked 1 to 12 times or more.
  • the decapeptide of SEQ ID NO: 2 is a fp-1 variant polypeptide linked in a series of twelve consecutive, but not limited thereto.
  • the inventors of the present invention found a new type of mussel adhesion protein fp-151 in which 10 repeated amino acids of fp-1 were repeated 6 times at the gene level at the N-terminal and C-terminal of fp-5 (WO2006 / 107183 and WO2005 / 092920) that the recombinant mussel adhesive protein was successfully expressed in E. coli, mass production was possible, and the possibility of industrial use was very high through a simple separation and purification process.
  • the catechol derivative is a compound containing a dihydroxy group and is capable of coordinating with a metal.
  • the catechol derivative is selected from the group consisting of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), dopa o-quinone, dopamine, norepinephrine, epinephrine, epigallocatechin gallate, and derivatives thereof.
  • the catechol derivative may be at least one selected from the group consisting of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), dopaquinone, 5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), topaquinone, and derivatives thereof.
  • the catechol derivative of the mussel adhesive protein may be 10 to 100% of the tyrosine residue of the mussel adhesive protein converted into a catechol derivative, particularly DOPA.
  • the anionic polymer of the present invention may be selected from the group consisting of hyaluronic acid, ferredoxin, poly styrene sulfonic acid, gum arabic, gelatin, albumin, Carbopol, high or low methoxyl pectin, sodium carboxymethyl guar gum, xanthan gum, whey protein, faba bean carboxymethyl cellulose, alginate, carrageenan, sodium hexametaphosphate, sodium casinate, hemoglobin, heparin, and extracellular matrix.
  • Polysaccharide B40 exopolysaccharide B40
  • hyaluronic acid preferably hyaluronic acid.
  • the molecular weight of the anionic polymer may be 1-5,000 kDa, but it may have a molecular weight selected from the group consisting of, but not limited to, 6 kDa to 2000 kDa, and more preferably 10 kDa to 1500 kD .
  • the molecular weight is more than or less than the above molecular weight, no coacervate is formed, or the viscosity becomes extremely high and it may be difficult to inject through a needle having a small diameter.
  • hyaluronic acid having a molecular weight of 10 kDa or more is used, coacervate formation can be performed more smoothly.
  • the catechol substitution degree of the anionic polymer is preferably from 10 to 52%, more preferably from 30 to 50%, for example, from 35 to 50%.
  • the degree of substitution degree of the anionic polymer when the degree of substitution exceeds 52% in the catechol substitution degree of the anionic polymer, the anionic residue of hyaluronic acid capable of reacting with the mussel adhesive protein is substituted by catechol So that coagulation and subsequent precipitation are produced instead of coagulase.
  • the degree of catechol substitution is less than 30%, there is no problem in the course of forming the core surfite, but it is not preferable in view of the present invention to obtain the maximum adhesive force.
  • the concentration of hyaluronic acid in the aqueous solution of hyaluronic acid used in the production process is preferably 0.5 to 10 g / L, more preferably 5 to 10 g / L.
  • the catechol for example, dopamine hydrochloride is added to the aqueous solution of hyaluronic acid at the concentration as described above in an equivalent water equivalent to 1 to 50 times the amount of hyaluronic acid, preferably 10 to 20 times Equivalent water, and more preferably 10 equivalents or less.
  • the pH preferably 4 to 5.5, more preferably 4.5 to 5.0, and then react at room temperature for 1 to 48 hours, preferably 24 to 48 hours.
  • the coacervate refers to a kind of colloid formed by binding a catechol derivative of the mussel adhesive protein and an anionic polymer substituted with catechol. That is, in the present invention, the coacervate is formed by mixing a catechol derivative of the mussel adhesive protein and an anionic polymer substituted with catechol.
  • the coacervate may be prepared in a water-soluble solvent, more preferably in an aqueous solution of methanol, ethanol, propanol, acetone, acetic acid, more preferably in an aqueous solution of acetic acid, 10% aqueous acetic acid solution, even more preferably 0.5 to 8% aqueous acetic acid solution.
  • the coacervate of the present invention may further comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome and one or more of these components. , A buffer solution, a bacteriostatic agent, and the like may be added.
  • injection formulations pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like by additionally adding diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants, Specific antibody or other ligand can be used in combination with the carrier.
  • an adhesive containing the coacervate according to the present invention wherein the adhesive can be a biomedical adhesive composition.
  • the composition comprising the coacervate may be administered intravenously, intraperitoneally, intramuscular, subcutaneous, intradermal, nasal, mucosal ), Inhalation, and oral route, as described above.
  • the dosage varies depending on the subject's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • the daily dose is about 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.5 to 10 mg / kg, and it is more preferable to administer the drug once or several times a day.
  • the method for producing a coacervate according to the present invention includes the steps of obtaining an anionic polymer having a catechol substituent by covalently substituting an anionic polymer; And mixing the catechol-substituted anionic polymer and the catechol derivative of the mussel adhesive protein.
  • the mixing can be preferably carried out in a water-soluble solvent, more preferably methanol, ethanol, propanol, acetone, acetic acid aqueous solution, more preferably aqueous acetic acid solution, more preferably 0.1% to 10% Of an aqueous acetic acid solution, even more preferably 0.5 to 8% of an aqueous acetic acid solution.
  • a water-soluble solvent more preferably methanol, ethanol, propanol, acetone
  • acetic acid aqueous solution more preferably aqueous acetic acid solution, more preferably 0.1% to 10% Of an aqueous acetic acid solution, even more preferably 0.5 to 8% of an aqueous acetic acid solution.
  • the step of mixing the catechol-substituted anionic polymer and the catechol derivative of the mussel adhesive protein may be performed by mixing them at a weight ratio of 1: 0.1 to 1:10 at pH 2.5 to pH 7.0.
  • the optimum pH may be, but not limited to, pH 2.5 to pH 7.0, more preferably pH 3.0 to pH 6.0, pH 3.5 to pH 5.5. If the pH is more than or less than the above-mentioned pH, coacervate may not be formed or deformation of the polymer may occur.
  • the amount of the catechol derivative of the mussel adhesive protein and the catechol-substituted anionic polymer added to the solvent is not limited thereto, but is preferably 1 to 100% (w / v) relative to the total volume of the solvent, May be 30 to 70% (w / v).
  • the coacervate may be formed by mixing the catechol derivative of the mussel adhesive protein and the catechol-substituted anionic polymer in a molar ratio of 1: 0.1 to 1:10, more preferably 1: : 0.25 to 1: 1.5, and more preferably in a molar ratio of 1: 0.43 to 1: 1.5. If the mixing ratio is more than or less than the mixing ratio, coacervate may not be effectively formed.
  • Fig. 1 schematically shows the production process of hyaluronic acid into which catechol is introduced. More specifically, dissolve hyaluronic acid in water or physiological saline (PBS). It is preferable to use physiological saline solution instead of water.
  • PBS physiological saline
  • the molecular weight of hyaluronic acid is 1-5,000 kDa, which can be used variously depending on the application. In this experiment, 10-1500 kDa was used.
  • the concentration of hyaluronic acid used in the reaction may be 0.5-10 g / L, and in this experiment, 5 g / L was used.
  • EDC 1-ethyl- (3,3-dimethyl aminopropyl) carboimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • FIG. 2 is a graph showing the substitution rate of catechol-hyaluronic acid according to the reaction concentration, molecular weight, reaction time, and equivalent number of hyaluronic acid.
  • the mussel adhesive protein fp-151 was fused with fp-1 (Mytilus mussel foot protein type 1 (SEQ ID NO: 2)) consisting of the decapeptide (AKPSYPPTYK), which was repeated six times in the amino acid sequence of the natural mussel adhesive protein fp-1 (Genbank No. Q27409) ) Mutant was synthesized, and the gene of Mgfp-5 (Genbank No. AAS00463) was inserted between the two fp-1 mutants, and was then prepared from E. coli.
  • the preparation of the mussel adhesive protein fp-151 is the same as that described in International Patent Publication No. WO 2005/092920, which patent application is incorporated herein by reference in its entirety.
  • the tyrosine residue of the mussel adhesive protein fp-151 was then converted to DOPA (dihydroxyphenylalanine) by performing an in vitro enzyme reaction using mushroom tyrosinase (SIGMA) enzyme. Specifically, 1.50 mg / mL fp-151 solution and 100 ⁇ g / mL tyrosinase were reacted in a buffer solution (100 mM sodium phosphate, 20 mM boric acid, 25 mM ascorbic acid, pH 6.8) for 1 hour, dialyzed with 1% acetic acid solution.
  • a buffer solution 100 mM sodium phosphate, 20 mM boric acid, 25 mM ascorbic acid, pH 6.8
  • the cationic mussel adhesive protein and the anionic catechol-hyaluronic acid prepared in 1. above were completely dissolved in an acetate buffer solution of pH 4, respectively, and the two solutions were mixed to form a core sustituate. Since the formation of core survival is strongly influenced by the intermolecular mole fraction, the protein concentration is measured by the bradford method (Bio-Rad) in order to find the optimum conditions in which the core survival is most likely to occur , And catechol-hyaluronic acid were mixed in various ratios. The amount of coacervate formed at this time was proportional to the absorbance, and the highest molar fraction of absorbance was confirmed, and the results are shown in FIG.
  • imWIMBA represents the number of equivalents of dopamine used in the catechol-hyaluronic acid reaction process, that is, the number of equivalents As the number in parentheses increases, imWIMBA has a higher catechol content, and WIMBA indicates core-survival with hyaluronic acid.
  • Coacervate formation is affected by the degree of substitution of catechol-hyaluronic acid.
  • the degree of substitution of catechol-hyaluronic acid was changed and it was confirmed whether or not coacervate was formed. The results are shown in Fig.
  • a cross-linking agent for inducing cross-linking was treated by oxidizing the catechol in an environment having shear stress, The crosslinking time required for crosslinking was measured by measuring the storage modulus (G '), the loss modulus (G "), and the complex viscosity by using a rheometer. A small amount of sodium periodate was used.
  • the core surfite (imWIMBA) according to the present invention had faster crosslinking and excellent physical properties under the same cross-linking conditions than core surfite (WIMBA) using hyaluronic acid.
  • the adhesion of the core-coated (imWIMBA) according to the present invention prepared in the above 2 on the wet aluminum oxide surface was measured and compared with that of the core-surfaced WIMBA using conventional hyaluronic acid.
  • FIG. 8 shows that the higher the catechol content, the higher the adhesion to wet pig skin. As the degree of substitution increases, the total catechol content of imWIMBA increases.
  • crosslinking time was 5 minutes, and crosslinking was carried out at the constant temperature and humidity using the same crosslinking agent as that used in 4.
  • imWIMBA having a higher degree of substitution than imWIMBA having a low degree of substitution showed better adhesion, and all of them showed remarkably higher adhesion than WIMBA.
  • FIG. 9 shows the results of measurement of mechanical properties and viscosity of a core sapate prepared by mixing hyaluronic acid having various molecular weights by using a flow analyzer.
  • core sustit imWIMBA
  • the mechanical properties and viscosity of the high molecular weight hyaluronic acid gradually increased, and the difference was found to be increased from the low molecular weight hyaluronic acid to the higher molecular weight hyaluronic acid. Further, it can be seen that when the core seed is prepared by mixing hyaluronic acid having various molecular weights, the value of the mechanical properties of the core seed having the respective molecular weights is shown. From this, it is expected that an adhesive having various physical properties can be produced in accordance with the application.
  • core saponification of high molecular weight hyaluronic acid can also be injected through a thin syringe.
  • hyaluronic acid having an excessively high molecular weight it is not preferable from the viewpoint of feeling of use because a large amount of force is required to inject the hyaluronic acid as the viscosity of the adhesive increases. Therefore, It is possible to form a core surfat having a desired viscosity and physical properties by using a mixture of lactic acid and lactic acid, thereby making it possible to make a tissue adhesive which can be easily injected and recovered after injection.

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Abstract

본 발명은 카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된, 코아세르베이트(coacervate); 상기 코아세르베이트를 포함하는 접착제; 및 음이온성 고분자를 카테콜 치환하여 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 획득하는 단계, 및 상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법에 관한 것이다.

Description

카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법
카테콜 치환된 음이온성 고분자로부터 형성된 코아세르베이트, 이를 포함하는 접착제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 카테콜이 도입된 히알루론산과 홍합 접착 단백질로 이루어진 우수한 접착력을 가지는 코아서베이트에 관한 것이다.
최근 비침습적(non-invasive or less-invasive) 검사 및 치료에 대한 수요가 점차 증가하면서 효과적인 조직 접착제 개발의 필요성이 지속적으로 제기되어 왔다. 기존에 사용되던 봉합사를 이용한 물리적 봉합 방법은 여러 외과 수술에서 광범위하게 사용되고 있지만, 수축과 팽창을 반복하는 방광, 심장 및 물리적 압력에 의해 쉽게 손상될 수 있는 뇌 혹은 폐와 같은 장기의 봉합에는 사용할 수 없다는 한계가 있다. 따라서 이러한 봉합사의 이용을 대체하거나 보완할 수 있는 접착제에 대한 연구 및 개발이 활발하게 일어나고 있지만, 현재까지 개발된 합성물 접착제(synthetic adhesive)는 높은 조직 독성(histotoxicity)과 가교 후 가지는 물성이 실제 조직과 매우 상이하여 그로 인한 조직 손상을 유발할 수 있다.
그에 비해 단백질 기반의 생물 유래 접착제(naturally derived adhesive)는 우수한 생체적합성(biocompatibility)을 가지지만, 매우 낮은 조직 접착력 때문에 그 사용이 매우 제한적이다. 한편, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)와 같은 생체적합성이 높은 합성 고분자로 이루어진 조직 접착제의 경우에도 생체 내 조직에서 충분한 접착력 및 기계적 물성을 가지지 못한다는 한계가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 해양 환경에서도 우수한 접착력을 가지는 홍합에 착안하여, 홍합이 분비하는 접착 단백질을 유전자 재조합 과정을 통해 대량생산 하였으며 복합 코아서베이션이라는 제형화를 통해 물속에서도 와해되지 않는 접착물질을 개발하고자 하는 시도가 있었다. 이러한 수중접착제는 우수한 내수성 및 실험실 수준의 실험에서 매우 우수한 접착력을 보였으나, 실제 동물 실험 혹은 임상에서 요구되는 접착력 혹은 기계적 물성에 도달하기까지 매우 오랜 시간이 필요하다는 단점이 있다.
실제 임상에서 이러한 단백질 접착제가 효과적으로 이용되기 위해서는 5분 이내에 충분한 접착력 및 기계적 물성을 가짐으로써, 가교되지 못한 접착제가 체액에 의해 씻겨 내려가거나 고정되지 못하고 흘러내리는 일을 최소로 해야 한다. 또한 처리해 준 접착제가 적용하고자 하는 조직의 특성 혹은 물성과 매우 상이한 경우, 접착제와 조직 사이의 기계적 강도 차이로 인한 조직의 손상 및 접착 효과의 감소가 유발될 수 있다.
따라서 생체 내 조직에서 좀 더 빠르고 우수한 접착력을 보이면서 용도에 따라 다양한 기계적 물성을 가질 수 있는 조직 맞춤형 조직 접착제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
(특허문헌 1) KR 10-2015-0037580
본 발명의 일 측면은 빠르고 우수한 접착력을 보이는 코아세르베이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 이와 같은 코아세르베이트를 포함하는 접착제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이와 같은 코아세르베이트의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된, 코아세르베이트(coacervate)가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 코아세르베이트를 포함하는 접착제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 음이온성 고분자를 카테콜 치환하여 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 획득하는 단계; 및 상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 반응 조건을 달리함으로써 히알루론산에 도입되는 카테콜의 함량을 다양하게 조절할 수 있으며, 이렇게 합성된 카테콜-히알루론산은 홍합 접착단백질과 복합 코아서베이트를 형성할 수 있다. 이와 같이 발명에 의한 카테콜-히알루론산을 포함하는 코아서베이트는 기존의 히알루론산으로 이루어진 접착제에 비해 빠른 가교 속도 및 더 우수한 기계적 물성을 가지기 때문에, 우수한 접착력과 폐쇄력을 가진다. 또한 다양한 분자량의 히알루론산을 이용해 홍합 접착 단백질과 혼합 코아서베이트를 만들 수 있으므로, 최종적으로 다양한 기계적, 유동학적 물성을 지니는 조직 접착제를 만들 수 있다. 빠른 가교 시간, 우수한 접착력, 다양한 물성을 가지는 새로운 조직 접착제는, 현재 조직 접착제의 사용이 어려운 여러 임상 분야에서 사용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 히알루론산에 EDC/NHS 반응을 통해 도파민을 카르복실기에 붙이는 반응식 및 카테콜-히알루론산과 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체가 혼합 코아서베이트를 형성하는 것에 대한 모식도이다.
도 2는 히알루론산의 반응 농도, 분자량, 반응 시간, 당량수에 따른 카테콜-히알루론산의 치환율에 대한 그래프이다.
도 3은 카테콜-히알루론산과 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체가 특정 몰분율로 혼합했을 때 가장 많은 코아서베이트가 형성됨을 자외선-가시광선 흡수분광 (UV-Vis spectroscopy) 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 EDC/NHS 반응에 넣어주는 도파민의 당량수가 달라지면서 카테콜-히알루론산의 치환도가 달라지는데, 치환도가 50% 이하인 경우에는 복합 코아서베이트가 생기고 50% 이상인 경우에는 침전이 생기는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체와 서로 다른 치환율을 가지는 카테콜-히알루론산을 혼합하였을 때 코아서베이트 혹은 침전이 생기는 것을 광학 현미경으로 확인한 결과이다.
도 6은 가교제를 섞어준 다음 카테콜-히알루론산/홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체로 이루어진 액상형태의 코아서베이트 점차 젤로 변하는 것을 유동분석계 (Rheometer)를 통해 확인하였으며, 액상의 접착제가 젤로 가교되었다고 판단할 수 있는 부분인 G'=G'' 지점이 히알루론산을 이용한 코아서베이트에 비해 카테콜-히알루론산을 이용한 코아서베이트가 빠름을 확인하였다. 그리고 같은 시간 동안 카테콜-히알루론산을 이용한 코아서베이트가 더 높은 물성치에 도달함을 확인하였다.
도 7는 대량 접착 시험 및 실리콘 튜브 폐쇄 실험을 통해 카테콜-히알루론산을 포함하는 코아서베이트의 접착력 및 폐쇄력을 히알루론산을 이용한 종래 코아서베이트와 비교한 결과이다.
도 8은 카테콜-히알루론산의 치환도가 증가함에 따라, 이를 포함하는 코아서베이트가 젖은 돼지 피부에서 더 우수한 접착력을 보이는 것을 접착 실험을 통해 보여준 결과이다.
도 9는 다양한 분자량을 가지는 히알루론산을 섞어 만든 코아서베이트의 기계적 물성과 점도를 유동분석계를 이용해 측정한 결과이다.
도 10은 히알루론산의 분자량 차이에 따른 코아서베이트의 물성 차이를 나타낸 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 빠른 가교시간, 우수한 접착력, 다양한 물성을 가지는 새로운 조직 접착제로 적용될 수 있는 코아세르베이트(coacervate)가 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 코아세르베이트(coacervate)는 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 것이다.
본 발명에 있어서, 홍합 접착 단백질은 KR10-2014-0002244, A WO2006/107183, WO2005/092920등에 개시된 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 제조 과정은 국제특허공개 WO2006/107183 및 WO2005/092920에 나타낸 바와 같이 수행될 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 홍합 접착 단백질 내 타이로신 잔기가 카테콜 유도체로 수정된(modified) 홍합 접착 단백질을 "수정 홍합 접착 단백질" 또는 " 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체"라 지칭하며, 그 수정 방법은 특히 제한되지 않는다.
이때 적용될 수 있는 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mgfp-2, Mgfp-3, Mgfp-4 및 Mgfp-5, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4, 및Mcfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1, fp-2, fp-3, fp-4, fp-5 및 fp-6으로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 WO2006/107183 및 WO2005/092920에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합접착단백질은 fp-151, fp-131, fp-353, fp-153, fp-351 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 홍합접착 단백질은 fp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 변이(variant) 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 이전의 연구에서 fp-1의 10개 반복 아미노산이 6번 반복된 구조를, fp-5의 N-말단과 C-말단에 유전자 수준에서 연결시킨 새로운 형태의 홍합접착단백질 fp-151을 개발하였으며, 상기 재조합 홍합접착단백질을 대장균에서 성공적으로 발현하여, 대량생산이 가능하고 단순한 분리정제 과정을 통해 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다(WO2006/107183 및 WO2005/092920).
상기 카테콜 유도체는 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 금속과 배위결합이 가능하다. 구체적으로 상기 카테콜 유도체는 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 도파민(dopamine), 노레피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrin), 에피갈로카테킨(epigallocatechin gallate) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것으로, 예를 들어 상기 카테콜 유도체는 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
예를 들어 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기의 10 내지 100%가 카테콜 유도체, 특히 DOPA로 변환된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 음이온성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid)인 것이다.
상기 음이온성 고분자의 분자량은 1-5000 kDa인 것일 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 6kDa 내지 2000kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 10kDa 내지 1500kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나, 점도가 매우 높아져 직경이 작은 니들을 통해 주사하기에 어려울 수 있기 때문이다. 특히 분자량 10kDa 이상의 히알루론산을 사용할 경우 코아세르베이트 형성이 보다 원활하게 이루어질 수 있으며, 분자량이 1500kDa을 초과하는 히알루론산을 사용할 경우 코아세르베이트는 형성되지만 형성된 코아세르베이트의 점도가 너무 높기 때문에 직경이 작은 니들을 통해 주사하기 어렵다. 조직 접착제의 경우, 가교 이전 액상 형태의 접착제가 체내로 주사될 수 있어야 하기 때문에 점도의 조절이 요구된다.
본 발명에 있어서 상기 음이온성 고분자의 카테콜 치환도는 10 이상 52% 이하인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 30 이상 50% 이하, 예를 들어 35 이상 50% 이하인 것이다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음이온성 고분자의 카테콜 치환도에 있어서, 치환도가 52%를 초과하는 경우에는 홍합 접착 단백질과 반응할 수 있는 히알루론산의 음이온성 잔기가 카테콜에 의해 치환되기 때문에 코아서베이트 대신 응집 및 이에 따른 침전이 생기게 된다. 또한, 카테콜 치환도가 30% 미만인 경우에는 코아서베이트 형성 과정에서의 문제는 없으나, 최대 접착력을 얻고자 하는 본 발명의 취지 상 바람직하지 않다.
이러한 치환도의 획득을 위해, 제조 공정에 사용되는 히알루론산 수용액 내 히알루론산의 농도는 0.5 내지 10 g/L인 것이 바람직하고, 5 내지 10 g/L인 것이 보다 바람직하다.
상기와 같은 농도의 히알루론산 수용액에 후속적으로 카테콜, 예를 들어 도파민(dopamine hydrochloride)을 히알루론산 대비 1 내지 50배에 해당하는 당량수로 넣어주며, 바람직하게는 10 내지 20배에 해당하는 당량수로 넣어주며, 보다 바람직하게는 10 당량수 이하로 혼합하는 것이다.
이때, pH를 바람직하게는 4 내지 5.5, 더 바람직하게는 4.5 내지 5.0으로 맞춰준 다음, 1 내지 48 시간, 바람직하게는 24 내지 48 시간 동안 상온에서 반응시킬 수 있다.
본 발명에서 코아세르베이트는 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 결합하여 형성된 콜로이드의 일종을 말한다. 즉 본 발명에서 코아세르베이트는 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 혼합되어 형성되는 것이다.
본 발명에서 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 형성될 수 있다.
상기 본 발명의 코아세르베이트는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
한편, 본 발명에 의하면, 상술한 본 발명의 코아세르베이트를 포함하는 접착제가 제공될 수 있으며, 상기 접착제는 생체용 접착제 조성물일 수 있다.
예를 들어, 상기 코아세르베이트를 포함하는 상기 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
나아가, 본 발명에 의하면, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법은 음이온성 고분자를 카테콜 치환하여 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 획득하는 단계; 및 상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는 것이다.
상기 혼합은 상술한 바와 같이 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 형성될 수 있다.
상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계는 pH 2.5 내지 pH 7.0에서 1:0.1 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 수행될 수 있다.
보다 상세하게, 상기 용매에서 상기 코아세르베이트를 제조하는 경우 적정 pH는 이에 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 7.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 3.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다.
용매에 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 각각 용매 전체 부피 대비 1 내지 100%(w/v)일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 30 내지 70 %(w/v)일 수 있다.
본 발명에서 코아세르베이트는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 1:0.1 내지 1:10의 몰비로 혼합하여 형성될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:1.5의 몰비로, 더 바람직하게는 1:0.43 내지 1:1.5의 몰비로 혼합하여 형성될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
상기와 같이 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 혼합하여 형성된 본 발명의 빠른 가교시간, 우수한 접착력, 다양한 물성을 가지는 새로운 조직 접착제를 제공할 수 있어서, 현재 조직 접착제의 사용이 어려운 여러 임상 분야에서 사용 가능할 것으로 기대된다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 카테콜이 도입된 히알루론산 제조
도 1에 카테콜이 도입된 히알루론산 제조 공정을 도식적으로 나타내었다. 보다 상세하게, 물 혹은 생리식염수(PBS)에 히알루론산을 녹인다. 물보다는 생리식염수를 사용하는 것이 좋으며, 히알루론산의 분자량은 1-5000 kDa으로 용도에 따라 다양하게 사용될 수 있으며, 본 실험에서는 10-1500 kDa인 것을 사용하였다.
반응에 쓰이는 히알루론산의 농도는 0.5-10 g/L가 사용될 수 있으며, 본 실험에서는 5 g/L인 것을 사용하였다. 히알루산이 녹아 있는 용액에 차례로 EDC(1-ethyl-(3,3-dimethyl aminopropyl) carboimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 각각 히알루론산과 같은 당량수로 넣고 계속해서 섞어준다. 후속적으로 도파민(dopamine hydrochloride)을 히알루론산 대비 1-50배에 해당하는 당량수로 넣어주며, 본 실험에서는 10 배 넣어주었다. 이렇게 섞은 용액의 pH를 4.5-5.0 로 맞춰준 다음, 24 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이 경우, 카테콜-히알루론산의 치환율은 대략 48-52 %이다. 도 2는 히알루론산의 반응 농도, 분자량, 반응 시간, 당량수에 따른 카테콜-히알루론산의 치환율에 대한 그래프이다.
2. 코아서베이트 제조
먼저, 홍합 접착 단백질 fp-151을 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 (Genbank No. Q27409)의 아미노산 서열에서 6회 반복 연결된 데카펩타이드(AKPSYPPTYK)로 이루어진 fp-1(Mytilus mussel foot protein type 1) 변이체를 합성하고, 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463)를 삽입한 후, 대장균으로부터 제조하였다. 상기 홍합 접착 단백질 fp-151의 제조는 국제특허공개 WO2005/092920에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허문헌은 전체 참조로 본원에 포함된다.
그 후, 티로시나제((mushroom tyrosinase, SIGMA) 효소를 이용한 시험관내(in vitro) 효소 반응을 수행하여, 상기 홍합 접착 단백질 fp-151의 티로신 잔기를 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환하였다. 구체적으로는, 1.50mg/mL의 fp-151 용액 및 100 μg/mL의 티로시나제를 버퍼 용액(100 mM 인산나트륨, 20mM 붕산, 25mM 아스코르브산, pH 6.8)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석하였다. 이러한 과정을 통해 양이온성 재조합 홍합접착 단백질인 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 제조하였다.
상기 양이온성 홍합접착단백질과 상기 1.에서 제조된 음이온성 카테콜-히알루론산을 각기 pH 4의 아세테이트 완충용액에 완전히 용해하고, 상기 두 용액을 혼합하여 코아서베이트를 형성하였다. 코아서베이트의 형성은 물질 간 몰분율에 큰 영향을 받으므로, 코아서베이트가 가장 많이 형성될 수 있는 최적 조건을 찾기 위해 브라드포드(bradford) 분석법(Bio-Rad)를 통해 단백질 농도를 측정한 후, 카테콜-히알루론산을 다양한 비율로 혼합하였다. 이때 형성되는 코아세르베이트의 양이 흡광도와 비례함을 이용해 흡광도가 가장 높은 몰분율을 확인하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 imWIMBA는 음이온성 카테콜-히알루론산을 이용한 코아서베이트를 나타내는 것으로 괄호 안의 숫자는 카테콜-히알루론산 반응과정에서 사용된 도파민의 당량수를 의미하는 것으로, 즉 도 2에 의하면 당량수가 증가함에 따라 치환율 역시 증가함 이는 괄호 안의 숫자가 커질수록 imWIMBA가 높은 카테콜 함량을 가진다는 것을 의미하는 것이며, WIMBA는 히알루론산을 이용한 코아서베이트를 나타내는 것이다.
그 후, 현탁액 상태의 코아서베이트를 4℃에서 9000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전시킴으로써 고농도의 코아서베이트상(coacervate phase)을 얻을 수 있었다.
3. 카테콜-히알루론산의 치환도의 코아서베이트에 대한 영향
코아서베이트 형성은 카테콜-히알루론산의 치환도에 영향을 받는다. 카테콜-히알루론산의 치환도를 변화시키며 코아서베이트 형성 여부를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4 및 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 카테콜-히알루론산의 치환을 위한 EDC/NHS 반응에 넣어주는 도파민의 당량수가 10으로 카테콜 치환도가 50% 이하인 경우(도 5 좌측 사진)에는 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체와 혼합 시 코아서베이트가 형성되나, 이때 도파민의 당량수가 20으로 카테콜 치환도가 약 75%이 이르는 경우(도 5 우측 사진)는 양이온성 홍합접착단백질과 반응할 수 있는 히알루론산의 음이온성 잔기가 도파민에 의해 치환되기 때문에 코아서베이트 대신 응집 및 이에 따른 침전이 생기는 것을 확인할 수 있었다. 이는 도 5의 광학 현미경으로 확인한 결과에서 명확하게 확인할 수 있다.
4. 코아서베이트의 기계적 ( 유동학적 ) 성질 분석
상기 2.에서 제조된 본 발명의 코아서베이트(imWIMBA)의 기계적 특성을 분석하기 위하여, 전단응력(shear stress)이 있는 환경에서 카테콜을 산화시켜 가교를 유도하는 가교제를 처리한 다음, 저장 탄성률(storage modulus, G'), 손실 탄성률(loss modulus, G"), 복소 점도(complex viscosity) 등을 유동계(rheometer)를 이용해 측정함으로써 가교에 필요한 가교 시간을 측정하였다. 가교제로는 세포 독성이 적은 과요오드산나트륨 (sodium periodate)을 사용하였다.
그 결과, 도 6에서 도시된 바와 같이, 가교제를 처리하기 전에는 G"이 G' 보다 높은 값을 가지는 액상 형태로 관찰되었으나, 가교제를 처리하자 G'이 점차 증가하면서 G"을 역전하여 점차 젤의 성질을 보임을 확인하였다. 이렇게 G'과 G"이 교차하는 시점을 가교 시간으로 보고 두 코아서베이트의 가교 시간을 비교하였을 때 카테콜-히알루론산을 이용한 본 발명의 코아서베이트의 가교 시간이 더 빠른 것으로 관찰되었다.
또한, 가교 후 물성도 종래 히알루론산을 이용한 코아서베이트(WIMBA)에 비해 본 발명의 코아서베이트(imWIMBA)가 높았으며 같은 시간 동안 더 높은 물성치에 도달함을 알 수 있었다.
이러한 성질에 기인하여, 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)의 경우 종래 히알루론산을 이용한 코아서베이트(WIMBA) 보다 같은 가교 조건에서 더 빠른 가교 및 우수한 물성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
5. 코아서베이트의 접착력 및 폐쇄력 측정
상기 2.에서 제조한 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)의 젖은 산화 알루미늄 표면에서의 접착력을 측정하여 그 값을 종래 히알루론산을 이용한 코아서베이트(WIMBA)와 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 2.에서 제조한 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)를 젖은 알루미늄 시편에 올리고 항온, 항습기 에서 각각 5분, 30분 가교시킨 샘플의 접착력을 측정한 결과, 가교 시간 상관없이 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)로 접착한 샘플 모두에서 종래 히알루론산을 이용한 코아서베이트(WIMBA)보다 높은 접착력을 나타내었고, 그 값의 차이는 통계학적 의미를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 7 (a)).
한편, 접착력뿐만 아니라, 폐쇄력에서 역시 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)를 3, 또는 5 mm의 직경을 가지는 실리콘 튜브에 처리한 다음, 약 5분간 항온, 항습기에서 가교시킨 다음, 일정한 유속을 가해 접착제가 견딜 수 있는 압력을 측정한 결과 종래 히알루론산을 이용한 코아서베이트(WIMBA)보다 우수한 폐쇄력을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 7(b)).
6. 히알루론산의 치환도에 따른 접착력 분석
도8은 카테콜 함량이 증가할수록 젖은 돼지피부에서 높은 접착력을 가지는 것을 보여주는 결과로, 치환도가 증가함에 따라 imWIMBA가 가지는 전체 카테콜 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이때 가교 시간은 5분으로, 4.에서 사용한 것과 동일한 가교제를 사용하여 항온, 항습기에서 가교하였다.
그 결과, 낮은 치환도를 가지는 imWIMBA에 비해서도 높은 치환도를 가지는 imWIMBA가 보다 우수한 접착력을 보였고, 이들은 모두 WIMBA 보다는 현저하게 높은 접착력을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 카테콜을 히알루론산에 추가적으로 도입한 방식이 현저한 접착력 증대 효과를 도출할 수 있음을 확인할 수 있다.
7. 히알루론산의 분자량에 따른 코아서베이트의 기계적 ( 유동학적 ) 성질 분석
홍합접착단백질과 혼합 코아서베이트를 이루는 히알루론산의 분자량을 다양하게 변화시킴으로써 결과적으로 만들어진 코아서베이트들의 기계적 성질을 변화시킬 수 있는지 여부를 확인하였다.
도 9는 다양한 분자량을 가지는 히알루론산을 섞어 만든 코아서베이트의 기계적 물성과 점도를 유동분석계를 이용해 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 코아서베이트(imWIMBA)에 있어서, 다양한 분자량의 히알루론산으로 만들어진 혼합 코아서베이트는 분자량에 따라 서로 다른 기계적 물성 및 점도를 나타내는 것을 알 수 있었다.
높은 분자량의 히알루론산으로 이루어질 경우 그 기계적 물성 및 점도가 점차 증가하였으며, 그 차이는 낮은 분자량의 히알루론산에서 보다 높은 분자량의 히알루론산으로 갈수록 커짐을 알 수 있었다. 또한, 다양한 분자량의 히알루론산을 혼합하여 코아서베이트를 만들게 되면 각각의 분자량으로 이루어진 코아서베이트가 가지는 기계적 물성의 사이 값을 나타내는 것을 알 수 있다. 이로부터, 다양한 물성을 가지는 접착제를 용도에 맞게 제작할 수 있을 것으로 기대된다.
나아가, 본 발명의 코아서베이트가 가지는 특이적인 전단 유동화 특성(shear thinning property) 덕분에 높은 분자량을 가지는 히알루론산으로 이루어진 코아서베이트 역시 가는 실린지(syringe)를 통한 주입이 가능하다.
한편, 코아서베이트가 접착제로 적용된 후 완전히 가교되어 조직에 단단히 부착되기 까지는 다소간의 시간이 소요되며, 그동안 코아서베이트 자체의 물성이 낮아 조직에 머무르지 못하고 흘러내리게 되면 접착제의 효과가 현저히 감소하게 되므로, 이 경우 가교 시간을 단축하거나 혹은 코아서베이트 자체의 물성(혹은 점성)이 어느 정도 보장이 되면 이러한 문제점을 줄일 수 있다. 따라서, 예를 들어 높은 분자량의 히알루론산으로 이루어진 코아서베이트를 사용할 경우, 적용 후 접착제가 조직에서 흘러내리는 현상을 방지할 수 있다는 것을 도 10을 통해 확인할 수 있다. 도 10에 있어서 낮은 분자량은 분자량 13-75 kDa 중 39 kDa인 것을 사용한 것이고, 높은 분자량은 분자량 111-1010 kDa 중 500 kDa인 것을 사용한 것이다.
다만, 과도하게 높은 분자량의 히알루론산을 쓰게 되면 접착제의 점도가 높아짐에 따를 이를 주입(injection)하기 위해 많은 힘을 요구하기 때문에 사용감 측면에서 바람직하지 않으므로, 도 9에 나타난 바와 같이 다양한 분자량을 지니는 히알루론산을 혼합하여 사용함으로써 원하는 점도와 물성을 가지는 코아서베이트를 형성할 수 있으며, 이를 통해 손쉬운 주입 및 주입 후 빠른 물성 회복이 가능한 조직 접착제를 만들 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체 및 카테콜 치환된 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된, 코아세르베이트(coacervate).
  2. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기의 10 내지 100%가 카테콜 유도체로 변환된, 코아세르베이트(coacervate).
  3. 제1항에 있어서, 상기 카테콜 유도체는 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 코아세르베이트(coacervate).
  4. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 코아세르베이트(coacervate).
  5. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자의 카테콜 치환도는 10 이상 52% 이하인, 코아세르베이트(coacervate).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 포함하는 접착제.
  7. 음이온성 고분자를 카테콜 치환하여 카테콜 치환된 음이온성 고분자를 획득하는 단계; 및
    상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계
    를 포함하는, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 카테콜 치환된 음이온성 고분자는 카테콜 치환도가 30 이상 52% 이하인, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 카테콜 치환된 음이온성 고분자 및 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체를 혼합하는 단계는 pH 2.5 내지 pH 7.0에서 1:0.1 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 수행되는, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 카테콜 유도체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기의 10 내지 100%가 카테콜 유도체로 변환된, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 카테콜 유도체는 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 코아세르베이트(coacervate)의 제조방법.
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