WO2012008722A2 - 조직 증강용 충전 조성물 - Google Patents

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WO2012008722A2
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황의진
서무석
박영수
김병수
한세광
박정규
염준석
오은주
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신풍제약 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to biocompatible filling compositions useful for tissue augmentation.
  • Tissue enhancers such as soft tissue enhancers
  • soft tissue enhancers have been used for medical and cosmetic purposes. Such augmentation may be done surgically through plastic surgery, or in a non-surgical way to increase the volume of soft tissue by administering a biocompatible material.
  • it can be used medically for facial atrophy in HIV-positive patients. Facial atrophy is very thin, referring to the loss of subcutaneous fat in the temples and cheeks.
  • it has been used to cosmetically enlarge the volume of cheeks, lips, chest and hips, and reduce fine lines and deep wrinkles on the skin.
  • Hyaluronic acid is a biopolymer material in which repeating units composed of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are linearly connected. Since it has an ophthalmic surgical aids, joint function improvers, drug delivery materials, eye drops, anti-wrinkle agents and the like are widely used in medical and medical applications or cosmetics. However, hyaluronic acid itself has a short half-life of only a few hours in the body, so the application is limited, and studies have been conducted to increase the half-life (persistence in the body) through crosslinking.
  • 5,827,937 discloses a method for preparing a hyaluronic derivative crosslinked product using a multifunctional epoxy compound as a crosslinking agent, and 1,4-butanediol diglycidyl ether as a multifunctional epoxy compound.
  • BDDE the hyaluronic acid cross-linked water a hydrogel form of Restylane ® produced by using as crosslinking agents are commercially available throughout the world as a filler for tissue enhancement, with the approval of the United States FDA.
  • the recognition site of hyaluronic acid degrading enzyme is a carboxyl group of hyaluronic acid, and thus adipic dihydrazide (ADH) which binds to the carboxyl group of hyaluronic acid is used.
  • ADH adipic dihydrazide
  • hyaluronic acid-ADH crosslinked hydrogels showed significantly higher biopersistance compared to commercially available hyaluronic crosslinked hydrogels, but due to their low viscoelasticity, they are not brittle, do not swell well, and are not evenly distributed in tissues. A problem was found.
  • the hyaluronic acid crosslinked product is manufactured using a chemical that can be recognized as a foreign substance in the body as a crosslinking agent, when it is subsequently administered to a living body and decomposed, there may be a problem such as an immune reaction due to the remaining crosslinking agent.
  • the amount of crosslinking agents or additives that can act as foreign substances during the manufacturing process should be minimized.
  • physicochemical properties such as viscoelasticity required for tissue correction should be maintained even after sterilization.
  • the present invention is intended to solve the problems of the prior art as described above, so that it can be used as an excellent tissue correction filler, excellent in vivo sustainability and biocompatibility, good physical properties such as viscoelasticity required for tissue correction even after sterilization It is an object of the present invention to provide a composition comprising a crosslinked hyaluronic acid hydrogel, which can be easily filled with an injection, and injected into biological tissues, and a method of preparing the same.
  • the present invention provides a filling composition for tissue enhancement comprising a hydrogel of the hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked formula of the following formula 1;
  • HA represents hyaluronic acid or a salt thereof except one carboxyl group
  • R 1 is a C 3 -C 10 alkylene group unsubstituted or substituted with hydroxy, C 1 -C 6 alkyl, or C 1 -C 6 alkoxy
  • m and n are integers of 10,000 to 4,000,000, preferably 20,000 to 3,000,000).
  • the hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel is included in 1 to 3 (w / w)% based on the total weight of the composition.
  • the composition further comprises unmodified (ie, uncrosslinked) hyaluronic acid, thereby reducing the extrusion force of the composition, so that it can be easily injected into tissue by filling into a syringe.
  • unmodified (ie, uncrosslinked) hyaluronic acid thereby reducing the extrusion force of the composition, so that it can be easily injected into tissue by filling into a syringe.
  • the unmodified hyaluronic acid is included at 0.05 to 1 (w / w)% based on the total weight of the composition.
  • the composition further comprises lidocaine in the hydrogel and unmodified hyaluronic acid of the hyaluronic acid and the alkylenediamine crosslinked product, thereby preventing the elasticity decrease after sterilization of the composition and exhibiting local anesthetic effects.
  • the lidocaine is included in 0.1 to 0.4 (w / w)% based on the total weight of the composition.
  • composition consists of pharmaceutically suitable carriers such as water, saline, and the like.
  • the molecular weight of hyaluronic acid is preferably 20,000 Daltons to 4,000,000 Daltons.
  • the alkylenediamine is preferably hexamethylenediamine.
  • the hyaluronic acid and the alkylenediamine crosslinked hydrogel are preferably selected from the group consisting of hydroxy, C 1 -C 6 alkyl, hyaluronic acid at pH 5.5 to 6.5 in the presence of a carboxyl activator and a peptide binding promoter. Or reacted with a C 3 -C 10 alkylene diamine compound substituted or unsubstituted with C 1 -C 6 alkoxy.
  • the crosslinking rate of the hyaluronic acid and the alkylenediamine crosslinked hydrogel is preferably 5 to 35% (TNBS assay).
  • tissue enhancing filler means an increase in tissue volume (eg tissue enlargement) and / or an improvement in tissue function.
  • tissue enhancing filler of the present invention may be used to indicate the increase in tissue volume or improvement of tissue function of soft tissues medically or cosmetically, in particular to remove or improve wrinkles of the skin; It can be used to enlarge the volume of body parts such as cheeks, lips, chest and hips.
  • hyaluronic acid is used herein to mean both hyaluronic acid itself as well as salts and derivatives thereof.
  • aqueous solution of hyaluronic acid as used below is a concept including all of aqueous solutions of hyaluronic acid, aqueous solutions of hyaluronic acid salts, and mixtures thereof.
  • the present invention also provides a method for preparing the composition of the present invention, which
  • the method of the present invention preferably dissolves the carboxyl group activator and the peptide bond promoter in water and adds the hyaluronic acid and the alkylene diamine compound mixture to the mixture of hyaluronic acid and the alkylene diamine compound within 30 minutes.
  • Water hydrogels can be prepared.
  • the hyaluronic acid and the alkylenediamine are sufficiently and completely crosslinked by allowing the reaction system to stand at 30 ° C. to 50 ° C. for at least 9 hours without agitation. Rendiamine crosslinked hydrogels can be prepared.
  • the method of the present invention is preferably sterilized by using a small amount of crosslinker (alkylenediamine) and auxiliaries (carboxyl group activator and peptide bond promoter) by preparing a hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel at pH 5.5 to 6.5. Subsequently, hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel having excellent physical properties such as elastic modulus and high biocompatibility can be prepared.
  • crosslinker alkylenediamine
  • auxiliaries carboxyl group activator and peptide bond promoter
  • the method of the present invention by homogenizing the prepared hydrogel sieve, to obtain a homogenized hydrogel of uniform size and narrow particle distribution, showing a relatively low protrusion pressure even after sterilization easily filled into the syringe tissue Injectable compositions can be prepared.
  • the method of the present invention is readily precipitated with an aqueous solution of C 1 -C 6 alcohol and washed with phosphate buffered saline (PBS) or sodium chloride buffer to facilitate alkylenediamine, carboxyl group activator and peptide in a short time. Unreacted materials such as binding promoters can be removed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • sodium chloride buffer to facilitate alkylenediamine, carboxyl group activator and peptide in a short time. Unreacted materials such as binding promoters can be removed.
  • hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel according to the present invention, a composition comprising the same and a preparation method thereof will be described in detail below.
  • Hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogels are prepared by reacting hyaluronic acid with an alkylene diamine compound in the presence of a carboxyl group activator and a peptide bond promoter.
  • the hyaluronic acid (HA) used has a molecular weight of 10,000 Daltons to 4,000,000 Daltons, more preferably 20,000 Daltons to 3,000,000.
  • In vivo degradation rate of the crosslinked hydrogel prepared by adjusting the molecular weight or concentration of HA can be controlled.
  • the higher the initial concentration of HA the higher the crosslinking rate of the crosslinked hydrogel to be produced, and thus lower degradation rate in vivo.
  • HA is used at a concentration of 1 to 3.5 (w / w)%, preferably 3 (w / w)%. If it is less than 1 (w / w)%, it is difficult to obtain a desired degree of biodegradation, and if it exceeds 3.5 (w / w)%, the prepared hydrogel is easily dried and broken.
  • the alkylene diamine compound is a C 3 -C 10 alkylene diamine compound unsubstituted or substituted with hydroxy, C 1 -C 6 alkyl, or C 1 -C 6 alkoxy, preferably C 3 -C 7 alkylenediamine More preferably C 4 -C 6 alkylene diamine, most preferably C 6 alkylenediamine (hexamethylenediamine), 3.5 to 80 mole%, preferably 10 to 30 mole of the hyaluronic acid repeat unit %, Most preferably from 10 to 25 mole%.
  • 1-alkyl-3- (3-dimethylaminopropyl) such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) ) Carbodiimides; 1-alkyl-3- (3- (such as 1-ethyl-3- (3- (trimethylammonio) propyl) carbodiimide (ETC, 1-ethyl-3- (3- (trimethylammonio) propyl) carbodiimide) Trimethylammonio) propyl) carbodiimides; 1-cycloalkyl-3- (2-morpholinoethyl) such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide (CMC, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide) Carbodiimide of water-soluble car
  • Examples of the peptide bond promoters include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) and 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HOOBt). , 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), sulfo-N -Hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O- (1H-benzotriazole-1-y) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoro Borate (TBTU, O- (1H-benzotriazole-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoro Borate (TBTU
  • FIG. 1 shows a hyaluronic acid-hexamethylenediamine crosslinked product prepared using hexamethylenediamine (HMDA) as the alkylene diamine compound.
  • HMDA hexamethylenediamine
  • the carboxyl group of hyaluronic acid is an important group involved in the recognition of hyaluronic acid by hyaluronidase, a hyaluronic acid degrading enzyme, and the hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked product of the present invention is used in the living body by using the carboxyl group of hyaluronic acid for crosslinking. Minimization of hyaluronic acid degradation by degrading enzymes at the time of infusion increases bioavailability.
  • the (-) charge of the carboxyl group affects physical properties such as swelling properties of the hydrogel, which greatly contributes to tissue enhancement.
  • the crosslinking reaction is usually carried out in water.
  • the hyaluronic acid, the alkylene diamine compound, the carboxyl group activator and the peptide bond promoter may be dissolved in water and mixed, respectively. Also good.
  • the transformation may occur at weak acidity into N -ethyl- N- (3-dimethylaminopropyl) urea (EDU), so that the EDC is dissolved in water and crosslinked with hyaluronic acid and alkylene diamine mixture.
  • EDC N -ethyl- N- (3-dimethylaminopropyl) urea
  • the time required for the addition to a long time the physical properties of the prepared crosslinked hydrogel may be deteriorated, such as the elastic modulus of the composition is lowered after sterilization.
  • the time required from dissolution to input is within 10 to 30 minutes, and most preferably within 10 to 20 minutes.
  • reaction temperature is maintained at 30-50 degreeC, Preferably it is 43-45 degreeC.
  • the hydrogelation reaction proceeds efficiently at this temperature, and usually hydrogel is produced within 30 minutes. It is also possible to prepare a hydrogel having good viscoelasticity by standing at this temperature for at least 9 hours. At this time, it is preferable to leave it without stirring. As the additional reaction time increases, physical properties such as viscoelasticity are increased, and there is almost no change in physical properties such as viscoelasticity of the prepared hydrogel at 9 hours or more.
  • the crosslinking rate of the prepared crosslinked hydrogel varies according to pH at the time of manufacture, and physical properties may be changed.
  • the pH can be adjusted by adding NaOH aqueous solution to the reaction solution, preferably 5.5 to 6.5, more preferably 6.0 to 6.3.
  • reaction aid e.g., carboxyl group activator such as EDC and peptide bond promoter such as HOBt
  • Hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogels having physical properties and without change in physicochemical properties such as viscoelasticity can be prepared even after sterilization.
  • Hydrogels prepared in an acidic environment with a pH of less than 5.5 exhibit a relatively low modulus of elasticity (G ′) after preparation, and may further degrade elasticity during sterilization.
  • the prepared hydrogel is passed through a sieve or homogenizer is used to form a uniform particle.
  • a sieve or homogenizer is used to form a uniform particle.
  • the buffer is preferably a PBS solution or sodium chloride (NaCl) solution, preferably using a sodium chloride (NaCl) solution.
  • an aqueous ethanol solution such as an 80% aqueous ethanol solution is added, hydrogel particles are produced by precipitation, in which unreacted substances are easily removed.
  • the precipitated hydrogel may be dried and powdered with nitrogen gas, and the powdered hydrogel may be rehydrated with a physiologically suitable aqueous solution.
  • PBS or saline is preferable as a physiologically suitable aqueous solution, and may be used by rehydrating a physiologically suitable aqueous solution at a ratio of 20 to 30 (volume ratio) with respect to the hyaluronic acid-alkyldiamine crosslinked hydrogel powder. .
  • the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel of the present invention has a crosslinking rate of 5 to 35%, and preferably has a crosslinking rate of 10 to 20%. If the crosslinking rate is less than 5%, the ratio of unreacted COOH groups not involved in crosslinking in hyaluronic acid is increased, so that it is easily decomposed by hyaluronidase, a degrading enzyme, and thus it is difficult to obtain a desired degree of biopersistence. .
  • crosslinking rate exceeds 35%, it is difficult to show the degree of swelling and viscoelasticity useful for tissue enhancement, and the biocompatibility is low, such as the possibility of causing an inflammatory reaction due to a high content of residual crosslinking agent after degradation in vivo.
  • the crosslinking rate of the hydrogel is low, physical properties such as viscoelasticity may be degraded after sterilization.
  • the crosslinking rate of the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked product of the present invention refers to the percentage of hyaluronic acid content participating in the crosslinking with respect to the total hyaluronic acid content.
  • the crosslinking rate can be adjusted by adjusting the pH at the time of manufacture. Determination of the crosslinking rate can be performed by assays known in the art, such as NMR analysis and TNBS assay (Habeeb, AFSA, Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.Anal. Biochem., 1966. 14: 328-33) This can be done easily.
  • the hydrogel of the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked product of the present invention has a significantly lower decomposition rate than the HA-DVS crosslinked hydrogel using divinyl sulfone (DVS) as a crosslinking agent, and adipic acid dihydrazide ( About twice as much swelling performance as compared to HA-ADH crosslinked hydrogel using ADH) as a crosslinking agent.
  • DVD divinyl sulfone
  • ADH adipic acid dihydrazide
  • Filling composition for reinforcing tissue comprising the hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel of the present invention is preferably 1 to 3 (w / w) based on the total weight of the composition of the hyaluronic acid and alkylenediamine crosslinked hydrogel %), Preferably 1.8 to 2.4 (w / w)%. If the hydrogel contains less than 1 (w / w)%, the composition prepared does not have the desired in vivo persistence and protrusion pressure, and if it contains more than 3 (w / w)%, the composition protrudes The pressure may be too high, making injection into the tissue difficult.
  • composition of the present invention may further include unmodified (ie, uncrosslinked) hyaluronic acid in addition to the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel.
  • Unmodified HA typically uses the same hyaluronic acid used to prepare the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel.
  • Unmodified HA acts as a lubricant to lower the pressure over the composition, thereby filling the syringe and injecting the composition into the tissue at a low pressure when injected into the tissue.
  • the unmodified hyaluronic acid is included in 0.05 to 1 (w / w)% with respect to the total weight of the composition, more preferably contained in 0.1 to 0.4 (w / w)%.
  • the protrusion pressure When included less than 0.05 (w / w)%, the protrusion pressure does not decrease to the desired degree, and when included in excess of 1 (w / w)%, the protrusion pressure is too low, and the composition continues to be pushed out little by little even under one pressure load. It may cause the physical properties to deteriorate, such as excessively low elastic modulus after sterilization.
  • composition of the present invention may further include a local anesthetic such as lidocaine in a composition composed of a hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel and an unmodified hyaluronic acid, thereby exhibiting anesthetic effect and better physical properties after sterilization.
  • a local anesthetic such as lidocaine
  • the unmodified HA is mixed with the hydrogel of the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked product, the extrusion pressure of the composition is lowered, but the elastic modulus (G ′) of the composition after sterilization is lower than that of the unmixed hydrogel.
  • lidocaine when lidocaine was mixed, it showed no effect on the protrusion pressure of the composition, but the elastic modulus increased more than 1.28 times after sterilization. That is, by mixing the unmodified HA in the hydrogel of the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked product of the present invention, the pressure of the composition is lowered and the lidocaine is mixed to prevent the elastic degradation after sterilization by the unmodified hyaluronic acid. have.
  • Lidocaine is included in 0.1 to 0.4 (w / w)% based on the total weight of the composition, preferably 0.2 to 0.3 (w / w)%.
  • composition consists of pharmaceutically suitable carriers such as water, saline, and the like.
  • the composition using the hydrogel of the hyaluronic acid and the alkylenediamine crosslinked product of the present invention has excellent physical properties such as biocompatibility and swelling properties and can be maintained for a long time in a living body, thereby exhibiting an advantageous effect of reducing the number of exchanges.
  • the unmodified hyaluronic acid and the composition in which the local anesthetic is further added can be easily sterilized because the physical properties necessary for tissue enhancement such as a decrease in elastic modulus are not degraded even after sterilization. There is an advantage that can be filled and injected into the tissue.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the synthesis process of the HA-HMDA crosslinked product of the present invention and the synthesized crosslinked structure.
  • Figure 2 shows the modulus of elasticity (G ') after sterilization of the composition comprising the HA-HMDA crosslinked hydrogel of the present invention ( ⁇ : Example 8, ⁇ : Example 9, ⁇ : Example 11).
  • Figure 3 shows the degradation effect by hyaluronidase enzyme of the sterilized composition comprising the HA-HMDA crosslinked hydrogel of the present invention and the control product of the restilylene lidocaine in association with the elastic modulus (G ') ( ⁇ Example 11, ⁇ : control).
  • Figure 4 is a photograph taken of the degree of dorsal epidermal wrinkle improvement of the wrinkle-induced negative control mouse, restillen administration positive control mouse and the hydrogel administration group mice of Examples 4 and 5 of the present invention observed 11 weeks after the sample injection.
  • Figure 5 shows the effect on the tissue of the composition comprising the HA-HMDA cross-linked hydrogel of the present invention in comparison with the control, the tissue samples of the dorsal part of each group of mice stained using H & E and optical microscope The result of the photographing, and the bar indicated is 20 ⁇ m ((A): normal group, (B): wrinkle-induced negative control, (C): restylin administration positive control, (D): HA-HMDA hydro of Example 2 Gel administration group (E): HA-HMDA hydrogel administration group of Example 3, E: epidermis, D: dermis, H: subcutaneous).
  • Figure 6 is an image of replica of each group of mice 13 weeks after the sample injection (A: normal group, B: wrinkle-induced negative control, C: restylingen lidocaine administration positive control, D: Example 11 administration group of the present invention).
  • Figure 8 shows the effect of the HA-HMDA cross-linked hydrogel sterilized composition of the present invention in comparison with the control, the tissue samples of the dorsal part of each group of mice stained using H & E and photographed with an optical microscope As a result, the indicated bars represent 100 ⁇ m (A: normal group, B: wrinkle-induced negative control group, C: restilendolidocaine dose positive control group, D: Example 11 administration group, E: epidermis, D: dermis, H: subcutaneous) ).
  • Hyaluronic acid (HA, manufacturer: Lifecore Core) having a molecular weight of about 230 kDa was completely dissolved in distilled water at a concentration of 1 (w / w)%, and then hexamethylenediamine (HMDA) was added to crosslink by reaction with a carboxyl group. HMDA was added at 72 mol% of the repeat units of HA.
  • the carboxyl activator 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) were dissolved in distilled water in an amount of 1.4 times the HA repeating unit, and the HA was And HMDA were added to the mixture.
  • the mixed solution was reacted at 37 ° C. for 1 hour for complete crosslinking of the HA-HMDA crosslinked product.
  • the pH of the solution was 5.0-5.5.
  • the prepared HA-HMDA hydrogel was sealed with a pre-washed dialysis membrane (molecular weight cut-off of 7 kDa) and dialyzed in 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) for 24 hours to maintain residual EDC, HOBt and HMDA. Was removed.
  • the degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 8-9%.
  • Hyaluronic acid (HA, manufacturer: Lifecore Core) having a molecular weight of about 230 kDa was completely dissolved in distilled water at a concentration of 1 (w / w)%, and then hexamethylenediamine (HMDA) was added to crosslink by reaction with a carboxyl group. HMDA was added at 72 mol% of the repeat units of HA.
  • the carboxyl activator 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) were dissolved in distilled water in an amount of 1.4 times the HA repeating unit, and the HA was And HMDA were added to the mixture.
  • the mixed solution was reacted at 37 ° C. for 1 hour for complete crosslinking of the HA-HMDA crosslinked product.
  • the pH of the solution was 5.0-5.5.
  • the prepared HA-HMDA hydrogel was pulverized first, and then passed through a 200 um pore size sieve under constant pressure to obtain a homogeneous hydrogel. 80% ethanol was added to obtain hydrogel powder as a precipitate, 1.3% NaCl solution was added to 100-fold volume and stirred for 1 hour. 80% ethanol was added again to obtain a precipitate, and the mixture was put in 100% ethanol for 10 minutes, and dried under reduced pressure at 40 ° C. for 12 hours to remove residual EDC, HOBt, and HMDA. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 8-9%.
  • HA-HMDA hydrogel was prepared in the same manner as in Example 1-1 except that HMDA was added at 25 mol% of the HA repeat units.
  • the degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 6-7%.
  • HA was used in the same manner as in Example 1 except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa (HA, manufacturer: Lifecore Co.) was used at a concentration of 1 (w / w)% and the pH of the solution was 5.5-5.9.
  • -HMDA crosslinked was prepared. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 11-13%.
  • Example except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa (HA, manufactured by Lifecore Co.) was used at a concentration of 1.5 (w / w)%, and the amount of HMDA added was 25 mol% of the repeating unit of HA.
  • a HA-HMDA crosslinked product was prepared.
  • the pH of the prepared hydrogel was 5.0-5.5.
  • the degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 11-13%.
  • Hyaluronic acid (HA, manufacturer: Lifecore Co.) having a molecular weight of 1,000 kDa was completely dissolved in water at a concentration of 3 (w / w)%, and then hexamethylenediamine (HMDA) was added to crosslink by reaction with a carboxyl group. HMDA was added at 20 mol% of the repeating units of HA. The pH was adjusted to 6.0-6.5 by addition of 0.25 N NaOH aqueous solution.
  • the carboxyl activator 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) were dissolved in distilled water in an amount of 1.0 times the HA repeating unit, and the HA was And HMDA aqueous solution.
  • the pH was adjusted to 6.0-6.5 by addition of 0.25 N NaOH aqueous solution.
  • the mixed solution was reacted at 45 ° C. for 1 hour for complete crosslinking of the HA-HMDA crosslinked product.
  • the prepared HA-HMDA hydrogel was sealed with a pre-washed dialysis membrane (molecular weight cut-off of 7 kDa) and dialyzed in 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) for 24 hours to maintain residual EDC, HOBt and HMDA.
  • PBS phosphate buffered saline, pH 7.4
  • Hyaluronic acid (HA, manufacturer: Lifecore Co.) having a molecular weight of 1,000 kDa was completely dissolved in water at a concentration of 3 (w / w)%, and then hexamethylenediamine (HMDA) was added to crosslink by reaction with a carboxyl group. HMDA was added at 20 mol% of the repeating units of HA. The pH was adjusted to 6.0-6.5 by addition of 0.25 N NaOH aqueous solution. Carboxyl activator 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) were added to distilled water in an amount of 1.0 times the HA repeating unit for 20 minutes.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HA and HMDA aqueous solution were added to the mixed solution of HA and HMDA aqueous solution. Stir at 45 ° C. for 30 minutes. The mixed solution was allowed to stand at 45 ° C. for 10 hours without agitation so that the HA-HMDA crosslinked material was completely crosslinked.
  • the prepared HA-HMDA hydrogel was first ground and then passed through a 200 um pore size sieve to obtain a homogeneous hydrogel. 80% ethanol was added to obtain hydrogel powder as a precipitate, 1.3% NaCl solution was added to 100-fold volume and stirred for 1 hour. 80% ethanol was added again to obtain a precipitate, and the obtained hydrogel precipitate was put in 100% ethanol for 10 minutes, and then dried under reduced pressure at 40 ° C.
  • HA-HMDA crosslinked hydrogel was prepared in the same manner as in Example 4-1 except for adding to the mixed solution of the mixed aqueous solution.
  • An HA-HMDA crosslinked hydrogel was prepared in the same manner as in Example 4-1 except that the mixed solution was left at 45 ° C. for 3, 5, 7, 9 hours without stirring.
  • a HA-HMDA crosslinked hydrogel was prepared in the same manner as in Example 4-1 except for homogenizing the hydrogel for 5 minutes at 8,000 rpm with a homogenizer (T-18 basic, IKA) instead of passing through a sieve. .
  • HA-HMDA hydrogel was prepared in the same manner as in Example 4-1 except that the prepared HA-HMDA crosslinked product was sealed with a dialysis membrane (7 kDa molecular weight cut-off) and dialyzed in PBS (pH 7.4) for 24 hours. It was.
  • the hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa was used at a concentration of 3 (w / w)%, the amount of HMDA was added using 20 mol% of the repeating unit of HA and the pH was adjusted to 5.5-5.9 by adding 0.25 N NaOH solution.
  • a HA-HMDA crosslinked product was prepared in the same manner as in Example 4 except for the above. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 10-12%.
  • HA-HMDA crosslinking in the same manner as in Example 4, except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa was used at a concentration of 3 (w / w)%, and the amount of HMDA added was 10 mol% of the repeating units of HA. Water was prepared. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 5-7%.
  • HA-HMDA crosslinking was carried out in the same manner as in Example 4, except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa was used at a concentration of 3 (w / w)%, and the amount of HMDA added was 40 mol% of the repeating units of HA. Water was prepared. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 32-35%.
  • hyaluronic acid-alkylenediamine hydrogel powder prepared and dried by the method of Example 4-1, 2 mg of hyaluronic acid (HA) having a molecular weight of 1,000 kDa was added and mixed and dissolved in 1 ml of PBS (pH 7.4). After stirring for 5 hours, a composition containing the hydrogel and unmodified hyaluronic acid of the present invention was obtained.
  • HA hyaluronic acid
  • hyaluronic acid (HA) having a molecular weight of 1,000 kDa was added and mixed and dissolved in 1 ml of PBS (pH 7.4). After stirring for 5 hours, a composition containing the hydrogel and unmodified hyaluronic acid of the present invention was obtained.
  • hyaluronic acid-alkylenediamine hydrogel powder prepared and dried by the method of Example 4-1, 2 mg of hyaluronic acid (HA) having a molecular weight of 1,000 kDa and 3 mg of lidocaine were added and PBS (pH 7.4) 1 After mixing in ml, the mixture was stirred for 5 hours to obtain a composition containing the hydrogel, unmodified hyaluronic acid, and lidocaine of the present invention.
  • HA hyaluronic acid having a molecular weight of 1,000 kDa
  • lidocaine PBS (pH 7.4)
  • hyaluronic acid-alkylenediamine hydrogel powder prepared and dried according to the method of Example 4-1, 4 mg of hyaluronic acid (HA) having a molecular weight of 1,000 kDa and 3 mg of lidocaine were added and PBS (pH 7.4) 1 After mixing in ml, it stirred for 5 hours and obtained the composition containing the hydrogel, unmodified hyaluronic acid, and lidocaine of this invention.
  • HA hyaluronic acid having a molecular weight of 1,000 kDa and 3 mg of lidocaine
  • the pH of the obtained HA / ADH mixed aqueous solution was adjusted to 4.8 using 1N hydrochloric acid aqueous solution, and then stirred thoroughly for 30 minutes. To this was added a 4-fold excess of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0.191 g) powder in a molar ratio with good stirring to activate the carboxyl group of HA.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • 1N HCl aqueous solution was added to the aqueous solution and reacted for 2 hours while maintaining the pH at 4.8. After two hours, the reaction was stopped by adding 1N aqueous sodium hydroxide solution to raise the pH to 7.0.
  • BS3 Bis [sulfosuccinimidyl] suberate (BS3), a crosslinking agent specific for hydrazide, was also dissolved in PBS and added to HA-ADH solution. At this time, the amount of BS3 added was 20 mol% of HA-ADH hydrazide. After thoroughly mixing the aqueous solution, the reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour to complete the crosslinking reaction to prepare a HA-ADH crosslinked hydrogel.
  • BS3 Bis [sulfosuccinimidyl] suberate
  • HA-DVS hydrogel was prepared.
  • the prepared hydrogel was then sealed with a pre-washed dialysis membrane (molecular weight cut-off of 7 kDa) and dialyzed in PBS for 24 hours to diffuse and release ions (Na + and OH ⁇ ) through the dialysis membrane and sealed HA
  • the pH of the -DVS crosslink was neutralized.
  • HA-HMDA crosslinking in the same manner as in Example 4 except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa was used at a concentration of 3 (w / w)%, and the amount of HMDA added was 5 mol% of the repeat units of HA. Water was prepared. The cross-linking degree of the prepared HA-HMDA hydrogel was 2-4%, and the viscoelasticity was too low to be used as a tissue filler.
  • HA-HMDA crosslinking in the same manner as in Example 4 except that hyaluronic acid having a molecular weight of about 1,000 kDa was used at a concentration of 3.3 (w / w)%, and the amount of HMDA added was 50 mol% of the repeating units of HA. Water was prepared. The degree of crosslinking of the prepared HA-HMDA hydrogel was 40-45%, which was well broken due to the formation of too dry crosslinks, making it difficult to use as a tissue filler.
  • the hyaluronic acid degrading enzyme was tested on the hyaluronic acid crosslinked hydrogels of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 The hyaluronic acid crosslinked hydrogels of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 were packed in the same mass in each vial.
  • 0.2 M PBS ( pH 6.2) with 50 U of hyaluronic acid degrading enzyme (hyaluronidase from Streptomyces hyalurolyticus , Sigma-Aldrich) was added. The mixture was reacted at 37 ° C. for a predetermined 48 hours. Thereafter, the supernatant was completely removed and the mass of the remaining hyaluronic acid crosslinked material was measured.
  • hyaluronic acid degrading enzyme hyaluronidase from Streptomyces hyalurolyticus
  • the degree of decomposition of the crosslinked product was calculated as the mass ratio (%) of the remaining crosslinked product and the original crosslinked product, and the degradation rate (degradation (%)) over time was shown in Table 1.
  • Table 1 the HA-DVS crosslinked product of Comparative Example 2 was completely decomposed within about 25 hours, while the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel according to the present invention was partially decomposed after 40 hours. Only it was done. From this, it can be seen that the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel of the present invention has excellent biopersistence superior to commercial hydrogels.
  • the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel according to the present invention exhibits a swelling ratio of two or more times higher than that of the HA-ADH crosslinked product of Comparative Example 1 showing a similar decomposition rate. From this, it can be seen that the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel according to the present invention is an excellent tissue enhancing filler which simultaneously exhibits bio-persistence and swelling properties.
  • Hyaluronic acid crosslinked hydrogels from Example 1 to Example 7 were packed in the same mass in each vial.
  • the mixture was reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • 0.8 M potassium borate pH 9.1 was added and then heated at 100 ° C. for 3 minutes.
  • Ehrlich's reagent was prepared according to the method of Reissig et al (J. Biol. Chem; 1955; 217: 959-996) to determine the amount of N-acetylglucosamine (NAG) that was degraded.
  • the reagent was added to the vial and allowed to react at 37 ° C for 20 minutes. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation, and the amount of NAG in the decomposed crosslinked product was measured by UV at 585 nm.
  • Degradation degree of the crosslinked product was set to 100% decomposition rate of Example 6, the decomposition rate of the remaining examples are shown in Table 2 below.
  • the crosslinking rate was affected by the molecular weight, initial concentration and pH of HA.
  • This experimental example was carried out to confirm the optimal hydrogel preparation concentration of the composition comprising the hyaluronic acid crosslinked hydrogel of the invention.
  • the hyaluronic acid crosslinked hydrogel of Example 4-1 was dissolved in PBS (pH 7.4) at concentrations of 1%, 1.5%, 2%, and 2.4%, respectively, and stirred for 5 hours, and these were filled in a syringe, and 121 ° C and 1.5 degrees. After sterilization atm for 20 minutes, the degradation rate, protrusion pressure, and modulus of elasticity (G ′) of the hyaluronic acid degrading enzyme were measured for this sterilized composition.
  • HA hyaluronic acid
  • PBS pH 7.4
  • the stirred composition was filled in 3 ml glass syringes with the same mass, followed by wet sterilization (121 ° C., 1.5 atm, 20 minutes), and the average particle size and protrusion pressure for each sterilized composition were measured and shown in Table 4 below.
  • the average particle size and distribution were measured using a Malvern Mastersizer 2000 (Malvern Instruments LTD, Worcestershire, UK) equipment and measured using 0.9% NaCl solution as a dispersion solvent. Protruding pressure was measured up to 6 mm at a constant speed of 1 mm / min using a 27 gauge and 30 gauge needle and EZ-S SHIMADZU.
  • the protrusion pressure was affected by the composition ratio of the unmodified HA. That is, it was confirmed that as the content of the unmodified HA in the composition increases, the unmodified HA acts as a lubricant, thereby reducing the protrusion pressure. According to the gauge of the needle used, the difference between the 30 gauge and the 27 gauge was approximately 1.6 times for the 3 ml syringe. On the other hand, the addition of lidocaine had little effect on the protrusion pressure. In the case of Examples 10 and 12 having a high content of unmodified HA in the composition, the protrusion pressure was too low, so that the composition continued to flow even after stopping after applying a constant force.
  • Example 4-9 homogenized with a homogenizer without passing through a sieve had a higher protrusion pressure than that when homogenized with a sieve.
  • a hydrogel with a wide particle distribution was obtained, and it was considered that the protrusion pressure was increased due to the irregularly sized hydrogel particles.
  • HA hyaluronic acid
  • PBS pH 7.4
  • the stirred composition was filled into 3 ml glass syringes in equal mass and then wet sterilized (121 ° C., 1.5 atm, 20 minutes), and the method of Ghosh et al (Biomacromolecules 2005; 6: 2857-2865) was applied to each sterilized composition. Rheological tests were conducted.
  • the elastic modulus is affected by the composition ratio of the unmodified HA.
  • the modulus of elasticity of the sterilized composition increased by 25.6% compared to the case where only HA was added. It was confirmed.
  • the modulus of elasticity was slightly reduced (4.9%) compared with the case of homogenization with a sieve. 2 shows the modulus of elasticity of 0.1-20 Hz of the sterilized compositions of Examples 8, 9 and 11.
  • the elastic modulus after sterilization was measured for the compositions of Examples 4-1 to 4-4.
  • the stirring time of EDC / HOBt which is a reaction aid, was changed to 20, 30, 40, and 60 minutes, respectively.
  • Each prepared hydrogel powder was added to PBS (pH 7.4) at a concentration of 20 mg / ml, stirred for 5 hours, and then wet sterilized (121 ° C., 1.5 atm, 20 minutes) in a 3 ml glass syringe.
  • PBS pH 7.4
  • 4-cm 2 ° -cone and plate geometry, measured at 0.1-20 Hz in 1% strain and oscillation mode, measured at 3 Hz
  • the coefficient (G ′) values are shown in Table 6 below. The deviation of the instrument was ⁇ 10% and the experiment was conducted at 25 ° C.
  • the preparation of the hyaluronic acid cross-linked hydrogel was found to be affected by the time until the reaction dosing time after dissolving in an aqueous solution of EDC / EDU.
  • Hyaluronic acid cross-linked hydrogel prepared by dissolution to charge within 20-30 minutes is similar to the elastic modulus after sterilization.
  • the hydrogel produced from dissolution to infusion for 40 minutes or more was degraded after sterilization, and at 60 minutes or more, hydrogels having a low elastic modulus such as water were prepared after sterilization. From these results, it can be seen that the time from dissolution to dosing of EDC / HOBt in the preparation of the hyaluronic acid-alkylenediamine crosslinked hydrogel is a very important factor.
  • the elastic modulus after sterilization of the compositions of Examples 4-1, 4-5 to 4-8 Measured.
  • the hydrogels of Examples 4-1 and 4-5 to 4-8 were prepared by varying the additional standing time for the complete crosslinking reaction of the hyaluronic acid crosslinking to 3, 5, 7, 9, and 12 hours.
  • Each prepared hydrogel powder was added to PBS (pH 7.4) at a concentration of 20 mg / ml, stirred for 5 hours, and then wet sterilized (121 ° C., 1.5 atm, 20 minutes) in a 3 ml glass syringe.
  • PBS pH 7.4
  • 4-cm 2 ° -cone and plate geometry, measured at 0.1-20 Hz in 1% strain and oscillation mode, measured at 3 Hz
  • the coefficient (G ′) values are shown in Table 7 below. The deviation of the instrument was ⁇ 10% and the experiment was conducted at 25 ° C.
  • the control limit of the hydrogel of Example 4-10 obtained by removing the unreacted substance by using dialysis membrane or the hydrogel of Example 4-1 removed using ethanol and buffer was controlled to 2 ppm or less. It was confirmed.
  • the detection limit was 2 ppm or less in the hydrogel of Example 4-1, but in Example 4-10 obtained by removing the unreacted substance using a dialysis membrane, about 10 times as much HOBt was detected. This may be because HOBt tends to be more soluble in organic solvents, making it difficult to purify by dialysis.
  • the hyaluronic acid crosslinked hydrogel sterilized composition of the present invention was evaluated by comparing the sensitivity to hyaluronic acid degrading enzyme with a value of G 'and comparing with restilylene lidocaine, a filler for enhancing tissue, which is commercially available.
  • the sterile composition and restylene lidocaine of Example 11 of the present invention were dispensed in 800 ml in 1.5 ml test tubes.
  • tissue enhancement effect and biocompatibility of the hyaluronic acid crosslinked hydrogel of the present invention were evaluated in comparison with Restylane ® , a filler for improving wrinkles on the market.
  • the hyaluronic acid crosslinked hydrogel of the present invention is the hyaluronic acid crosslinked hydrogels of Examples 2, 3, 4 and 5 of the present invention, respectively, in a homogeneous group (T-18 basic, IKA, Tokyo, Japan) at 5 Prepared by homogenization for minutes, and 0.4 ml each was injected through a 30 gauge syringe needle into a tattooed rectangle in the dorsal subcutaneous layer of the wrinkle-inducing mouse.
  • the wrinkle improvement area over time is shown in Table 8 below.
  • Table 8 the group treated with Restylane ® after the induction of wrinkles as a positive control group, the HA-HMDA crosslinked hydrogel of Example 2 of the present invention, and the HA-HMDA crosslinked hydrogel of Example 3 were treated.
  • mice showed a marked improvement in wrinkles compared to the wrinkle-induced negative control mice treated with nothing after the induction of wrinkles.
  • FIG. 4 shows the hairless mice treated with wrinkle-induced group as a negative control after 11 weeks, hairless mice treated with Restylane ® after the induction of positive control, and hairless mice treated with HA-HMDA hydrogels of Examples 4 and 5 after wrinkles. Photograph showing the condition of the dorsal epidermis. As can be seen from Table 8 and Figure 4, the composition comprising the HA-HMDA hydrogel of the present invention showed a better wrinkle improvement effect than Restylane ® .
  • H & E hematoxylin-iosin staining 12 weeks after hyaluronic acid crosslinked hydrogel administration. Skin samples were taken from each mouse and fixed in 10% by volume buffered formaldehyde, dehydrated with ethanol, then stored in paraffin to make samples, which were cut into 4 ⁇ m sections and stained with H & E. 5 shows the results of photographing the stained samples using an optical microscope. As shown in Figure 5, the mice administered the hydrogels of the present invention did not show any inflammatory response as the control mice did not cause wrinkles (in H & E, hematozain was blue Stained with iosin, which is stained red with hematoxylin as a contrast dye).
  • the wrinkle-induced negative control (5B) compared to the normal group (5A) it can be seen that the epidermis (E) is flattened, the dermis (D) is thick and rough due to the skin damage caused by wrinkles.
  • the test group injected with the positive control group administered with the Wrinkle-induced negative control group, Restylane ® remarkably expanded the lumen of the subcutaneous tissue, while regenerating by injecting the HA-HMDA crosslinked hydrogel of Example 3
  • the lumen of the subcutaneous tissue was regenerated in almost the same form as the lumen of the control subcutaneous tissue that did not cause wrinkles.
  • tissue enhancement effect and biocompatibility of the hyaluronic acid crosslinked hydrogel composition of the present invention were evaluated in comparison with Restylane ® Lidocaine, a filler for improving wrinkles on the market.
  • Example 11 of the present invention Three days after the application of the wrinkle causing agent was stopped, 0.4 ml of the hyaluronic acid crosslinked hydrogel composition of Example 11 of the present invention was injected through a 3 ml syringe and a 27 gauge needle into a tattooed rectangle of the dorsal subcutaneous layer of the wrinkled mouse. .
  • 0.4 ml of Restylane ® Lidocaine (manufactured by Q-Med AB; 20 mg / ml) was injected using a 27-gauge needle.
  • H & E hematoxylin-iosin staining 14 weeks after hyaluronic acid crosslinked hydrogel administration. Skin samples were taken from each mouse and fixed in 10% by volume buffered formaldehyde, dehydrated with ethanol, then stored in paraffin to make samples, which were cut into 4 ⁇ m sections and stained with H & E. The result of photographing the stained sample using an optical microscope is shown in FIG. Mice administered with the sterilized hydrogel composition of Example 11 of the present invention did not show any inflammatory response as in the normal group mice (for H & E, hematoxylin is stained blue in the inflammatory reaction, Io God is dyed red as a contrast dye with hematozain).
  • Wrinkle-induced negative control and restylingulidocaine-positive control showed some inflammatory responses in the dermis, but the hydrogel-administered group of the present invention did not have any hemolysis or inflammatory response as the normal group, and dermal tissue was regenerated.
  • the thickness of the regenerated dermis was equivalent to the normal control and the positive control group receiving restylene lidocaine. This increase in dermal thickness effectively contributes to tissue enhancement.
  • the test group injected with the anti-wrinkle negative control group, the positive control group administered with restylene lidocaine significantly expanded the lumen of the subcutaneous tissues, whereas the regenerated subcutaneous tissues were injected by injecting the sterilized composition of Example 11. The lumen was regenerated in almost the same way as the subcutaneous lumen of the normal group.
  • the hyaluronic acid-alkylene diamine crosslinked hydrogel and the sterilized hydrogel of the present invention show excellent biocompatibility, and have excellent tissue enhancement due to proper swelling and regeneration of dermis and subcutaneous tissue. Effect), and since it lasts much longer in vivo than a commercial tissue filler, it can be effectively used as a tissue filler.

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Abstract

본 발명은 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는 조직증강용 충전제에 관한 것으로, 생체 적합성 및 팽윤성 등 조직증강에 필요한 물성이 우수하고 생체내에서 오래 지속될 수 있어 그 교환횟수를 줄일 수 있는 유리한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

조직 증강용 충전 조성물
본 발명은 조직증강에 유용한 생체적합성 충전 조성물에 관한 것이다.
연조직 증강과 같은 조직 증강은 의학 및 미용 목적으로 사용되어 왔다. 이러한 증강은 성형수술을 통해 외과적으로 이루어지거나, 또는 생체 적합성 물질을 투여하여 연조직의 부피를 증대시키는 비외과적인 방법으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 의학적으로는 HIV 양성 환자에게서 나타나는 안면 지방위축증에 사용될 수 있다. 안면 지방위축증은 관자놀이 및 볼의 피하지방 손실을 언급하는 것으로 매우 여윈 모습을 나타내게 된다. 그 외 미용상으로 볼, 입술, 가슴, 엉덩이의 부피를 확대시키고, 피부의 잔주름 및 깊은 주름을 감소시키는데 사용돼 왔다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체 적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다. 그러나 히알루론산 그 자체는 체내에서 수시간에 불과한 짧은 반감기를 나타내어 적용에 한계가 있어, 가교결합을 통해 반감기(체내 지속성)를 증대시키려는 연구가 진행되어 왔다. 예컨대 디비닐술폰, 비스에폭사이드, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 가교제로 사용하여 가교결합된 히알루론 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었으며, 이러한 제법을 기반으로 한 다양한 제품들이 피부 연조직 증강용 충전제(dermal filler)로 시판되고 있다. 미국 특허 제4,582,865호는 디비닐술폰(DVS)을 가교제로 사용하여 가교된 히알루론 유도체를 개시하고 있으며, 이의 하이드로겔 형태가 Hylaform
Figure PCTKR2011005072-appb-I000001
의 상품명으로 시판되고 있고, 미국특허 제5,827,937호는 다기능에폭시화합물을 가교제로 사용하여 히알루론 유도체 가교물을 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 이중 다기능에폭시화합물로서 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)을 가교제로 사용하여 제조한 히알루론산 가교물의 하이드로겔 형태인 Restylane®는 미국 FDA의 승인을 받아 조직증강용 충전제로서 세계적으로 시판되고 있다. 이들 제품들은 모두 히알루론산의 하이드록시기와 가교제가 결합하여 생성되는 것으로, 미가교 히알루론산에 비하면 그 생체내 지속성이 증대되었다고는 하나, 여전히 6개월 이내에 분해되는 등 생체 지속성이 낮은 문제가 있다.
이러한 시판 제품의 낮은 생체 지속성의 문제를 해결하기 위해, 본 출원인은 히알루론산 분해효소의 인식부위가 히알루론산의 카르복시기임에 착안하여, 히알루론산의 카르복시기와 결합하는 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용하여 생체 지속성이 높은 히알루론산-ADH 가교물을 제조하는 방법을 개발하고 이를 제10-2008-0074260호로 출원한 바 있다. 한편 히알루론산-ADH 가교물 하이드로겔은 시판 히알루론 가교물 하이드로겔에 비하여 현저히 높은 생체지속성을 나타내었으나, 점탄성이 낮아 부서지기 쉽고 잘 팽윤되지 않으며 조직내 균등하게 분포되지 않아 조직 보정이 용이하지 않다는 문제점이 발견되었다. 또한, 히알루론산 가교물은 체내에서 이물질로 인식될 수 있는 화학물질을 가교제로 사용하여 제조되므로, 추후 생체에 투여되어 분해되는 경우, 잔여 가교제로 인해 면역반응이 일어나는 등의 문제가 있을 수 있으므로, 제조과정 중 이물질로 작용할 수 있는 가교제나 첨가제의 양이 최소화되어야 한다. 그 외에도, 생체에 주입되는 물질이므로 멸균이 가능하여야 하며, 멸균 후에도 조직 보정에 필요한 점탄성 등의 물리화학적 성질이 유지되어야 한다.
이상과 같이, 우수한 조직보정용 충전제로 사용될 수 있도록, 생체내 지속성, 생체 적합성 및 멸균후에도 조직보정에 필요한 점탄성 등의 물성이 양호하며, 용이하게 주사제에 충진되어 생체 조직에 주입될 수 있는, 가교결합된 히알루론산 하이드로겔이 요망된다.
[선행기술문헌]
<특허문헌>
미국 특허 제4,582,865호(1986년 4월 15일 공개)
미국특허 제5,827,937호(1998년 10월 27일 공개)
한국 특허 출원 제10-2008-0074260호(2009년 2월 5일 공개)
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 한 것으로, 우수한 조직보정용 충전제로 사용될 수 있도록, 생체내 지속성 및 생체 적합성이 우수하고, 멸균후에도 조직보정에 필요한 점탄성 등의 물성이 양호하게 유지되며, 용이하게 주사제에 충진되어 생체 조직에 주입될 수 있는, 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 식 1의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물의 하이드로겔을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물을 제공한다;
[식 1]
[HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
(식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 10,000 ~ 4,000,000, 바람직하게는 20,000 ~ 3,000,000의 정수이다).
바람직하게 상기 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 3 (w/w)%로 포함된다.
바람직하게, 본 조성물은 미변형(즉, 가교되지 않은) 히알루론산을 더 포함하여, 조성물의 돌출압력(extrusion force)를 감소시킴으로써, 주사기에 충전하여 용이하게 조직내 주입할 수 있다.
바람직하게 상기 미변형 히알루론산은 조성물 총 중량에 대하여 0.05 내지 1 (w/w)%로 포함된다.
바람직하게, 본 조성물은 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물의 하이드로겔 및 미변형 히알루론산에 리도카인을 더 포함하여, 조성물의 멸균 후 탄성 저하를 방지하고 국소마취효과를 나타낸다.
바람직하게 상기 리도카인은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 0.4 (w/w)%로 포함된다.
조성물의 나머지 잔부는 물, 생리식염수 등의 약학적으로 적합한 담체로 구성된다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 히알루론산의 분자량은 바람직하게 20,000 달톤 내지 4,000,000 달톤이다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 알킬렌디아민은 바람직하게 헥사메틸렌디아민이다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 바람직하게 pH 5.5 내지 6.5에서, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 제조된다.
상기 본 발명의 조성물에 있어서, 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 가교율은 바람직하게 5 내지 35 %이다(TNBS assay).
본 명세서에서, "증강"은 조직 부피의 증가(예를 들면 조직확대) 및/또는 조직 기능의 향상을 의미한다. 따라서 본 발명의 조직증강용 충전제는 의학적, 또는 미용적으로 연조직의 조직부피의 증가 또는 조직 기능의 향상을 나타내는데 사용될 수 있으며, 특히 피부의 주름을 제거 또는 개선시키거나; 볼, 입술, 가슴, 엉덩이 등의 신체부위의 부피를 확대시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체는 물론 그의 염 및 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용되는 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 이들의 혼합물 수용액을 모두 포함하는 개념이다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물의 제조방법을 제공하며, 이는
(1) 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조하는 단계;
(2) 제조된 하이드로겔을 균질화하는 단계; 및
(3) 미반응 물질을 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 바람직하게 30분 이내에, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제를 물에 용해시키고 히알루론산과 알킬렌 디아민 화합물 혼합물에 첨가함으로써, 멸균후에도 탄성계수 등 물성이 우수한 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게, 반응계를 30℃ 내지 50℃에서 9시간 이상 교반없이 방치함으로써, 히알루론산 및 알킬렌디아민이 충분하고 완전하게 가교되어, 멸균후에도 탄성계수 등 물성이 우수한 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게 pH 5.5 내지 6.5에서 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조함으로써, 소량의 가교제(알킬렌디아민) 및 보조제(카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제)를 사용하여, 멸균후에도 탄성계수 등 물성이 우수하고, 생체적합성이 높은 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 제조된 하이드로겔을 체로 걸러 균질화함으로써, 균일한 크기 및 좁은 입자분포의 균질화된 하이드로겔을 얻을 수 있으며, 멸균후에도 비교적 낮은 돌출압력을 나타내어 용이하게 주사기에 충전하여 조직내 주입가능한 조성물을 제조할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 C1-C6 알콜 수용액으로 침전시키고, 인산완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS) 또는 염화나트륨 버퍼로 세척함으로써, 짧은 시간내 용이하게 알킬렌디아민, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제 등의 미반응 물질들을 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔, 이를 포함하는 조성물 및 그 제법을 구체적으로 이하에서 설명한다.
1) 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 제조
히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 제조한다.
사용되는 히알루론산(HA)은 분자량이 10,000 달톤 내지 4,000,000 달톤, 더욱 바람직하게는 20,000 달톤 내지 3,000,000이다. HA의 분자량 또는 농도를 조절하여 제조되는 가교물 하이드로겔의 생체 내 분해율을 조절할 수 있다. 통상 HA의 초기 농도가 높을수록 제조되는 가교물 하이드로겔의 가교율이 높으며, 이에 따라 낮은 생체내 분해율을 나타낸다. 바람직하게 HA는 1 내지 3.5 (w/w)%의 농도로 사용하며, 바람직하게는 3 (w/w)%를 사용한다. 1 (w/w)% 미만인 경우에는 원하는 정도의 생체분해율을 얻기 어렵고, 3.5 (w/w)%를 초과하는 경우에는 제조된 하이드로겔이 건조하여 부서지기 쉽다.
알킬렌 디아민 화합물은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물로서, 바람직하게는 C3-C7 알킬렌디아민, 보다 바람직하게는 C4-C6 알킬렌 디아민, 가장 바람직하게는 C6 알킬렌디아민(헥사메틸렌디아민)을 사용하며, 히알루론산 반복 단위의 3.5 내지 80 몰%, 바람직하게는 10 내지 30몰%, 가장 바람직하게는 10 내지 25몰%로 사용한다.
카르복실기 활성화제로서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드들; 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드 (ETC, 1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드들; 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)와 같은 1-사이클로알킬-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드의 카르보디이미드를 사용하며, 보다 바람직하게는, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용하는 것이 바람직하다.
펩티드 결합 촉진제로서는 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), 설포-N-히드록시설포숙신이미드 (Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)를 사용하며, 바람직하게 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게 알킬렌 디아민 화합물로서, 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 사용하여 제조한 히알루론산-헥사메틸렌디아민 가교물을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에, 히알루론산의 카르복실기와 알킬렌 디아민 화합물의 아민기가 아미드 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자내에서 일어날 수도 있다. 히알루론산의 카르복실기는 히알루론산 분해효소인 히알루로니다제가 히알루론산을 인식하는 데에 관여하는 중요한 기로서, 본 발명의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물은 히알루론산의 카르복실기가 가교에 사용됨으로써 생체 내에 투입시 분해효소에 의한 히알루론산 분해가 최소화되어 생체 지속성이 증대된다. 또한 카르복실기의 (-)전하는 조직 증강에 크게 기여하는 하이드로겔의 팽윤성 등의 물성에 영향을 미친다.
상기 가교 반응은 통상 물에서 수행된다. 히알루론산, 알킬렌 디아민 화합물, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제는 각각 물에 용해시켜 혼합하여도 좋고, 히알루론산 및 알킬렌 디아민 화합물을 녹인 용액에 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제를 녹인 용액을 혼합하여도 좋다. 특히, 카르복실기 활성화제로 사용되는 EDC의 경우, 약한 산성에서 EDU(N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) urea)로 변형이 일어날 수 있어, EDC를 물에 녹이고 가교될 히알루론산 및 알킬렌 디아민 혼합물에 투입하는데 소요되는 시간이 길어짐에 따라 제조된 가교물 하이드로겔의 물성 특히 멸균후 조성물의 탄성계수가 낮아지는 등 물성이 열화될 수 있다. 바람직하게는 용해에서 투입시까지의 소요되는 시간은 10 내지 30분 이내, 가장 바람직하게는 10분 내지 20분 이내로 하는 것이 좋다.
또한, 반응 온도는 30 내지 50℃, 바람직하게는 43 내지 45℃로 유지한다. 상기 온도에서 효율적으로 하이드로겔화 반응이 진행되어, 통상 30분 내에 하이드로겔이 생성된다. 또한 상기 온도에서 최소한 9시간 동안 방치시켜 양호한 점탄성을 갖는 하이드로겔을 제조할 수 있다. 이 때, 교반없이 방치하는 것이 바람직하다. 추가 반응 시간이 증가함에 따라 점탄성 등의 물성이 증가하며, 9시간 이상에서는 제조된 하이드로겔의 점탄성 등 물성의 변화가 거의 없다.
또한, 제조시 pH에 따라 제조된 가교 하이드로겔의 가교율이 달라지며, 물성이 변화될 수 있다. pH는 NaOH 수용액을 반응 용액에 첨가하여 조정할 수 있으며, 바람직하게 5.5 내지 6.5, 더욱 바람직하게 6.0 내지 6.3로 하는 것이 좋다. 특히, pH를 5.5 내지 6.5로 조정함으로써, 비교적 소량의 가교제 (예, 헥사메틸렌디아민) 및 반응보조제(예, EDC와 같은 카르복실기 활성화제와 HOBt와 같은 펩티드 결합 촉진제)를 사용하여도 우수한 점탄성 등의 물성을 가지며, 멸균 후에도 점탄성 등의 물리화학적 성질의 변화가 없는 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조할 수 있다. pH가 5.5 미만의 산성 환경에서 제조된 하이드로겔은 제조후 비교적 낮은 탄성 계수(G')를 나타내며, 멸균시 탄성이 더욱 저하될 수 있다.
2) 하이드로겔의 균질화
제조된 하이드로겔은 체를 통과시키거나, 호모게나이저를 사용하여 균일한 입자형태로 만든다. 특히, 체를 사용하여 균질화하는 것이 바람직하며, 좁은 입자분포 및 낮은 돌출압력을 갖는 하이드로겔을 얻을 수 있다.
3) 미반응 물질의 제거
가교반응이 끝난후, 미반응 물질들은 PBS에 24시간 내지 3 일 동안 투석막을 이용하여 투석하여 제거하거나, 에탄올 수용액 및/또는 버퍼를 이용하여 검출한계(2 ppm) 이하로 제거할 수 있다. 다만, HOBt와 같은 촉진제는 유기용매에 더 잘 녹는 경향이 있어, 투석막과 PBS를 이용하는 투석법에 의해서는 정제가 잘 되지 않으나, 에탄올 수용액 및/또는 버퍼를 이용하여 용이하게 검출한계 이하로 제거할 수 있다. 이때, 버퍼는 바람직하게 PBS용액이나 염화나트륨(NaCl) 용액을 사용하며, 바람직하게는 염화나트륨(NaCl) 용액을 사용한다. 사용되는 NaCl의 농도가 높을수록 정제가 용이하며, 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 1 내지 1.3%로 사용한다. 또한, 에탄올 수용액 예컨대 80% 에탄올 수용액을 첨가하는 경우, 하이드로겔 입자가 침전으로 생성되며, 이 과정에서 미반응 물질들이 용이하게 제거된다. 침전된 하이드로겔은 질소 가스로 건조하여 분말화할 수 있고, 분말로 된 하이드로겔은 생리학적으로 적합한 수용액으로 재수화시켜 사용할 수 있다. 이때, 생리학적으로 적합한 수용액으로는 PBS나 생리식염수가 바람직하며, 히알루론산-알킬디아민 가교된 하이드로겔 분말에 대해 20 내지 30(부피비)의 비율로 생리학적으로 적합한 수용액으로 재수화시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 5 내지 35 %의 가교율을 가지며, 바람직하게는 10 내지 20%의 가교율을 가진다. 가교율이 5% 미만인 경우에는 히알루론산내 가교결합에 관여하지 않은 미반응 COOH기의 비율이 높아짐으로써 분해효소인 히알루로니다제(hyaluronidase)에 의해 쉽게 분해되므로, 원하는 정도의 생체 지속성을 얻기 어렵다. 가교율이 35%를 초과하는 경우에는 조직 증강에 유용한 정도의 팽윤성 및 점탄성을 나타내기 어려우며, 생체내 분해후 잔여 가교제의 함량이 높아져 염증반응 등을 일으킬 가능성이 커지는 등 생체 적합성이 낮다. 또한, 하이드로겔의 가교율이 낮은 경우 멸균후 점탄성 등의 물성이 열화될 수 있다.
본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물의 가교율은 전체 히알루론산 함량에 대한 가교에 참여한 히알루론산 함량의 백분율을 의미하는 것으로, 가교제로 사용하는 알킬렌디아민의 전체 히알루론산에 대한 사용비율을 조절하거나, 제조시 pH를 조절하는 등을 통해 가교율을 조절할 수 있다. 가교율의 측정은 당업계에서 공지된 분석법 예를 들면, NMR 분석 및 TNBS assay(Habeeb, A.F.S.A., Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem., 1966. 14: 328-33 참조)을 통해 용이하게 시행할 수 있다.
이상의 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물로된 하이드로겔은 디비닐설폰(DVS)를 가교제로 사용한 HA-DVS 가교물 하이드로겔에 비하여 현저히 낮은 분해율을 나타내며, 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용한 HA-ADH 가교물 하이드로겔에 비하여 약 2배의 팽윤성을 나타내었다.
본 발명의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는 조직 보강을 위한 충전용 조성물은 바람직하게 상기 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 3 (w/w)%으로 포함하며, 바람직하게 1.8 내지 2.4 (w/w)%로 포함한다. 하이드로겔을 1 (w/w)% 미만으로 포함하는 경우, 제조되는 조성물이 원하는 정도의 생체내 지속성 및 돌출압력을 갖지 못하며, 3 (w/w)%를 초과하여 포함하는 경우, 조성물의 돌출압력이 지나치게 높아져 조직내 주입이 어려워 질 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 이외에 미변형(즉, 가교되지 않은) 히알루론산을 더 포함할 수 있다. 미변형 HA는 통상 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 제조시 사용한 동일한 히알루론산을 사용한다. 미변형 HA는 윤활제로 작용하여 조성물의 돌출압력을 낮춤으로써, 주사기에 충전하여 조직내 주입시 낮은 압력으로 조성물을 조직내 주입할 수 있다. 바람직하게 상기 미변형 히알루론산은 조성물 총 중량에 대하여 0.05 내지 1(w/w)%로 포함되며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.4 (w/w)%로 포함된다. 0.05 (w/w)% 미만으로 포함시 원하는 정도로 돌출 압력이 저하되지 않으며, 1 (w/w)%를 초과하여 포함되는 경우, 돌출압력이 지나치게 낮아져, 한번의 압력부하에도 조성물이 계속 조금씩 밀려나오는 현상을 나타나며, 멸균후 탄성계수가 지나치게 낮아지는 등, 물성이 열화될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 및 미변형 히알루론산으로 구성된 조성물에 리도카인과 같은 국소마취제를 더 포함하여, 마취효과와 더불어 멸균후 더 나은 물성을 나타낼 수 있다. 히알루론산-알킬렌디아민 가교물의 하이드로겔에 미변형 HA를 혼합하는 경우, 조성물의 돌출 압력은 낮아지나, 멸균후 조성물의 탄성계수(G')가 미혼합 하이드로겔보다 낮아진다. 그러나, 리도카인을 혼합하는 경우, 조성물의 돌출압력에는 아무 영향을 나타내지 않고, 다만 멸균후 탄성계수가 1.28배 이상 증가하였다. 즉 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물로 된 하이드로겔에 미변형 HA을 혼합함으로써 조성물의 돌출압력을 저하시키고, 리도카인을 혼합함으로써, 미변형 히알루론산에 의한 멸균후 탄성저하는 방지할 수 있다. 리도카인은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 0.4(w/w)%로 포함되며, 바람직하게 0.2 내지 0.3(w/w)% 로 포함된다. 0.1(w/w)%미만으로 사용되는 경우, 원하는 정도로 미변형 히알루론산에 의한 멸균후 탄성저하효과를 상쇄시키지 못하며, 0.4(w/w)%를 초과하여 사용하는 경우, 지나치게 조직을 마취시켜 불쾌감을 유발할 수 있다.
조성물의 나머지 잔부는 물, 생리식염수 등의 약학적으로 적합한 담체로 구성된다.
본 발명의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물의 하이드로겔을 사용한 조성물은 생체 적합성 및 팽윤성 등 조직증강에 필요한 물성이 우수하고 생체내에서 오래 지속될 수 있어 그 교환횟수를 줄일 수 있는 유리한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 미변형 히알루론산 및 국소마취체를 더 첨가한 조성물은 상기 효과이외에도 멸균후에도 탄성계수 저하 등 조직 증강에 필요한 물성이 열화되지 않아 쉽게 멸균하여 사용할 수 있으며, 돌출압력이 저하되어 용이하게 주사기에 충전되어 조직에 주입될 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 HA-HMDA 가교물의 합성과정 및 합성된 가교물 구조에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 멸균후 탄성계수(G')를 나타낸 것이다 (●: 실시예 8, ▲: 실시예 9, ■: 실시예 11).
도 3은 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 포함하는 멸균된 조성물과 대조품인 레스틸렌 리도카인 제품의 히알루로니다아제 효소에 의한 분해 효과를 탄성계수(G')와 연관지어 나타낸 것이다 (○: 실시예 11, ●: 대조품).
도 4는 시료 주입 11주 후에 관찰한 주름 유발 음성 대조군 마우스, 레스틸렌　 투여 양성 대조군 마우스 및 본 발명의 실시예 4, 5의 하이드로겔 투여군 마우스의 등쪽 표피 주름개선 정도를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 조직에 미치는 효과를 대조군과 비교하여 나타낸 것으로, 각 군 마우스의 등 부분의 조직 표본을 H&E를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이며, 표시된 막대기는 20 ㎛를 나타낸다 ((A): 정상군, (B): 주름 유발 음성 대조군, (C): 레스틸렌　 투여 양성 대조군, (D): 실시예 2의 HA-HMDA 하이드로겔 투여군, (E): 실시예 3의 HA-HMDA 하이드로겔 투여군, E: 표피, D: 진피, H: 피하).
도 6은 시료 주입 13주 후에 각 군 마우스의 리플리카를 뜬 이미지이다 (A: 정상군, B: 주름 유발 음성 대조군, C: 레스틸렌　 리도카인 투여 양성 대조군, D: 본 발명의 실시예 11 투여군).
도 7은 시료 주입 13주 후에 각 군 마우스의 리플리카를 뜬 이미지를 Visioline 장비를 이용하여 분석한 결과이다 (Normal C: 정상군, Negative C: 주름 유발 음성 대조군).
도 8은 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔 멸균된 조성물이 조직에 미치는 효과를 대조군과 비교하여 나타낸 것으로, 각 군 마우스의 등 부분의 조직 표본을 H&E를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이며, 표시된 막대기는 100 ㎛를 나타낸다 (A: 정상군, B: 주름 유발 음성 대조군, C: 레스틸렌　리도카인 투여 양성 대조군, D: 실시예 11 투여군, E: 표피, D: 진피, H: 피하).
실시예 1: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량 약 230 kDa의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Core)을 1 (w/w)%의 농도로 완전히 증류수에 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위의 72 몰%로 첨가하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.4배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA의 혼합액에 첨가하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 37℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 용액의 pH는 5.0-5.5이었다. 그 후, 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막 (7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 24시간 동안 투석하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 8-9% 이었다.
실시예 1-1:
분자량 약 230 kDa의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Core)을 1 (w/w)%의 농도로 완전히 증류수에 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위의 72 몰% 로 첨가하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.4배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA의 혼합액에 첨가하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 37℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 용액의 pH는 5.0-5.5이었다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 일차적으로 분쇄한 후, 일정 압력을 주어서 200 um pore size 체를 통과하여 균질한 하이드로겔을 얻었다. 80% 에탄올을 가하여 하이드로겔 분말을 침전으로 수득하고, 1.3% NaCl 용액을 100배 부피로 가하여 1 시간 동안 교반하였다. 다시 80% 에탄올을 가하여 침전을 얻고, 100% 에탄올에 10분간 넣고, 40℃, 12시간 감압건조 하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 8-9% 이었다.
실시예 1-2:
HMDA가 HA 반복단위의 25 몰%가 첨가된 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 HA-HMDA 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 6-7% 이었다.
실시예 2: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Co.)을 1 (w/w)%의 농도로 사용하고 용액의 pH는 5.5-5.9로 하는 것을 제외하고 실시예 1와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 11-13% 이었다.
실시예 3: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 1.5 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 25 몰%를 사용한 것을 제외하고 실시예 1와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 하이드로겔의 pH는 5.0-5.5이었다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 11-13% 이었다.
실시예 4: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 3 (w/w)%의 농도로 물에 완전히 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위 (repeating unit)의 20 몰%로 첨가하였다. 0.25 N NaOH 수용액을 첨가하여 pH를 6.0 - 6.5 로 조정하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.0배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA 수용액의 혼합액에 첨가하였다. 0.25 N NaOH 수용액을 첨가하여 pH를 6.0 - 6.5 로 조정하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 45℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 그 후, 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막 (7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 24시간 동안 투석하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 10-14% 이었다.
실시예 4-1:
분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 3 (w/w)%의 농도로 물에 완전히 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위 (repeating unit)의 20 몰%로 첨가하였다. 0.25 N NaOH 수용액을 첨가하여 pH를 6.0 - 6.5로 조정하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.0배의 양으로 증류수에 넣고 20분동안 교반한 후, 상기 HA와 HMDA 수용액의 혼합액에 첨가하였다. 45℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합용액을 교반없이 45℃에서 10시간 동안 방치시켜 HA-HMDA 가교물이 완전히 가교될 수 있도록 하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 일차적으로 분쇄한 후, 200 um pore size 체를 통과시켜 균질한 하이드로겔을 얻었다. 80% 에탄올을 가하여 하이드로겔 분말을 침전으로 수득하고, 1.3% NaCl 용액을 100배 부피로 가하여 1 시간 동안 교반하였다. 다시 80% 에탄올을 가하여 침전을 얻고, 수득된 하이드로겔 침전을 100% 에탄올에 10분간 넣은 후, 40℃, 12시간 감압건조 하여 잔류된 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. LC 분석결과, 검출한계인 2 ppm 이하로 컨트롤되고 있음을 확인하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 10-14% 이었다.
실시예 4-2 내지 4-4:
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 각각 증류수에 넣고 30분, 40분, 60분 동안 교반한 후 HA와 HMDA 혼합 수용액의 혼합액에 첨가하는 것을 제외하고 실시예 4-1과 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 4-5 내지 4-8:
혼합용액을 교반없이 45℃에서 3, 5, 7, 9시간 방치하는 것을 제외하고 실시예 4-1과 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 4-9 :
체를 통과시키는 대신에 호모게나이저(T-18 basic, IKA)로 8,000 rpm으로 5분간 하이드로겔을 균질화하는 것을 제외하고 실시예 4-1과 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 4-10 :
제조된 HA-HMDA 가교물을 투석막 (7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 PBS (pH 7.4)에 24시간 투석한 것을 제외하면 실시예 4-1과 동일한 방법으로 HA-HMDA 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 5: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산을 3 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 20 몰%를 사용한 것과 0.25 N NaOH 용액을 첨가하여 pH를 5.5-5.9로 맞춘 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 10-12% 이었다.
실시예 6: 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산을 3 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 10 몰%를 사용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 5-7% 이었다.
실시예 7: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산을 3 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 40 몰%를 사용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 32-35% 이었다.
실시예 8: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 조성물
실시예 4-1의 방법에 의하여 제조 및 건조 된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔 분말 20 mg을 PBS (pH 7.4) 1 ml에 용해한 후 5 시간 교반하여 본 발명의 하이드로겔을 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 9: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 조성물
실시예 4-1의 방법에 의하여 제조 및 건조 된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔 분말 18 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 2 mg을 가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합 및 용해한 후 5 시간 교반하여 본 발명의 하이드로겔 및 미변형 히알루론산 을 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 10: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 조성물
실시예 4-1의 방법에 의하여 제조 및 건조 된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔 분말 16 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 4 mg을 가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합 및 용해한 후 5 시간 교반하여 본 발명의 하이드로겔 및 미변형 히알루론산 을 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 11: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 조성물
실시예 4-1의 방법에 의하여 제조 및 건조 된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔 분말 18 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 2 mg 및 리도카인을 3 mg 첨가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합한 후, 5 시간 교반하여 본 발명의 하이드로겔, 미변형 히알루론산 및 리도카인을 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 12: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 조성물
실시예 4-1의 방법에 의하여 제조 및 건조 된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔 분말 16 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 4 mg 및 리도카인을 3 mg 첨가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합한 후, 5 시간 교반하여, 본 발명의 하이드로겔, 미변형 히알루론산 및 리도카인을 함유하는 조성물을 얻었다.
비교예 1: 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용한 히알루론산-아디프산 디하이드라자이드(HA-ADH) 가교물 하이드로겔의 제조
Hahn 등(Hahn SK et al., Int. J. Biol. Macromol., 2007;40;374-380)의 방법에 따라 분자량 약 234 kD의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Co.) 100 mg을 물 20 ml에 녹여 5 mg/ml의 HA 수용액을 제조했다. 상기 HA 수용액에 HA 대비 몰비로 40배 과량의 아디프산 디하이드라자이드(ADH) 분말(1.736 g)을 혼합하고 10분간 완전히 녹였다. 얻어진 HA/ADH 혼합 수용액의 pH를 1 N 염산 수용액을 이용하여 4.8로 맞춘 후, 30분간 완전히 교반시켰다. 여기에 HA의 카르복실기를 활성화시키기 위해 교반을 잘 해주면서 몰비로 4배 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 0.191 g) 분말을 첨가하였다. 상기의 수용액에 1 N HCl 수용액을 첨가하여 pH를 4.8로 유지하면서 두 시간 동안 반응시켰다. 두 시간 후에, 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 7.0으로 끌어올려 반응을 정지시켰다. 수득된 생성물의 점성과 불순물(결합되지 않은 ADH)을 줄이기 위해 미리 씻어놓은 투석튜브 (7 kDa의 분자량 컷-오프)에 넣어 100 mM NaCl 수용액에 60시간 투석시켰다. 이 후 25% 에탄올과 증류수에 각각 투석을 반복하였다. 투석이 완료된 수용액을 3일 동안 동결건조하여 HA-ADH 유도체를 얻었다. 상기의 방법으로 얻은 HA-ADH를 0.01 M PBS(pH 7.4)에 2시간 동안 녹였다. 하이드라자이드에 특이적 가교제인 비스[설포숙신이미딜]수베레이트(BS3)를 역시 PBS에 녹인 후 HA-ADH 용액에 첨가하였다. 이때 BS3의 첨가량은 HA-ADH의 하이드라자이드의 20 몰%에 해당하는 양이었다. 상기의 수용액을 완전히 섞어준 후 가교반응을 완전히 하기 위해 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 HA-ADH 가교물 하이드로겔을 제조하였다.
비교예 2: 디비닐설폰(DVS)을 가교제로 사용한 히알루론산-디비닐설폰(HA-DVS) 가교물 하이드로겔의 제조
Oh 등(Oh EJ et al., J. Biomed. Mater. Res A., 2008;86;685-693)의 방법에 따라 분자량 약 230 kDa의 히알루론산(HA, 제조사:Lifecore Co.) 68mg을 0.2 N의 수산화나트륨 (NaOH) 수용액 (=pH 13) 1.68 ml에 녹였다. 완전히 녹인 후, HA의 하이드록실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 디비닐설폰(DVS)을 첨가하였다. 이때, 히알루론산의 하이드록실기와 첨가된 DVS의 몰비율은 1:1로 하였다. 상기 용액을 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 HA-DVS 하이드로겔을 제조하였다. 이후 제조된 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막 (7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하고 PBS에 24시간 동안 투석하여, 이온들 (Na+과 OH-)을 투석막을 통해 확산 방출시키고 밀봉되어 있는 HA-DVS 가교물의 pH를 중성화시켰다.
비교예 3: 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산을 3 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 5 몰%를 사용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 2-4 % 이었으며, 점탄성이 너무 낮아 조직충전제로 사용하기 어려웠다.
비교예 4: 히알루론산-헥사메틸렌디아민 히알루론산 (HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량이 약 1,000 kDa의 히알루론산을 3.3 (w/w)%의 농도로 사용하고, HMDA의 첨가량을 HA의 반복단위의 50 몰%를 사용한 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 HA-HMDA 가교물을 제조하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 40-45% 이었으며, 너무 건조한 가교물 생성으로 잘 부서져 조직 충전제로 사용하기 어려웠다.
실험예 1: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체외 분해 및 팽윤성 확인시험
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체내 지속성을 예측하기 위하여, 실시예 1과 비교예 1 및 2의 히알루론산 가교물 하이드로겔에 대해 히알루론산 분해효소에 의한 분해시험을 수행하였다.
실시예 1과 비교예 1 및 2의 히알루론산 가교물 하이드로겔들을 각 바이얼에 동일한 질량으로 담았다. 히알루론산 분해효소(hyaluronidase from Streptomyces hyalurolyticus, Sigma-Aldrich) 50 U을 포함한 0.2 M PBS (=pH 6.2)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 미리 정해 놓은 48시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 완전히 제거하고 잔류하는 히알루론산 가교물들의 질량을 측정하였다. 가교물의 분해정도는 잔류하는 가교물과 본래의 가교물의 질량비율 (%)로 산출하고, 시간 경과에 따른 분해율(degradation, %)을 표 1에 나타내었다. 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 2의 HA-DVS 가교물은 약 25시간 내에 완전히 분해되는 반면, 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 40시간이 지나도 부분적인 분해만이 이루어졌다. 이로부터, 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 시판 하이드로겔을 능가하는 우수한 생체 지속성을 가짐을 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 비슷한 분해율을 나타내는 비교예 1의 HA-ADH 가교물에 비하여, 2배 이상의 높은 팽창율을 나타냄을 확인할 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 생체 지속성 및 팽윤성을 동시에 나타내는 우수한 조직 증강용 충전제임을 확인할 수 있다.
표 1
Figure PCTKR2011005072-appb-T000001
실험예 2: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체외 분해 확인시험
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체내 지속성을 예측하기 위하여, 실시예 1부터 실시예 7까지의 히알루론산 가교물 하이드로겔에 대해 히알루론산 분해효소에 의한 분해시험을 수행하였다.
Ibrahima et al (Polymer Degradation and Stability 2007;92:915-919) 의 방법에 따라 생체외 분해 실험을 실시하였다. 실시예 1부터 실시예 7까지의 히알루론산 가교물 하이드로겔들을 각 바이얼에 동일한 질량으로 담았다. 히알루론산 분해효소(hyaluronidase from Streptomyces hyalurolyticus , Sigma-Aldrich) 6080 U을 포함한 0.2 M PBS (=pH 7.4)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 효소 반응을 멈추기 위하여, 0.8 M potassium borate pH 9.1을 첨가후 100℃에서 3분간 가열하였다. 분해되어 나온 N-아세틸글루코사민(NAG)의 양을 측정하기 위하여 Ehrlich's 시약을 Reissig et al (J. Biol.Chem;1955;217:959-996)의 방법에 따라 제조하였다. 이 시약을 상기 바이얼에 첨가 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 원심분리하여 상등액을 취하여 분해되어 나온 가교물들 중 NAG의 양을 UV로 흡광도 585 nm에서 측정하였다. 가교물의 분해정도는 실시예 6의 분해율을 100%로 정하고, 나머지 실시예의 분해율을 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2011005072-appb-T000002
표 2에서 보는 바와 같이, HA의 분자량, 초기농도 및 pH에 따라 가교율이 영향을 받음을 알 수 있었다. HA의 초기 농도가 높을수록 가교율이 높은 가교물이 만들어졌으며, 첨가된 가교제의 양이 많아도 pH에 따라 가교율이 비슷하거나 낮은 경우도 관찰되었다. 또한 가교율이 높을수록 분해율이 낮음을 확인할 수 있었다. 이것을 토대로, 원하는 물성의 하이드로겔을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 농도에 따른 분해율, 돌출압력 및 탄성계수 확인시험
본 실험예는 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 최적의 하이드로겔 제조 농도를 확인하기 위하여 수행되었다. 실시예 4-1의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 각각 1%, 1.5%, 2%, 2.4%의 농도로 PBS (pH 7.4) 에 용해한 후 5 시간 교반하고 이들을 주사기에 충진하고, 121℃, 1.5 atm, 20 분간 멸균한 후, 이 멸균 조성물에 대하여, 히알루론산 분해효소에 대한 분해율, 돌출압력 및 탄성계수(G')를 측정하였다.
표 3
Figure PCTKR2011005072-appb-T000003
표 3에서 보는 바와 같이, 히알루론산 가교물 하이드로겔의 농도가 증가함에 따라 멸균 후 돌출압력도 증가함을 알 수 있다. 하이드로겔 농도가 2.0 및 2.4 %인 경우, 탄성계수(G')은 장비의 10% 편차를 고려할 때 거의 동일하며, 분해율 역시 동등하였다. 하이드로겔 농도가 2.4 %인 경우, 제조된 후 멸균된 하이드로겔의 돌출압력이 2.0% 보다 1.3배 정도 높다. 따라서 하이드로겔의 적정 농도는 2.0%으로 선택될 수 있으며, 이를 토대로 원하는 조성물의 조합을 만들 수 있었다.
실험예 4: 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 멸균후 돌출압력 및 평균입자크기
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 주사기 및 사용 주사바늘에 따른 돌출압력(extrusion force)을 예측하기 위하여, 본 실험을 수행하였다.
실시예 4-9의 하이드로겔 분말 18 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 2 mg을 가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합 및 용해한 후 5 시간 교반한 조성물 및 실시예 8 내지 12의 교반된 조성물을 3 ml 유리 주사기에 동일한 질량으로 충진 후 습식 멸균(121℃, 1.5 atm, 20 분)하고, 멸균된 각 조성물에 대해 평균입자크기 및 돌출압력을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
평균입자크기 및 분포 측정은 Malvern Mastersizer 2000 (Malvern Instruments LTD, Worcestershire, UK) 장비를 이용하였으며, 분산용매로 0.9% NaCl 용액을 사용하여 측정하였다. 돌출압력은 27 게이지 및 30 게이지 바늘을 장착하고 EZ-S SHIMADZU 장비를 이용하여 1 mm/min 의 일정한 속력으로 6 mm까지 측정하였다.
표 4
Figure PCTKR2011005072-appb-T000004
표 4에서 보는 바와 같이, 미변형 HA의 조성비율에 따라 돌출압력이 영향을 받았다. 즉, 조성물내 미변형 HA의 함량이 높아질 수록, 미변형 HA가 윤활제로 작용하여, 돌출압력이 감소됨이 확인되었다. 사용한 바늘의 게이지에 따라서 3 ml 주사기의 경우, 30 게이지와 27 게이지의 차이는 대략 1.6배의 차이가 있었다. 한편, 리도카인의 첨가는 돌출압력에 거의 영향을 미치지 않았다. 조성물내 미변형 HA의 함량이 높은 실시예 10 및 12의 경우는 돌출압력이 너무 낮아져, 일정한 힘을 가한 후 정지한 경우에도 조성물이 계속 흘러나오는 현상이 관찰되었다. 또한 체를 거치지 않고 균질기로 균질화한 실시예 4-9 조성물의 경우는 체로 균질화한 경우에 비해 돌출압력이 높았다. 균질기로 균질화하는 경우, 입자 분포가 넓은 하이드로겔이 수득되고, 이러한 불규칙한 크기의 하이드로겔 입자로 인해 돌출압력이 높아지는 것으로 사료되었다.
실험예 5: 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 멸균후 탄성계수
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 멸균후 물성변화를 관찰하기 위하여, 본 시험을 수행하였다.
실시예 4-9의 하이드로겔 분말 18 mg에 분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA) 2 mg을 가하고 이를 PBS (pH 7.4) 1 ml에 혼합 및 용해한 후 5 시간 교반한 조성물 및 실시예 8 내지 12의 교반된 조성물을 3 ml 유리 주사기에 동일한 질량으로 충진 후 습식 멸균(121℃, 1.5 atm, 20 분)하고, 멸균된 각 조성물에 대해 Ghosh et al (Biomacromolecules 2005;6:2857-2865)의 방법을 이용하여 유변물성 실험을 실시하였다. AR 2000 controlled stress rheometer (T.A Instruments Ltd., USA) 장비와 4-cm, 2°-cone and plate 기하학을 이용하여 1% strain 및 oscillation mode로 0.1-20 Hz까지 측정 했으며, 3 Hz에서 측정된 탄성계수(G')값을 하기 표 5에 나타내었다. 장비의 편차는 ±10% 이며, 25℃에서 실험은 진행되었다.
표 5
Figure PCTKR2011005072-appb-T000005
표 5에서 보는 바와 같이, 미변형 HA의 조성비율에 따라 탄성계수가 영향을 받음을 알 수 있었다. 윤활제 역할을 하는 미변형 HA의 농도가 높을수록 멸균후 탄성계수가 낮은 조성물이 만들어졌으며, 리도카인이 추가적으로 첨가된 경우, 단순히 HA만 첨가된 경우에 비해, 멸균된 조성물의 탄성계수가 25.6% 정도 증가하는 것이 확인되었다. 한편, 균질기로 균질화한 경우(실시예 4-9), 체로 균질화한 경우에 비해 탄성계수가 다소(4.9%) 감소하였다. 도 2에 실시예 8, 실시예 9, 실시예 11의 멸균된 조성물의 0.1-20 Hz의 탄성계수를 나타내었다.
실험예 6: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조방법에 따른 물성 확인시험 (탄성계수 : G')
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조방법에 따른 물성 (탄성계수: G')을 확인하기 위하여, 실시예 4-1 내지 4-4의 조성물에 대해 멸균후 탄성계수를 측정하였다. 실시예 4-1 내지 4-4의 하이드로겔은 각각 반응보조제인 EDC/HOBt의 교반시간을 20, 30, 40, 60 분으로 달리한 것이다.
제조된 각 하이드로겔 분말을 PBS (pH 7.4)에 20 mg/ml의 농도로 첨가하고, 5시간 교반한 후, 3 ml 유리 주사기에 담아서 습식멸균 (121℃, 1.5 atm, 20 분) 하였다. AR 2000 controlled stress rheometer (T.A Instruments Ltd., USA) 장비와 4-cm, 2°-cone and plate 기하학을 이용하여 1% strain 및 oscillation mode로 0.1-20 Hz까지 측정 했으며, 3 Hz에서 측정한 탄성 계수(G') 값을 하기 표 6에 나타내었다. 장비의 편차는 ±10% 이며, 25℃에서 실험은 진행되었다.
표 6
Figure PCTKR2011005072-appb-T000006
표 6에서 보는 바와 같이, 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조는 EDC/EDU 수용액에 용해후 반응투입 시간까지의 시간에 영향을 받음을 알 수 있었다. 20-30분 내에 용해에서 투입까지 완료되어 제조된 히알루론산 가교물 하이드로겔은 멸균후 탄성계수가 비슷하다. 반면, 40분 이상 용해에서 투입까지는 제조된 하이드로겔은 멸균후 물성이 저하되었으며, 60분 이상에서는 멸균후 탄성계수가 거의 물과 같은 낮은 수준의 하이드로겔이 제조되었다. 이러한 결과로부터, 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 제조시 EDC/HOBt의 용해에서 투입까지의 시간이 매우 중요한 요소임을 알 수 있다.
실험예 7: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조방법에 따른 물성 확인시험 (탄성계수 : G')
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조방법에 따른 물성변화 (탄성계수: G')를 확인하기 위하여, 실시예 4-1, 4-5 내지 4-8의 조성물에 대해 멸균후 탄성계수를 측정하였다. 실시예 4-1, 4-5 내지 4-8의 하이드로겔은 히알루론산 가교물의 완전한 가교반응을 위한 추가 방치시간을 3, 5, 7, 9, 12 시간으로 달리하여 제조한 것이다.
제조된 각 하이드로겔 분말을 PBS (pH 7.4)에 20 mg/ml의 농도로 첨가하고, 5시간 교반한 후, 3 ml 유리 주사기에 담아서 습식멸균 (121℃, 1.5 atm, 20 분) 하였다. AR 2000 controlled stress rheometer (T.A Instruments Ltd., USA) 장비와 4-cm, 2°-cone and plate 기하학을 이용하여 1% strain 및 oscillation mode로 0.1-20 Hz까지 측정 했으며, 3 Hz에서 측정한 탄성 계수(G') 값을 하기 표 7에 나타내었다. 장비의 편차는 ±10% 이며, 25℃에서 실험은 진행되었다.
표 7
Figure PCTKR2011005072-appb-T000007
표 7에서 보는 바와 같이, 방치시간이 증가할 수록 멸균후 조성물의 탄성계수가 증가되었으며, 9시간 이상의 경우 거의 동일한 탄성계수를 나타냄을 알 수 있다. 이로부터, 상기 온도에서 9시간 이상 방치시키는 경우, 완전하고 충분하게 가교 반응이 진행되어 멸균후에도 양호한 탄성계수를 갖는 하이드로겔이 제조되는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터, 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 제조시 완전한 가교 반응을 위해서 일정 시간 이상 방치하는 것이 중요함을 알 수 있다.
실험예 8: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 정제 방법에 따른 미반응물 제거
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조방법에 따른 미반응물 제거 차이을 확인하기 위하여, 실시예 4-1 및 4-10에서 제조된 히알루론산 가교물 하이드로겔에 대해, 잔여 미반응물을 액체크로마토그라피를 이용하여 확인하였다. 시료를 히알루론산 분해효소(Hase)를 처리하여 분해하고, HMDA의 미반응물은 C18-칼럼, 이동상은 ACN/0.1% TFA, UV 검출기를 이용하여 정량하였다. EDC 및 HOBt 미반응물들은 GPC 칼럼, 이동상은 20 mM sodium phosphate (pH 7.6), UV 검출기를 사용하여 분석하였다. HMDA와 EDC의 경우 투석막을 이용하여 미반응물을 제거하여 수득한 실시예 4-10의 하이드로겔이나 에탄올 및 버퍼를 이용하여 제거한 실시예 4-1의 하이드로겔 모두에서 검출한계인 2 ppm 이하로 컨트롤 되고 있음이 확인되었다. 그러나 HOBt의 경우는 실시예 4-1의 하이드로겔에서는 검출한계인 2 ppm 이하이었으나, 투석막을 이용하여 미반응물을 제거하여 수득한 실시예 4-10의 경우, 약 10배나 많은 HOBt가 검출되었다. 이는 HOBt가 유기용매에 더 잘 녹는 경향이 있어 투석에 의해서는 정제가 잘 되지 않기 때문으로 사료된다.
실험예 9: 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔 조성물의 생체외 분해정도와 물성(G')에 따른 지속 효과 확인
본 발명의 히알루산 가교물 하이드로겔 멸균된 조성물의 히알루론산 분해효소에 대한 민감성을 G'값과 연관지어, 시판되고 있는 조직 증강용 충전제인 레스틸렌 리도카인과 비교하여 평가하였다. 시간에 따른 분해 정도를 G'값과 연관지어 관찰하기 위하여 본 발명의 실시예 11의 멸균된 조성물 및 레스틸렌 리도카인을 1.5 ml 시험관에 800㎕씩 분주하였다. 히알루론산 분해효소(Hase, Bovine Testes, Sigma-Aldrich)를 2 mg/ml로 PBS (pH 7.4)에 용해한 후 (2000 U), 15 ㎕씩을 각 시험관에 분주하여 37℃에서 시간대 별로 반응시킨 다음, 3 Hz에서 탄성계수(G')를 측정하여 그 변화를 도 3에 나타내었다. 레스틸렌 리도카인은 3 Hz에서 620 Pa의 초기 탄성계수를 나타내며, 실시예 11의 멸균된 조성물은 3 Hz에서 410 Pa의 초기 탄성계수를 나타내었으며, 25 시간에 걸쳐 탄성계수의 변화를 확인하였다. 도 3에 보이는 바와 같이 레스틸렌 리도카인의 경우는 초기 탄성계수(G')는 높지만 3시간 까지 매우 급격하게 히알루론산 분해효소에 의해 분해되어 매우 낮은 탄성계수을 나타내었고, 반면, 본 발명 실시예 11의 멸균된 조성물은 25 시간 까지도 분해에 대한 안정성을 보였다. 또한, 가교된 히알루론산(HA)의 분해는 초기 탄성계수 G'와 무관함이 확인되었다.
실험예 10: 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔의 조직증강(주름개선) 효과 및 생체 적합성 확인
본 발명의 히알루산 가교물 하이드로겔의 조직증강효과 및 생체적합성을 시판 주름개선용 조직증강용 충전제인 Restylane®과 비교하여 평가하였다.
조직증강(주름개선)효과:
Fujimura 등(Fujimura T et al., J. Dermatol. Sci., 2000;24;105-111)의 방법에 따라 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse type SKH; Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea)를 동일 면적의 등판에 주름 유발된 표면적을 측정하기 위해 무모 마우스 등의 사각형 (1.5 ~ 1.5 cm2)의 문신을 하고, 0.2 ㎍의 칼시트리올(calcitriol in ethanol)을 1일에 1회씩 주 6회로 4주 동안 도포하여, 인위적으로 주름을 유발시켰다. 주름 유발제 도포를 중단하고 3일 후 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔과 대조군으로서 시판품 Restylane®을 상기 주름이 유발된 사각형 문신 내에 피하 투여하였다. 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔은 본 발명의 실시예 2, 3, 4 및 5의 히알루론산 가교물 하이드로겔들을 각각 균질기 (T-18 basic, IKA, Tokyo, Japan)로 8,000 rpm에서 5분 동안 균질화 (homogenization)하여 준비하고, 0.4 ml를 각각 주름 유발 마우스의 등쪽 피하층의 문신된 사각형 안에 30 게이지 주사기 바늘을 통해 주입하였다. 양성 대조군으로서 Restylane®(제조사: Q-Med AB; 20 mg/ml) 0.4 ml를 30-게이지 주사바늘을 이용하여 주입 하였다. 주름개선 정도는 동일한 거리와 조명 아래서 사진촬영을 한 뒤 이미지 분석기(Image Analyzer, Artimage2 software)를 이용하여 주름개선의 면적을 계산하여 평균한 후 분석하였다.
대조군 및 시험군으로서 각각 3마리씩을 사용하였으며, 각각의 주름개선 면적을 계산하여 평균하였다. 주름개선 정도는 11주 동안 1주에 1번 이미지 분석기를 이용하여 쥐의 등의 문신된 사각형의 표면적을 측정하여 평가하였다.
시간 경과에 따른 주름개선면적을 하기 표 8에 나타내었다. 표 8에 보인 바와 같이, 양성 대조군으로 주름유발후 Restylane®을 처리한 군과 본 발명의 실시예 2의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔 및 실시예 3의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 처리한 군의 마우스들은 주름 유발후 아무것도 처리하지 않은 주름 유발 음성 대조군 마우스에 비해 주름개선 효과가 현저한 것으로 나타났다.
표 8
Figure PCTKR2011005072-appb-T000008
4주까지는 Restylane®과 실시예 2 및 3의 HA-HMDA 하이드로겔 처치군들은 모두 비슷한 주름개선 효과를 보였으나, 4주 이후에는 시간이 경과함에 따라 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 투여한 군에서 양성 대조군인 Restylane®을 투여한 군 보다 더 높은 주름개선 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 실시예 4 및 실시예 5의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔도 실시예 2 및 실시예 3의 하이드로겔과 동등한 정도의 주름개선 효과를 나타내었다. 도 4는 11주 후 음성 대조군인 주름 유발군 무모 마우스, 양성대조군인 주름 유발후 Restylane®을 처리한 무모 마우스, 및 주름 유발후 실시예 4와 5의 HA-HMDA 하이드로겔을 처리 한 무모 마우스의 등쪽 표피의 상태를 나타낸 사진이다. 상기 표 8 및 도 4를 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 HA-HMDA 하이드로겔을 포함하는 조성물은 Restylane®보다 더 우수한 주름개선효과를 나타내었다.
생체적합성:
조직학적 검사는 히알루론산 가교물 하이드로겔 투여 12주 후에 헤마토자일린-이오신(H&E) 염색 사용하여 시행하였다. 각 마우스로부터 피부 샘플을 취한 후 10 부피% 완충 포름알데히드에 고정시키고, 에탄올로 탈수한 후, 파라핀에 보관하여 표본을 만들고, 이들을 4 μm 부분으로 얇게 자르고 H&E로 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경을 이용하여 촬영한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 하이드로겔을 투여한 마우스는 주름을 유발시키지 않은 대조군 마우스들과 동일하게 아무런 염증반응을 나타내지 않았다 (H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조 염색으로서 붉게 염색이 된다).
한편, 주름유발 음성 대조군 (5B)은 정상군(5A)과 비교해 볼 때, 주름유발에 따른 피부 손상으로 인해 표피 (E)가 평평해지고, 진피 (D)가 굵고 거칠게 된 것을 확인할 수 있다.
반면, 본 발명의 실시예 2 및 3의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔(도 5D 및 도 5E)을 처치한 경우, 표피, 진피 그리고 피하에서 뚜렷한 개선 효과가 관찰되었는 바, 표피는 정상군 마우스의 표피와 유사하게 변화되었다. 진피의 경우 주름 유발 음성 대조군 및 Restylane® 투여 양성 대조군은 일부 염증 반응을 나타내었으나, 본 발명 하이드로겔 투여군은 정상군 마우스와 같이 어떠한 용혈이나 염증 반응이 관찰되지 않았으며, 진피 조직이 재생되었고, 재생된 진피의 두께는 Restylane®을 투여한 양성 대조군 및 주름비유발 대조군과 동등하였다. 이상과 같은 진피 두께의 증강은 조직증강에 효과적으로 기여한다. 피하조직에 있어서도, 주름유발 음성 대조군, Restylane®을 투여한 양성대조군을 주입한 시험군은 그 피하조직의 내강이 두드러지게 팽창된 반면, 실시예 3의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 주입하여 재생된 피하조직의 내강은 주름을 유발시키지 않은 대조군 피하조직의 내강과 거의 동일한 형태로 재생되었다.
실험예 10-1:
본 발명의 히알루산 가교물 하이드로겔 조성물의 조직증강효과 및 생체적합성을 시판 주름개선용 조직증강용 충전제인 Restylane® Lidocaine과 비교하여 평가하였다.
조직증강(주름개선)효과:
Fujimura 등(Fujimura T et al., J. Dermatol. Sci., 2000;24;105-111)의 방법에 따라 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse type SKH; Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea)를 동일 면적의 등판에 주름 유발된 표면적을 측정하기 위해 무모 마우스 등의 사각형 (1.5 ~ 1.5 cm2)의 문신을 하고, 0.2 ㎍의 칼시트리올(calcitriol in ethanol)을 1일에 1회씩 주 6회로 4주 동안 도포하여, 인위적으로 주름을 유발시켰다. 주름 유발제 도포를 중단하고 3일 후 본 발명의 실시예 11의히알루론산 가교물 하이드로겔 조성물 0.4 ml을 주름이 유발된 마우스의 등쪽 피하층의 문신된 사각형 안에 3 ml 주사기와 27 게이지 바늘을 통해 주입하였다. 양성 대조군으로서 Restylane®　Lidocaine (제조사: Q-Med AB; 20 mg/ml) 0.4 ml를 27-게이지 주사바늘을 이용하여 주입하였다.
정상군, 음성/양성 대조군 및 시험군으로서 각각 7마리씩을 사용하였으며, 13주 동안 관찰 후 실리콘으로 된 물질 (Silflo, Flexico Development Ltd., UK)을 이용하여 주름에 의해 생성된 등쪽 피부 부분의 리플리카를 만들고, 이미지 분석기 (Visioline SV650, CK Electronics, Germany)를 사용하여 각각의 주름개선 면적을 측정 및 계산하여 평균을 산출하였다. 마우스의 등쪽 문신된 정사각형 부분의 리플리카의 이미지를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 11의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔의 멸균된 조성물을 처리한 마우스는 주름 유발후 아무것도 처리하지 않은 마우스(B)에 비해 주름개선 효과가 현저한 것으로 나타났다. 이러한 우수한 조직증강(주름개선)효과는 본 발명 HA-HMDA 가교물 하이드로겔 멸균된 조성물의 우수한 팽윤성 및 우수한 진피 및 피하 재생효과에 기인하는 것으로 사료된다. 또한 상기의 리플리카를 Visioline을 이용하여 주름 정도를 측정하여 분석 및 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 6 및 도 7을 통해 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 HA-HMDA 하이드로겔 멸균된 조성물 처리한 무모 마우스는 거의 정상군과 동일한 정도로 현저하게 등쪽 표피의 주름을 개선하며, 레스틸렌 리도카인보다 더 우수한 주름 개선효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
생체적합성:
조직학적 검사는 히알루론산 가교물 하이드로겔 투여 14주 후에 헤마토자일린-이오신(H&E) 염색 사용하여 시행하였다. 각 마우스로부터 피부 샘플을 취한 후 10 부피% 완충 포름알데히드에 고정시키고, 에탄올로 탈수한 후, 파라핀에 보관하여 표본을 만들고, 이들을 4 μm 부분으로 얇게 자르고 H&E로 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경을 이용하여 촬영한 결과를 도 8에 나타내었다. 본 발명의 실시예 11의 멸균된 하이드로겔 조성물을 투여한 마우스는 정상군 마우스들과 동일하게 아무런 염증반응을 나타내지 않았다 (H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조 염색으로서 붉게 염색이 된다).
한편, 주름유발 음성 대조군 (B)은 정상군(A)과 비교해 볼 때, 주름유발에 따른 피부 손상으로 인해 표피 (E)가 평평해지고, 진피 (D)가 굵고 거칠게 된 것을 확인할 수 있다. 반면, 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔의 멸균된 조성물을 처치한 경우(D), 표피, 진피 그리고 피하에서 뚜렷한 개선 효과가 관찰되었는 바, 표피는 정상군의 표피와 유사하게 변화되었다. 진피의 경우 주름 유발 음성 대조군 및 레스틸렌　리도카인 투여 양성 대조군은 일부 염증 반응을 나타내었으나, 본 발명 하이드로겔 투여군은 주름을 정상군과 같이 어떠한 용혈이나 염증 반응이 관찰되지 않았으며, 진피 조직이 재생되었고, 재생된 진피의 두께는 레스틸렌 리도카인을 투여한 양성 대조군 및 정상군과 동등하였다. 이상과 같은 진피 두께의 증강은 조직증강에 효과적으로 기여한다. 피하조직에 있어서도, 주름유발 음성 대조군, 레스틸렌 리도카인을 투여한 양성대조군을 주입한 시험군은 그 피하조직의 내강이 두드러지게 팽창된 반면, 실시예 11의 멸균된 조성물을 주입하여 재생된 피하조직의 내강은 정상군의 피하조직 내강과 거의 동일한 형태로 재생되었다.
이상의 결과로부터 본 발명의 히알루론산-알킬렌 디아민 가교물 하이드로겔 및 멸균된 하이드로겔은 매우 뛰어난 생체적합성을 나타냄을 알 수 있고, 적절한 팽윤성 및 진피 및 피하조직의 재생으로 인해 뛰어난 조직증강(주름개선효과)를 나타냄을 알 수 있으며, 시판 조직증강용 충전제에 비하여 훨씬 오랫동안 생체내 지속되므로, 효과적으로 조직증강용 충전제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (21)

  1. 하기 식 1의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물의 하이드로겔을 포함하는 조직 증강용 충전 조성물;
    [식 1]
    [HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
    (식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 10,000 ~ 4,000,000의 정수이다).
  2. 제1항에 있어서, 미변형 히알루론산을 더 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 리도카인을 더 포함하는 조성물.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량이 20,000 달톤 내지 4,000,000 달톤인 조성물.
  5. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬렌디아민이 헥사메틸렌디아민인 조성물.
  6. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물은 pH 5.5 내지 6.5에서, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 제조한 것인 조성물.
  7. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교물 하이드로겔의 가교율이 5 ~ 35 %인 조성물.
  8. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 3 (w/w)%로 포함되는 조성물.
  9. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 주름을 제거 또는 개선시키기 위한 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 볼, 입술, 가슴 및 엉덩이로부터 선택되는 신체부위의 부피를 확대시키기 위한 것인 조성물.
  11. (1) 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조하는 단계;
    (2) 제조된 하이드로겔을 균질화하는 단계; 및
    (3) 미반응물을 제거하는 단계를 포함하는 제1항의 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 30분 이내에, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제를 물에 용해시키고 히알루론산과 알킬렌 디아민 화합물 혼합물에 첨가하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제1단계에서 30℃ 내지 50℃에서 9시간 이상 교반없이 방치하여 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, pH 5.5 내지 6.5에서 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조하는 것인 방법.
  15. 하기 식 1의 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는 조직증강용 충전제;
    [식 1]
    [HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
    (식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 10,000 ~ 4,000,000의 정수이다).
  16. 제 15항에 있어서, 상기 히알루론산 및 알킬렌디아민 가교물은 히알루론산을 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 제조한 것인 조직증강용 충전제.
  17. 제15항에 있어서, 상기 알킬렌디아민이 헥사메틸렌디아민인 조직증강용 충전제.
  18. 제15항에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량이 10,000 달톤 내지 4,000,000 달톤인 조직증강용 충전제.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교물의 가교율이 5 ~ 35 %인 조직증강용 충전제.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 피부의 주름을 제거 또는 개선시키기 위한 것인 조직증강용 충전제.
  21. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 볼, 입술, 가슴 및 엉덩이로부터 선택되는 신체부위의 부피를 확대시키기 위한 것인 조직증강용 충전제.
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