WO2024029993A1 - 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치 - Google Patents

상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치 Download PDF

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WO2024029993A1
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amino acid
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wound healing
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최강열
이성훈
강민정
조승우
안수환
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주식회사 씨케이리제온
연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic hydrogel patch that can promote wound healing and minimize scarring, and a cosmetic pack containing the same.
  • the skin performs various functions in our body, and the most important function among them is that it acts as a barrier that protects our body from the outside.
  • a state in which the normal structure of the skin, which acts as a barrier, is destroyed is called a wound or wound.
  • Wound healing clinically means complete suturing of the skin, and normal wounds, not chronic wounds, are completely healed in approximately 3-14 days. Wound healing is a complex process in which various types of cells such as keratinocytes, fibroblasts, endothelial cells, macrophages, and platelets interact and regulate.
  • the wound treatments mainly used in Korea include Dongkuk Pharmaceutical's 'Combined Madecassol' (launched in 1985) and Dongwha Pharmaceutical's 'Fucidin' (launched in 1980).
  • the efficacy of the two agents is generally similar, but Fucidin has an antibacterial effect and Madecassol has a slightly stronger strength in scar relief.
  • steroid ointments are effective for anti-inflammatory, immunosuppressive, and allergic diseases, but they cause side effects such as pimples, skin wrinkles, and folliculitis, and are not effective for bacterial diseases such as athlete's foot. Additionally, ointments containing antibiotics can develop resistance and cause various side effects when used on delicate skin wounds such as those on children.
  • the present inventors used a hyaluronic acid derivative modified with pyrogallol to create a hydrogel that not only has excellent drug delivery efficiency and user convenience, but is also advantageous for clinical applications because it does not require oxidizing agents, such as wound healing or A patch containing a drug with excellent efficacy in alleviating scars was produced.
  • the purpose of the present invention is to provide a therapeutic hydrogel patch that can promote wound healing and minimize scarring.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic mask pack that can promote wound healing and minimize scars.
  • the hydrogel patch for promoting wound healing or minimizing scars of the present invention to achieve the above object is made of a biocompatible polymer modified with drug-loaded pyrogallol,
  • the drug is a single drug consisting of a polypeptide fused with a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoding PTD (protein transduction domain), or a mixture of the fused polypeptide and valproic acid. It may be a mixed drug.
  • the mixed drug is a polypeptide fused with a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoding PTD (protein transduction domain), and valproic acid are mixed at a molar ratio of 1:100-1000. You can.
  • the single drug or mixed drug may be contained at a concentration of 0.3 to 10 mg/ml.
  • the hydrogel patch increases the content of collagen III in the wound area, so that the ratio of collagen III/collagen I may be 2 to 70.
  • the hydrogel patch can increase CD105, a dermal stem cell marker, and CD31, a marker of angiogenesis, at the wound site.
  • the biocompatible polymer may be selected from the group consisting of hyaluronic acid, heparin, cellulose, dextran, alginate, chitosan, chitin, collagen, gelatin, chondroitin sulfate, and pectin.
  • the biocompatible polymer may be hyaluronic acid.
  • the PTD protein transduction domain
  • the PTD may include poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp, or Transportan.
  • the polypeptide may additionally have a linker inserted between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence encoding the PTD.
  • the hydrogel patch may be a medical device patch.
  • the cosmetic mask pack for promoting wound healing or minimizing scars of the present invention for achieving the other purposes described above includes a hydrogel patch made of a biocompatible polymer modified with drug-loaded pyrogallol,
  • the drug is a single drug consisting of a polypeptide fused with a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoding PTD (protein transduction domain), or a mixture of the fused polypeptide and valproic acid. It may be a mixed drug.
  • the hydrogel patch containing the single drug or mixed drug of the present invention when attached to the wound area, the content of collagen III increases, which is a pattern observed in wound healing without scars in fetal wound healing. Based on this, it can be seen that scars can be minimized.
  • an angiogenesis marker when the hydrogel patch containing the single drug or mixed drug of the present invention is attached to the wound area, CD105, a dermal stem cell marker, and CD31, an angiogenesis marker, increase, which not only promotes wound healing but also minimizes scarring. .
  • the hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug of the present invention can not only be used as a medical device, but can also be used as a cosmetic mask pack containing a hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug.
  • Figure 1A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Patch group control, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group on day 0 (0 d), day 3 (3 d), day 6 (6 d), Pictures showing the scar area on the 9th day (9 d) and 11th day (11 d);
  • Figure 1B shows the quantification of the scar area on the 11th day of wound treatment in each group using the Image J program.
  • FIG 2A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; This is an H&E staining image on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 1B shows scar width (a.u.) measured in wound tissue on the 11th day of wound treatment in each group.
  • Figure 3A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; These are immunohistochemical staining images for collagen I and collagen III on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 3B is a graph in which the average intensity of collagen I and collagen III of each group was measured and quantified by the ratio of collagen III/collagen I.
  • Figure 4A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Immunohistochemical staining images for CD105 in the wound dermis on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 4B is a graph quantifying the number of CD105 positive cells in the wound dermis of each group.
  • Figure 5A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Immunohistochemical staining images for CD31, an angiogenesis marker, on the 11th day of wound treatment in the Patch group control, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 5B is a graph quantifying the number of CD31 positive cells in each group.
  • the present invention relates to a therapeutic hydrogel patch that can promote wound healing and minimize scarring, and a cosmetic mask pack containing the same.
  • the hydrogel patch refers to a thin membrane-shaped structure with a certain thickness made of biocompatible polymer, and can be cut into a desired shape and used.
  • the hydrogel patch for promoting wound healing or minimizing scars of the present invention is made of a biocompatible polymer modified with drug-loaded pyrogallol, and the drug is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and PTD (protein transduction)
  • the drug is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and PTD (protein transduction)
  • a single drug consisting of a polypeptide fused with a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoding a domain, or a polypeptide consisting of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence encoding a PTD (protein transduction domain) It may be a mixed drug containing a mixture of fused polypeptide and valproic acid.
  • the pyrogallol is a 1,2,3-trihydroxybenzene with three hydroxy groups (-OH) adjacent to each other, and forms covalent crosslinks with various functional groups through an oxidation reaction. do.
  • -OH hydroxy groups
  • natural oxidation can occur within a few minutes without treatment with an oxidizing agent in an environment with high oxygen concentration, such as within the human body. Therefore, when applying the hydrogel patch in actual clinical practice, it has the advantage of being able to be applied directly without additional treatment with an oxidizing agent. there is.
  • the biocompatible polymer may be selected from the group consisting of hyaluronic acid, heparin, cellulose, dextran, alginate, chitosan, chitin, collagen, gelatin, chondroitin sulfate, and pectin, and is preferably hyaluronic acid.
  • the hydrogel patch made of a biocompatible polymer modified with pyrogallol (hereinafter referred to as a hydrogel patch) is a solution-based hydrogel made of a biocompatible polymer modified with pyrogallol (hereinafter referred to as bulk hydrogel). ), it has a nanofiber-based porous structure and has excellent swelling properties, so it can effectively carry cells or drugs within the patch even in an in vivo environment.
  • hydrogel patches have better elasticity, mechanical properties, and tissue adhesion than bulk hydrogels, so they can effectively deliver drugs to tissues in vivo.
  • the hydrogel patch of the present invention may have a thickness of 0.05 to 10.0 mm, and preferably may have a thickness of 0.1 to 5.0 mm. If the thickness of the hydrogel patch is less than the lower limit, durability and adhesion after drug loading may decrease, and if it exceeds the upper limit, the drug release time frame may be prolonged.
  • the drug of the present invention is a single drug consisting of a polypeptide (PTD-DBM) fused with a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence encoding a PTD (protein transduction domain), or the PTD -A mixed drug containing DBM and valproic acid (VPA) is included.
  • PTD-DBM polypeptide
  • VPA valproic acid
  • the PTD-DBM protein transduction domain-fused Dvl-binding motif
  • Dvl CXXC5-Dishevelled
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a DBM peptide (Dvl minimal binding peptide) corresponding to some amino acid sequences of proteins CXXC4 and CXXC5 (CXXC-Type Zinc Finger Protein 5) that exist in the body, and CXXC5 binds to Dvl (Dishevelled). This blocks signal transduction by the Wnt/ ⁇ -catenin signaling system.
  • the DBM peptide blocks the interaction between CXXC5 and Dvl and activates the Wnt/ ⁇ -catenin signaling system.
  • an amino acid sequence encoding a protein transduction domain can be additionally inserted into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the PTD mainly consists of basic amino acids such as arginine or lysine, and by adding the PTD to the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, it can penetrate the cell membrane and induce penetration into the cell.
  • the PTD may include poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp or Transportan, where poly R8 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, HIV-Tat is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and HSV VP22 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of 4, Antp may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or Transportan may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a linker may be additionally inserted between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence encoding PTD.
  • a specific example of a linker inserted between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence encoding PTD is a sequence of 4 to 12 amino acids, which may be 4 to 8 glycines, and the polypeptide in which the linker is additionally inserted is It may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 below.
  • valproic acid is used as a glycogen synthase kinase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ) inhibitor, and when used together with PTD-DBM, it can further promote wound healing and alleviate scar formation.
  • the PTD-DBM and valproic acid may be mixed at a molar ratio of 1:100-1000, preferably 1:200-500. Based on PTD-DBM, if the content of valproic acid is less than the above lower limit, the ratio of collagen III/collagen I may be lowered, and if it is more than the above upper limit, the CD105 marker and CD31 marker may not increase.
  • the single drug or mixed drug of the present invention can be carried in the hydrogel patch at a concentration of 0.3 to 10 mg/ml, preferably 1 to 8 mg/ml. If the concentration of the mixed drug loaded is less than the lower limit, the effect may be minimal, and if it exceeds the upper limit, the effect of alleviating scars may be reduced.
  • the content of collagen III which is important for regenerative wound healing, increases at the wound area, so that the ratio of collagen III/collagen I is 2 to 70, preferably Since it increases to 15 to 65, more preferably 52 to 60, scars can be minimized.
  • an angiogenesis marker when the hydrogel patch containing the single or mixed drug of the present invention is attached to the wound area, CD105, a dermal stem cell marker, and CD31, an angiogenesis marker, increase, which not only promotes wound healing but also minimizes scarring.
  • the hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug of the present invention can not only be used as a medical device, but can also be used as a cosmetic mask pack containing a hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug.
  • Hydrogel (HA-PG) is synthesized through carbodiimide chemistry.
  • Hyaluronic acid (HA, molecular weight 200 kDa, Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA) was completely dissolved in TDW (triple distillation water) at a concentration of 10 mg/ml, and then mixed with hyaluronic acid and 1-(3-dimethylaminopropyl).
  • TDW triple distillation water
  • EDC Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
  • NHS was added so that the molar ratio of hyaluronic acid and N-hydroxysuccinimide (NHS, Sigma-Aldrich, St.
  • HA-PG was obtained by stirring for 24 hours while maintaining the temperature of 4.5 to 5.0.
  • HA-PG Unreacted chemicals and by-products were removed through dialysis using a 6-8 kDa barrier membrane (Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, USA) against acidic PBS (Biosesang, Seongnam, Gyeonggi), and the generated HA- PG was lyophilized and stored at 4°C until use. The successful synthesis of HA-PG was confirmed by 1H-NMR spectroscopy at 300 MHz (Bruker, Billerica, MA, USA).
  • poly R8 RRRRRRRR
  • GGGG polyglycine linker
  • PolyR8-DBM RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKCK-(FITC)
  • poly R8 RRRRRRRR
  • GGGG polyglycine linker
  • PolyR8-DBM RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKCK-(FITC)
  • a mixed drug was obtained by mixing the PolyR8-DBM peptide (PTD-DBM) and valproic acid at a molar ratio of 1:500.
  • Valproic acid was used alone.
  • Epidermal growth factor was used to promote wound recovery.
  • the control group is an untreated group.
  • Topical means that the drug prepared in Examples and Comparative Examples was applied topically to the mouse
  • Patch means applying the drug prepared in Examples and Comparative Examples to the HA- prepared in Preparation Example 1. It is a hydrogel patch soaked in PG.
  • the hydrogel patch was prepared by dissolving the HA-PG prepared in Preparation Example 1 in PBS at a concentration of 1% (w/v) and then placing the drugs prepared in Examples and Comparative Examples in a pre-designed 1cm x 1cm rectangular mold. Each loaded HA-PG solution was poured and completely freeze-dried to obtain each HA-PG patch. The obtained HA-PG patch was stored at -20°C before use to avoid moisture.
  • 6-week-old male C3H mice weighing 21 to 26 g obtained from Coretech were adapted to the new environment for 1 week and the effects of the drugs prepared in Examples and Comparative Examples or hydrogel patches loaded with the drugs on wound healing and alleviation of scar formation were examined. It was used to measure impact. They were raised in acrylic cages (45 And constant temperature (20-24 °C) and humidity (45-65%) were maintained. We monitored them for a week to help them adapt to the changed environment, maintained their sleep cycle, and checked for abnormal behavior.
  • a 7-week-old C3H mouse with resting hair follicles was anesthetized with 2,2,2-tribromoethanol (Sigma Aldrich), the hair on the back of the mouse was shaved with clippers, and a 1 cm 2 wound was made on the back of the mouse.
  • the topical treatment group (Topical) was It was applied to the wound every day, and the hydrogel patch group was applied to the wound once.
  • Figure 1A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Patch group control, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group on day 0 (0 d), day 3 (3 d), day 6 (6 d), Pictures showing the scar area on the 9th day (9 d) and 11th day (11 d);
  • Figure 1B shows the quantification of the scar area on the 11th day of wound treatment in each group using the Image J program.
  • Example 1 consisting of PTD-DBM and Example 2 combining PTD-DBM and VPA promoted wound healing and scar formation compared to the other groups. It was confirmed that the formation was significantly alleviated.
  • the mouse wound tissue was fixed overnight at 4°C using 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA), dehydrated, paraffinized, embedded in paraffin, and sectioned at a thickness of 4 ⁇ m. Sections were deparaffinized and rehydrated through a series of xylene and ethanol, and slides were incubated in Harris hematoxylin for 5 minutes and eosin for 1 minute. H&E-stained slides were observed using a bright-field optical microscope (ECLIPSE TE2000-U, Nikon).
  • PFA paraformaldehyde
  • FIG 2A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; This is an H&E staining image on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 1B shows scar width (a.u., arbitary unit) measured in wound tissue on the 11th day of wound treatment in each group.
  • Example 1 consisting of PTD-DBM and Example 2 combining PTD-DBM and VPA promoted wound healing and scar formation compared to the other groups. It was confirmed that the formation was significantly alleviated.
  • the slides were subjected to antigen retrieval using 10 mM sodium citrate buffer for antigen retrieval. After cooling, the slides were incubated in PBS and then blocked with 5% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 30 min at room temperature, and then the slides were incubated overnight at 4°C with the following dilutions of primary antibodies.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure 3A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; These are immunohistochemical staining images for collagen I and collagen III on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 3B is a graph in which the average intensity of collagen I and collagen III of each group was measured and quantified by the ratio of collagen III/collagen I.
  • collagen I increased in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group, but in the control group, PTD-DBM group, and VPA in the Patch group.
  • group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group were confirmed to have increased collagen III compared to each group in the Topical group.
  • the ratio of collagen III/collagen I was very low at less than 10 in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group, but the Patch group It was confirmed that the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group had a higher collagen III/collagen I ratio compared to each group in the Topical group.
  • the PTD-DBM+VPA_HA-PG patch group loaded with the mixed drug combining PTD-DBM and VPA of Example 2 was confirmed to have a significantly high collagen III/collagen I ratio of 57.2.
  • Figure 4A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Immunohistochemical staining images for CD105 in the wound dermis on the 11th day of wound treatment in the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 4B is a graph quantifying the number of CD105 positive cells in the wound dermis of each group.
  • Example 1 consisting of PTD-DBM and Example 2 combining PTD-DBM and VPA were stem cell markers in the wound dermis compared to the other groups. It was confirmed that CD105 was significantly increased.
  • Figure 5A shows the control group, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group in the Topical group; Immunohistochemical staining images for CD31, an angiogenesis marker, on the 11th day of wound treatment in the Patch group control, PTD-DBM group, VPA group, PTD-DBM+VPA group, and EGF group;
  • Figure 5B is a graph quantifying the number of CD31 positive cells in each group.
  • CD31 an angiogenesis marker
  • Example 1 consisting of PTD-DBM
  • Example 2 combining PTD-DBM and VPA compared to the other groups. It was confirmed that there was a significant increase.
  • the HA-PG patch carrying the materials of Example 1, Example 2, Comparative Example 1, and Comparative Example 2, respectively, showed a greater overall increase in CD31 than when applied topically, and among them, PTD- of Example 2 It was confirmed that the PTD-DBM+VPA_HA-PG patch group loaded with the mixed drug combining DBM and VPA showed a significantly increased number of CD31 positive cells.
  • the hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug of the present invention can not only be used as a medical device, but can also be used as a cosmetic mask pack containing a hydrogel patch containing a single drug or a mixed drug.

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Abstract

본 발명은 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치에 관한 것으로 PTD-DMB, 또는 PTD-DMB와 발프로산이 혼합된 혼합 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 하이드로젤 패치를 이용함으로써, 재생성 상처 치유 및 흉터를 완화하는데 중요한 콜라겐 Ⅲ의 함량이 증가하며 상처부위에서 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가하므로 상처 치유를 촉진하며, 흉터를 최소화시킬 수 있다.

Description

상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치
본 발명은 상처 치유를 촉진하며, 흉터를 최소화시킬 수 있는 치료용 하이드로젤 패치 및 이를 포함하는 화장품용 팩에 관한 것이다.
우리 몸에서 피부는 여러 가지 기능을 담당하고 있으며, 그 중에서도 가장 중요한 기능은 외부로부터 우리의 몸을 보호하는 장벽 역할이라고 할 수 있다. 이러한 장벽 역할을 하는 피부의 정상적인 구조가 파괴된 상태를 창상 또는 상처라고 한다.
이와 같이 피부가 상처를 입게 되면 상처 부위가 노출되어 외부 균의 침입을 받을 수 있으므로 신속한 상처치료가 되어야 추가 감염(infection)을 막을 수 있고, 그로 인한 과도한 염증반응(inflammation)을 막을 수 있다. 과도한 염증반응은 상처치유 기간을 연장시킬 뿐 아니라 흉터의 원인이 되기도 한다.
상처치유(wound healing)란 임상적으로 피부가 완전하게 봉합되는 것을 의미하며, 만성상처(chronic wound)가 아닌 일반적인 상처는 대략 3-14일 안에 완전히 치유된다. 상처치유는 각질세포(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast), 혈관내피세포(endothelial cell), 대식세포(macrophage), 혈소판(platelet) 등 여러 종류의 세포가 상호작용하면서 조절하는 복잡한 과정으로 이루어진다.
현재 국내에서 주로 사용되는 상처 치료제는 동국제약사의 '복합 마데카솔'(1985년 출시)과 동화약품사의 '후시딘'(1980년 출시)이 있다. 두 제제의 효능은 대체로 비슷하지만, 후시딘은 항균력, 마데카솔은 흉터 완화에 조금 더 강점을 가지고 있다.
기존의 스테로이드 연고는 소염작용, 면역억제기능, 알레르기성 질환 등에 효과적이지만, 부작용으로 곰보자국, 피부주름, 모낭염 등을 유발하며, 무좀 등의 세균성 질환에는 효과가 없다. 또한, 항생제를 포함하는 연고는 내성을 가질 수 있으며 아이들과 같은 연약한 피부 상처에 사용할 경우 여러 가지 부작용을 유발할 수 있다.
따라서, 스테로이드 연고나 항생연고가 가지는 문제점을 극복하기 위해 상처치유 기전을 기반으로 한 상처 치료제가 요구되고 있다.
또한, 일상에서의 피부 상처보다 더 심각한 사고 상해, 멜라노마와 같은 피부질환, 수술 후 생기는 큰 상처, 당뇨병과 같은 타 질환과 연계된 상처 등은 치유에 시간이 걸릴 뿐 아니라 종종 흉터를 유발하는 등 큰 문제가 되고 있다. 대웅제약사에서 일반의약품으로는 국내 최초로 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)를 함유하고 있는 상처치료제 '이지에프 새살연고'를 출시했다. 상피세포 성장인자가 상처 부위의 살갗을 덮고(재상피화) 새살을 만들어내는 것(육아조직 증식)을 촉진해 상처 치유를 도와준다. 하지만, 상피세포 성장인자는 단백질인 만큼 생산과 안전성 유지 등에 드는 비용과 노력이 매우 크며 흉터에 크게 영향을 미치지 못하는 단점이 있다.
한편, 질병이나 사고에 의하여 손상된 조직 및 장기를 효과적으로 회복시키기 위해서는 생체 내외에 약물 또는 세포를 효율적으로 전달할 수 있어야 한다. 이에 따라 약물 또는 세포를 전달하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔지만 실제 임상에 사용되어 만족할만한 수준의 치료 효과를 보이는 시스템은 아직까지 개발이 부족하다.
약물 전달의 방법 중에서 경구 투여와 같은 기존의 단순 투여 방식은 약물의 빠른 분해 및 확산으로 인해 약물 체류 시간이 짧은 문제점이 존재하며, 효과적인 치료를 위해서는 많은 양의 약물을 주입하거나 약물 주입 빈도가 높아질 수밖에 없었다.
기존의 약물 또는 세포 전달 방법의 문제를 해결하기 위해 하이드로젤을 이용한 전달 방법에 관한 연구가 진행되었으나 대부분이 하이드로젤 용액에 약물 또는 세포를 탑재하고 가교시켜 젤 형성을 유도하는 방식에 관한 연구였다. 그러나 상기 방식은 하이드로젤을 생체에 주입하는 형태로 적용되기 때문에 하이드로젤을 다루는 사용자의 숙련도에 따라 결과가 달라질 가능성이 많고 사용자의 편의성이 크게 떨어지는 문제가 있다. 또한, 주사를 통하여 생체 내로 주입되기 때문에 조직 손상 및 출혈의 위험성이 여전히 존재하고, 기존의 하이드로젤은 물성 및 접착력이 생체 내에서 장기간 유지되기에는 부족한 경우가 많았다.
상기 종래 기술의 한계를 극복하기 위하여 본 발명자들은 파이로갈롤로 수식된 히알루론산 유도체를 이용하여 약물 전달 효율과 사용자 편의성이 우수할 뿐만 아니라, 산화제가 불필요하여 임상 적용에 유리한 하이드로젤에 상처 치유 또는 흉터 완화에 탁월한 효능을 가지는 약물을 담지시킨 패치를 제작하였다.
본 발명의 목적은 상처 치유를 촉진하며, 흉터를 최소화시킬 수 있는 치료용 하이드로젤 패치를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상처 치유를 촉진하며, 흉터를 최소화시킬 수 있는 화장품용 마스크 팩을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치는 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 것으로서,
상기 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드로 이루어진 단독 약물, 또는 상기 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 혼합된 혼합 약물일 수 있다.
상기 혼합 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드, 및 발프로산은 1 : 100-1000 의 몰비로 혼합될 수 있다.
상기 단독 약물 또는 혼합 약물은 0.3 내지 10 mg/ml의 농도로 담지될 수 있다.
상기 하이드로젤 패치에 의해 상처부위에서 콜라겐 Ⅲ의 함량이 증가하여 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 Ⅰ의 비율이 2 내지 70일 수 있다.
상기 하이드로젤 패치에 의해 상처부위에서 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가할 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산일 수 있다.
상기 PTD(protein transduction domain)는 poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp 또는 Transportan을 포함할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 PTD를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 링커가 추가로 삽입될 수 있다.
상기 하이드로젤 패치는 의료기기용 패치일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩은 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 하이드로젤 패치를 포함하는 것으로서,
상기 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드로 이루어진 단독 약물, 또는 상기 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 혼합된 혼합 약물일 수 있다.
PTD-DBM(단독 약물), 또는 PTD-DBM과 VPA이 결합된 혼합 약물에 의해서 상처 치유가 되고 흉터 형성이 완화되지만, 상기 단독 약물 또는 혼합 약물을 각각 HA-PG에 담지시킨 본 발명의 하이드로젤 패치를 이용하는 경우에는 상기 단독 약물 또는 혼합 약물만 사용한 경우에 비하여 더욱 우수한 상처 치유 촉진 및 흉터 형성 완화 효과를 보인다.
또한, 본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 상처부위에 부착하면 콜라겐 Ⅲ의 함량이 증가하는데, 이는 태아상처치유(fetal wound healing)에서 흉터 없이 치유되는 상처 치유에서 관찰되는 패턴으로서 이를 바탕으로 흉터를 최소화할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 상처부위에 부착하면 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가하여 상처 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라 흉터를 최소화시킬 수 있다.
본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치는 의료기기용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 포함하는 화장품용 마스크 팩으로도 사용할 수 있다.
도 1A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 0일째(0 d), 3일째(3 d), 6일째(6 d), 9일째(9 d) 및 11일째(11 d) 흉터 면적을 나타낸 사진이며; 도 1B는 상기 각 군의 상처 치료 11일째에 흉터 면적을 Image J 프로그램을 이용하여 정량화한 것이다.
도 2A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 H&E 염색 이미지이며; 도 1B는 상기 각 군의 상처 치료 11일째에 상처 조직에서 흉터 너비(a.u.)를 측정한 것이다.
도 3A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 콜라겐 I 및 콜라겐 Ⅲ에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 3B는 상기 각 군의 콜라겐 I 및 콜라겐 Ⅲ에 대한 평균 강도를 측정한 후 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 I의 비율로 정량화한 그래프이다.
도 4A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 상처 진피에서 CD105에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 4B는 상기 각 군의 상처 진피에서 CD105 양성 세포 수를 정량화한 그래프이다.
도 5A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 혈관신생 마커인 CD31에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 5B는 상기 각 군의 CD31 양성 세포 수를 정량화한 그래프이다.
본 발명은 상처 치유를 촉진하며, 흉터를 최소화시킬 수 있는 치료용 하이드로젤 패치 및 이를 포함하는 화장품용 마스크 팩에 관한 것이다.
상기 하이드로젤 패치(hydrogel patch)는 생체적합성 고분자로 이루어진 일정 두께를 갖는 얇은 막 형태의 구조물을 말하며, 원하는 형태로 잘라서 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치는 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 것이며, 상기 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드로 이루어진 단독 약물, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 혼합된 혼합 약물일 수 있다
파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자(HA-PG)
상기 파이로갈롤(pyrogallol)은 히드록시기(-OH) 세 개가 인접 위치한 1,2,3-트리하이드록시벤젠(trihydroxybenzene)으로서, 산화반응에 의해서 여러가지 작용기(functional group)와 공유 가교(crosslinking)를 형성한다. 특히, 빠르게 산화되는 특성으로 인해 인체 내와 같이 산소 농도가 높은 환경에서는 산화제 처리 없이 자연산화가 수 분내로 이루어질 수 있으므로 하이드로젤 패치를 실제 임상에 적용할 때 별도의 산화제 처리 없이 바로 적용이 가능한 장점이 있다.
상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산이다.
상기 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 하이드로젤 패치(이하, 하이드로젤 패치로 기재함)는 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 용액 기반 하이드로젤(이하, 벌크 하이드로젤로 기재함)과 비교하여 나노섬유 기반의 다공성 구조를 가지고, 팽윤성이 뛰어나므로 생체 내 환경에서도 패치 내에 세포 또는 약물을 효과적으로 담지할 수 있다. 또한, 하이드로젤 패치는 벌크 하이드로젤보다 탄성력, 기계적 물성, 조직 접착력이 우수하므로 생체 내 조직에 약물을 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤 패치는 0.05 내지 10.0 ㎜의 두께를 가질 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 5.0 ㎜의 두께를 가질 수 있다. 하이드로젤 패치의 두께가 상기 하한치 미만인 경우에는 약물 담지 후 내구성 및 접착력이 저하될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 약물 방출 타임 프레임이 길어질 수 있다.
단독 약물(PTD-DBM) 또는 혼합 약물(PTD-DBM 및 발프로산 혼합)
본 발명의 약물로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드(PTD-DBM)로 이루어진 단독 약물, 또는 상기 PTD-DBM 및 발프로산(VPA)이 혼합된 혼합 약물을 들 수 있다.
상기 PTD-DBM(protein transduction domain-fused Dvl-binding motif)은 CXXC5-Dishevelled(Dvl) 상호작용을 방해하는 펩타이드이다.
[서열번호 1] : RKTGHQICKFRKC
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 체내에 존재하는 단백질 CXXC4 및 CXXC5 (CXXC-Type Zinc Finger Protein 5)의 일부 아미노산 서열에 해당하는 DBM 펩타이드(Dvl minimal binding peptide)로서, CXXC5가 Dvl(Dishevelled)에 결합하여 Wnt/β-카테닌 신호전달계에 의한 신호전달을 차단하게 되는데 상기 DBM 펩타이드가 CXXC5와 Dvl이 상호작용하는 것을 차단하여 Wnt/β-카테닌 신호전달계를 활성화시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 펩타이드(DBM)가 세포막을 투과하여 세포 내 침투를 유도하기 위하여 서열번호 1의 아미노산 서열에 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열을 추가로 삽입할 수 있다.
상기 PTD는 주로 아르기닌이나 라이신 등의 염기성 아미노산으로 구성되며, PTD를 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-terminal 또는 C-terminal에 추가함으로써 세포막을 투과하여 세포 내로의 침투를 유도할 수 있다.
상기 PTD로는 poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp 또는 Transportan을 들 수 있으며, poly R8은 하기 서열번호 2의 아미노산 서열, HIV-Tat은 하기 서열번호 3의 아미노산 서열, HSV VP22는 하기 서열번호 4의 아미노산 서열, Antp는 하기 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 Transportan는 하기 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
[서열번호 2] : RRRRRRRR
[서열번호 3] : YGRKKRRQRRR
[서열번호 4] : DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
[서열번호 5] : RQIKIWFQNRRMKWKK
[서열번호 6] : AGYLLGKINLKALAALAKKIL
또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 PTD를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 링커가 추가로 삽입될 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열과 PTD를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 삽입되는 링커의 구체적인 예는 4개 내지 12개의 아미노산 서열로서, 4개 내지 8개의 글라이신일 수 있고, 링커가 추가로 삽입된 폴리펩타이드는 하기 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
[서열번호 7] : RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKC
또한, 상기 발프로산(VPA)은 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 저해제로 사용되는 것으로서, PTD-DBM과 함께 사용 시 상처 치유를 더욱 촉진시키며, 흉터 형성을 완화시킬 수 있다.
상기 PTD-DBM과 발프로산은 1 : 100-1000의 몰비, 바람직하게는 1 : 200-500의 몰비로 혼합될 수 있다. PTD-DBM를 기준으로 발프로산의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 Ⅰ의 비율이 낮아질 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 CD105 마커 및 CD31 마커가 증가하지 못할 수 있다.
본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물은 하이드로젤 패치에 0.3 내지 10 mg/ml의 농도, 바람직하게는 1 내지 8 mg/ml의 농도로 담지될 수 있다. 담지되는 혼합 약물의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 효과가 미미할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 흉터 완화의 효과가 줄어들 수 있다.
본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 상처부위에 부착하면 상처부위에서 재생성 상처 치유에 중요한 콜라겐 Ⅲ의 함량이 증가하여 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 Ⅰ의 비율이 2 내지 70, 바람직하게는 15 내지 65, 더욱 바람직하게는 52 내지 60까지 높아지므로 흉터를 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 단독 혹은 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 상처부위에 부착하면 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가하여 상처 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라 흉터를 최소화시킬 수 있다.
본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치는 의료기기용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 포함하는 화장품용 마스크 팩으로도 사용할 수 있다.
제조예 1. 하이드로젤(HA-PG)
하이드로젤(HA-PG)은 카르보디이미드 화학을 통해 합성된다.
히알루론산(HA, 분자량 200 kDa, Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA)을 TDW(triple distillation water)에 10 mg/ml의 농도로 완전히 용해시킨 후 상기 히알루론산과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)의 몰비가 1:1.5가 되도록 EDC를 첨가하여 15분 동안 교반하였다. 그 후 히알루론산과 N-하이드록시숙신이미드(NHS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 몰비가 1:1이 되도록 NHS을 첨가한 후 혼합 용액을 pH 5.5에서 15분 동안 더 교반하여 히알루론산의 카르복실기를 활성화시킨 후 반응액에 히알루론산과 5-하이드록시도파민 염산염(5-hydroxydopamine hydrochloride, Sigma-Aldrich)의 몰비가 1:1이 되도록 5-하이드록시도파민 염산염을 첨가하여 pH 4.5~5.0을 유지하면서 24시간 교반하여 HA-PG를 수득하였다.
미반응 화학물질과 부산물은 산성 PBS(바이오세상, 경기 성남)에 대해 6-8 kDa의 차단막(Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, USA)을 사용하여 투석을 통해 제거하고, 생성된 HA-PG를 동결건조한 후 사용할 때까지 4 ℃에서 보관하였다. HA-PG의 성공적인 합성은 300 MHz에서 1H-NMR 분광법(Bruker, Billerica, MA, USA)으로 확인하였다.
실시예 1. PTD-DBM 단독
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 효능을 확인하기 위하여 서열번호 1의 아미노산 말단에 poly R8(RRRRRRRR)과 폴리 글라이신 링커(GGGG) 및 카르복실 말단에 라이신과 형광 염색물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 덧붙인 PolyR8-DBM 펩타이드를 합성하여 이용하였다.
PolyR8-DBM: RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKCK-(FITC)
실시예 2. 혼합 약물(PTD-DBM+VPA)
PTD-DBM
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 효능을 확인하기 위하여 서열번호 1의 아미노산 말단에 poly R8(RRRRRRRR)과 폴리 글라이신 링커(GGGG) 및 카르복실 말단에 라이신과 형광 염색물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 덧붙인 PolyR8-DBM 펩타이드를 합성하였다.
PolyR8-DBM: RRRRRRRRGGGGRKTGHQICKFRKCK-(FITC)
혼합 약물
상기 PolyR8-DBM 펩타이드(PTD-DBM)와 발프로산을 1 : 500의 몰비로 혼합하여 혼합 약물을 수득하였다.
비교예 1. VPA 단독
발프로산(valproic acid) 단독으로 이용하였다.
비교예 2. EGF 단독
상처의 회복 촉진을 위하여 상피세포 성장인자(EGF)를 이용하였다.
<시험예>
대조군(control)은 무처리군이다.
도면에서 국소(Topical)는 실시예 및 비교예에서 제조된 약물을 마우스에 국소적으로 바른 것을 의미하며, 패치(Patch)는 실시예 및 비교예에서 제조된 약물을 제조예 1에서 제조된 HA-PG에 담지시킨 하이드로젤 패치이다.
구체적으로, 하이드로젤 패치는 제조예 1에서 제조된 HA-PG를 PBS에 1%(w/v)농도로 용해시킨 후 미리 설계된 1cm X 1cm의 직사각형 몰드에 실시예 및 비교예에서 제조된 약물을 각각 로딩시킨 각각의 HA-PG 용액을 붓고 완전히 동결 건조시켜 각 HA-PG 패치를 수득하였다. 상기 수득된 HA-PG 패치는 습기를 피하기 위해 사용 전에 -20 ℃에서 보관하였다.
동물실험
코아텍에서 얻은 21~26 g의 6주령 수컷 C3H 마우스를 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 실시예 및 비교예에서 제조된 약물 또는 상기 약물이 담지된 하이드로겔 패치가 상처 치유 및 흉터 형성 완화에 미치는 영향을 측정하는데 사용하였다. 아크릴 케이지(45 X 60 X 25 cm)에서 사육되었으며, 충분한 사료와 물이 공급되며 적절한 인공조도로 12시간의 낮, 밤을 조절하였다(am 8:00부터 낮). 그리고 일정한 온도(20~24 ℃) 및 습도(45~65%)를 유지시켜 주었다. 바뀐 환경에 적응하도록 일주일간 살펴보며 수면주기를 유지하고, 이상행동을 확인하였다.
모낭이 휴지기인 7주령 C3H 마우스를 2,2,2-tribromoethanol(Sigma Aldrich)로 마취하고 이발기로 마우스 등의 털을 면도한 후 마우스의 등에 두께 1 cm2 상처를 만들고 국소 처리 그룹(Topical)은 상처에 매일 도포하였으며, 하이드로젤 패치 그룹(Patch)은 상처에 1회 부착 적용하였다.
-10개 군의 마우스-
Topical
(매일 도포)		 control: 인산염 완충 식염수
PTD-DBM: 실시예 1의 PTD-DBM 100 uM 매일 도포
VPA: 비교예 1의 VPA 50 mM 매일 도포
PTD-DBM+VPA: 실시예 2의 100 uM PTD-DBM과 50 mM VPA의 혼합 약물 매일 도포
EGF: 비교예 2의 EGF 100 uM 매일 도포
Patch
(1회 부착)		 control: 인산염 완충 식염수
PTD-DBM: 실시예 1의 PTD-DBM 0.3 mg/ml 농도로 담지
VPA: 비교예 1의 VPA 7.2 mg/ml 농도로 담지
PTD-DBM+VPA: 실시예 2의 0.3 mg/ml PTD-DBM과 7.2 mg/ml VPA의 혼합 약물 담지
EGF: 비교예 2의 EGF 0.6 mg/ml 농도로 담지
데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 통계 분석은 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행된다. 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005와 같이 제시되어 있다.
시험예 1. 마우스의 상처 면적 측정
도 1A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 0일째(0 d), 3일째(3 d), 6일째(6 d), 9일째(9 d) 및 11일째(11 d) 흉터 면적을 나타낸 사진이며; 도 1B는 상기 각 군의 상처 치료 11일째에 흉터 면적을 Image J 프로그램을 이용하여 정량화한 것이다.
도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같이, Topical 그룹 및 Patch 그룹 모두에서 PTD-DBM로 이루어진 실시예 1 및 PTD-DBM과 VPA이 결합된 실시예 2가 다른 군에 비하여 상처 치유를 촉진하며, 흉터 형성을 유의적으로 완화시키는 것을 확인하였다.
더욱이, 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 약물이 각각 담지된 HA-PG 패치는 국소(Topical) 적용 시보다 전체적으로 상처 치유 촉진 및 흉터 형성 완화 효과가 더욱 우수하였으며, 그중에서 실시예 2의 PTD-DBM과 VPA가 결합된 혼합 약물이 담지된 PTD-DBM+VPA_HA-PG 패치 군이 가장 우수하게 상처 치유 촉진 및 흉터 형성 완화 효과를 보이는 것을 확인하였다.
시험예 2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
마우스의 상처 조직을 4%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)를 이용하여 4 ℃에서 overnight 고정한 후 탈수 및 파라핀화하여 파라핀에 포매하고, 4 μm 두께로 얇게 절편하였다. 섹션을 탈파라핀화하고 일련의 자일렌(xylene) 및 에탄올(ethanol)을 통해 재수화하고 슬라이드를 Harris hematoxylin에서 5분 및 eosin에서 1분 동안 배양하였다. H&E 염색된 슬라이드는 명시야 광학현미경(ECLIPSE TE2000-U, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.
도 2A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 H&E 염색 이미지이며; 도 1B는 상기 각 군의 상처 치료 11일째에 상처 조직에서 흉터 너비(a.u., Arbitary unit)를 측정한 것이다.
도 2A 및 도 2B에 도시된 바와 같이, Topical 그룹 및 Patch 그룹 모두에서 PTD-DBM로 이루어진 실시예 1 및 PTD-DBM과 VPA이 결합된 실시예 2가 다른 군에 비하여 상처 치유를 촉진하며, 흉터 형성을 유의적으로 완화시키는 것을 확인하였다.
더욱이, 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 물질이 각각 담지된 HA-PG 패치는 국소(Topical) 적용시보다 전체적으로 상처 치유 촉진 및 흉터 형성 완화 효과가 더욱 우수하였으며, 그 중에서 실시예 2의 PTD-DBM과 VPA가 결합된 혼합 약물이 담지된 PTD-DBM+VPA_HA-PG 패치 군이 현저하게 우수한 상처 치유 촉진 및 흉터 형성 완화 효과를 보이는 것을 확인하였다.
시험예 3. 면역조직화학 염색
4 μm 파라핀 절편을 탈파라핀화하고 재수화한 후 항원 검색을 위해 슬라이드를 10 mM 시트르산나트륨 완충액을 이용하여 항원복구를 하였다. 냉각 후, 슬라이드를 PBS에서 배양한 다음 PBS 중 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 실온에서 30분 동안 차단한 다음 슬라이드를 1차 항체의 다음 희석액과 함께 4 ℃에서 overnight 배양하였다.
항-콜라겐 I(1:200, Abcam), 항-콜라겐 III(1:200, Novus Biologicals), 항-CD105(1:50, R&D systems), 항-CD31(1:100, Abcam)를 PBS로 세척한 후, 슬라이드를 Alexa Fluor 488- 또는 Alexa Fluor 555-conjugated IgG 2차 항체(Invitrogen, 1:500)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 10분 동안 DAPI(Boehringer Mannheim, 1:5000)로 염색하였다. 염색된 이미지는 Nikon Eclipse Ti 현미경(Nikon)을 사용하여 조사되었다.
정량화는 NIS Elements V3.2 소프트웨어(Nikon)를 사용하여 수행하였다.
3-1. 콜라겐 I 및 콜라겐 Ⅲ에 대한 면역조직화학 염색
도 3A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 콜라겐 I 및 콜라겐 Ⅲ에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 3B는 상기 각 군의 콜라겐 I 및 콜라겐 Ⅲ에 대한 평균 강도를 측정한 후 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 I의 비율로 정량화한 그래프이다.
도 3A에 도시된 바와 같이, Topical 그룹의 control 군, PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군은 콜라겐 I이 증가하였으나, Patch 그룹의 control 군, PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군은 Topical그룹의 각 군에 비하여 콜라겐 Ⅲ가 증가하는 것을 확인하였다.
또한 도 3B에 도시된 바와 같이, Topical 그룹의 control 군, PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군은 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 I의 비율이 10 이하로 매우 낮았으나, Patch 그룹의 control 군, PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군은 Topical그룹의 각 군에 비하여 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 I의 비율이 높은 것을 확인하였다.
특히, Patch 그룹 중에서 실시예 2의 PTD-DBM과 VPA가 결합된 혼합 약물이 담지된 PTD-DBM+VPA_HA-PG 패치 군은 콜라겐 Ⅲ/콜라겐 Ⅰ의 비율이 57.2로서 현저히 높은 것을 확인하였다.
3-2. 상처 진피에서 CD105에 대한 면역조직화학 염색
도 4A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 상처 진피에서 CD105에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 4B는 상기 각 군의 상처 진피에서 CD105 양성 세포 수를 정량화한 그래프이다.
도 4A 및 도 4B에 도시된 바와 같이, Topical 그룹 및 Patch 그룹 모두에서 PTD-DBM로 이루어진 실시예 1 및 PTD-DBM과 VPA이 결합된 실시예 2가 다른 군에 비하여 상처 진피에서 줄기세포 마커인 CD105가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
더욱이, 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 물질이 각각 담지된 HA-PG 패치는 국소(Topical) 적용시보다 전체적으로 CD105가 더욱 증가하였으며, 그 중에서 실시예 2의 PTD-DBM과 VPA가 결합된 혼합 약물이 담지된 PTD-DBM+VPA_HA-PG 패치 군이 현저하게 증가된 CD105 양성 세포 수를 보이는 것을 확인하였다.
3-3. CD31에 대한 면역조직화학 염색
도 5A는 국소(Topical) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군과; 패치(Patch) 그룹의 대조군(control), PTD-DBM 군, VPA 군, PTD-DBM+VPA 군 및 EGF 군의 상처 치료 11일째의 혈관신생 마커인 CD31에 대한 면역조직화학 염색 이미지이며; 도 5B는 상기 각 군의 CD31 양성 세포 수를 정량화한 그래프이다.
도 5A 및 도 5B에 도시된 바와 같이, Topical 그룹 및 Patch 그룹 모두에서 PTD-DBM로 이루어진 실시예 1 및 PTD-DBM과 VPA이 결합된 실시예 2가 다른 군에 비하여 혈관신생 마커인 CD31이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
더욱이, 실시예 1, 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 물질이 각각 담지된 HA-PG 패치는 국소(Topical) 적용시보다 전체적으로 CD31이 더욱 증가하였으며, 그 중에서 실시예 2의 PTD-DBM과 VPA가 결합된 혼합 약물이 담지된 PTD-DBM+VPA_HA-PG 패치 군이 현저하게 증가된 CD31 양성 세포 수를 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치는 의료기기용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 단독 약물 또는 혼합 약물이 담지된 하이드로젤 패치를 포함하는 화장품용 마스크 팩으로도 사용할 수 있다.
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Claims (13)

  1. 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 하이드로젤 패치로서,
    상기 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드로 이루어진 단독 약물, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 혼합된 혼합 약물인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 1 : 100-1000의 몰비로 혼합된 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 패치에 의해 상처부위에서 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PTD(protein transduction domain)는 poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp 또는 Transportan을 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 PTD를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 링커가 추가로 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 패치는 의료기기용 패치인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진용 또는 흉터 최소화용 하이드로젤 패치.
  8. 약물이 담지된 파이로갈롤로 수식된 생체적합성 고분자로 이루어진 하이드로젤 패치를 포함하는 화장품용 마스크 팩으로서,
    상기 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드로 이루어진 단독 약물, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 혼합된 혼합 약물인 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
  9. 제8항에 있어서, 상기 혼합 약물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 PTD(protein transduction domain)를 코딩하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 융합된 폴리펩타이드와 발프로산이 1 : 100-1000의 몰비로 혼합된 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
  10. 제8항에 있어서, 상기 하이드로젤 패치에 의해 상처부위에서 진피 줄기세포 마커인 CD105 및 혈관신생 마커인 CD31이 증가하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
  11. 제8항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
  12. 제8항에 있어서, 상기 PTD(protein transduction domain)는 poly R8, HIV-Tat, HSV VP22, Antp 또는 Transportan을 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
  13. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 PTD를 코딩하는 아미노산 서열 사이에 링커가 추가로 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 상처 치유 촉진 또는 흉터 최소화를 위한 화장품용 마스크 팩.
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