WO2018088850A2 - Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to anti-CD40 antibodies that specifically bind to CD40 and uses thereof, specifically, anti-CD40 antibodies or antigen-binding fragments thereof, and cancer, cancer metastasis, infection, and / or immunity comprising the same as an active ingredient.
  • CD4Q is a co-stimulatory molecule belonging to the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily that is present on antigen presenting cells (APCs) including dendritic cells, B cells and macrophages.
  • APC is activated when CD40 binds to its ligand CD154 (CD40L) on TH cells.
  • CD40-mediated APC activation is involved in various immune responses, including cytokine production, up-regulation of co-stimulatory molecules (such as CD86), and enhanced antigen presentation and B cell proliferation.
  • CD40 can also be expressed by endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts and epithelial cells.
  • Agonistic anti-CD40 antibodies constitute one of the most effective classes of these reagents.
  • CD40 is a cell surface member of the tumor necrosis factor superfamily expressed on antigen presenting cells (APCs) such as dendritic cells, B cells and macrophages.
  • APCs antigen presenting cells
  • Preclinical studies with anti-CD40 agonists have shown that the induction of CD40 using crosslinked antibodies on antigen presenting cells (APC) can replace CD4 T cell help, which is typically provided through CD40 ligands, as well as amplification of CD8 effector T cells. But also suggests that activation can be facilitated.
  • macrophages activated by CD40 may exert direct antitumor function.
  • the anti-CD40 antibody or antigen binding fragment thereof is specifically free of CD40.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is characterized by recognizing a site different from the binding site between CD40 and CD40L, which is a ligand of CD40.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is an agent for CD40.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof may have a property that does not inhibit the interaction between CD40 / CD40L by recognizing a site different from the binding site between CD40 and CD40L which is a ligand of CD40.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (GYGFTNYL) or SEQ ID NO: 33 (NYLIE) (CDR-H1), polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (INPGYGGV) or SEQ ID NO: 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG) -H2) and a heavy chain complementarity determining site (CDRs) comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 (GGSGFAF) (CDR-H3) or the heavy chain complementarity determining site A heavy chain variable region comprising; And
  • Light chain complementarity determining site comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of (QQGNTLP) 22 (CDR-L3) or light chain variable region comprising the light chain complementarity determining site
  • Another example provides hybridomas that produce anti-CD40 antibodies.
  • Another example provides nucleic acid molecules encoding heavy chain complementarity determining sites, heavy chain variable regions or heavy chains of an anti-CD40 antibody.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining site, light chain variable region or light chain of an anti-CD40 antibody.
  • nucleic acid molecules encoding the heavy chain complementarity determining site, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-CD40 antibody and nucleic acid molecules encoding the light chain complementarity determining site, light chain variable region or light chain of the anti-CD40 antibody. It provides a recombinant vector comprising one vector together or each included in a separate vector. Another example provides recombinant cells comprising said recombinant vector. Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating a disease comprising an anti-CD40 antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example includes administering an anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and / or treatment of the disease .
  • a prophylactic and / or therapeutic pharmaceutical composition is provided.
  • Another example provides a use for the prevention and / or treatment of a disease of an anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof or for the preparation of a composition for the prevention and / or treatment of a disease.
  • the disease may be selected from cancer, cancer metastasis, infection, immunodeficiency disease, and the like.
  • anti-CD40 antibodies that specifically recognize CD40 and uses thereof.
  • the anti-CD40 antibody is characterized in that it recognizes a site different from the binding site between CD40 and CD40L which is a ligand of CD40-and may exhibit an agent activity against CD40.
  • the anti-CD40 antibody may be one that does not inhibit the interaction between the CD40 / CD40L by recognizing a site different from the binding site between CD40 and CD40L ligand of CD40.
  • not inhibiting the interaction between CD40 / CD40L means not inhibiting the CD40 / CD40L interaction to a significant level, and may be used to include some inhibition that does not cause a significant inhibitory effect. .
  • CD40 is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily, which is normal and neoplastic human B cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, CD8 + T cells, endothelial cells, monocytes and epithelial cells, and lungs, breasts, ovaries, 45-50 kDa cell-surface antigen present on the surface of many tumors (eg, solid tumors), including bladder and colon cancer.
  • CD40 is expressed on activated T cells, activated platelets, inflammatory vascular smooth muscle cells, eosinophils, synovial membranes of rheumatoid arthritis, cutaneous fibroblasts, murine and other non-lymphoma cell types.
  • CD40 acting as an antigen of an antibody provided herein may be of mammalian origin, for example human-derived CD40 (eg, NCBI access i on numbers NP—001241. 1, NP — 001289682. 1, NP ⁇ 690593. 1, NP_001309351. One , NP— 001309350. 1, etc.).
  • human-derived CD40 eg, NCBI access i on numbers NP—001241. 1, NP — 001289682. 1, NP ⁇ 690593. 1, NP_001309351. One , NP— 001309350. 1, etc.
  • the five kinds of human derived CD40 of is ' oform have a common extracel lular region, and the anti-CD40 antibody provided herein recognizes and / or binds the extracel lular region.
  • CD40 binds to its cognate ligand, CD40L (or CD154), which stimulates B cell proliferation and differentiation into plasma cells, antibody production, isotype switching, and B-cell memory production.
  • CD40L the ligand of CD40, also known as CD154, is a 32-33 kDa transmembrane protein in which two subunits, 18 kDa and 31 kDa, respectively, exist in biologically active soluble form.
  • CD40 and CD40L Interaction between CD40 and CD40L induces humoral and cell-mediated immune response.
  • CD40 regulates ligand-receptor interactions as described above to activate monocytes (B cells), and other antigen presenting cells (APCs), including dendritic cells (DCs).
  • CD40 signal transduction on monocytes and DCs improves survival as well as the secretion of cytokines (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF- ⁇ and ⁇ — ⁇ ).
  • CD40 ligation to these APCs also induces upregulation of costimulatory molecules such as ICVII-1, LFA-3, CD80, and CD86.
  • Activation of the CD40 receptor is one of the important signals that fully matures DC into an efficient APC that drives T cell activation.
  • the term "antibody” refers to a substance that is produced by stimulation of an antigen in the immune system or a protein that specifically binds to a specific antigen, and the kind thereof is not particularly limited.
  • the antibody may be an animal antibody (eg, a mouse antibody, etc.), a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody. Polyclonal antibodies.
  • the antibody herein may be understood to include antigen-binding fragments of an antibody having antigen-binding ability, unless otherwise specified.
  • “Complementar i tyi determining regions (CDR)” refers to a site that confers binding specificity with an antigen in variable region symptoms of an antibody.
  • the antigen-binding fragment of the antibody described above may be an antibody fragment comprising one or more complementarity determining regions.
  • One embodiment of the present invention provides an anti-CD40 antibody or antigen binding fragment thereof that specifically recognizes CD40 or specifically binds to CD40.
  • the recognition site or binding site on CD40 of the CD40 antibody or antigen binding fragment thereof may be a site different from the interaction site or binding site between CD40 / CD40L.
  • the CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof may have an agonist function for CD40, and the CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof may not inhibit CD40 / CD40L interaction.
  • the CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof may have activity of tumor associated macrophage (T ⁇ ) polarization and cancer eel 1 apoptosis.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof determines the complementarity of the heavy chain (Heavy chain) (com lementarity determining region, CDR) as polypeptide (CDR-H1), SEQ ID NO: 18 (INPGYGGV) or SEQ ID NO: 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (GYGFTNYL) or SEQ ID NO: 33 (NYLIE)
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is a polypeptide (CDR—L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (QDISNH) or SEQ ID NO: 35 (RASQDISNHLN) as a complementarity determining site of the light chain.
  • SEQ ID NO: 32 (STS (Xaa) n; n means the number of any amino acids Xaa, 0 (Xaa not present or an integer from 1 to 4); for example SEQ ID NO: 21 (STS) or sequence Polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 (STSRLHS)) (CDR—L2), and polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 (QQGNTLP) (CDR-L3).
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • Polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (GYGFTNYL) or SEQ ID NO: 33 (NYLIE) (CDR-H1), polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (INPGYGGV) or SEQ ID NO: 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG) -H2). And a heavy chain complementarity determining site comprising a polypeptide (CDR-H3) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 (GGSGFAF) or a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining site; And
  • the heavy chain variable region may include an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 23, 24, 25, 26, 27, or 28 (see Table 1 and Table 6).
  • the light chain variable region may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 29, or 30 (see Table 1 and Table 6).
  • Chimeric antibodies that are produced by immunizing a desired antigen with an immunized animal generally cause immunity rejection when administered to humans for therapeutic purposes, and chimeric antibodies (chimeric ant ibody) have been developed to suppress such immune rejection reactions. It became. Chimeric antibodies are those obtained by replacing the constant region of an animal-derived antibody causing an anti-isotype reaction with a constant region of a human antibody using genetic engineering methods. Chimeric antibodies are animal. Significant improvements have been made in anti-isotype reactions compared to derived antibodies, but animal-derived amino acids are still present in the variable region, which has side effects on potential anti-idiotypic reactions. Humanized antibodies have been developed to ameliorate these side effects. It is produced by implanting a region of the human antibody framework (complex) determining regions (CDRs) that play an important role in the binding of the chimeric antibody to the variable region of the antigen.
  • CDRs human antibody framework
  • the most important in the CDR grafting technique for the production of humanized antibodies is to select optimized human antibodies that can best accept the CDR regions of animal-derived antibodies. Analysis of crystal structures, molecular modeling techniques, etc. are utilized. However, even when the CDR region of an animal-derived antibody is implanted into an optimized human antibody skeleton, there are many cases where the antigen-binding capacity is not conserved because some amino acids are located in the skeleton of the animal-derived antibody and affect antigen binding. Therefore, the application of additional antibody engineering techniques to restore antigen binding capacity is essential.
  • the antibody may be an animal antibody (eg a mouse antibody), a chimeric antibody (eg a mouse-human chimeric antibody) or a humanized antibody.
  • the chimeric antibody is an animal antibody (eg a mouse antibody), a chimeric antibody (eg a mouse-human chimeric antibody) or a humanized antibody.
  • the chimeric antibody is an animal antibody (eg a mouse antibody), a chimeric antibody (eg a mouse-human chimeric antibody) or a humanized antibody.
  • the chimeric antibody is
  • the C-terminal region of the heavy chain variable region (including the heavy chain variable region of the mouse antibody and the constant region of human immunoglobulin (IgG (IgGl. IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM, IgA, IgD, or IgE)) Heavy chains)
  • a light chain comprising a light chain variable region of a mouse antibody and a kappa (K) or lambda ( ⁇ ) type constant region (coupling the C terminus of the light chain variable region with the N terminus of the constant region).
  • the chimeric antibody may include a heavy chain variable region of a mouse antibody and a constant region of human Ig (eg, human IgGl, human IgG2, human IgG3, or human IgG4) as a chain.
  • the chimeric antibody may be a heavy chain comprising a heavy chain variable region of a mouse antibody and a constant region of human IgG4.
  • the humanized antibody is a humanized antibody.
  • CDRs heavy chain complementarity determining sites
  • IgG immunoglobulins
  • IgM immunoglobulins
  • IgA immunoglobulin A
  • IgD immunoglobulins
  • i g E Reinforcement comprising a region region
  • Light chain CDRs of mouse antibodies, and kappa) ⁇ are light chains comprising a lambda ( ⁇ ) type framework and constant regions.
  • the humanized antibody may be one comprising the heavy chain CDRs of a mouse antibody and frameworks and constant regions of human IgGs such as human IgGl, human IgG2, human IgG3, or human IgG4.
  • the humanized antibody may be one comprising a heavy chain CDR of a mouse antibody and a framework and constant regions of human IgG4 as heavy chains.
  • a complete antibody is a structure with two full length light chains and two full-light chains, each light chain linked by a heavy chain and disulfide bond.
  • the constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has a gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) type, subclass gamma 2 gamma 2), and has a gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • variable chain refers to a variable region domain V H comprising an amino acid sequence having a variable region sequence sufficient to confer specificity to an antigen and 3 constant region domain C H1, full-length heavy and 'thereof comprising the C H2 and C H3, and a hinge (hinge). Is interpreted to include all fragments.
  • light chain also refers to both the full-length light chain and fragment thereof comprising the variable region domain V L and the constant region domain C L comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. It is interpreted to include.
  • CDR complement ar i t y determining region
  • the heavy and light chains may each comprise three CDRs (CDRHl, CDRH2, CDRH3 and CDRLl, CDRL2, CDRL3).
  • the CDRs can provide key contact residues for the antibody to bind antigen or epitope.
  • the terms “specifically bind” or “specifically recognized” are the same as those commonly known to those skilled in the art, antigen and. Antibodies react specifically to immunological reactions.
  • antigen binding fragment is a fragment thereof for the entire structure of an immunoglobulin, which refers to a polypeptide and part comprising a moiety to which an antigen can bind, eg, scFv, (scFv) 2 , Fab, Fab 'or F (ab') 2 may be, but is not limited to.
  • Fab in the antigen-binding fragment has one antigen-binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and a first unchanged region (C H1 ) of the heavy chain.
  • Fab ′ differs from Fab in that it has a hinge region comprising at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CHI domain.
  • the F (ab ') 2 antibody consists of disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab' . Is generated. Fv is heavy chain. Recombinant techniques for generating Fv fragments from fragments of the antibody that only have variable and light chain variable regions are well known in the art.
  • Double-chain FvCtwo-chain Fv is a non-covalent bond in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked, and the single-chain Fv is generally covalently linked to the variable region of the heavy chain and the short chain variable region through a peptide linker. Double chained or linked directly at the C-terminus . Like Fv, the structure may be dimer-like.
  • the antigen binding fragment can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields a Fab). And cleaved with pepsin to obtain F (ab ') 2 fragments), which can be produced by genetic recombination techniques.
  • proteolytic enzymes e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields a Fab.
  • pepsin e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields a Fab
  • F (ab ') 2 fragments e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields a Fab.
  • flankinge region refers to a region included in the heavy chain of an antibody, which exists between the CH1 and CH2 regions, and which functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody. .
  • the anti CD40 antibody may be a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it may be manufactured using a phage display technique.
  • anti-CD40 antibodies can be prepared as monoclonal antibodies derived from mice by conventional methods.
  • individual monoclonal antibodies can be screened based on their ability to bind to CD40 using a typical Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) format. Assays can be assayed for inhibitory activity through functional assays such as competitive ELISA or cell-based assays to assay molecular interactions for the conjugates. The respective Kd values for CD40 can then be assayed for selected monoclonal antibody members based on strong inhibitory activity. The final selected antibodies can be prepared and used as humanized antibodies, as well as human immunoglobulin antibody antibodies other than the antigen-binding portion. Methods of making humanized antibodies are well known in the art. (Ali Mgro, JC and Fransson, .J., "Humanizat ion of ant i bodies,! L Front lers in Bioscience, 13 (2008), 1619--1633).
  • hybridoma that produces the anti-CD40 antibody.
  • the hybridoma may be one having accession number KCLRF-BP-00381.
  • Another example provides a hybridoma producing the anti-CD40.
  • An antibody or an antigen binding fragment which.
  • CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, or a combination thereof heavy chain complementarity determining regions (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, or a combination thereof) of the anti-CD40 antibody produced by the hybridoma, light chain complementarity determining regions (CDR-L1. CDR-L2, CDR-L3 ′ or a combination thereof. Or combinations thereof; Or an anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof of the anti-CD40 antibody produced by the hybridoma.
  • the complementarity determining region may be determined by any conventional method, for example, IMGT definition (http://www.inigt.org/IMGT_vquest/share/textes/) or Cabat definition (ht tp: //www.bioinf.org.uk/abs/), but is not limited thereto.
  • IMGT definition http://www.inigt.org/IMGT_vquest/share/textes/
  • Cabat definition ht tp: //www.bioinf.org.uk/abs/
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating a disease comprising the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • use of the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the treatment and / or prophylaxis of a disease, or for use in the manufacture of a composition for the treatment and / or prophylaxis of a disease is provided.
  • a method of preventing and / or treating a disease comprising administering a therapeutically effective amount of the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof to a patient in need thereof. .
  • the method of preventing and / or treating the disease may further comprise identifying a patient in need of preventing and / or treating the disease prior to the administering step.
  • the disease may be selected from cancer cancer metastasis, infection, immunodeficiency disease, and the like.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the formulation of drugs, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline Selected from the group consisting of cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineryl-oil, etc. May be more than one species, but It is not limited.
  • the pharmaceutical composition may also further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • An effective amount of the pharmaceutical composition, or the antibody or antigen-binding fragment thereof, may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, or topical administration of lesion site.
  • the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may be childized into target cells.
  • the amount of the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof in the pharmaceutical composition or the dosage of the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is formulated. It may be prescribed in various ways, such as by the method, the mode of administration, the age, body weight, sex, morbidity of the patient, food, time of administration, interval of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity.
  • the daily dose of the CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof is 0.001 to 1000 mg / kg, specifically 0.01 to 100 mg / kg, more specifically 0.01 to 50 mg / kg, more specifically 0.1 to 1.
  • the daily dosage may be formulated into one formulation in unit dosage form, may be formulated in appropriate quantities or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the pharmaceutical composition may be co-administered with other drugs such as other anticancer agents, and the dosage, method of administration and type of other drugs may be appropriately prescribed according to the condition of the patient.
  • compositions may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, etc. It may further include a topic.
  • the patient to be administered the pharmaceutical composition may be a mammal including a primate including a human, a monkey, and the like, a rodent including a mouse, a rat, and the like.
  • the cancer may be solid cancer or hematologic cancer, but is not limited to squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, skin, skin or intraocular melanoma, rectal cancer, Anal muscle cancer, 'esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, leukemia (eg chronic or acute leukemia), lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer Ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver tumor, breast cancer, colon cancer, colon cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, head and neck cancer, brain cancer, osteosarcoma It may
  • Treatment of cancer herein may mean any anti-cancer action that prevents, alleviates, or improves the symptoms of cancer, such as inhibiting the proliferation of cancer cells, killing cancer cells, inhibiting metastasis, or partially or completely eradicate cancer.
  • the anti-CD40 antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to CD40, it can be detected or confirmed by using this. Therefore, another example of the present invention is the anti-CD40 antibody or antigen binding thereof Provided is a composition for detecting CD40 comprising a fragment. Another yes is processing the anti-CD40 antibody or an antigen-binding fragment to the biological sample; And it provides a detection method of CD40 comprising the step of confirming the antigen-antibody response. In the detection method, when an antigen-antibody reaction is detected, it can be determined (determined) that CD40 is present in the biological sample. Therefore, the detecting method may further include determining that CD40 is present in the biological sample when the antigen-antibody reaction is detected after the checking.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of (isolated) cells, tissues, body fluids, cultures thereof, etc. obtained from mammals, such as humans (eg cancer patients).
  • the step of determining whether the antigen-antibody reaction can be carried out through various methods known in the art. For example, conventional enzyme reactions. Neon. Can be measured via luminescence and / or radiation detection, specifically. Immunochromatography (I ⁇ unochromatography),
  • Immunohistochemical staining Inimunohi stochemi stry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (Floresence) immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting, microarray, etc., but may be measured by a method selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • the heavy chain complementarity determining site, light chain complementarity determining site, or a combination thereof of the anti-CD40 antibody described above Or a polypeptide molecule comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof.
  • the polypeptide molecules can be used in the production of antibodies as precursors of antibodies, as well as protein scaf folds (such as peptibodies) having structures similar to antibodies, bispecific antibodies. It may be included as a component of a multispecific antibody.
  • Another example provides nucleic acid molecules encoding heavy chain complementarity determining sites, heavy chain variable regions or heavy chains of an anti-CD40 antibody.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining site, light chain variable region or light chain of an anti CD40 antibody.
  • Heavy chain variable region or nucleic acid molecule encoding heavy chain and light chain of anti-CD40 antibody Provided are recombinant vectors comprising one vector together with nucleic acid molecules encoding complementarity determining sites, light chain variable regions or light chains, or in separate vectors, respectively.
  • vector refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, r retrovirus vectors and adeno-associated virus vectors. Can be used as the recombinant vector .
  • Vectors with plasmids often used in the art eg, pSClOl, pGV1106, pACYC177, ColEl, pKT230, ⁇ 290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, P BD9, P HC79, IJ61, pLAFRl, pHV14, pGEX series, pET series and pUC19, etc.
  • phage e.g., gt4 B, ⁇ -Charon, ⁇ ⁇ , M13, etc.
  • viruses e.g. SV40, etc.
  • the nucleic acid molecule can be operably linked to a promoter.
  • operatively l inked refers to a functional bond between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • a nucleotide expression control sequence eg, a promoter sequence
  • Such regulatory sequences may be 'operatively 1 inked' to thereby regulate ' transcription and / or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a pL promoter, a CMV promoter, a / ⁇ promoter, an Asc promoter, an ac promoter
  • ribosomal binding sites for initiation of translation and transcription / detox termination sequences.
  • a replication origin that operates in the eukaryotic cell included in the vector is fl replication origin.
  • SV40 replication origin pMBl replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin and BBV replication origin and the like, but are not limited thereto.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters
  • Mammalian promoters derived from viruses e.g., adenovirus late promoter, the back shinny "Oh virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, the promoter ⁇ - mat HSV
  • viruses e.g., adenovirus late promoter, the back shinny "Oh virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, the promoter ⁇ - mat HSV
  • the transcription termination sequence polyamic It generally has a denylation sequence.
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into a suitable host cell. remind.
  • the host cell may be any host cell known in the art as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector, and as a prokaryotic cell, for example, E. coli JM109, E. coli BL21. , E. coli RRl, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus genus strains such as Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia Marseille CL and are a variety of Pseudomonas species and strains and the like jangnaegyun like, if, for transforming a eukaryotic cell i is used as a host cell, -S- Saccharoinyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, for example, Sp2 / 0, CH0 (Chinese hamster ovary) Kl, CHO DG44, PER. C6, W138, BHK COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the delivery (introduction) of the nucleic acid molecule or the recombinant vector comprising the same into a host cell may employ a delivery method well known in the art.
  • a delivery method well known in the art.
  • the host cell is a prokaryotic cell
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • a micro-injection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, Liposomal-mediated transfection methods and gene bombardments may be used, but are not limited thereto.
  • the method for selecting the transformed host cell can be easily carried out using a phenotype expressed by a selection label, according to methods well known in the art.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another example provides a method of producing an anti-CD40 antibody comprising expressing the nucleic acid molecule or a recombinant vector comprising the same in a host cell.
  • the method comprises the steps of culturing a recombinant cell comprising said recombinant vector, and optionally isolating and / or purifying the antibody from the culture medium. It may be to include a step.
  • the present invention provides an anti-CD40 antibody that specifically binds to CD40, has an agonist activity against CD40, and does not inhibit the interaction between CD40 / CD40L, thereby enabling more effective cancer treatment. .
  • rCD40 recombinant human CD40
  • rCD40L recombinant antigen human CD40L
  • FIG. 2 is a graph showing binding affinity of three chimeric 5C2 antibodies to human CD40 (Chimeric IgGl: chimeric antibody comprising human IgGl constant region; Chimeric IgG2: chimeric antibody comprising human IgG2 constant region Chimeric IgG4: chimeric antibody comprising human IgG4 constant region; CP870.893: control antibody; (-): no antibody treatment).
  • FIG. 3 is a graph showing binding affinity for human CD40 antibodies of eight humanized 5C2 antibodies (VH1VL1: Combination of heavy chain VH1 with light chain VL1; Heavy chain VH2VL1: Combination of VH2 with light chain VL1; VH3VL1: Heavy chain VH3 with light chain VL1) Combination; VH5VL1: combination of heavy chain VH5 and light chain VL1; VH1VL2: combination of heavy chain VH1 and light chain VL2; VH2VL2: combination of layered chain VH2 and light chain VL2; VH3VL2: combination of heavy chain .VH3 and light chain VL2; VH5VL2: heavy chain VL22: heavy chain (-): Antibody-free group; Positive: chimeric 5C2 antibody comprising a human IgG4 variable region).
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of CD80 when treated with monoclonal antibody 5C2 in dendritic cells as a relative value to a control (no treat: no antibody treated group).
  • FIG. 6 is a graph showing the expression level of CD86 when treated with monoclonal antibody 5C2 in dendritic cells as a relative value to a control (no treat: no antibody treated group).
  • 7 is a graph showing the expression level of CD83 when treated with monoclonal antibody 5C2 in dendritic cells as a relative value to a control (no treat: no antibody treated group).
  • Toll like receptor 1 igand Lipopolysaccharid; is a graph showing the relative value of the CD80 'control the degree upon expression of' LPS) and a single combination of keulreun antibody 5C2 'treatment (antibody untreated group).
  • FIG. 9 is a graph showing the expression level of CD83 in the combination treatment of Toll like receptor 1 igand (Lipopolysaccharid (LPS)) and monoclonal antibody 5C2 as a relative value to the control group (antibody-treated group).
  • Toll like receptor 1 igand Lipopolysaccharid (LPS)
  • LPS Lysaccharid
  • FIG. 10 shows the degree of CD86 expression in the treatment of human IgGl chimeric IgGl, human IgG2 chimeric antibody, and human IgG4 chimeric IgG4 of monoclonal antibody 5C2. Graph relative to untreated antibody).
  • FIG. 11 shows the degree of CD83 expression in the treatment of human IgGl chimeric antibody (chimeric IgGl), human IgG2 chimeric antibody (chimeric IgG2), and human IgG4 chimeric antibody (chimeric IgG4) of monoclonal antibody 5C2. Graph relative to untreated antibody).
  • Figure 12 CD86 expression in combination treatment with human IgGl chimeric antibody (chimeric IgGl), ingin 'IgG2 chimeric antibody (chimeric IgG2), or human IgG4 chimeric antibody (chimeric IgG4) of monoclonal antibody 5C2 with Interferon gamma. It is a graph showing the degree relative to the control (no treat: no antibody treated group).
  • FIG. 16 is a graph showing (%) Ramos tumor cell line apoptosis efficacy induced by chimeric .5C2 antibody
  • Human IgGl irrelevant human IgGl ;. c5C2 IgGl: IgGl: chimeric 5C2 antibody comprising a human IgGl constant region; C5C2 IgG2: chimeric 5C2 antibody comprising a h ⁇ an IgG2 constant region; c5C2: chimeric 5C2 antibody comprising a human IgG4 constant region; CP870,893: control antibody; Rituximab: control antibody).
  • FIG. 17 is a graph showing the percentage of Raji tumor cell line autoapoptosis induced by humanized 5C2 antibody (7 humanized 5C2 antibodies, VH1VL2, VH2VL1, VH2VL2, VH3VL1, VH3VL2, VH5VL1, VH5VL2; (-): antibody Untreated group; Human IgG: irrelevant human IgGl; CP870,893: control antibody).
  • FIG. 18 is a graph showing the degree of T cell activation by 5C2 antibody under super-antigen SEB conditions.
  • SEB Staphylococcal Enterotoxin B
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • IFN-gaVIIa content which was added additionally and secreted is shown (4 humanized antibody 5C2; (-): antibody-free group; Human IgG: irrelevant human IgGl; CP870,893: control antibody).
  • 19 is a graph showing the change in tumor size when treated with chimeric 5C2 I g G2 antibody alone in xenograft mouse animal models according to days after antibody injection.
  • 20 is a graph showing the change in tumor size when chimeric 5C2 antibody was treated in a xenograft mouse animal model injected with human dendritic cells and PBMC according to days after antibody injection.
  • mice Made by fusion of splenocytes of Balb / c rats injected with human recombinant protein CD40 antigen and myeloma cell line X63-Ag8.653 (ATCC, PTA ⁇ 8431) of 8-azaguanine resistant mice .
  • Balb / c rats received 100 ug of human CD40 recombinant antigen at 6-week intervals for 6 weeks. Intraperitoneal ; The immune response was induced by injection, and spleens were extracted 3 days after the last additional hybrid to produce cell suspension. According to the method of Keller and Milstein (Koeler & Milstein 1975), 10 8 splenocytes and 10 7 myeloma cells were obtained from 50% polyethylene glycol 400 in Dulbeco's modified Eagle's inediLim (DMEM). Cells fused using: fused.
  • DMEM Dulbeco's modified Eagle's inediLim
  • DMEM culture HAT culture
  • fetal bovine serum 100 uM hypoxanthine, 0.44 uM aminopterin and 16 uM thymidine.
  • 96-well plates were aliquoted and incubated in an incubator with 37 ° C., 5% C02.
  • ELISMEnzyme-Linked I ⁇ unoSorbent Assay method was selected.
  • the positive group was a case where 10 5 or more cells were formed per single well. Cells were taken from wells in which colonies with high antibody titers of supernatant were formed and subcloned according to the limiting dilution assay method to obtain monoclonal cells with high antibody titers. It was stored for.
  • the monoclonal cell line 5C2 producing antibodies that specifically respond to recombinant antigen human CD40 could be selected.
  • the obtained cell line was deposited with the Korean Cell Line Research Foundation (KCLRF), located in Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seolle-si, Korea, on November 2, 2016, and was granted accession number KCLRF-BP-00381. 1-1-3. Monoclonal Antibody Production from Selected Monoclonal Cell Lines
  • Cell line 5C2 established in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum was incubated for 2 weeks at 37 ° C and C0 2 conditions.
  • Anti-CD40 antibody 5C2 and anti-CD40L 5C8 were each diluted in phosphate buffered saline at 1.0 ug / mL, each added 100 uL per well and reacted at 37 ° C for one hour. , Washed three times with phosphate buffered saline and treated with the secondary antibody Goat ant i -Mouse IgG-HRP. After reaction at 37 ° C. for 30 minutes, the solution was pretreated three times with phosphate saturated saline, and 100 uL per well of TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No. 002023) was added. 100 uL of 1.0 N sulfuric acid solution was added to terminate the color development, and the absorbance was measured at 450 nm.
  • FIG. 1 the y axis represents absorbance.
  • the 5C2 antibody specifically binds to the human CD40 antigen, without cross-reactivity to CD40L or human IgG. 1-2.
  • heavy chain expression plasmids and light chain expression plasmids were prepared, respectively. Both heavy and light plasmids for expression were pcDNA3.4 (Invitrogen) vector.
  • variable region coding cDNAs of heavy and light chains for antibody expression were cloned using Ig-Primer sets (Novagen), inserted into pCR2.1 vector (Invitrogen, Cat. No .: K200001), and then sequenced. DNA sequencing was confirmed, and mouse antigenic genes were identified through IMGT site ( ⁇ w. Imgt.org).
  • variable and light chain variable regions of the mouse .5C2 monoclonal antibody and coding gene sequences thereof are shown in Table 1 below.
  • variable region coding cDNA and the constant region coding cDNA of each antibody were summed up (Bioneer).
  • the heavy and light chain expression genes synthesized as described above were cut with restriction enzymes Xho I and EcoRl, and the heavy and light chain fragments were l igat ionized into the PCDNA3.4 vector to express three heavy and one light chain antibodies. Produced.
  • the amino acid sequences of the heavy and light chains and their coding gene sequences of the three chimeric antibodies prepared as above are summarized in Table 2 below:
  • STAST GPSVFPLAPCSRS C TGTGAC include GTGTCTACAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTGnCCCTCTGGCC) VTVSWNSGALTSGVHTFPA GATTATnCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCHGGAACAGCGGAGCCCTGACTAGC of TSESTAALGCLVKDYFPEP CCATGHCTAGGTCTACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTCGGCTGTCTGGTGAAG heavy chain VLQSSGLYSLSSVVTVPSS GGAGTGCACACC CCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACAGCCTCTCTCTCTCT
  • VD TVERKCCVECPPCPAP GTGGATCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGATAAGACCGTGGAGAAAGTGC
  • VYTLPPSREEMTKNQVSLT ATTGAGAAGACCATCAGTAAGACCAAGGGACAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTAC
  • CARGGSGFAFWGQGTLYrV CGTCTATTm nnnxx AGTGGcrnraTn ⁇ g STASTKGPSVFPLAPCSRS CTTGTGAamxnCTACAGCTTCCACC GGGCCCCTCCGTGnCCCTCl ⁇ include) VTVSWNSGALTSGVHTFPA GACTACnCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGCGCACTGACCAGC of TSESTAALGCLVKDYFPEP CCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAG reprinted VLQSSGLYSLSSVVTVPSS GGCGTGCACACCnGCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC
  • VDKRVES YGPPCPPCPAP GTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTAC
  • AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAATGA (SEQ ID NO: 10) light chain DIQ triTSSLSASLGQRV GACA CCAMTGACCCA CCACCrcCTCACrrcCGCATCTCrrGGACAAAGAG TISCRASQDISNHLNWYQQ TCACCATCTCC GTAGGGCMGTCMGACATCTCCMCCACCTCMC GGTACCA KPNGTVRLLISSTSRLHSG GCAGMGCC ACGGAACraTAGGT GTrGATCTCCAGCACCrCACG r GCAC VPSRFSGSGSGTDYSLTIS TCAGGAGTACCATCA (ATOAGCGCTAGTGGTTCTGGTACAGATTACAGCTTGA NLEQEDIATYFCQQGNTLP CCATTAGCMCCTGGAGCAGGAGGATATTGCTACCTACrrc GCCAGCAG GCM WTFGGGTKLEIKRTVAAPS TACCC GCCTTGGACATTTGGGGGGGGCACA ACTGGAMT
  • Anti-CD40 human antibody CP870, 893 (US7338660 B2; 21.4. 1 antibody) was synthesized together for use as a positive control antibody (control antibody).
  • the vector for expression of pcDNA3.4 was produced together in the same manner.
  • An antibody prepared using the sequence information of the CP870 / 893 antibody (US7338660 B2; 21.4. 1 antibody) for use as a control antibody was named CP870, 893 antibody analog.
  • the amino acid sequences and coding gene sequences used to construct the CP870.893 antibody analogs are summarized in Table 3 below:
  • VTHQGLSSPVTKSFNRGEC AGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC
  • expression vectors of three heavy chains including the constant regions of human IgGL human IgG2 and human IgG4 respectively
  • one light chain including the kappa constant regions
  • Transient transformation yielded IgGl chimeric antibodies (including constant regions of human IgGl), IgG2 chimeric antibodies (including constant regions of human IgG2), and IgG4 chimeric antibodies (including constant regions of human IgG4), respectively.
  • the ExpiCHO—S cell line provided by the ExpiCHO Expression system kit (Termof isher, Cat.No.:A29133) was thawed and placed in the expression medium and cultured at 37 ° C, 8% C0 2 , and 120 rpm to obtain the necessary cell lines. .. After recovering ExpiCHO—S cells 6 X in Expression medium . 150 niL was prepared by inoculating 10 6 cells / mL.
  • the obtained culture solution was sterilized and injected into a HiTrap Protein A HP column (GE Healthcare, Cat. No.: 11- 0034 ⁇ 93) equilibrated with a Protein A equilibration buffer (20mM phosphate, pH7.4), and the equilibration buffer was washed by washing. Then, it was recovered with an elution buffer (20 mM Citric acid pH3.0). The recovered antibody was dialyzed in phosphate buffered saline : the buffer was replaced and used for subsequent testing.
  • a HiTrap Protein A HP column GE Healthcare, Cat. No.: 11- 0034 ⁇ 93
  • Recombinant antigen human CD40 (Sino Biolobical Inc., Cat. No .: 10774—H02H) was diluted in phosphate buffered saline at a concentration of 1.0 ug / mL and added to the microplate at 100 uL / well for 1 hour at 37 ° C. 200
  • CP870,893 analogues (21.4.1 antibodies in Table 2) were serially diluted from 10.0 ug / mL concentration to 100 uL / well, reacted at 37 ° C for 1 hour, washed three times with phosphate buffered saline, and then the secondary antibody.
  • Goat ant i-Human IgG F (ab ') 2-HRP Jackson Immunoresearch, Cat. No .: 109-035—006) was treated. After reaction at 37 ° C. for 30 minutes, washed three times with phosphate buffered saline, and then added 100 uL per well of TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No. 002023). 100 uL of 1.0 N sulfuric acid solution was added to terminate the color development, and the absorbance was measured at 450 nm.
  • the A450 nm absorbance of the 3 ⁇ 4 chimeric antibody thus obtained is shown in FIG. 2 ((—) means a control not treated with the antibody). As shown in FIG. 2, all three anti-CD40 chimeric antibodies showed an affinity for CD40 or more compared to the control antibody.
  • an anti-CD40 humanized antibody was prepared.
  • the humanized antibody sequence was selected by in silico method, which retained the CDR region sequence of each of the repetitive and light chains of the mouse CD40 antibody 5C2, and recombined the region sequence for the framework region based on the germline sequence encoding the human antibody gene.
  • the table is provided, wherein the 1 - CD40 mouse antibody heavy chain variable region and light chain variable region sequence with the heavy chain based on the CDR of the 5C2; determining (Complementary Results 3 ⁇ 4 region complementarity determining region) and light chain CDR, respectively (IMGT / V- QUEST (see http://www.imgt.org/IMGT—vquest/share/textes/), summarized in Table 4 below:
  • the heavy chain sequence was completed by linking the variable region chain sequence selected by the In silico method to the human IgG2 constant region, and the light chain variable region sequence was linked to the kappa light chain constant region to complete the light chain sequence. After converting the selected amino acid sequence into a gene sequence encoding, the gene fragment having the sequence was synthesized (Cosmogenetech).
  • the coding gene fragments of the light chain and the light chain prepared as described above were transferred to the pCDNA3.4 vector, respectively, and eight humanized antibodies were combined with four heavy chains (VH1, VH2, VH3 and VH5) and two light chains (L1 and L2).
  • VH1VL1 Combination of VH1 and VL1; VH2VL1: Combination of VH2 and VL1; VH3VL1: Combination of VH3 and VL1; VH5VL1: Combination of VH5 and VL1; VH6VL1: Combination of VH6 and VL1; Combination of VH1VL2: VH1 and VH2 : Combination of VH2 and VL2; VH3VL2: Combination of VH3 and VL2; VH5VL2: Combination of VH5 and VL2; VH6AVL2: Combination of VH6 and VL2) and ViaFect Trans feet ion Reagent (Pr omega, Cat. After inducing expression in CHO cells (Sigma, Cat. #: 85050302), supernatants were taken for 2 additional days of culture.
  • Reactivity of each humanized antibody culture against recombinant antigen human CD40 was analyzed by ELISA method. After diluting rCD40 in phosphate buffered saline at 1.0 iig / mL and adding 100 uLAvell to the microplate, it was reacted at 37 ° C for 1 hour and coated. Then, 200 ul per well of lx blocking solution (signia) was added and reacted at 37T for 1 hour for blocking. .
  • Each humanized, anti-CD40 antibody culture solution was added 100 uL and reacted at 37 ° C for one hour, washed three times with phosphate buffered saline, and the secondary antibody Goat ant i -Human IgG F (ab ') 2-HRP (Jackson I ⁇ unoresearch, Cat. No .: 109-035-006) was treated. After reaction at 37 ° C. for 30 minutes, washed three times with phosphate-buffered saline solution and TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No .: 002023) 100 uL of sugar was added and reacted for 5-10 minutes in a room temperature cow. 100 uL of 1.0 N sulfuric acid solution was added to terminate the color development, and the absorbance was measured at 450 nm. .
  • Blocking test was performed to determine whether 5C2 antibody (mouse antibody) influences the interaction between CD40 and CD40L in human body.
  • 5C2 antibody and Isotype control antibody were respectively dialyzed in 0.1 M sodium bicarbonate buffer to replace the buffer, and then 1.0 nig of antibody solution was prepared, respectively.
  • FITC Isomer I Invitrogen, Cat. No .: F1906
  • DMSO Sigma-Aldr.ich, Cat. No.:276855
  • monocyte-derived dendritic cells were prepared by differentiation, and the efficacy of the anti-CD40 antibody was tested.
  • PBMC pellet was suspended in 10% fetal bovine serum RPMI medium, and then transferred to a cell culture dish (V0M plastic crop., Cat.No.:V100D) and incubated at 37 ° C and 5% C0 2 for 4 hours.
  • rhGM-CSF Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (JW creagene) and rhIL-4) to differentiate dendritic cells. JW creagene) was treated with 5 ⁇ 10 3 uni t / mL, respectively. On days 3 and 6 of culture, rhGM CSF and rhIL-4 were added at 5 ⁇ 10 3 un / inL, respectively, replacing with fresh 10% fetal bovine serum RPMI culture.
  • rhGM-CSF Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
  • dendritic cells were detached with Trypsin-EDTA buffer (Thermo, Cat. No .: R001100), washed with 10% fetal bovine serum RPMI culture, and fractionated in 24 well or 12 well cell culture dishes.
  • Anti-CD40 antibody and various reagents were treated according to the test purpose and further cultured for 2 to 5 days, and then the change of dendritic cells was analyzed.
  • dendritic cells were detached using Trypsin-EDTA (Thermo, Cat. No .: R001100).
  • Trypsin-EDTA Trypsin-EDTA
  • To identify dendritic cells to stain dendritic cells with anti-CDllc antibody -FITC (eBiosceince, Cat. No .: 11-0116-42) and to measure the degree of activation, anti-CD80 antibody -PECy5 (eBiosceince, Cat No .: 15-0809-42), anti-CD86 antibody - ⁇ (eBiosceince. Cat.
  • the obtained fluorescence intensity was calculated as a relative value with respect to the control (non-antibody group; 100%), and FIG. 5 (relative expression level of CD80), FIG. Relative expression level) and Figure 7 (relative expression level of CD83) (in Figures 5-7 ' , GAM means cross-linked secondary antibody Goat ant i -Mouse IgG (H + L)).
  • FIGS. 5 to 7 the 5C2 monoclonal antibody induced overexpression with the co-stimulatory factors CD80, CD83, and CD86, and it can be seen that the effect is further increased when crosslinking is induced with the secondary antibody.
  • TLR Toll like receptor
  • LPS lipopolysaccharid
  • the obtained fluorescence intensity was calculated as a relative value with respect to the control (non-antibody group; 10OT) and is shown in FIG. 8 (relative expression level of CD80) and 9 (relative expression level of CD83) (in FIGS. 8 and 9, GAM refers to the secondary antibody Goat ant ⁇ -Mouse IgG (H + L) for crosslinking).
  • FIGS. 8 and 9 LPS alone induced some overexpression of CD80 and CD83, but when LPS was added to 5C2 cross-linking conditions, overexpression of CD80 and CD80 was significantly increased.
  • dendritic cells were detached using Trypsin-EDTA (Thermo, Cat. No .: R001100).
  • staining dendritic cells with anti-CDllc antibody -FITC eBiosceince, Cat. No .: 11-0116-42
  • anti-CD86 antibody -PE eBiosceince, Cat
  • anti-CD83 antibody -APC eBiosceince, Cat. No .: 17-0839 ⁇ 42
  • the obtained fluorescence intensity was calculated as a relative value to the control group (no treat; 100%) and is shown in FIGS. 10 (relative expression level of CD86) and 11 (relative expression level of CD83).
  • variable regions of the three 5C2-derived chimeric antibodies were identical, indicating no significant difference in reactivity to recombinant antigen human CD40 (FIG. 2). As shown in FIGS. 10 and 11, isotype in terms of activation of dendritic cells. Depending on the difference was observed. In the case of mouse 5C2 antibody, cross-linking antibody was necessary for inducing co-stimulatory molecule overexpression. In chimeric antibodies of the IgG2 or IgG4 type, it can be confirmed that CD86 and CD83 are overexpressed in dendritic cells without cross-linking antibodies. Moreover, 5C2 IgG4 chimeric antibodies showed superior dendritic cell activation efficacy compared to Pfizer CP870,893 analogues, which are known to best induce dendritic cell activation.
  • T cell activation is known to be an essential requirement to interferon gamma directly involved in dendritic cell differentiation.
  • interferon ga ⁇ a IFN
  • interferon gamma Pepprotech
  • Dendritic cells were detached using Trypsin-EDTA (Thermo, Cat. No .: R001100).
  • eBiosceince.. Cat. No .: 11-0116-42 To measure the degree of activation, anti-CD86 antibody-PE (eBiosceince, Cat. No .: 12-0869-42) and anti-CD83 antibody-APC (eBiosceince, Cat. No .: 1G 0839-42), respectively Staining together, the expression level of the costimulatory factors CD83 and CD86 was measured through the detected fluorescence intensity.
  • the obtained fluorescence intensity was calculated as a relative value to the control group (antibody and interferon gamma untreated group (N); 100%) and is shown in FIG. 12 (relative expression level of CD86) and FIG. 13 (relative expression level of CD83)
  • N no treatment with antibody and interferon gamma
  • N + IFN treatment with interferon gamma only
  • IgG2 treatment with IgG2 chimeric antibody only
  • IgG2 + IFN treatment with IgG2 chimeric antibody and interferon gamma
  • IgG4 treatment with IgG4 chimeric antibody only
  • IgG4 + IFN IgG4 chimeric antibody and interferon gamma treatment
  • CP8 CP870.893 analog only
  • CP8 + IFN CP870.893 analog and interferon gamma treatment
  • CD86 and CD83 overexpression is induced by Interferon gamma, chimeric antibody.
  • synergistic effects of CD86 and CD83 expression by interferon gamma addition were observed with the combination of IgG4 isotype chimeric antibody.
  • Example 4 CD8 T Cell Activation Effect in Dendritic Cells
  • the T cells When dendritic cells recognize the external antigen and construct a C / external antigen complex and present it to the T cells, the T cells are recognized and activated to efficiently remove the external antigen.
  • anti -CD40 antibody provided by the present embodiment is able to induce T cell activation by activated dendritic cells and continuous ", using the bucket lymphoma cell line, Ramos a foreign epitope was tested whether T cell activation It was.
  • Ramos cell lines (ATCC, ATCC CRL-1596) were incubated in 10% fetal calf serum PMI medium, followed by repeated thawing for two to dissolve the cell lines and centrifugation to remove precipitates. After taking the supernatant (Ramos lysate) 3 ⁇ 4- absorbance value at 280 nm wavelength was randomly set to the concentration unit "mg / mL".
  • Dendritic cells were prepared by differentiating monocytes from monocytes as in Example 3-1, and then, 5 x 10'Vwell was dispensed into 12 well culture clish, and the prepared Ramos lysate was 3 ⁇ 4 in dendritic cells at a concentration of 20 ug / mL.
  • Anti-CD40 antibody effects For comparison, three chimeric 5C2 antibodies (chimeric IgGl, chimeric IgG2, and chimeric IgG4) and CP870,893 analogs (US7338660 B2; 21.4.1 antibody; see Table 3) were added at 10 ug / niL concentrations, respectively. It was.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Raji bucket lymphoma cell lines (ATCC, ATCC CCL-86) were washed with phosphate buffered saline, and resuspended in 3.OT fetal bovine serum RPMI medium with 2 X lOVwell.
  • T cell activation occurs antigen-specifically, it is not possible to induce activation with one antigen unless T cells with the same TCR.
  • In vitro testing with PBMCs requires the use of super-antigens, such as SEBs, that can induce T cell activation nonspecifically in order to activate T cells globally.
  • the SEB was treated with PBMC to prepare conditions for activating T cells, and then treated with 5C2 antibody to evaluate whether the immune response was further enhanced.
  • 5C2 antibodies can be expected to have antitumor effects because they can induce CD8 T cell activation via dendritic cells.
  • the 5C2 antibody shows an autoapoptotic effect in the tumor cell line expressing CD40, it can be expected an additional anti-tumor effect.
  • 5C2 antibodies do not have cross reaction to mouse CD40, the effects of 5C2 antibodies in two models injected with tumor cell lines alone and with human dendritic cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Were tested respectively.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NSG mice (NOD. Scid Cg- c I 12rg tmlWj VSzJ) mice (The Jackson Laboratory, 25 gram, 6 ⁇ 8 weeks old) in leukemia cell line, Ramos cell line (ATCC, ATCC CRL-1596), a single subcutaneous injection, or human dendritic cells ⁇ and P3MC were injected together.
  • Dendritic cells in this test were collected with whole blood from healthy adult volunteers as in Example 3-1 and Ficoll-paque Plus (GE Healthcare, Cat.
  • PBMCs were prepared by taking whole blood from the same donor of dendritic cells, isolated with Ficoll-paque Plus (GE Healthcare, Cat. No .: EG 1440-03), washed with phosphate-buffered saline, and then 2 X 10 6 eel in the mouse abdomen. Subcutaneous injection with ls / mouse
  • the average of the volume change (mm 3 ) of the tumor obtained is
  • 5C2 antibody (Group 2) in tumor cell alone injection animal model showed the effect of delaying tumor growth.
  • the autoapoptotic effect of 5C2 antibody appears to have contributed to the antitumor effect.
  • Table 8 and FIG. 20 in the animal model in which dendritic cells and Pli C were injected together with tumor cell lines, tumors in the control group grew rapidly and exceeded 10,000 mm 3 at 24 days, but 5C2 Antibody-treated Case (Group 4) completely inhibited tumor stature-up to 34 days of antibody administration, and tumor growth was observed in one mouse after 34 days. Tumor growth is presumed to be due to the failure of antitumor effects due to the end of life span of injected human dendritic cells and PBMC.

Abstract

CD40에 특이적으로 결합하는 항 CD40 항체 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이를 유효성분으로 포함하는 것으로 암, 암전이, 감염, 및 /또는 면역 결핍 질환의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
CD40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 [기술분야]
본 발명은 CD40에 특이적으로 결합하는 항 CD40 항체 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로， 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편， 및 이를 유효성분으로 포함하는 암, 암전이, 감염， 및 /또는 면역 결핍 질환의 예방 및 /또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경 기술】
CD4Q은 수지상 세포， B 세포 및 대식세포가 포함되는 항원 제시 세포 (APC) 상에 존재하는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 수퍼패밀리에 속하는 공동 -자극 분자이다. CD40이 TH 세포 상의 이의 리간드인 CD154 (CD40L)에 결합할 때 APC가 활성화된다. 사이토카인 생산, 공동 자극 분자 (예컨대 CD86)의 상향-조절, 및 강화된 항원 제시 및 B 세포 증식이 포함되는 다양한 면역 반응에서 CD40-매개 APC 활성화가 수반된다. CD40은 내피 세포, 평활근 세포， 섬유모세포 및 상피 세포에 의해 또한 발현될 수 있다. 작용쎄성 항 -CD40 항체는 이 시약들의 가장 효과적인 부류들 중 하나를 구성한다. CD40은 항원 제시 세포들 (APC) , 예컨대, 수지상세포, B 세포 및 대식세포 상에서 발현되는 종양 괴사 인자 수퍼패밀리의 세포 표면 구성원이다. 항 -CD40 작용제를 사용한 임상전 연구는 항원 제시 세포들 (APC) 상에서 가교연결 항체를 사용한 CD40의 유발이 통상적으로 CD40 리간드를 통해 제공되는 CD4 T 세포 보조를 대신할 수 있고 CD8 효과기 T 세포의 증폭뿐만 아니라 활성화도 용이하게 할 수 있다는 것을 암시한다. 또한， CD40에 의해 활성화된 대식세포는 직접적인 항종양 기능올 발휘할 수도 있다.
[선행문헌]
W0 2016/069919 A1 (2016.05.06. )
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 일 예는 CD40을 특이적으로 있지하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40와 CD40의 리간드인 CD40L 간의 결합 부위와 상이한 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다. 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40에 대한 작용제이다. 또한， 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40와 CD40의 리간드인 CD40L 간의 결합 부위와 상이한 부위를 인지함으로써 CD40/CD40L 간 상호 작용을 저해하지 않는 특성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은，
서열번호 17 (GYGFTNYL) 또는 서열번호 33 (NYLIE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1) , 서열번호 18 ( INPGYGGV) 또는 서열번호 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2) , 및 서열번호 19 (GGSGFAF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 (Comp lementar i ty Determi ning Regi ons ; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 20 (QDISNH) 또는 서열번호 35 (RASQDISNHLN)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1) , 서열번호 32 (STS(Xaa)n ; n은 임의의 아미노산 Xaa의 개수를 의미하는 것으로, 0 (Xaa가 존재하지 않음) 또는 1 내지 4의. 정수일 수 있음; 예컨대， 서열번호 21 (STS) 또는 서열번호 36(STSRLHS) )의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2) 및 서열번호 22 (QQGNTLP)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR- L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 항 CD40 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
다른 예는 항 CD40 항체의 중쇄 상보성 결정 부위， 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 CD40 항체의 경쇄 상보성 결정 부위， 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항 CD40 항체의 중쇄 상보성 결정 부위， 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 백터 함께 포함하거나 각각,별개의 백터에 포함하는 재조합 백터를 제공한다. - 다른 예는 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 다른 예는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 질병의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 질병의. 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 질병의 예방 및 /또는 치료， 또는 질병의 예방 및 /또는 치료용 조성물 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 질병은， 암， 암전이， 감염， 면역 결핍 질환 등에서 선택된 것일 수 있다. 【기술적 해결방법】
본 명세서에서는 CD40을 특이적으로 인지하는 항 CD40 항체 및 이의 용도가 제공된다. 상기 항 CD40 항체는 CD40와 CD40의 리간드인 CD40L 간의 결합 부위와 상이한 부위를 인지하는 것을 특징으로 하며-， CD40에 대하여 작용제 활성을 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 항 CD40 항체는 CD40와 CD40의 리간드인 CD40L 간의 결합 부위와 상이한 부위를 인지함으로써 CD40/CD40L 간 상호 작용을 저해하지 않는 것일 수 밌다. 본 명세서에서 CD40/CD40L 간 상호 작용을 저해하지 않는다고 함은 CD40/CD40L 간 상호 작용을 유의미함 수준으로 저해하지 않음을 의미하고， 유의미한 저해 효과를 발생시키지 않는 일부 저해도 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
CD40은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며, 정상 및 종양성 인간 B 세포， 수지상 세포, 단핵구， 대식세포， CD8+ T 세포, 내피 세포， 단핵 및 상피 세포, 및 폐， 유방， 난소， 방광， 및 결장암을 포함하는 다수의 종양 (예컨대， 고형 종양)의 표면상에 존재하는 45—50 kDa 세포 -표면 항원이다. CD40은 활성화 T 세포, 활성화 혈소판， 염증 맥관성 평활근 세포， 호산구, 류마티스 관절염의 윤활막， 피부 섬유모세포, ᅳ및 기타 비-림프종 세포 유형 상에서 발현된다.
본 명세서에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 CD40은 포유류 유래의 것일 수 있으며， 예컨대 인간 유래 CD40 (예컨대， NCBI access i on numbers NP— 001241. 1， NP_001289682. 1 , NPᅳ 690593. 1， NP_001309351. 1 , NP— 001309350. 1 등)일 수 있다. 상기 5종류 i s'oform의 인간 유래 CD40은 공통된 extracel lular region을 가지며， 본 명세서에서 제공되는 항 CD40 항체는 상기 extracel lular region를 인지 및 /또는 결합한다.
CD40는 이의 동족 리간드인 CD40L (또는 CD154)에 결합하여， Bᅳ세포 증식 및 혈장 세포로의 분화， 항체 생산， 아이소타입 스위칭， 및 B-세포 기억 생성을 자극한다. CD40의 리간드인 CD40L는 CD154로도 알려져 있으며， 각각 18 kDa 및 31 kDa인 두 개의 subuni t이 생물학적 활성인 가용성 형태로 존재하는 32-33 kDa의 경막 단백질이다.
CD40와 CD40L 간의 상호작용이 체액성 및 세포 -매개 면역 반웅을 유도한다.
CD40은 앞서 설명한 바와 같은 리간드—수용체 상호작용을 조절하여, 단핵구 (B 세포) , 및 수지상 세포 (DC)를 포함하는 다른 항원제시 세포 (APC)를 활성화시킨다. 단핵구 및 DC 상의 CD40 시그널 전달은 사이토카인 ( IL— 1 , IL-6 , IL-8 , IL-10 , IL-12 , TNF- α 및 ΜΙΡ—Ί α )의 분비뿐만 아니라 생존율을 향상시킨다. 이들 APC에 대한 CD40 라이게이션은 또한 IC崖 -1， LFA-3 , CD80 , 및 CD86과 같은 공동자극 분자의 상향조절을 유도한다. CD40 수용체의 활성화는 DC를， T 세포 활성화를 구동시키는 효율적인 APC로 완전히 성숙시키는 중요한 시그널 중 하나 이다.
본 명세서에서 "항체' '라 함은， 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질 또는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것， 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대， 마우스 항체 등) , 키메릭 항체， 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
또한 본 명세서에서 항체는， 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 "상보성 결정부위 . (Complementar i ty一 determining regions , CDR) "라 함은， 항체의 가변 부위 증에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 항체 단편일 수 있다.
본 발명의 일 예는 CD40을 특이적으로 인식 또는 CD40에 특이적으로 결합하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CD40 상의 인식 부위 또는 결합 부위는 CD40/CD40L 간 상호 작용 부위 또는 결합 부위와 상이한 부위일 수 있다. 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40에 대한 작용제 (agonist) 기능을 갖는 것일 수 있으며， 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40/CD40L 간 상호 작용을 저해하지 않는 것일 수 있다. 또한， 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 T崖 (Tumor associated macrophage) polarization 및 암세포 사멸 (cancer eel 1 apoptosis) 활성을 가질 수 있다.
구체예에서, 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 중쇄 (Heavy chain)의 상보성 결정
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(com lementarity determining region, CDR)로서, 서열번호 17 (GYGFTNYL) 또는 서열번호 33 (NYLIE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번흐 18 (INPGYGGV) 또는 서열번호 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 19 (GGSGFAF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함할 수 있다.
또한， 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 경쇄 (Light chain)의 상보성 결정 부위로서, 서열번호 20 (QDISNH) 또는 서열번호 35 (RASQDISNHLN)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR— L1), 서열번호 32 (STS(Xaa)n; n은 임의의 아미노산 Xaa의 개수를 의미하는 것으로, 0 (Xaa가 존재하지 않음 또는 1 내지 4의 정수일 수 있음; 예컨대， 서열번호 21 (STS) 또는 서열번호 36(STSRLHS))의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR— L2), 및 서열번호 22 (QQGNTLP)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함할 수 있다.
따라서 , 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 17 (GYGFTNYL) 또는 서열번호 33 (NYLIE)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 18 (INPGYGGV) 또는 서열번호 34 (VINPGYGGVNYNEKFKG)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2). 및 서열번호 19 (GGSGFAF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 20 (QDISNH) 또는 서열번호 35 (RASQDISNHLN)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 32 (STS(Xaa)n; n은 임의의 아미노산 Xaa의 개수를 의미하는 것으로'， 0 (Xaa가 존재하지 않음) 또는 1 내지 4의 정수일 수 있음; 예컨대， 서열번호 21 (STS) 또는 서열번호 36(STSRLHS) )의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2)ᅳ 및 서열번호 22 (QQGNTLP)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR一 L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1， 23， 24 , 25 , 26， 27 , 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다 (표 1 및 표 6 참조) .
상기 경쇄 가변영역은 서열반호 2， 29 , 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다 (표 1 및 표 6 참조) .
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면멱거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반웅을 억제하고자 키메릭 항체 (chimer ic ant ibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항- 아이소타입 (ant.i-i sotype) 반웅의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물. 유래 항체에 비하여 항 -아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나， 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항- 이디오타입 (ant i-idiotypic) 반웅에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체 (humani zed ant ibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 증 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR( comp 1 ement ar i t i y determining regions) 부위를 인간 항체 골격 ( framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식 (graf t ing) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며， 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조 (crystal structure)의 분석 , 분자모델링 기술 .등이 활용된다. 그러나， 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향올 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로， 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 항체는 동물 항체 (예컨대， 마우스 항체)， 키메릭 항체 (예컨대, 마우스—인간 키메릭 항체) 또는 인간화 항체일 수 있다ᅳ 상기 키메릭 항체는
마우스 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 면역글로불린 (IgG (IgGl. IgG2, IgG3, IgG4, 등)， IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)의 불변영역을 포함하는 (상기 중쇄 가변영역의 C말단을 불변 영역의 N 말단과 결합시킨) 중쇄; 및 마우스 항체의 경쇄 가변영역 및 카파 (K) 또는 람다 (λ) 타입 불변영역을 포함하는 (상기 경쇄 가변영역의 C말단을 불변 영역의 Ν 말단과 결합시킨) 경쇄를 포함하는 정일 수 있다.
일 예에서， 상기 키메릭 항체는 증쇄로서 마우스 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 Ig(^ 예컨대， 인간 IgGl, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키메릭 항체는 중쇄로서 마우스 항체의 중쇄 가변영역 및 인간 IgG4의 불변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인간화 항체는
마우스 항체의 중쇄 상보성 결정 부위 (CDR), 및 인간 면역글로불린 (IgG (IgGl, IgG2, IgG3. IgG4, 등)， IgM, IgA, IgD, 또는 igE)의 프레임워크 (frameworks; CDR을 제외한 가변영역 부위) 및 불변영역을 포함하는 증쇄； 및
마우스 항체의 경쇄 CDR, 및 카파 ) ^는 람다 (λ) 타입의 프레임워크 및 불변영역을 포함하는 경쇄 .
를 포함하는 것일 수 있디ᅳ.
일 예에서 , 상기 인간화 항체는 중쇄로서 마우스 항체의 증쇄 CDR 및 인간 IgG, 예컨대， 인갑 IgGl, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4의 프레임워크 및 불변 영역을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 인간화 항체는 중쇄로서 마우스 항체의 중쇄 CDR 및 인간 IgG4의 프레임워크 및 불변 영역을 포함하는 것일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전징- 증쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며， 중쇄 불변 영역은 감마 (γ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε ) 타입을 가지고， 서브클래스로 감마 감마 2 2), 감마 3(γ3), 감마 4(Υ4), 알파 1(α1) 및 알파 2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다.
용어， "중쇄 (heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및' 이의. 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한， 용어 "경쇄 (light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, " CDR( comp 1 ement ar i t y determining region)"은 면역글로불린의 증쇄 및 경쇄의 고가변영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRHl, CDRH2, CDRH3 및 CDRLl, CDRL2, CDRL3) . 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편， 본 명세서에 있어서， 용어 , "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식 "은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서， 항원 및 . 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반웅을 하는 것훌 의미한디 -.
용어， "항원 결합 단편' '은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드와 일부를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일.수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 블변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab '는 중쇄 CHI 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서. 생성된다. Fv는 중쇄. 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가자고 있는 ^소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 FvCtwo-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄. Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이를 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어， 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역 (hinge region) "은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서 , CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며， 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 (flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한당..
상기 항 CD40 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는， 항 CD40 항체는 이용해서 통상의 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
한편， 전형적인 ELISA( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 포맷을 이용하여 CD40와의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석 또는 세포 -기반 분석 (cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 CD40에 대한 각각의 친화도 (Kd values)를검정할 수 있다. 최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. (AliMgro, J. C. and Fransson, . J., "Humanizat ion of ant i bodies , !l Front lers in Bioscience, 13(2008)， 1619—1633).
다른 예는 상기 항 CD40 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 구체예에 있어서, 상기 하이브리도마는 기탁번호 KCLRF-BP-00381인 것일 수 있다.
다른 예는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CD40.항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다'.
다른 예는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CD40 항체의 중쇄 상보성결정부위 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합)， 경쇄 상보성결정부위 (CDR-L1. CDR-L2, CDR-L3ᅳ 또는 이들의 조합). 또는 이들의 조합; 또는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CD40 항체의 중쇄 가변영역， 경쇄 가변영역， 또는 이들의 조합을 포함하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 이 때， 상기 상보성결정부위는 통상적인 모든 방법에 의하여 결정될 수 있으며， 예컨대， IMGT definition (http://www. inigt .org/IMGT_vquest/share/textes/) 또는 Cabat definition (ht tp : //www . bi oinf . org . uk/abs/ )에 의하여 결정될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예는 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 질병의 치료 및 /또는 예방에 사용하기 위한 용도， 또는 질병의 치료 및 /또는 예방용 조성물 제조에 사용하기 위한 용도가 제공된다. 또 다른 예에서， 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 질병의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는， 질병의 예방 및 /또는 치료 방법이 제공된다. 상기 질병의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 상기 질병의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 질병은， 암 암전이， 감염， 면역 결핍 질환 등에서 선택된 것일 수 있다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스 , 덱스트로스， 수크로스 , 솔비를, 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물, 시럽， 메틸 셀롤로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘， 미네릴- 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에. 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제， 윤활제, 습윤제, 감미제， 향미제, 유화제， 현탁제， 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
. 상기 약학 조성물， 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입， 내피 투여， 비내 투여， 폐내 투여, 직장내 투여， 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시， 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한ᅳ 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 아동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량 또는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령, 체중， 성, 병적 상태， 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다ᅳ 예컨대, 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000mg/kg , 구체적으로 0.01 내지 lOOing/kg , 보다 구체적으로 0. 1 내지 50 mg/kg , 더욱 구체적으로 0. 1 내지
20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나， 적절하게 분량하여 제제화되거나， 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다른 항암제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며， 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 산제， 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며， 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 대상 환자는 인간， 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스， 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며， 이에 제한되지 않지만， 편평상피세포암 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암 폐의 편평상피암, 복막암， 피부임 · , 피부 또는 안구내 흑색종， 직장암， 항문부근암, '식도암, 소장암, 내분비선암， 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종， 요도암， 백혈병 (예컨대， 만성 또는 급성 백혈병)， 림프종 , 간세포암, 위장암， 췌장암， 교아종, 경부암， 난소암, 간암， 방광암， 간종양， 유방암, 결장암， 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암， 신장암, 간암， 전립선암， 음문암, 갑상선암， 간암， 두경부암, 뇌암， 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본 명세서에서 암의 치료는 암세포의 증식 저해, 암세포 사멸, 전이 억제 등과 같이 암의 증상의 악화를 방지하거나 완화 또는 호전시키거나， 암을 부분적 또는 전부 소멸시키는 모든 항암 작용을 의미하는 것일 수 있다.
한편， 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 CD40를 검출 또는 확인할 수 있다. 따라서， 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CD40의 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 '예는 생물 시료에 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계 ; 및 항원 -항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 CD40의 검출 방밥을 제공한다. 상기 검출 방법에서, 항원 -항체 반응이 탐지되는 경우， 상기 생물 시료에 CD40이 존재하는 것으로 결정 (판단)할 수 있다. 따라서, 상기 검출 방법은 상기 확인하는 단계 이후에， 항원 -항체 반응이 탐지되는 경우， 상기 생물 시료에 CD40이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 생물 시료는 포유류， 예컨대 인간 (예컨대 암환자)으로부터 얻은 (분리된) 세포, 조직， 체액， 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원 -항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법올 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반웅. 형광. 발광 및 /또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로. 면역크로마토그래피 ( I隱 unochromatography) ,
면역조직화학염색 ( Inimunohi stochemi stry)， 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme l inked immunosorbent assay: ELISA) , .방사선 면역측정법 (radioimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay - EIA) , 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) , 발광면역분석 ( luminescence immunoassay: LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blot t ing) , 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다ᅳ
다른 예에서， 앞서 설명한 항 CD40 항체의 중쇄 상보성 결정 부위， 경쇄 상보성 결정 부위， 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역， 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaf fold ; 예컨대 펩티바디) , 이중 특이 항체. 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다.
다른 예는 항 CD40 항체의 중쇄 상보성 결정 부위， 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 CD40 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항 CD40 항체의 중쇄 상보성 결정 부위. 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40 항체의 경쇄 상보성 결정 부위， 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 백터 함께 포함하거나 각각 별개의 백터에 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다ᅳ 용어 "백터 (vector ) "는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들에 플라스미드 백터， 코즈미드 백터 및 박테리오파아지 백터, 아데노바이러스 백터， r레트로바이러스 백터 및 아데노—연관 바이러스 백터와 같은 바이러스 백터를 포함한다. 상기 재조합 백터로 사용될 수.있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면， pSClOl , pGV1106, pACYC177, ColEl , pKT230 , ρΜΕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, PBD9, PHC79 , IJ61 , pLAFRl , pHV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 pUC19 등)， 파지 (예를 들면， gt4 B, λ -Charon, λ Δ ζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명， SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 백터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operat ively l inked) "은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operat ively 1 inked) ' '됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 '전사 및 /또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 백터는, 전형적으로 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물， 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 사용되는 백터가 발현 백터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어， pL, 프로모터， CMV 프로모터， /τ 프로모터 , Asc 프로모터， ac 프로모터， T7 프로모터 등) , 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열올 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 백터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f l 복제원점. SV40 복제원점, pMBl 복제원점， 아데노 복제원점， AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어， 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어， 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니"아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 맟 HSV의 Α—프로모터)가 이용될 수 있으며 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
다른 예는 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 재조합 백터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기. 숙주세포는 상기 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는， 예를 들어， E. coli JM109 , E. coli BL21 , E. coli RRl , E. coli LE392 , E. coli B , E. coli X 1776 , E. coli W3110 , 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 ᅵ 전환시키는 '경우에는 숙주 세포로서， —S— Saccharoinyce cerevisiae) , 곤충 세포， 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어， Sp2/0 , CH0( Chinese hamster ovary) Kl , CHO DG44 , PER. C6 , W138 , BHK COS-7 , 293 , HepG2 , Huh7 , 3T3 , RIN , MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포 내로의 운반 (도입)은， 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고， 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는， 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법， 전기 천공법， 리포좀 -매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나， 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여， 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어， 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 백터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항 CD40 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계， 및 임의로 배양 배지로부터 항체를 분리 및 /또는 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명은 CD40에 특이적으로 결합하고, CD40에 대하여 작용제 활성을 가지며ᅳ CD40/CD40L 간 상호 작용을 저해하지 않는 것을 특징으로 하는 항 CD40 항체를 제공하며， 이를 통하여 , 보다 효과적인 암 치료가 가능하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 항 -CD40 단클론항체 5C2의 CD40에 대한 결합 친화도를 보여주는 그래프이다 (rCD40: 재조합 인간 CD40; rCD40L: 재조합 항원 인간 CD40L) .
도 2는 3종의 키메릭 5C2 항체의 인간 CD40에 대한 결합 친화도를 보여주는 그래프이다 (Chimeric IgGl: human IgGl 불변영역을 포함하는 키메릭 항체; Chimeric IgG2: human IgG2 불변영역을 포함하는 키메릭 항체; Chimeric IgG4: human IgG4 불변영역을 포함하는 키메릭 항체; CP870.893: 대조항체 ; (-): 항체를 처리하지 않음).
도 3은 8종의 인간화 5C2 항체의 인간 CD40메 대한 결합 친화도를 보여주는 그래프이다 (VH1VL1: 증쇄 VH1과 경쇄 VL1의 조합; 중쇄 VH2VL1: VH2와 경쇄 VL1의 조합; VH3VL1: 중쇄 VH3과 경쇄 VL1의 조합; VH5VL1: 중쇄 VH5와 경쇄 VL1의 조합; VH1VL2: 중쇄 VH1과 경쇄 VL2의 조합; VH2VL2: 층쇄 VH2와 경쇄 VL2의 조합; VH3VL2: 중쇄 .VH3과 경쇄 VL2의 조합; VH5VL2: 중쇄 VH5와 경쇄 VL2의 조합; (-)： 항체 무처리군; Positive: human IgG4 블변영역을 포함하는 키메릭 5C2 항체).
도 4는 항 -CD40 단클론항체 5C2의 CD40/CD40L 상호작용에 미치는 효과를 시험한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 5는 수지상세포에 단일클론항체 5C2 처리시의 CD80의 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다. 도 6은 수지상세포에 단일클론항체 5C2 처리시의 CD86의 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다. 도 7은 수지상세포에 단일클론항체 5C2 처리시의 CD83의 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다. 도 8은 Toll like receptor 1 igand (Lipopolysaccharid; ' LPS)와 단일클른항체 5C2의 병용 '처리시의 CD80 '발현 정도를 대조군 (항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 9는 Toll like receptor 1 igand (Lipopolysaccharid; LPS)와 단일클른항체 5C2의 병용 처리 시의 CD83 발현 정도를 대조군 (항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 10은 단일클론항체 5C2의 인간 IgGl 키메뢰 항체 (chimeric IgGl), 인간 IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2), 및 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4) 처리 시의 CD86 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 11은 단일클론항체 5C2의 인간 IgGl 키메릭 항체 (chimeric IgGl), 인간 IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2) , 및 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4) 처리 시의 CD83 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 12는 단일클론항체 5C2의 인간 IgGl 키메릭 항체 (chimeric IgGl), 인긴' IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2), 또는 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4)와, Interferon gamma와의 병용 처리 시의 CD86 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 13은 단일클론항체 5C2의 인간 IgGl 키메릭 항체 (chimeric IgGl), 인간 IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2), 또는 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4)와', Interferon gamma와의 병용 처리 시의 CD83 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 14는 단일클론항체 5C2의 인간 IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2), 또는 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4)가 각각 처리된 수지상 세포를 PBMC와 공동배양 시의 CD86 및 CD83 발현 정도를 대조군 (no treat: 항체 미처리군)에 대한 상대값으로 보여주는 그래프이다.
도 15는 단일클론항체 5C2의 인간 IgG2 키메릭 항체 (chimeric IgG2) , 또는 인간 IgG4 키메릭 항체 (chimeric IgG4)가 각각 처리된 수지상 세포를 PBMC와 공동배양 시의 활성화된 CD69 양성 CD8 세포의 비율 (%)을 보여주는 그래프이다.
도 16은 키메릭 .5C2 항체에 의하여 유도되는 Ramos 종양 세포주 자가세포사멸 (apoptosis) 효능 (%)을 나타낸 그래프이다 (Human IgGl: irrelevant human IgGl;. c5C2 IgGl: IgGl: human IgGl 불변영역을 포함하는 키메릭 5C2 항체; C5C2 IgG2: h醒 an IgG2 불변영역을 포함하는 키메릭 5C2 항체; c5C2: human IgG4 불변영역을 포함하는 키메릭 5C2 항체; CP870,893: 대조항체; Rituximab: 대조항체).
도 17은 인간화 5C2 항체에 의하여 유도되는 Raji 종양세포주 자가세포사멸 효능 (%)을 나타낸 그래프이다 (인간화 5C2 항체 7종, VH1VL2, VH2VL1, VH2VL2, VH3VL1, VH3VL2, VH5VL1, VH5VL2; (-)： 항체 무처리군; Human IgG: irrelevant human IgGl; CP870,893: 대조항체).
도 18은 Super-antigen SEB조건에서 5C2 항체에 의한 T 세포 활성화 정도를 보여주는 그래프로서， SEB(Staphylococcal Enterotoxin B)을 30 ng/mL 농도로 PBMC에 처리하여 비특이적으로 T 세포 활성화 유도하고 인간화 5C2 항체를 추가로 첨가하여 분비되는 IFN-ga隱 a 함량을 측정한 결과를 보여준다 (인간화 항체 5C2 4종; (―)： 항체 무처리군; Human IgG: irrelevant human IgGl; CP870,893: 대조항체).
도 19은 이종이식 마우스 동물모델에서 키메릭 5C2 IgG2 항체 단독 처리시의종양 크기 변화를 항체 주사 후 경과 일수에 따라서 보여주는 그래프이다.
도 20은 인간 수지상세포 및 PBMC를 함께 주사한 이종이식 마우스 동물모델에 키메릭 5C2 항체 처리한 경우의 종양 크기 변화를 항체 주사 후 경과 일수에 따라서 보여주는 그래프이다.
【발명을 실시하기 위한 형태】
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 블과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 '실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다. 실시예 1. 항 -CD40항체의 제조
1-1. 마우스 항체 제조
1-1-1. 단일클론항체 생산세포 제조
사람 재조합단백질 CD40 항원을 주입한 Balb/c 흰쥐의 비장세포와 8- 아자구아닌 (8-azaguanine) 내성 (resistant) 마우스의 골수종세포주 X63- Ag8.653(ATCC, PTAᅳ 8431)의 융합을 통하여 만들었다.
Balb/c 흰쥐에 6주간 2주 간격으로 100 ug의 사람 CD40 재조합항원을 복강내 ;주사하여 면역반응을 유도하였고， 마지막 추가 잡종 후 3일째에 비장을 적출하여 세포부유액을 만들었다. 켈러와 밀스테인 (Koeler & Milstein 1975)의 방법에 따라， DMEM(Dulbeco' s modified Eagle's inediLim)에서 108개의 비장세포와 107개의 골수종 세포를 50% 폴리에틸렌글라이콜 400을. 사용하여 세포 융합하였다: 융합된. 세포는 세척한 후， 20% 우태아혈청, lOOuM 하이포크산틴 (hypoxanthine), 0.44uM 아미노프테린 (aminopterin) 및 16uM 티미딘 (thymidine)이 보충된 DMEM 배양액 (HAT 배양액)에 재부유시키고, 세포들은 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 분주하고 37°C, 5% C02가 공급되는 배양기에서 배양하였다.
2주후 집락의 형성이 관찰되면 상청액을 취하여 CD40 결합 여부를
ELISMEnzyme-Linked I画 unoSorbent Assay) 방법으로 분석하여 선정하였다. 양성집단은 웰 (well)당 105개 이상의 세포가 단일로 형성된 경우로 하였다. 상청액의 항체 역가가 높은 군락이 형성된 웰에서 세포를 취하여 제한희석시험 (limiting dilution assay) 방법에 따라 서브클로닝하여 항체역가가 높은 단일클론세포를 수득하였다ᅳ 단일클론세포의 배양액은 상청액을 취하여 후속 실험을 위하여 보관하였다.
1-1-2. 인간 CD40에 대한 항체를 생산하는 단일클론 세포 선별 인간 재조합단백질 CD40CR&D systems, Cat. No.:P25942)을 maxisorp EL ISA plate에 well 당 100.0 ng 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 항체 코팅한 뒤, lx blocking 용액 (sigma)을 well 당 200 ill 넣고 37°C에서 한 시간 반웅시켜 블로킹하였다.
단일클론세포의 배양액을 well 당 100 uL 넣고 37°C에서 한 시간 반응한 뒤 인산염완충식염수로 3회 세척하고 2차 항체 Goat anti-Mouse IgG-HRP를 처리하였다. 37°C에서 30분 반응한 뒤 인산염완충식염수로 3회 세척하고 TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No: 002023) well 당 100 uL 넣고 상온 암소에서 5 ~ 10분 반응하였다. 1.0N 황산용액을 100 uL 넣어 발색을 종료한 뒤 450 nm 파장에서 흡광값을 측정하였다.
재조합항원 인간 CD40에 특이하게 반응하는 항체를 생산하는 단일클론 세포주 5C2을 선별할 수 있었다. 상기 얻어진 세포주는 2016년 11월 2일자로 대한민국 서을시 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단 (Korean Cell Line Research Foundation; KCLRF)에 기탁하여， accession number KCLRF-BP-00381을 부여 받았다. 1-1-3. 선별한단클론 세포주로부터 단클론항체 생산
10% 우태아혈청이 포함된 RPMI 배지에서 확립한 세포주 5C2를 37 °C 및 C02 조건에서 2주간 배양하였다.
세포주 배양액을 제균여과하여 Protein G 평형버퍼 (20mM phosphate, pH7.4)로 평형화한 HiTrap Protein G HP 컬럼 (GE Healthcare, Cat. No.： 17-0405-03)에 주입하고 평형버퍼를 홀려 세척한 뒤 용출버퍼 (20mM Citric acid pH3.0)로 회수하였다. 회수한 항체는 5C2. 마우스 항체)로ᅳ명명하고， 인산염완충식염수에 투석하여 버퍼를 교체한 뒤 후속 시험에 사용하였다. 1-1-4. 단클론 항 -CD40항체의 특이도 시험
항一 CD40 5C2 항체 (마우스 항체) 특이도 평가를 위하여 재조합 항원 인간 CD40(rCD40; R&D systems, Cat. No.:P25942), 재조합 항원 인간 CD40L( Recombinant Human sCD40 Ligand; Peprotech, Cat. No. :310-02； 아미노산 서열: MQKGDQNPQI AAHVISEASS KTTSVLQWAE KGYYTMSNNL VTLENGKQLT VKRQGLYYIY AQVTFCSNRE ASSQAPFIAS LWL SPGRFE RILLRAANTH SSA PCGQQS IHLGGVFELQ PGASVFVNVT DPSQVSHGTG FTSFGLLKL (서열번호 31))， 및 human IgG (다이노나)에 대한 반웅성을 ELISA 방법으로 분석하였다. 상기 3종의 항원을 각각 1.0 ug/niL의 양으로 인산염완충식염수에 희석하고， Mi crop late에 100 uL/well씩 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 코팅한 후, lx blocking 용액 (sigma)을 well 당 200ul씩 넣고 37°C에서 한 시간 반웅시켜 블로킹하였다,
항 -CD40 항체 5C2 및 항 -CD40L 5C8(ATCC, ATCC. HB-10916; 양성대조군)을 각각 1.0 ug/mL로 인산염완충식염수에 희석하여 well 당 100 uL씩 넣고 37°C에서 한 시간 반응한 뒤 , 인산염완충식염수로 3회 세척하고 2차 항체 Goat ant i -Mouse IgG-HRP를 처리하였다. 37°C에서 30분 반웅한 뒤 인산염완층식염수로 3회 ^척하고 TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No: 002023) well 당 100 uL씩 넣고 상은 암소에서 5 ~ 10분 반웅시켰다. 1.0N 황산용액을 100 uL 넣어 발색을 종료한 뒤 450 nm 파장에서 흡광값을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 y축은 흡광도를 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이， 5C2 항체는 CD40L 또는 human IgG에 대한 교차반응성 없이, 인간 CD40 항원에 특이적으로 결합하고 있음을 확인하였다. 1-2. 키메릭 항체 제조
상기 제작된 항 -CD40 마우스 항체 5C2의 아미노산 서열을 기초로, 항 -CD43 키메릭 항체를 제작하였다. 1-2-1. 플라스미드 제작
항 -CD40 키메릭 항체의 발현을 위하여， 중쇄 발현용 플라스미드와 경쇄 발현용 플라스미드를 각각 제작하였다. 중쇄 및 경쇄 발현용 플라스미드는 모두 pcDNA3.4 (Invitrogen사) 백터를 사용하였다.
항체 발현을 위한 중쇄 및 경쇄의 가변영역 코딩 cDNA는 Ig-Primer sets (Novagen 사)를 이용하여 클로닝하였으며， pCR2.1 백터 (Invitrogen, Cat. No.: K200001)에 삽입한 후, 시뭔싱을 통해 DNA 염기서열을 확인하였으며， IMGT site (丽 w. imgt .org)를 통해 마우스 항채 유전자를 확인하였다.
마우스 .5C2 단클론항체의 증쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이의 코딩 유전자 서열은 아래 표 1과 같다.
【표 1】
항 -CD40 마우스 5C2 단일클론항체의 가변영역의 아미노산 서열
Figure imgf000022_0001
(밑줄 그은 부분은 차례로 CDRl, CDR2, 및 CDR3 (IMGT definition에 따름)를 나타낸다)
추가적인 아미노산 삽입 없이 항체 각각의 가변영역 코딩 cDNA와 불변영역 코딩 cDNA를 연속적인 아미노산 서열로서 발현되도록 하기 위하여， 상기 클로닝한 가변영역의 코딩 염기서열과 알려진 human IgGl, human IgG2, 및 human IgG4(S228P , 228번 ser in을 pro l ine으로 치환)의 불변영역 (중쇄) 및 kappa 불변영역 (경쇄)의 코딩 염기서열을 연결한 유전자 조각을 각각 합상 (Bioneer 사)하였다. 이와 같이 합성한.중쇄 및 경쇄 발현 유전자는 제한 효소 Xho I 과 EcoRl으로 자른 후, 중쇄 및 경쇄 유전자 조각을 PCDNA3.4 백터에 각각 l igat ion 하여 중쇄 3종과 경쇄 1종의 항체 발현용 백터를 제작하였다. 상기와 같이 제작된 3종의 키메릭 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 이의 코딩 유전자 서열을 아래의 표 2에 정리하였다:
■ 【표 2】
3종의 키메릭 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 이의 코딩 유전자 서열 (굵은 글씨는 가변영역을 나타냄)
Figure imgf000023_0001
키메릭 VSCKASGYGFTNYLIEWVK AGGTCAGCTCTMGGCTAGCGGATACGGT TCACCMCT^^
항체 QRPGQGLEWIGVINPGYGG CAAGCAGAGGCCAGGACMGGn GGAGTGGATrGGAGTGATTAACCCCGGGTAT
(human VNYNEKFKGKAILTADKSS GGGGGCGTGMTTACM GAGMGTrrMAGGC AGO^TACTGACCGGAGACA
IgG2의 STAYMHLTSLTSDDSAVYF AATCMGTAGTACCGCCTATATGCACC GACATCn GACATC GACGATrC GC 불변영 CARGGSGFAFWGQGTLVTV CGTGTATrrnmx xxmxxxxiAintm Km^
STAST GPSVFPLAPCSRS C TGTGAC GTGTCTACAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTGnCCCTCTGGCC 포함) TSESTAALGCLVKDYFPEP CCATGHCTAGGTCTACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTCGGCTGTCTGGTGAAG 의 VTVSWNSGALTSGVHTFPA GATTATnCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCHGGAACAGCGGAGCCCTGACTAGC 중쇄 VLQSSGLYSLSSVVTVPSS GGAGTGCACACC CCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACAGCCTCTCT
NFGTQTYTCNVDH PSNT TCTGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCAACHCGGAACACAGACCTACACATGTAAC
VD TVERKCCVECPPCPAP GTGGATCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGATAAGACCGTGGAGAGAAAGTGC
PVAGPSVFLFPPKPKDTLM TGTGTGGAGTGCCCTCCATGTCCTGCCCCACCTGTGGCTGGACCTOTGTGTTT
ISRTPEVTCVVVDVSHEDP CTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCAGCAGAACTCCTGAGGTG
EVQFNWYVDGVEVHNAKTK ACCTGTGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCTGAGGTGCAG'ITTAACTGG
PREBfiFNSTFRVVSVLTVV TACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAACGCTAAGACAAAGCCTAGGGAGGAGCAG
HQDWLNfGKEY CKVSNKGL TTTAACAGCACCnCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGiiAnGG
PARIE TISKTKGQPREPQ CTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCTMCAA& CCTGCCAGCCCCT
VYTLPPSREEMTKNQVSLT ATTGAGAAGACCATCAGTAAGACCAAGGGACAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTAC
CLV GFYPSDIAVEWESNG ACCCTGCCTCCTTCCAGAGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGT
QPENNYKTTPP LDSDGSF CTGGTGAAGGGCnCTACCCTAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGC
FLYS LTVDKS WQQGNVF CAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCTATGCTGGACAGCGATGGCTCT
SCSVMHEALHNHYTQKSLS HCrrCCTGTACTCTAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAAC
LSPG (서열번호 7) GTGriTrCTTGnCTGTGATGCACGAGGCCCTGCAC CCACTACACCCAG G
TCTCTGTCTCTGTCTGCAGGCAAGTGA (서열번호 8)
IgG4 QVQMLQSGTELVRPGTSVK CAOTACAGA GCTGCAGAGCGGMCTGAAC GGTTAGACCTGGTACTAGCGTTA 키메릭 VSCKASGYGFTNYLIEWVK AGGTCAGCTG MGGCTAGCGGATACGGn CACCAACTACCTCATCGAA GGGT 항체 QRPGQGLEWIGVINPGYGG CMGCAGAGGCCAGGACMGG GGAG GGATTGGAGTGMTMCCCCGGGTAT
(human VNYNEKFKGKAILTADKSS GGGGGCGTGMTTACMTGAGAAGTTTA GGCMAGCCATACTGACCGCAGACA
IgG4의 STAYMHLTSLTSDDSAVYF MTCAAGTAG ACCGCCTATATGCACCTGACATCn GACATCTGACGATrC GC
CARGGSGFAFWGQGTLYrV CGTCTATTm nnnxx AGTGGcrnraTn^^ ᄀ STASTKGPSVFPLAPCSRS CTTGTGAamxnCTACAGCTTCCACC GGGCCCCTCCGTGnCCCTCl^ 포함) TSESTAALGCLVKDYFPEP CCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAG 의 VTVSWNSGALTSGVHTFPA GACTACnCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGCGCACTGACCAGC 증쇄 VLQSSGLYSLSSVVTVPSS GGCGTGCACACCnGCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCC
SLGT TYTCNVDHKPSNTK TCCGTCGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCMGACCTACACCTGTAAC
VDKRVES YGPPCPPCPAP GTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTAC
EFLGGPSVFLFPPKPKDTL GGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATrTCTGGGCGGACCTTCCGTG
MISRTPEVTCVVVDVSQED TTCamCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAA
PEVQFNWYVDGVEVHNAKT GTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAAT
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LHQDWLNG EY CKVSNKG CAGTrCMCTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTCCTGCACCAGGAC LPSSIEKTISKAKGQPREP TGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCMGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCC QVYTLPPSQEEMT NQVSL AGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCGCCGCGAGCCTCAGGTG TCLVKGFYPSDIAVEWESN TACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAAGAGATGACCMGAACCAGGTGTCCCTGACC GQPENNY TTPPVLDSDGS TGTCTCGTCAAAGGCrrCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAAC FFLYSRLTVDKSRWQEG V GGCCAGCCCGAGAACAACTAC GACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGC FSCSVMHEALHNHYTQ SL TCC CHTCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGC SLSLGK (서열번호 9) AACGTCHCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAG
AAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAATGA (서열번호 10) 경쇄 DIQ triTSSLSASLGQRV GACA CCAMTGACCCA CCACCrcCTCACrrrcCGCATCTCrrGGACAAAGAG TISCRASQDISNHLNWYQQ TCACCATCTCC GTAGGGCMGTCMGACATCTCCMCCACCTCMC GGTACCA KPNGTVRLLISSTSRLHSG GCAGMGCC ACGGAACraTAGGT GTrGATCTCCAGCACCrCACG r GCAC VPSRFSGSGSGTDYSLTIS TCAGGAGTACCATCA( ATOAGCGCTAGTGGTTCTGGTACAGATTACAGCTTGA NLEQEDIATYFCQQGNTLP CCATTAGCMCCTGGAGCAGGAGGATATTGCTACCTACrrc GCCAGCAG GCM WTFGGGTKLEIKRTVAAPS TACCC GCCTTGGACATTTGGGGGGGGCACA ACTGGAMTTMGCGGACTGTT VFIFPPSDEQLKSGTASW GCTGCTCCATCTGTTTrTATATrTCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGM GCGGC CLL NFYPREAKVQW VDN ACTGCCTCTGTGGTGTGTCTGCTGAATAATTTTTACCCCCGGGAAGCCAAAGTC ALQSGNSQESVTEQDS DS CAGTGGMGGTGGATAATGCCCrCCAGTCTGGG CAGTCAGGAAAGTGTGACA TYSLSSTLTLSKADYEKH GAACAGGATAGTAAGGACTCTACITATAGCCTCTCTTCTACACTGACTCTGTCA VYACEVTHQGLSSPVT SF AAGGCCGACTATGAGAAGCATAAAGTGTATGCCTGCGAGGTGACACATCAGGGC NRGEC (서열번호 11) CTGAGTTCACCCGTGACAAAATCmTAACCGCGGCGAGTGCTGA
(서열번호 12) 양성 대조군 항체 (대조항체)로 사용하기 위하여 항—CD40 인간항체 CP870 , 893(US7338660 B2 ; 21.4. 1 항체)을 함께 합성하였고. pcDNA3.4 발현용 백터를 동일한 방법으로 함께 제작하였다. 대조 항체로 사용하기 위하여 CP870 /893 항체 (US7338660 B2 ; 21.4. 1 항체)의 서열 정보를 이용하여 제작한 항체를 이하 CP870 , 893 항체 유사체로 명명하였다. CP870.893 항체 유사체의 제작에 사용된 아미노산 서열과 코딩 유전자 서열을 아래 표 3에 정리하였다:
【표 3】
항 -CD40 인간항체 CP870 , 893 (21.4. 1 항체)의 아미노산 서열 및 유전자 서열 (밑줄 그은 부분은 s ignal sequence이고， 굵은 글씨는 가변영역을 나타냄)
Figure imgf000025_0001
mTRDTSIS AYMELNRLRSDD G GGCACAAACTATGCACAGMGTTTCAGGGCAGGG CACCATGACCAGGGACACG TAVYYCARDQPLGYCT GVCSY TCCATCAGCACAGCCTACA GGAGC GMCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGT FDYWGQGILVTVSSAST GPSV GTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGTACTMTGGTCTATGCTCCT
FPLAPCSRSTSESTAALGCLV ACTTOACTACTGGGGCCAGGGMCCC GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG DYFPEPVTVSWNSGALTSGV GGCCCATCGGTCHCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAG HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACnCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT GAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCC KVDKTVERKCCVECPPCPAPP TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACHCGGCA VAGPSVFLFPPKPKDTLMISR CCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA TPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN GACAGnGAGCGGAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTG WYVDGVEVHNAKTKPREEQFN GCAGGACCGTCAGTCnCCTCrrCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT STFRVVSVLTVVHQDWL G E CCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGA Y C VSNKGLPAPIEKTISKT GGTCCAGnCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG KG'QP EPQVYTLPPSREEMT CCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGnCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTG NQVSLTCLV GFYPSDIAVEW TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGG ESNGQPENNYKTTPPMLDSDG CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAA SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAG UCCAGGTCA SCSV¾IHEALHNHYTQKSLSLS GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCHCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA PGK (서열번호 13) GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCC
GACGGCTCCHCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAC GAGCAGGTGGCAGC AGGGGAAGGTCnCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호 14) 경 MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCD ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGnCCCAGGTTCCA 쇄 IQ!ffQSPSSVSASVGDRVTirC GATGCGACATOAGATCAC ACTCTCCATCTTCCG GTCTGCATCTGTAGGAGAC
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VCLLNNFYPREA VQWKVDNA CTGCACCATCTGTCnCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGnGAAATCTGGAAC
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LSSTLTLSKADYE HKVYACE TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGC
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC AGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGC
(서열번호 15) AGACTACGAGAAACACA.AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC
TCGCCCGTCACA GAGC C CAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호 16)
1-2-2. 키메릭 항 -CD40항체생산
키메릭 항체 생산을 위하여 중쇄 3종 (human IgGL human IgG2 , 및 human IgG4의 불변영역을 각각 포함)과 경쇄 1종 (kappa 불변영역 포함)의 발현 백터를 ExpiCHO Express ion system(Thrmof i sher , Cat . No .： A29133)에 도입하여 일시적 형질전환으로 IgGl 키메릭 항체 (human IgGl의 불변영역 포함), IgG2 키메릭 항체 (human IgG2의 불변영역 포함), 및 IgG4 키메릭 항체 (human IgG4의 불변영역 포함)를 각각 생산하였다.
ExpiCHO Expression system kit(Termof isher , Cat . No. :A29133)에서 제공하는 ExpiCHO— S 세포주를 해동한 뒤 Expression medium에 넣어 37°C， 8% C02, 120 rpm 조건으로 배양하여 필요한 세포주를 확보였다.. ExpiCHO—S 세포를 회수한 뒤 Expression medium에 6 X.106 cells/mL이 되도록 접종하여 150 niL을 준비하였다. 경쇄와 중세의 비율이 2:1을 유지하고 백터의 농도는 1.0 ug/mL이 되도록 경쇄 백터 100 ug과 중쇄 백터 50 ug을 준비하여 매뉴얼에서 제시한 바와 같이 백터를 OptiPRO SFM 및 ExpiFectamine CH0 reagent와 흔합하여 혼합액을 제조하였다. 형질전환을 위하여 준비된 백터 흔합액을 ExpiCHO— S 세포주에 철가한 뒤 37°C, 8% C02) 120 rpm 조건으로 24시간 배양하였다. 배양 24시간 경과 시점에 ExpiCHO Enhancer와 Feed를 추가 적으로 첨가하였고， 배양 5일차에 32°C, 5% C02, 120 rpm 조건으로;: 배양조건을 변경하고 ExpiCHO Feed를 첨가하여 12일까지 배양하ᅳ여 배양액을 생산하였다.
확보한 배양액을 제균여과하여 Protein A 평형버퍼 (20mM phosphate, pH7.4)로 평형화한 HiTrap Protein A HP 컬럼 (GE Healthcare, Cat. No. :11- 0034ᅳ 93)에 주입하고 평형버퍼를 홀려 세척한 뒤 용출버퍼 (20mM Citric acid pH3.0)로 회수하였다. 회수한 항체는 인산염완충식염수에 투 :석하여 버퍼를 교체한 뒤 후속 시험에 사용하였다.
1-2-3. 키메릭 항 -CD40항체의 항원 결합력 시험
상기 실시예 1-2-2에서 제작된 IgGl, IgG2, 및 IgG4의 3종의 항— CD40 키메릭 항체의 항원 반응성을 ELISA. assay로 비교 평가하였다. 재조합항원 인간 CD40(Sino Biolobical Inc. , Cat. No.： 10774— H02H)을 1.0 ug/mL 농도로 인산염완충식염수에 희석하여 Microplate에 100 uL/well로 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 코팅하고 lx blocking 용액 (sigma)을 well 당 200ul 넣고 37°C에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다.
3종의 항 -CD40 키메릭 항체 및 대조항체로서 항 -CD40 인간 항체
CP870,893 유사체 (표 2의 21.4.1 항체)을 각각 10.0 ug/mL 농도부터 계열희석하여 100 uL/well로 넣고 37°C에서 한 시간 반응한 뒤 인산염완충식염수로 3회 세척하고 2차 항체 Goat ant i -Human IgG F(ab')2- HRP( Jackson Immunoresearch, Cat. No.： 109-035— 006)를 처리하였다. 37°C에서 30분 반응한 뒤 인산염완충식염수로 3희 세척하고 TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No: 002023) well 당 100 uL 넣고 상온 암소에서 5 ~ 10분 반웅하였다. 1.0N 황산용액을 100 uL 넣어 발색을 종료한 뒤 450 nm 파장에서 흡광값을 측정하였다.
이와 같이 얻어 ¾ 키메릭 항체의 A450 nm 흡광값을 도 2에 나타내었다 ((— )는 항체를 처리하지 않은 대조군을 의미함). 도 2에 나타난 바와 같이， 3종의 항 -CD40 키메릭 항체는 모두 대조항체와 비교하여 동등 이상의 CD40에 대한 친화도를 보였다ᅳ
1-3. 인간화항체 제조
상기 제작된 항 -CD40 마우스 항체 5C2의 아미노산 서열을 기초로, 항 -CD40 인간화 항체를 제작하였다
1-3-1. In silico Humanization에 의한 재조합항체 서열 선정
Mouse CD40 항체 5C2의 증쇄 및 경쇄 각각의 CDR 부위 서열을 유지하고， 사람 항체 유전자를 코딩하고 있는 germline의 서열을 기반으로 Framework region 에 대한 부위 서열을 재조합한 인간화 항체 서열을 in silico 방법으로 선별하였다. -
' 우선, 표 1에 제공된 항— CD40 마우스 항체 5C2의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 서열을 기반으로 중쇄 CDR (상보성 결¾부위; complementarity determining region)과 경쇄 CDR을 각각 결정 (IMGT/V- QUEST (http://www. imgt .org/IMGT— vquest/share/textes/)을 참조함)하여 아래의 표 4에 정리하였다:
【표 4】
Figure imgf000028_0001
CD40 항체 5C2의 중쇄 및 경쇄의 각각의 서열과 가장 유사성이 높아 인간화 재조합 항체 서열의 backbone으로 사용한 사람 항체 Germline 유전자를 아래의 표 5에 정리하였다:
【표 5】
마우스 5C2 항체의 인간화에 사용한 사람 항체 Germline 유전자
Figure imgf000029_0001
위의 사람 항체 Germline 유전자 서열올 이용하여 In silico 방법으로 인간화 5C2 항체 중쇄 가변영역 6종과 경쇄 가변영역 2종을 선별하였으며， 선별된 서열을 아래의 표 6에 정리하였다:
【표 6】
In silico 방법으로 선정된 5C2 인간화 항체 가변영역
Figure imgf000029_0002
(밑줄 그은 부분은 차례로 CDRl, CDR2, 및 CDR3 (IMGT definition에 따름)를 나타낸다)
1-3-2. 인간화 재조합항체의 발현 및 분석
In silico 방법으로 선정한 가변영역 증쇄 서열을 인간 IgG2 불변영역에 연결하여 중쇄 서열을 완성하고， 경쇄 가변영역 서열은 kappa 경쇄 불변영역에 연결하여 경쇄 서열을 완성하였다. 상기 선정한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열로 변환한 뒤， 상기 서열을 갖는 유전자 단편을 합성 (코스모진텍)하였다ᅳ
상기와 같이 준비된 증쇄 및 경쇄의 코딩 유전자 단편을 pCDNA3.4 백터로 각각 옮긴 뒤， 중쇄 4종 (VH1, VH2, VH3, VH5)과 경쇄 2종 (L1, L2)을 조합하여 8종의 인간화 항체 (VH1VL1: VH1과 VL1의 조합; VH2VL1: VH2와 VL1의 조합; VH3VL1: VH3과 VL1의 조합; VH5VL1: VH5와 VL1의 조합; VH6VL1： VH6과 VL1의 조합; VH1VL2: VH1과 VL2의 조합; VH2VL2: VH2와 VL2의 조합; VH3VL2: VH3과 VL2의 조합; VH5VL2: VH5와 VL2의 조합; VH6AVL2: VH6과 VL2의 조합)를 만들고, ViaFect Trans feet ion Reagent (Pr omega, Cat. No.:D4981)을 사용하여 CHO 세포 (Sigma, Cat.#: 85050302)에서 발현을 유도한 후， 추가 2일 배양한 상청액을 취하였다.
재조합항원 인간 CD40(rCD40; R&D systems, Cat. No.： P25942) 대한 각각의 인간화 항체 배양액의 반응성을 ELISA 방법으로 분석하였다. rCD40을 1.0 iig/mL로 인산염완충식염수에 희석하여 Microplate에 100 uLAvell로 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 코팅하고 lx blocking 용액 (signia)올 well 당 200 ul 넣고 37T：에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다.
각각의 인간화,항— CD40 항체 배양액 100 uL을 넣고 37°C에서 한 시간 반응시킨 뒤 인산염완충식염수로 3회 세척하고 2차 항체 Goat ant i -Human IgG F(ab' )2-HRP( Jackson I隱 unoresearch, Cat. No.： 109-035-006)를 처리하였다ᅳ 37°C에서 30분 반웅한 뒤 인산염완충식염수로 3회 세척하고 TMB Single Solution (Life Technologies, Cat. No: 002023)을 well 당 100 uL 넣고 상온 암소에서 5 ~ 10분 반웅하였다. 1.0N 황산용액을 100 uL 넣어 발색을 종료한 뒤 450 nm 파장에서 흡광값을 측정하였다. .
이와 같이 얻어진 8종의 인간화 항체의 A450 nm 흡광값을 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 시험된 8종의 인간화 항체 모두 CD40에 대한 높은 반웅성을 나타내었다. 실시예 2. 항" CD40항체 5C2에 의한 CD40/CD40L겹합력
5C2 항체 (마우스 항체)가 인체내 CD40과 CD40L 간의 상호작용에 영향력을 미치는지 확인하기 위하여 Blocking test를 실시하였다.
5C2 항체 및 Isotype control 항체 (다이노나， Cat .No. :88020R)를 각각 0.1M sodium bicarbonate buffer에 투석하여 버퍼를 교체한 뒤, 항체 용액 1.0 nig을 각각 준비하였다. FITC Isomer I (Invitrogen, Cat. No.： F1906) solution을 DMSO (Sigma-Aldr.ich, Cat. No. :276855)에 녹여 2.6 mg/mL 농도로 만든 후, 상기 준비한 각각의 항체 용액에 20.0 uL의 양으로 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반하여 FITC 접합을 유도하고 인산염완충식염수로 투석하여 FITC 표지 항체를 제조하였다.
인간 CD40을 발현하는 Ramos 세포주 (ATCC, ATCC CRL-1596) 5xl06cells에 재조합항원 CD40L(Peprotech, Cat. No. :310-02)을 15.0 ug/mL 농도 7로 희석한 희석용액 100 uL을 넣어 상온에서 30분 반웅시켰다. 이후 인산염완충식염수로 세척한 뒤 상기 준비된 FITC 표지 5C2 항체 및 FITC 표지 Isotype 항체를 각각 1.0 ug/mL의 양으로 첨가하여 상온에서 15분간 반응시키고， 인산염완충식염수로 세척한 뒤， 유세포분석기 (Stratedigm, SlOOOEXi)로 형광면역분석을 실시하였다.
상기 얻어진 유세포 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 항원 CD40L을 사용하여 preincLibation을 실시한 경우 CD40L을 사용하지 않은 경우에 비하여 FITC 표지 5C2에 의한 형광값이 입체장애 현상으로 다소 낮아졌으나， 여전히 FITC 표지 5C2에 의한 형광이 발생하고 있음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 5C2 항체가 CD40를 인식함에 있어서， CD40/CD40L 겹합부위와는 다른 부위를 인지함을 보여준다. 실시예 3. 수지상세포의 활성화시험
3-1. 단핵구 유래 수지상세포와준비
항 -CD40 항체에 의한 수지상세포 활성화 여부를 확인하기 위하여， 단핵구 유래 수지상 세포를 분화시켜 준비하고, 이에 대한 항 -CD40 항체의 효능을 시험하였다.
건강한 성인 지원자로부터 전혈을 채혈.하여. EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)가 처리된 tube로 전혈을 옮긴 뒤， 인산염완충식염수 동량과 흔합하고， Fi co 11 -paque Plus(GE Healthcare, Cat. No. :17-1440-03) 위로 전협 흔합액을 올려 실온에서 700 g의 속도로 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) 층만 따로 모아 새로운 tube로 . 옮기고, 약 2배의 인산염완충식염수를 첨가하여 4°C에서 700 g 속도로 5분간 원심분리하여 PBMC pellet을 수집하였다. 10% 우태아혈청 RPMI 배지로 PBMC pellet를 부유시킨 뒤 , cell culture dish(V0M plastic crop. , Cat. No.:V100D)에 옮겨 37°C, 5% C02 조건에서 4시간 배양하였다.
Cell culture dish에 부착하지 않은 비부착 세포를 제거하고 새로운 10% 우태아혈청 RPMI을 넣은 뒤， 수지상세포 분화를 위하여 rhGM- CSF( Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor; JW creagene사)와 rhIL-4(JW creagene사)을 각각 5 X 103 uni t/mL로 처리하였다. 배양 3일 및 6일에 새로운 10% 우태아혈청 RPMI 배양액으로 교체하면서 rhGM CSF와 rhIL—4을 각각 5 X 103 un /inL로 첨가하였다.
분화 7일차에 수지상세포를 Trypsin-EDTA buffer (Thermo, Cat. No.： R001100)로 탈착 시킨 뒤 10% 우태아혈청 RPMI 배양액으로 세척하고 24 well 또는 12 well cell culture dish에 분획하였다. 시험 목적에 따라 항 -CD40 항체 및 다양한 시약을 처리하고 2일에서 5일 정도 추가 배양한 이후 수지상세포의 변화를 분석하였다.
3-2. 마우스 단일클론 5C2에 의한수지상세포 활성화
상기 실시예 3-1에서 준비된 5 X 105 단핵구 유래 수지상 세포에 마우스 단일클론 항체 5C2을 10 ug/mL로 처리하고, 효능 증폭을 위한 가교결합용 2차 항체 Goat ant i -Mouse IgG(H+L)(Dionona사)을 함께 처리하였다.
항체 처리 이후 37°C, 5% C02 조건에서 2일간 추가 배양하고 Trypsin-EDTA( Thermo, Cat . No.： R001100)을 사용하여 수지상세포를 탈착하였다. 수지상세포를 확인하기 위하여 항 -CDllc 항체 -FITC (eBiosceince, Cat. No.： 11-0116— 42)로 수지상세포를 염색하고， 활성화 정도를 측정하기 위하여， 항 -CD80 항체 -PECy5 (eBiosceince, Cat. No.： 15- 0809-42) , 항 -CD86 항체 -ΡΕ (eBiosceince. Cat. No.： 12—0869—42)， 및 항- CD83 항체— APC (eBiosceince, Cat. No.： 17— 0839-42)를 각각 함께 염색하여 : 검출되는 형광 세기를 통하여 보조 자극 인자 CD80, CD83, 및 CD86의 발현 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 형광 세기를 대조군 (항체 미처리군; 100%)에 대한 상대값으로 산정하여 도 5 (CD80의 상대적 발현 수준)， 도 6 (CD86의 상대적 발현 수준) 및 도 7 (CD83의 상대적 발현 수준)에 나타내었다 (도 5 내지 도 7에서'， GAM은 가교결합용 2차 항체 Goat ant i -Mouse IgG(H+L)를 의미함). 도 5 내지 도 7에 나타난 바와 같이 , 5C2 단클론 항체는 보조 자극 인자 CD80, CD83, 및 CD86와 과발현을 유도하였으며， 2차 항체로 가교결합을 유도하였을 경우 그 효과는 더 증대됨을 확인할 수 있다.
3-3. Toll like Receptor 리간드 병용에 의한 수지상세포 활성화 효과
Toll like receptor (TLR)는 대식세포， 수지상세포와 같은 선천면역을 담당하는 첨병 세포에서 널리 발현되며， 세균에서 유래된 물질들을 인지하여 선천면역을 활성화하는 기능을 담당한다. Lipopolysaccharid (LPS)는 TLR— 4에 의하여 인지되는 TLR ligand로 알려져 있기 때문에 5C2 항체와 병용으로 처리하여 수지상세포의 활성화를 평가하였다.
상기 실시예 3-1에서 준비된 5 X 105 단핵구 유래 수지상 세포에 LPS(Sigma-Aldrich, Cat .No. :L3024)을 1.0 ng/mL 농도로 처리하고 5C2 10 ug/niL 및 2차 항체 Goat ant i -Mouse IgG(H+L)(Dionona사) 20 ug/niL를 함께 처리하였다. 2일간 추가 배양하고 Trpysin-EDTA로 수지상세포를 탈착하였다. 항— CDllc— FITC (eBiosceince, Cat. No.： 11一 0116— 42) 항체로 수지상세포를 염색하였고 활성화 정도를.측정하기 위하여 항 -CD80-PECy5 (eBiosceince, Cat. No.： 15-0809-42) , 항— CD83—APC (eBiosceince, Cat. No.： 17—0839— 42)을 함께 염색하고, 검출되는 형광 세기를 통하여 보조 자극 인자 CD80 및 CD83의 발현 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 형광 세기를 대조군 (항체 미처리군; 10OT)에 대한 상대값으로 산정하여 도 8 (CD80의 상대적 발현 수준) 및 도 9 (CD83의 상대적 발현 수준)에 나타내었다 (도 8 및 도 9에서， GAM은 가교결합용 2차 항체 Goat ant ί -Mouse IgG(H+L)를 의미함). 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, LPS 단독으로도 CD80과 CD83의 과발현이 다소 유도되었으나 5C2 가교결합을 유도한 조건에 LPS을 첨가한 경우 CD80 및 CD80의 과발현이 보다 현저하게 증대되었다.
3-4. 키메릭 5C2에 의한수지상세포 활성화
상기 실시예 3-1과 같이 5 X 105 단핵구로부터 수지상 세포를 분화하여 준비하고, 키메릭 5C2 항체 2종 (chimeric IgG2, 및 chimeric IgG4)과 CP870.893 유사체 (US7338660 B2; 21.4.1 항체; 표 3 참조)를 2차 항체 첨가 없이 10 ug/mL 농도^ 수지상 세포에 처리하였다.
항체 처리 이후 37°C, 5% C02 조건에서 5일간 추가 배양한 후 Trypsin-EDTA(Thermo, Cat. No.： R001100)을 사용하여 수지상세포를 탈착하였다. 수지상세포를 확인하기 위하여 항 -CDllc 항체 -FITC (eBiosceince, Cat. No.： 11— 0116— 42)로 수지상세포를 염색하고， 활성화 정도를 측정하기 위하여 , 항 -CD86 항체 -PE (eBiosceince, Cat. No.： 12- 0869-42) 및 항— CD83 항체 -APC (eBiosceince, Cat. No.： 17-0839ᅳ 42)를 함께 염색하여， 검출되는 형광 세기를 통하여 보조 자극 인자 CD83 및 CD86의 발현 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 형광 세기를 대조군 (항체 미처리군 (no treat); 100%)에 대한 상대값으로 산정하여 도 10 (CD86의 상대적 발현 수준) 및 도 11 (CD83의 상대적 발현 수준)에 나타내었다.
5C2 유래 키메릭항체 3종의 가변영역이 동일하여 재조합항원 인간 CD40에 대한 반응성에서는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었으나 (도 2), 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이， 수지상세포의 활성화 측면에서는 isotype에 따라 차이가 관찰되었다. 마우스 5C2 항체의 경우 보조자극분자 과발현 유도를 위해서는 가교항체가 필수적으로 필요하였으나. IgG2 또는 IgG4 유형의 키메릭 항체에서는 가교항체 없이 수지상세포에서 CD86 및 CD83이 과발현 됨을 확안할 수 있다. 더욱이 , 5C2 IgG4 키메릭 항체는 수지상세포 활성화를 가장 잘 유도할 수 있다고 알려진 화이자 CP870,893 유사체와.비교하여.뛰어난 수지상세포 활성화 효능을 나타내었다.
3-5. IFN-gamma 첨가에 의한수지상세포 활성화상승 효과
수지상세포가 T 세포 활성화를 유도하여 효과적으로 외래물질 또는 암세포를 공격하기ᅵ 위해서는 interferon gamma가 필수적으로 요구되며, 수지상세포 분화에도 직접 관여하는 것으로 알려져 있다.
Interferon ga睡 a(IFN)가 추가 되었을 때 5C2 키메릭 항체에 의한 수지상세포 활성화 및 싸이토카인 변화를 확인하기 위하여， 상기 실시예 3一ᅳ 1에서 준비된 5 X 105 단핵구 유래 수지상 세포에 interferon gamma (Pepprotech. Cat. No. :300-02)을 1000 unit/mL 농도로 첨가하였다.
여기에 키메릭 5C2 항체 2종 (chimeric IgG2, 및 chimeric IgG4)과 CP870.893 유사체 (US7338660 B2; 21.4.1 항체; 표 3 참조)를 각각 10.0 ug/mL 농도로 첨가하였다.
항체 처리 이후 37°C, 5% CO2 조건에서 2일간 추가 배양한 후 Trypsin-EDTA(Thermo, Cat. No.： R001100)을 사용하여 수지상세포를 탈착하였다. 수지상세포를 확인하기 위하여 항 -CDllc 항체 -FITC (eBiosceince.. Cat. No.： 11-0116-42)로 수지상세포를 염색하고. 활성화 정도를 측정하기 위하여， 항 -CD86 항체 -PE (eBiosceince, Cat. No.： 12- 0869-42) 및 항— CD83 항체— APC (eBiosceince, Cat. No.： 1그 0839-42)를 각각 함께 염색하여 , 검출되는 형광 세기를 통하여 보조 자극 인자 CD83 및 CD86의 발현 정도를 측정하였다. ·
상기 얻어진 형광 세기를 대조군 (항체 및 interferon gamma 미처리군 (N); 100%)에 대한 상대값으로 산정하여 도 12 (CD86의 상대적 발현 수준) 및 도 13 (CD83의 상대적 발현 수준)에 나타내었다 (N: 항체 및 interferon gamma 미처리군， N+IFN: interferon gamma만 처리, IgG2: IgG2 키메릭 항체만 처리, IgG2+IFN: IgG2 키메릭 항체 및 interferon gamma 처리, IgG4: IgG4 키메릭 항체만 처리， IgG4+IFN: IgG4 키메릭 항체 및 interferon gamma 처리, CP8: CP870.893 유사체만 처리, CP8+IFN: CP870.893 유사체 및 interferon gamma 처리 ). '
도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, Interferon gamma에 의하여 CD86과 CD83 과발현이 유도되고 있으나， 키메릭 항체. 특히 IgG4 isotype 키메릭 항체의 병용 처리에 의하여， Interferon gamma 첨가에 의한 CD86과 CD83 발현의 상승효과가뚜렷하게 관찰되었다'. 실시예 4. 수지상세포 경우 CD8 T세포 활성화 효과
수지상세포가 외부항원을 인지하고 應 C/외부항원 복합체를 구성하여 T 세포에 제시하면 T 세포가 인지하여 활성화 됨으로써 효율적으로 외부항원을 제거할 수 있다. 본 실시예에서 제공하는 항 -CD40 항체가 수지상세포를 활성화하고 연속하여 T 세포 활성화를 유도할 수 있는지 '확인하기 위하여， 버킷 임파종 세포주인 Ramos을 외부항원으로 사용하여 T 세포 활성화 여부 확인시험을 실시하였다.
Ramos 세포주 (ATCC, ATCC CRL-1596)를 10% 우태아혈청 PMI 배지에서 배양한 뒤 넁해동을 2희 반복하여 세포주를 용해시키고 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상청액 (Ramos lysate)¾- 취한 뒤 280 nm 파장에서 흡광값을 측정하여 농도단위 "mg/mL"로 임의 설정하였다.
상기 실시예 3-1에서와 같이 단핵구로부터 수지상 세포을 분화하여 준비한 뒤, 12 well culture clish에 5 X 10'Vwell로 분주하고， 상기 준비된 Ramos lysate을 20 ug/mL 농도로 수지상세포에 ¾가였다. 항 -CD40 항체 효과를 비교하기 위하여, 키메릭 5C2 항체 3종 (chimeric IgGl, chimeric IgG2, 및 chimeric IgG4)과 CP870,893 유사체 (US7338660 B2; 21.4.1 항체; 표 3 참조)를 각각 10 ug/niL 농도로 첨가하여 배양하였다. 익일 수지상세포 공여자로부터 전혈을 취하여 PBMC (peripheral blood mononuclear cells)을 분리한 뒤， 상기 준비된 수지상세포와 5일간 공동배양하였다. 수지상세포 활성화여부는 CD86과 CD83 과발현으로 확인하였다. 수지상세포를 확인하기 위하여 항 -CDllc 항체 -FITC (eBiosceince, Cat. No. : 11-0116-42)로 수지상세포를 염색하고， 항 -CD86 항체 -PE (eBiosceince, Cat. No.： 12-0869-42) 및 항ᅳ CD83 항체— APC (eBiosceince, Cat. No.： 17- 0839— 42)를 각각 함께 염색하여, 검출되는 형광 세기를 통하여 보조 자극 인자 CD83 및 CD86의 발현 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 형광 세기를 대조군 (항체 미처리군 (No treat); 100%)에ᅵ 대한 상대값으로 산정하여 도 14에 나타내었다 (No treat: 항체 미처리군, IgG2: IgG2 키메릭 항체 처리， IgG4: IgG4 키메릭 항체 처리, CP870893: CP870.893 유사체 처리). 수지상세포와 PBMC를 공동배양시, 단클론항체 5C2의 키메릭 항체가 처리된 수지상 세포에서의 CD86과 CD83의 발현 수준이 증가하였으며, 특히 IgG4 키메릭 항체가 처리된 수지상세포의 경우， CD86과 CD83의 발현 수준이 상대적으로 높게 관찰되었다.
T 세포 활성화 분석을 위하여， 상기 항체 처리 및 수지상세포와 ¾동: 배양된 PBMC에 ^-CD8-FITC(Dinona, Cat. No.:10143B)와 항 -CDe,9— - PE(eBioscience, Cat. No„： 12-0699-42)을 함께 염색하여， 검출되는 형광 세기를 통하여 CD8를 발현하는 세포 (CD8-FITC 양성 세포) 및 CD69를 발현하는 세포 (CD69 양성 세포)를 선별하였다. 상기 선별된 CD8— FITC 양성 T 세포군에서의 CD69 양성인 세포의 비율 (% (세포' 개수 기준))을 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 단클론항체 5C2의. 키메릭 항체 처리에 의하여， 활성화된 CD69 양성 CD8 세포의 비율이 증가하였으며， 특히 IgG4 키메릭 항체 처리시에 활성화된 CD69 양성 CD8 세포의 비율이 가장 높게 나타났다. 실시예 5. 자가세포사멸 (Apoptosis) 효능 시험
5-1. 키메릭 5C2항체에 의한자가세포사멸 효능 시험
종양 세포주에 대한 직접적인 5C2 항체의 세포 살해능을 확인하기 위하여 자가세포사멸 시험을 실시하였다. Ramos 세포주 (ATCC, ATCC CRL- 1596)를 인산염완충식염수를 사용하여 세척한 뒤 5.0% 우태아혈청 RPMI 배지로 재현탁하여 2 X lOVwell로 분주하였다. 항 -CD40 키메릭 항체 3종 (IgGl, IgG2, IgG4) , CP870,893 유사체 및 리특산을 1.0 ug/mL로 처리하고， 37 °C, 5% C02 조건에서 2일간 추가 배양하였다. 세포 살해효과는 FITC Annex in-V (BD Pharmingen, Cat. No.： 51— 65874X)와 7— AAD(BD Pharmingen, Cat. No.： 51-68981E)를 제조사의 매뉴얼에 따라 염색하여 양성 세포 비율 (¾>)로 판정하였으며， 시험결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 확인되는 바와 같이， 5C2 IgG2 isotypic 매우 우수한 종양 세포 살해능을 나타내었다. 5-2. 인간화항체 5C2항체에 의한 apoptosis효능 시험
인간화항체 5C2의 자가세포사멸 효능을 확인하기 위하여 Raji 버킷 임파종 세포주 (ATCC, ATCC CCL-86)를 인산염완충식염수를 사용하여 세척한 뒤 3.OT 우태아혈청 RPMI 배지로 재현탁 하여 2 X lOVwell로 분주하였다. 인간화 항체 5C2 IgG2 7종 (VH1VL2, VH2VL1, VH2VL2,. VH3VL1, VH3VL2, VH5VL1, VH5VL2), CP870,893 유사체 및 human IgG를 10.0 ug/mL로 처리하여 2일간 37°C, 5% C02 조건에서 추가 배양하였다. 이후 5-1에서 제시한 바와 같이 FITC Annexin-V와 7-AAD로 염색하여 자가세포사멸 효능을 판정하여 ：— 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에 나타난 바와 같이， 7종의 인간화항체 모두쎄서 CP870,893 유시체 보다 뛰어난 차가세포사멸 효능이 있음을 확인하였다. 실시예 6. Super-antigen Staphylococcal Enterotoxin B(SEB) ■처리 조건에서 5C2항체의 의한 T세포활성화
T 세포 활성화는 항원 특이적으로 발생하기 때문에 동일한 TCR을 가진 T 세포가 아니라면 하나의 항원으로 활성화를 유도할 수 없다. PBMC를 이용한 시험관 시험등에서 T 세포를 전반적으로 활성화하려면 비특이적으로 T 세포 활성화를 유도 할 수 있는 SEB와 같은 super-antigen을 사용해야 한다.
본 시험에서는 SEB를 PBMC에 처리하여 T 세포가 활성화될 수 있는 조건을 조성한 이후 5C2 항체를 처리하여 면역반응이 더 증강되는지 여부를 평가하였다.
건강한 지원자로부터 전혈을 취하여 PBMC을 분리한 뒤 I X 106/well 조건으로 분주하였다. 이후 SEB을 30 ng/mL로 처리하고 인간화 항체 5C2 4종 (VH2VL1, VH2VL2, VH3VL1, VH3VL2) , CP870,893 유도체 및 Human IgG을 10 ug/mL로 함께 처리하였다. 37°C, 5% C02 조건에서 3일간 추가 배양을 실시한 뒤 배양액 상청액을 취하여 Human IFN— gamma (Affymetrix, Cat. NO. : 88-7316-22)을 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 18에. 나타내었다. 도 18에 나타난 바와 같이， 5C2 인간화 항체를 처리한 경우 대조군에 비하여 2-3배 이상에 달하는 IFN-gamma가 측정되었다. 이는 5C2 자극에 의하여 면역반응이 더욱 증대될 수 있음을 뒷받침한다ᅳ 실시예 7. 동물모델을 이용한 5C2항종양효과시험
5C2 항체는 수지상세포를 경유하여 CD8 T 세포 활성화를 유도할 수 있기 때문에 항종양 효과가 있을 것으로 기대할 수 있다. 또한, 5C2 항체가 CD40을 발현하는 종양 세포주에서 자가세포사멸 효과를 나타내므로 부수적인 항종양 효과를 기대할 수 있다.
5C2 항체는 마우스 CD40에 대한 교차 반웅성이 없기 때문에 종양세포주를 단독으로 주입한 모델과 인간 수지상 세포 및 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells; PBMC)를 함께 주입한 두 가지 모델에서 5C2 항체의 효과를 각각 시험하였다.
NSG (NOD . Cg- cscidI 12rgtmlWj VSzJ ) 마우스 (The Jackson Laboratory, 25 gram, 6~8 주령)에 백혈병 세포주인 Ramos 세포주 (ATCC, ATCC CRL-1596)를 단독 피하 주사하거나， 인간 수지상 세포와 P3MC를 함께 주사하였디■.
본 시험에서 수지상 세포는 실시예 3—1과 같이 건강한 성인 지원자로부터 전혈을 채혈하고 Ficoll-paque Plus(GE Healthcare, Cat.
No. :17- 1440-03)로 PBMC를 분리한 뒤 배양접시 부착 세포를 rhGM一 CSF(Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony St imulat ing
Factor; JW creagene사)와 rhIL-4(JW creagene사)로 분화하여 준비하였다. 분화 7일차 수지상 세포를 탈착하고 인산염완충식염수로 세척한 뒤 마우스 복부에 5 X 105 eel ls/mouse로 피하 주사하였다.
PBMC는 수지상세포 동일 공여자로부터 전혈을 취한 뒤 Ficoll-paque Plus(GE Healthcare, Cat. No.： 1그 1440-03)로 분리하여 준비하였고 인산염완충식염수로 세척한 뒤 마우스 복부에 2 X 106 eel ls/mouse로 피하 주사하였다
세포 주사 이후 곧이어 키메릭 5C2 IgG2 항체 또는 인산염완충식염수를 복강주사 '하였고 일주일 경과 시점에 항체 또는 인산염완충식염수 1회 추가 주사하였다. 구체적 시험 내용을 아래의 표 7에 요약하였다:
【 ^^ 7]
5C2 항암효과 동물시험방법
Figure imgf000039_0001
항체 투여 후 종양의 체적 변화 (mm )를 측정하였다.
상기 얻어진 종양의 체적 변화 (mm3)의 평균을 하기의
및 도 20에 나타내었다.
【표 8】
종양 체적 변화 (隱 3)의 평균
Figure imgf000039_0002
표 8 및 도 19에서 보여지는 바와 같이, 종양세포 단독 주입 동물모델에서 5C2 항체 (Group 2)는 종양의 성장을 지연시키는 효과를 나타내었다. 5C2 항체의 자가세포사멸 효능이 항종양 효과에 기여한 것으로 보인다. 표 8 및 도 20에서 보여지는 바와 같이， 수지상세포와 P丽 C를 종양세포주와 함께 주입한 .동물모델에서 대조군의 종양은 급격하게 성장하여 24일 경과 시점에 10， 000 mm3 초과하였으나， 5C2 항체를 처리한 경우 (Group 4)에는 항체 투여 34일까지 종양 성징-이 완벽하게 억제되었고， 34일 이후 한 마리 마우스에서 종양의 성장이 관찰되었다. 종양의 성장은 주입한 인간 수지상 세포 및 PBMC의 수명이 다하여 항종양 효과를 발휘 할 지 못하였기 때문으로 추측된다.
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A Institute for Life ci nce liF, Ol mpic 4:M¾ S al 138^ 6, Korea
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Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
다음의 상보성 결정부휘 (com lementarity determining region; CDRs)를 포함하는, 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
서열번호 17 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR— H2, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3,
서열번호 20 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21 또는 서열번호 36의 아미노산 서열올 포함하는 CDR— L2, 및
서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
서열반호 1. 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 2， 29， 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 을 포함하는， 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 3】
기탁번호 KCLRF— -BP-00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편ᅳ
【청구항 4】
기탁번호 KCLRF-BP-00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체의 CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-L2, 및 CDR-L3를 포함하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 5】
기탁번호 KCLRF— BP-00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편ᅳ
【청구항 6】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 항 CD40 항체는 동물 항체， 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 7】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 항원 결합 단편은 상기 항 CD40 항체의 scFv. (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2인， 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 8】
게 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서， CD40 에 대하여 작용제 (agonist) 활성을갖는 것인, 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 9】
기탁번호 KCLRF-BP— 00381인 항 CD40 항체 생산을 위한 하이브리도마.
【청구항 10】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 약학 조성물.
【청구항 11】
거 U항 내지 게 5항 중 어느 한 항의 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암， 암전이， 감염， 및 면역 결핍 질환에서 선택된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 .
【청구항 12】 ,
제 11항에 있어서, 상기 질병은 혈액암인， 약학 조성물.
【청구항 13】
서열번호 17.내지 22 및 33 내지 36 중에서 선택된 아마노산 서열을 암호화하는 핵산. '
【청구항 14】
서열번호 1, 23, 24， 25, 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열;
서열번호 2， 29, 또는 30의 아미노산 서열; 또는
이들 모두
를 암호화하는 핵산.
【청구항 15】
제 13항 또는 제 14항의 핵산을 포함하는 재조합 백터 .
【청구항 16】
제 15항의 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포.
【청구항 17]
제 1항의 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결할 단편을 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 질병은 암, 암전이， 감염， 및 면역 결핍 질환에서 선택된 질병인,
질병의 예방 또는 치료 방법.
【청구항 18】
제 17항에 있어서, 상기 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 , 23 , 24 , 25， 26， 27 , 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열.번호 2 , 29， 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 을 포함하는 것인， 질병의 예방 또는 치료 방법.
【청구항 19】
다음 중에서 선택된 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하고，
상기 질병은 암， 암전이， 감염, 및 면역 결핍 질환에서 선택된 질병인，
질병의 예방 또는 치료 방법:
기탁번호 KCLRF-BPᅳ 00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
기탁번호 KCLRF-BP— 00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체의 CDR-Hl , CDR-H2 , CDR-H3 , CDR-Ll , CDR-L2 , 및 CDR-L3를 포함하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편 ; 및
기탁번호 K(XRF-BP-00381의 하이브리도마로부터 생산된 항 CD40 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편. ᅵ
【청구항 20】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 암, 암전이， 감염ᅳ 및 면역 결핍 질환에서 선택된 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도.
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