CN110546164A - 特异性结合cd40的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与CD40特异性结合的抗CD40抗体及其用途，特别是提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段，以及含有相同抗体或片段作为有效成分用于预防和/或治疗癌症、癌症转移、感染和/或免疫缺陷疾病的药物组合物。

Description

特异性结合CD40的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及特异性结合CD40的抗CD40抗体及其用途，更具体地，涉及抗CD40抗体或其抗原结合片段和包含其作为预防和/或治疗癌症、癌症转移、感染，和/或免疫缺陷疾病的有效成分的组合物。
背景技术
CD40是共刺激蛋白分子，属于在抗原呈递细胞(APC)上发现的肿瘤坏死因子(TNF)-受体超家族，所述抗原呈递细胞包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞。TH细胞上的配体CD154(CD40L)与CD40的结合激活抗原呈递细胞。包括细胞因子产生、共刺激分子(例如CD86)的上游调节和增强的抗原呈递以及B细胞增殖的各种免疫反应伴随CD4介导的APC活化。CD40也可以由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞表达。
激动性抗CD40抗体构成这些试剂中最有效的一类。CD40是在抗原呈递细胞(APC)如树突细胞、B细胞和巨噬细胞上表达的肿瘤坏死因子超家族的细胞表面成员。使用抗CD40激动剂的临床前研究表明，在抗原呈递细胞(APC)上用交联抗体触发CD40可以替代通常通过CD40配体提供的CD4T细胞的帮助，并促进CD8效应T细胞的活化和扩增。此外，CD40活化的巨噬细胞也可以发挥直接的杀肿瘤功能。
[现有技术文献]
WO2016/069919A1(2016年5月6日)
发明内容
技术问题
一种实施方式提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段，其特异性识别CD40。抗CD40抗体或其抗原结合片段的特征在于识别不同于CD40与其配体CD40L之间的结合位点的位点。抗CD40抗体或其抗原结合片段是CD40的激动剂。另外，抗CD40抗体或其抗原结合片段可以通过识别不同于CD40与其配体CD40L之间的结合位点的位点而不干扰CD40/CD40L相互作用。
抗CD40抗体或其抗原结合片段可包含：
重链互补决定区(CDR)或含有重链互补决定区(CDR)的重链可变区，重链互补决定区包括：包含SEQ ID NO：17(GYGFTNYL)或SEQ ID NO：33(NYLIE)的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)；包含SEQ ID NO：17(GYGFTNYL)或SEQ ID NO：33(NYLIE)的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)；包含SEQ ID NO：18(INPGYGGV)或SEQ ID NO：34(VINPGYGGVNYNEKFKG)的氨基酸序列的多肽(CHR-H2)；和包含SEQ ID NO：19(GGSGFAF)的氨基酸序列的多肽(CHR-H3)；和
轻链互补决定区(CDR)或含有轻链互补决定区的轻链可变区，轻链互补决定区包括：包含SEQ ID NO：20(QDISNH)或SEQ ID NO：35(RASQDISNHLN)的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)；包含SEQ ID NO：32(STS(Xaa)n的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，其中n表示任意氨基酸Xaa的数目，并且可以是0(Xaa为空)或1-4的整数，例如，具有SEQ ID NO：21(STS)或SEQ IDNO：36(STSRLHS)的氨基酸序列的多肽；和包含SEQ ID NO：22(QQGNTLP)的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
另一种实施方式提供了产生抗CD40抗体的杂交瘤。
另一种实施方式提供了编码抗CD40抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子。
另一种实施方式提供了编码抗CD40抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸。
另一种实施方式提供了携带编码抗CD40抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗CD40抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子两者的重组载体，或分别携带所述核酸分子的重组载体。
另一种实施方式提供了重组细胞，其锚定其中的重组载体或多个重组载体。
另一种实施方式提供了药物组合物，其包含抗CD40抗体或其抗原结合片段作为预防和/或治疗疾病的有效成分。
另一种实施方式提供了预防和/或治疗疾病的方法，该方法包括将抗CD40抗体或其抗原结合片段给予需要预防和/或治疗该疾病的受试者。
另一种实施方式提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段在预防和/或治疗疾病或在制备用于预防和/或治疗疾病的组合物中的用途。
该疾病可选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷疾病。
技术方案
本文提供了特异性识别CD40的抗CD40抗体及其用途。抗CD40抗体的特征在于识别不同于CD40与其配体CD40L之间的结合位点的位点，并且可以表现出对CD40的激动活性。另外，抗CD40抗体或其抗原结合片段可以通过识别不同于CD40与其配体CD40L之间的结合位点的位点而不干扰CD40/CD40L相互作用。本文中，表述“不干扰CD40/CD40L相互作用”意指不以显著水平抑制CD40/CD40L相互作用并且包括不引起显著抑制作用发生的一些抑制。
CD40是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，是在正常和肿瘤人B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞、内皮细胞、单核和上皮细胞，以及包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和直肠癌的许多肿瘤(例如实体瘤)的表面发现的45-50kDa细胞表面抗原。CD40在活化的T细胞、活化的血小板、炎性血管平滑肌细胞、类风湿性关节炎中的滑膜、真皮成纤维细胞和非淋巴瘤细胞中表达。
作为本文提供的抗体的抗原的CD40可以源自哺乳动物，例如人源CD40(例如NCBI登录号NP_001241.1、NP_001289682.1、NP_690593.1、NP_001309351.1和NP_001309350.1)。人源CD40的五种同种型中存在细胞外区域，并且本发明中提供的抗CD40抗体识别和/或结合细胞外区域。
CD40与其同源配体CD40L(或CD154)之间的结合导致B细胞增殖和向浆细胞分化、抗体产生、抗体同种型转换和记忆B细胞发育。CD40L是CD40的配体，也称为CD154，是分别由18kDa和31kDa两个亚基组成的32-33kDa跨膜蛋白，并且以可溶形式存在，其具有生物活性。
CD40和CD40L之间的相互作用诱导体液和细胞介导的免疫应答。
CD40上调上述配体-受体相互作用以激活其他抗原呈递细胞(APC)，包括单核细胞、B细胞和树突细胞(DC)。单核细胞和DC上的CD40信号传导增强细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和MIP-1α)的存活以及分泌。CD40与这些APC的连接还诱导共刺激分子如ICAM-1、LFA-3、CD80和CD86的上调。CD40配体激活是在使DC完全成熟至有效驱动T细胞活化的APC中起关键作用的信号之一。
如本文所用，术语“抗体”一般表示通过刺激免疫***中的抗原或与特定抗原特异性结合的蛋白质制备的物质，并且对其种类没有特别限制。抗体可以是以非天然方式产生的抗体，例如以重组或合成方式产生的抗体。抗体可以是动物抗体(例如，小鼠抗体等)、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
除非另有说明，否则本发明中的抗体可以理解为包括具有抗原结合能力的其抗原结合片段。如本文所用，术语“互补决定区(CDR)”是指抗体中可变区的一部分，其赋予抗原结合特异性。在这方面，抗体的前述抗原结合片段可以是包含一个或多个互补决定区的抗体片段。
本发明的一种实施方式提供了特异性识别或结合CD40的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
CD40上被抗CD40抗体或其抗原结合片段识别或结合的位点可以不同于CD40L与CD40相互作用或结合CD40的位点。抗CD40抗体或其抗原结合片段可具有CD40的激动剂功能。抗CD40抗体或其抗原结合片段可以不干扰CD40/CD40L相互作用。此外，抗CD40抗体或其抗原结合片段可具有TAM(肿瘤相关巨噬细胞)极化和癌细胞凋亡活性。
在具体实施方式中，抗CD40抗体或其抗原结合片段可包含作为重链中的互补决定区(CDR)的包含SEQ ID NO：17(GYGFTNYL)或SEQ ID NO：33(NYLIE)的氨基酸序列的多肽(CDR-H1)，包含SEQ ID NO：18(INPGYGGV)或SEQ ID NO：34(VINPGYGGVNYNEKFKG)的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列(GGSGFAF)的多肽(CDR-H3)。
另外，抗CD40抗体或其抗原结合片段可以包含作为轻链中的互补决定区的包含SEQ ID NO：20(QDISNH)或SEQ ID NO：35(RASQDISNHLN)的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，包含SEQ ID NO：32(STS(Xaa)n的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，其中n表示任意氨基酸Xaa的数目并且可以是0(Xaa为空)或1至4的整数，例如，SEQ ID NO：21(STS)或SEQ ID NO：36(STSRLHS))的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)；和包含SEQ ID NO：22(QQGNTLP)的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
因此，抗CD40抗体或其抗原结合片段可包含：重链互补决定区或包含重链互补决定区的重链可变区，重链互补决定区包括：包含SEQ ID NO：17(GYGFTNYL)或SEQ ID NO：33(NYLIE)的氨基酸序列多肽(CDR-H1)，包含SEQ ID NO：18(INPGYGGV)或SEQ ID NO：34(VINPGYGGVNYNEKFKG)的氨基酸序列的多肽(CDR-H2)，和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列(GGSGFAF)的多肽(CDR-H3)；和轻链互补决定区或包含轻链互补决定区的轻链可变区，轻链互补决定区包括：包含SEQ ID NO：20(QDISNH)或SEQ ID NO：35(RASQDISNHLN)的氨基酸序列的多肽(CDR-L1)，包含SEQ ID NO：32(STS(Xaa)n的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)，其中n表示任意氨基酸Xaa的数目并且可以是0(Xaa为空)或1至4的整数，例如，SEQ ID NO：21(STS)或SEQ ID NO：36(STSRLHS))的氨基酸序列的多肽(CDR-L2)；和包含SEQ ID NO：22(QQGNTLP)的氨基酸序列的多肽(CDR-L3)。
重链可变区可包含SEQ ID NO：1、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列(参见表1和6)。
轻链可变区可包含SEQ ID NO：2、29或30的氨基酸序列(参见表1和6)。
当对人进行医学治疗时，通过用所需抗原免疫非免疫动物产生的动物来源的抗体通常引起免疫排斥反应。为了抑制这种免疫排斥，已经开发了嵌合抗体。使用基因工程技术制备嵌合抗体，其中引起抗同种型反应的动物来源抗体的恒定区被人抗体的那些恒定区替代。尽管与其原始动物来源的抗体相比，抗同种型反应显著改善，但由于动物来源的氨基酸并入嵌合抗体的可变区，因此嵌合抗体仍然保留了抗独特型反应的副作用的潜在风险。开发人源化抗体以减少这种副作用。通过将嵌合抗体的可变区的互补决定区(CDR)(的原结合关键)与人抗体构架接枝来产生人源化抗体。
产生人源化抗体的CDR移植过程中的一个重要方面是选择优化的用于接受动物来源抗体的CDR的人抗体。为此，利用抗体数据库、晶体结构分析、分子建模技术等。然而，即使将动物来源的抗体的CDR移植到优化的人抗体构架中，也可能存在位于动物来源的抗体的构架中的氨基酸，并对抗原结合有影响，在许多情况下，这导致抗原结合力的降低。因此，人源化抗体的产生可能需要额外的抗体工程技术来恢复抗原结合力。
根据一种实施方式，抗体可以是动物抗体(例如小鼠抗体)、嵌合抗体(例如小鼠-人嵌合抗体)或人源化抗体。
嵌合抗体可包括：
重链，包含小鼠抗体的重链可变区和人免疫球蛋白(IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)、IgM、IgA、IgD或IgE)的恒定区(重链可变区的C-末端与恒定区的N-末端连接)；和
轻链，包含小鼠抗体的轻链可变区和κ(κ)-或λ(λ)-型恒定区(轻链可变区的C末端连接到恒定区的N末端)。
在一种实施方式中，嵌合抗体可以包含作为重链的小鼠抗体的重链可变区和人IgG(例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)的恒定区。在一种实施方式中，嵌合抗体可以包含作为重链的小鼠抗体的重链可变区和人IgG4的恒定区。
人源化抗体可包括：
重链，包含小鼠抗体的互补决定区(CDR)和人免疫球蛋白(IgG1(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等))、IgM、IgA、IgD或IgE)的构架(不包括CDR的可变域)和重链；和
轻链，包含小鼠抗体的轻链CDR和κ(κ)-或λ(λ)-型构架和恒定区。
在一种实施方式中，人源化抗体可包含作为重链的小鼠抗体的重链CDR和人IgG(例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)的构架和恒定区。在一种实施方式中，人源化抗体可以包含作为重链的小鼠抗体的重链CDR和人IgG4的构架和恒定区。
完整抗体具有由两条全长轻链和两条全长重链组成的结构，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。恒定区存在于重链和轻链中的每一个中。重链恒定区具有γ(γ)、μ(μ)、α(α)、δ(δ)或ε(ε)型，可进一步细分为γ1(γ1)、γ2(γ2)、γ3(γ3)、γ4(γ4)、α1(α1)或α2(α2)。轻链恒定区为κ(κ)或λ(λ)型。
如本文所用，术语“重链”旨在涵盖由可变区VH组成的全长重链，该可变区VH包含足以赋予抗体上的对抗原特异性的氨基酸序列，三个恒定区域CH1、CH2和CH3、铰链和全长重链的片段。术语“轻链”是指由可变区VL组成的全长轻链，该可变区VL包含足以赋予抗体上的对抗原特异性的氨基酸序列和恒定区CL，或全长轻链的片段。
术语“CDR(互补决定区)”表示位于免疫球蛋白的重链和轻链高变区的氨基酸序列。每条重链和轻链具有三个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3)。CDR提供接触残基，其在抗体与抗原或表位的结合中起主要作用。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性识别”具有与本领域普通技术人员公知的相同含义，并且表明抗体和抗原彼此特异性相互作用以诱导免疫活性。
术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，其具有负责抗原结合的多肽的一部分。可用于本发明的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、Fab、Fab′和F(ab′)2，但不限于此。
在抗原结合片段中，Fab由保留一个抗原结合位点的来自轻链的一个可变域和一个恒定域以及来自重链的一个可变域和第一个恒定(CH1)域组成。
Fab′片段与Fab的不同之处在于Fab′还包含在重链CH1域的C末端具有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。
因为两个Fab′片段通过铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键连接形成了F(ab′)2抗体。Fv片段是仅由来自重链和轻链的可变域组成的最小抗体片段。用于产生Fv的重组技术是本领域熟知的。
在双链Fv片段中，重链可变域通过非共价键与轻链可变域缔合。单链Fv片段具有这样的结构，其中重链可变域和轻链可变域通过共价键彼此通过共价键连接或直接在C-末端共价连接，因此它可以形成如同在双链Fv片段中的二聚体。
可以使用蛋白酶获得抗原结合片段(例如，可以用木瓜蛋白酶消化完整抗体以获得Fab片段，或者可以用胃蛋白酶消化以获得F(ab′)2片段)，或者可以通过基因重组技术制备抗原结合片段。
术语“铰链区”是指位于抗体重链中的CH1和CH2区之间的区域，对随后的抗体中的抗原结合位点呈现灵活性。
抗CD40抗体可以是单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法制备单克隆抗体，例如噬菌体展示技术。或者，可以通过任何常规方法将抗CD40抗体制备为小鼠来源的单克隆抗体。
同时，可以通过使用典型的ELISA(酶联免疫吸附测定)形式、基于单个单克隆抗体的CD40结合能力筛选单个单克隆抗体。可以通过使用功能测定法(例如用于检查复合物内组分之间的分子相互作用的竞争性ELISA)和基于细胞的测定来分析单克隆抗体的抑制活性。然后，可以测试基于有效抑制活性选择的单克隆抗体成员的对CD40的各自亲和力(Kd值)。
最后选择的抗体由除抗原结合部分之外的人免疫球蛋白抗体组成，并且可以制备为人源化抗体。人源化抗体的制备方法是本领域熟知的(Almagro，J.C.和Fransson，J.，“人源化抗体，”生物科学前沿，13(2008)，1619-1633)。
另一方面提供了产生抗CD40抗体的杂交瘤。在一种实施方式中，杂交瘤可以是以登记号为KCLRF-BP-00381保藏的杂交瘤。
另一方面提供了由杂交瘤产生的抗CD40抗体，或其抗原结合片段。
另一方面提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段，该抗CD40抗体包含由杂交瘤产生的抗CD40抗体中的重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3或其组合)或轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3或其组合)，或其组合；或由杂交瘤产生的抗CD40抗体中的重链可变区或轻链可变区，或其组合。在这方面，决定互补性的区域可以通过所有典型方法确定，例如，IMGT定义(http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)或Cabat定义(http：//www.bioinf.org.uk/abs/)，但不限于此。
另一方面提供了药物组合物，其包含抗CD40抗体或其抗原结合片段作为预防和/或治疗疾病的有效成分。另一方面提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段在预防和/或治疗疾病或在制备用于治疗和/或预防疾病的组合物中的用途。另一方面提供了预防和/或治疗疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的抗CD40抗体或其抗原结合片段给予有需要的受试者。用于预防和/或治疗疾病的方法可以进一步包括在给药步骤之前鉴定需要预防和/或治疗疾病的受试者。该疾病可选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷疾病。
药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是通常用于配制药物的载体。药学上可接受的载体的例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。此外，药物组合物还可包含选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、保湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂及其组合组成的组中的典型添加剂。
有效量的药物组合物或抗体或其抗原结合片段可以口服或胃肠外给药。对于肠胃外给药，可以选择静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、真皮内、鼻内、肺内、直肠内或病灶周围途径。然而，对于口服给药，由于蛋白质或肽被胃蛋白酶消化，因此可以包衣或配制药物组合物以保护活性成分免于在胃中降解。另外，可以借助于适于将药物组合物递送至靶细胞的仪器进行给药。
可以考虑包括制剂类型、患者的年龄、体重和性别、所治疗疾病的严重程度、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、***率和敏感性的各种因素来确定药物组合物中抗CD40抗体或其抗原结合片段的含量或抗CD40抗体或其抗原结合片段的给药量。例如，抗CD40抗体或其抗原结合片段的日剂量可以为约0.001至1000mg/kg，特别是约0.01至100mg/kg，更特别是约0.1至50mg/kg，更特别是约0.1至20mg/kg，但不限于此。日剂量可以配制成单位剂量形式或分配成单独的剂量形式或可以包含在多剂量包装内。
药物组合物可以与不同的药物如抗癌剂联合给药。在这方面，药物组合物的剂量和给药途径以及不同药物的种类可以根据患者的状态适当地确定。
药物组合物可以配制成油或含水介质、悬浮液、糖浆、乳液、酏剂、粉末、颗粒、片剂或胶囊中的溶液，在这种情况下，可以进一步使用分散剂或稳定剂。
给药药物组合物的受试者可以是哺乳动物，其例子包括灵长类动物如人或猴，和啮齿动物如小鼠和大鼠。
癌症可以是实体癌症或血癌。癌症可选自由鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、直肠癌、肛周癌、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、白血病(如慢性或急性白血病)、淋巴瘤、肝癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、头或颈部癌症、脑癌、骨肉瘤及其组合，但不限于此。癌症可能是原发性癌症或转移性癌症。
如本文所用，术语“癌症治疗”旨在涵盖所有抗癌作用，通过该作用可防止癌症症状恶化，缓解或逆转至更好的状况，例如抑制癌细胞增殖、杀死癌细胞、抑制癌症转移等，或部分或完全消除癌症。
抗CD40抗体或其抗原结合片段与CD40的特异性结合可用于检测或鉴定CD40。因此，本发明的另一方面提供用于检测CD40的组合物，该组合物包含抗CD40抗体或其抗原结合片段。另一方面提供了检测CD40的方法，该方法包括以下步骤：用抗CD40抗体或其抗原结合片段处理生物样品；和检查抗原-抗体反应是否已经发生。在检测方法中，如果发生抗原-抗体反应，可能导致确定(决定)生物样品中CD40的存在。因此，检测方法可以进一步包括当在鉴定步骤之后检测到抗原-抗体反应时确定生物样品中CD40的存在。生物样品可以选自从人(例如癌症患者)或从其培养物中获得(分离)的细胞、组织或体液。
抗原-抗体反应的检查可以使用本领域公知的方法进行，例如，基于酶反应、荧光、发光和/或辐射。用于检查生物样品的抗原-抗体反应的方法的例子可包括免疫层析、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)、蛋白质(Western)印迹和微阵列，但不限于此。
另一方面提供了多肽分子，其包含重链互补决定区、轻链互补决定区或其组合；或上述抗CD40抗体中的重链可变区、轻链可变区或其组合。
多肽可以用作构建抗体的前体，或者可作为具有与抗体、双特异性抗体和多特异性抗体类似结构的蛋白质支架(例如肽体)中的组分被包含。
另一方面提供了编码抗CD40抗体中的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸。
另一方面提供了编码抗CD40抗体中的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子。
另一方面提供了携带编码抗CD40抗体的重链互补决定区、重链可变区或重链的核酸分子和编码抗CD40抗体的轻链互补决定区、轻链可变区或轻链的核酸分子两者的重组载体，或分别携带上述核酸分子的重组载体。
另一方面提供了含有重组载体的重组细胞。
术语“载体”是指在宿主细胞中表达靶基因的部件，例如质粒载体、粘粒载体和病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可以通过操作由本领域常用的质粒构建(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19)、噬菌体(例如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)或病毒(例如SV40等)。
在重组载体中，核酸分子可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”旨在涉及目标核苷酸序列和表达调控序列(例如启动子序列)之间的功能性连接。当“可操作地连接时，调节元件可以控制目标核苷酸的转录和/或翻译。
重组载体通常可以构建为克隆载体或表达载体。对于重组表达载体，可以使用通常用于在植物、动物或微生物细胞中表达外源蛋白的载体。可以使用本领域熟知的各种方法构建重组载体。
为了在宿主例如原核或真核细胞中使用，可以适当地构建重组载体。例如，当载体构建为用于原核生物宿主中的表达载体时，载体通常包含用于转录的强启动子(例如，pLκλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)，用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止位点。另一方面，用于真核生物宿主的表达载体包括在真核细胞中起作用的复制起点，例如fl复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺病毒复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点，但不限于此。此外，表达载体通常包含源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子)和聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
另一方面提供了含有重组载体的重组细胞。
可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞中来制备重组细胞。只要其允许以稳定方式顺序克隆和表达重组载体，可以在本发明中使用本领域已知的任何宿主细胞。可用于本发明的原核生物宿主细胞的例子包括大肠杆菌(E.coli)JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776、大肠杆菌W3110、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，以及肠杆菌科菌株如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。待转化的真核生物宿主细胞可以是但不限于酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞和动物细胞，如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN和MDCK。
使用本领域熟知的方法，可以将核酸分子或携带其的重组载体导入(掺入)宿主细胞中。当宿主细胞是原核生物细胞时，可以使用CaCl2或电穿孔方法进行该转化。对于真核生物宿主细胞，可以使用但不限于显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染或粒子轰击来实现基因引入。
为了选择转化的宿主细胞，可以根据本领域已知的方法利用有助于选择标记的表型。例如，当选择标记是对某种抗生素具有抗性的基因时，宿主细胞可以在培养基中在抗生素存在下生长，以选择感兴趣的转化体。
另一方面提供了产生抗CD40抗体的方法，该方法包括在宿主细胞中表达核酸分子或携带其的重组载体的步骤。制备方法可包括在其中培养含有重组载体的重组细胞，和任选地从培养基中分离和/或纯化抗体。
有益效果
本发明提供了特异性结合CD40的抗CD40抗体，其具有CD40的激动功能，并且不干扰CD40/CD40L相互作用，从而允许更有效地治疗癌症。
附图说明
图1是显示抗CD40单克隆抗体5C2与CD40(rCD40：重组人CD40；rCD40L：重组抗原人CD40L)的结合亲和力的图。
图2是显示3种抗CD405C2嵌合抗体(嵌合IgG1：包含人IgG1恒定区的嵌合抗体；嵌合IgG2：包含人IgG2恒定区的嵌合抗体；嵌合IgG4：包含人IgG4恒定区的嵌合抗体；CP870,893：对照抗体；(-)：无抗体处理)与CD40的结合亲和力的图。
图3是显示8种人源化5C2抗体(VH1VL1：重链VH1和轻链VL1的组合；VH2VL1：重链VH2和轻链VL1的组合；VH3VL1：重链VH3和轻链VL1的组合；VH5VL1：重链VH5和轻链VL1的组合；VH1VL2：重链VH1和轻链VL2的组合；VH2VL2：重链VH2和轻链VL2的组合；VH3VL2：重链VH3和轻链VL2的组合；VH5VL2：重链VH5和轻链VL2的组合；(-)：抗体未处理组；阳性：包含人IgG4恒定区的嵌合5C2抗体)与人CD40的结合亲和力的图。
图4显示了用于检查抗CD40单克隆抗体5C2对CD40/CD40L相互作用的影响的流式细胞术的结果。
图5是显示用单克隆抗体5C2处理的树突细胞中CD80的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图6是显示用单克隆抗体5C2处理的树突细胞中CD86的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图7是显示用单克隆抗体5C2处理的树突细胞中CD83的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图8是显示当用Toll样受体配体(脂多糖(Lipopolysaccharid)；LPS)和单克隆抗体5C2共同处理细胞时CD80的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(抗体未处理组)的相对值。
图9是显示当用Toll样受体配体(脂多糖；LPS)和单克隆抗体5C2共同处理细胞时CD83的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(抗体未处理组)的相对值。
图10是显示用单克隆抗体5C2的人IgG1嵌合抗体(嵌合IgG1)、人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)和人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)处理细胞时CD86表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图11是显示用单克隆抗体5C2的人IgG1嵌合抗体(嵌合IgG1)、人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)和人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)处理细胞时CD83的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图12是显示当用干扰素γ与单克隆抗体5C2的人IgG1嵌合抗体(嵌合IgG1)、人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)和人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)一起共同处理细胞时CD86的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图13是显示当用干扰素γ与单克隆抗体5C2的人IgG1嵌合抗体(嵌合IgG1)、人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)和人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)一起共同处理细胞时CD83的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图14是显示用单克隆抗体5C2的人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)或人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)处理并与PBMC共培养的树突细胞中CD86和CD83的表达水平的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图15是显示用单克隆抗体5C2的人IgG2嵌合抗体(嵌合IgG2)或人IgG4嵌合抗体(嵌合IgG4)处理并与PBMC共培养的树突细胞中活化的CD69阳性CD8细胞的比例(％)的图，其中表达水平表示为与对照组(未处理：抗体未处理组)的相对值。
图16是显示由嵌合5C2抗体(人IgG1：无关的人IgG1；c5C2 IgG1：IgG1：包含人IgG1恒定区的嵌合5C2抗体；c5C2IgG2：包含人IgG2恒定区的嵌合5C2抗体；c5C2：包含人IgG4恒定区的嵌合5C2抗体；CP870,893：对照抗体；利妥昔单抗：对照抗体)诱导的Ramos肿瘤细胞系凋亡功效(％)的图。
图17是显示由人源化5C2抗体(7种人源化5C2抗体：VH1VL2、VH2VL1、VH2VL2、VH3VL1、VH3VL2、VH5VL1、VH5VL2；(-)：抗体未处理组；人IgG：无关的人IgG1；CP870,893：对照抗体)诱导的Raji肿瘤细胞系凋亡功效(％)的图。
图18是显示在超抗原SEB条件下5C2抗体的T细胞活化水平的图，其中通过用30ng/mL SEB(葡萄球菌肠毒素B)处理PBMC以非特异性诱导T细胞活化，然后用每种人源化5C2抗体处理，随后测量通过处理人源化5C2抗体(4种人源化5C2抗体；(-)：抗体未处理组；人IgG：无关的人IgG1；CP870,893：对照抗体)分泌的IFN-γ的量获得T细胞活化水平。
图19是显示异种移植小鼠模型中单独用嵌合5C2IgG2抗体处理时肿瘤体积变化的图，其中结果根据抗体注射后的天数显示。
图20是显示当用嵌合5C2IgG2抗体处理时，与人树突细胞和PBMC共同移植的异种移植小鼠模型中肿瘤体积变化的图，其中结果根据抗体注射后的天数显示。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例详细描述本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，对本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：抗CD40抗体的产生
1-1.小鼠抗体制备
1-1-1.产生单克隆抗体的细胞的制备
将注射有人重组蛋白CD40抗原的Balb/c小鼠的脾细胞与来自8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠的骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653(ATCC，PTA-8431)融合。为此，每两周向Balb/c小鼠注射100μg人CD40重组抗原，持续六周以诱导免疫反应。在最后一次接种后第3天，分离脾细胞并悬浮。根据Koeler和Milstein方法(Koeler&Milstein 1975)，在DMEM(Dulbeco改良的Eagle培养基)中使用50％聚乙二醇400将108个脾细胞和107个骨髓瘤细胞彼此融合。洗涤融合细胞，然后重悬于补充有20％胎牛血清、100μM次黄嘌呤、0.44μM氨基蝶呤和16μM胸苷(HAT培养基)的DMEM培养基中。将细胞接种到96孔板中，并在37℃下在提供有5％CO2的培养箱中培养。
当两周后观察到菌落时，取出上清液并使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)分析以检查是否与CD40结合。
对于阳性组，选择在单个部分中每孔形成105个或更多个细胞的孔。从形成菌落的孔中取出，测定上清液具有高抗体滴度后，根据有限稀释度测定法亚克隆细胞，得到具有高抗体滴度的单克隆细胞。从单克隆细胞培养物中取出上清液并储存直至随后的实验。
1-1-2.选择产生单克隆细胞的人CD40抗体
将人重组CD40(R&D***，目录号：P25942)以每孔100.0ng的量接种到MaxiSorpELISA板中，并在37℃下反应1小时用于抗体包被，然后在37℃下通过与200μL每孔1x封闭溶液(Sigma)孵育1小时进行封闭。
以100μL/孔的密度加入单克隆细胞培养物，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，然后用二抗山羊抗小鼠IgG-HRP处理。在37℃下孵育30分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤三轮。然后，以每孔100μl的量加入TMB单一溶液(生命科技，目录号：002023)，并在室温下在暗处孵育5-10分钟。用100μL的1.0N硫酸终止显色，测定450nm的吸光度。
结果，可以选择产生与重组抗原人CD40特异性反应的抗体的单克隆细胞系5C2。由此获得的细胞系于2016年11月2日保藏在位于首尔市钟路区莲建洞的韩国细胞系研究基金会(KCLRF)，登记号为KCLRF-BP-00381。
1-1-3.从选定的单克隆细胞系产生单克隆抗体
将建立的细胞系5C2在补充10％胎牛血清的RPMI培养基中于37℃在5％CO2条件下培养2周。
通过过滤灭菌后，将细胞系培养物加载到用蛋白G平衡缓冲液(20mM磷酸盐，pH7.4)平衡的HiTrap Protein G HP柱(GE医疗集团，目录号：17-0405-03)中，通过将平衡缓冲液流动通过柱洗涤，并用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸pH3.0)回收。将回收的抗体命名为5C2(小鼠抗体)，并用磷酸盐缓冲盐水透析，以交换缓冲液用于后续测试。
1-1-4.测定单克隆抗CD40抗体的特异性
为了测定抗CD405C2抗体(小鼠抗体)的特异性，使用ELISA对重组抗体人CD40(rCD40；R&D***，目录号：P25942)、重组抗原人CD40L(重组人sCD40配体；Peprotec，目录号：310-02；氨基酸序列：MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID NO：31))和人IgG(Dinona)进行了分析。将三种抗原各自在磷酸盐缓冲盐水中以1.0μg/mL的密度稀释，并将稀释液以100μL/孔接种到微量培养板中，并在37℃下孵育1小时以用其涂覆平板。然后，以每孔200μL的量加入1x封闭溶液(Sigma)，并在37℃下孵育1小时以封闭抗原。
将抗CD40抗体5C2和抗CD40L 5C8(ATCC，ATCCHB-10916；阳性对照)各自在磷酸盐缓冲盐水中稀释至1.0μg/mL的密度，并以每孔100μL的体积加入稀释液，在37℃下孵育1小时，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，并用二抗山羊抗小鼠IgG-HRP处理。在37℃孵育30分钟后，将孔用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，以每孔100μL的量加入TMB单一溶液(生命科技，目录号：002023)，并在室温下在黑暗的地方孵育5-10分钟。用100μL 1.0N硫酸终止显色，测量450nm处的吸光度。
获得的结果描绘于图1中。在图1中，y轴表示吸光度。如图1所示，由于CD40L或人IgG没有交叉反应性，因此鉴定出5C2抗体与人CD40抗原特异性结合。
1-2.嵌合抗体的制备
基于所产生的抗CD40小鼠抗体5C2的氨基酸序列，制备抗CD40嵌合抗体。
1-2-1.质粒构建
为了用于表达抗CD40嵌合抗体，分别构建表达重链的质粒和表达轻链的质粒。表达重链和轻链的质粒均基于pcDNA3.4载体(英杰公司)。
使用Ig-引物组(Novagen)克隆用于抗体表达的编码重链和轻链可变区的cDNA，将其***pCR2.1载体(英杰公司，目录号：K200001)，并通过测序鉴定。借助于IMGT位点(www.imgt.org)鉴定小鼠抗体基因。
小鼠5C2单克隆抗体中重链和轻链可变区的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列如下。
表1
抗CD40小鼠5C2单克隆抗体中可变区的氨基酸序列
(CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT定义)依次加下划线)
为了使编码可变区的cDNA和编码恒定区的cDNA能够作为抗体中的连续氨基酸序列表达，合成了已知的人IgG1、人IgG2和人IgG4(S228P，228位的丝氨酸被脯氨酸取代)的各基因片段和κ恒定区(轻链)(Bioneer)，在各基因片段中，将克隆的编码可变区的核苷酸序列连接至编码恒定区的核苷酸序列(重链)。因此，合成的表达重链和轻链的基因用限制酶XhoI和Eco R1消化。将由此获得的重链和轻链基因片段连接到各自的pcDNA3.4载体上，构建三条重链和一条轻链的抗体表达载体。由此构建的三种嵌合抗体中的重链和轻链的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列总结在表2中，如下：
表2
三种嵌合抗体中重链和轻链的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列(粗体代表可变区)
为了用作阳性对照抗体，还合成了抗CD40人抗体CP870,893(US7338660B2；21.4.1抗体)。以相同方式构建了pcDNA3.4表达载体。为了用作对照，使用CP870,893抗体(US7338660B2；21.4.1抗体)的序列信息构建抗体，并命名为CP870,893抗体类似物。用于构建CP870,893抗体类似物的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列总结于表3中，如下：
表3
抗CD40人抗体CP870,893(21.4.1抗体)的氨基酸和核苷酸序列(下划线为信号序列和粗体为可变区)
1-2-2.嵌合抗CD40抗体的产生
对于嵌合抗体产生，将携带三条重链(分别包含人IgG1、人IgG2和人IgG4的恒定区)和一条轻链(包括κ恒定区)的表达载体以瞬时转化方式引入ExpiCHO表达***(Thrmofisher，目录号：A29133)以产生IgG1嵌合抗体(包括人IgG1的恒定区)、IgG2嵌合抗体(包括人IgG2的恒定区)和IgG4嵌合抗体(包括人IgG4的恒定区)。
将ExpiCHO表达***试剂盒(Termofisher，目录号：A29133)中包含的ExpiCHO-S细胞系解冻并加入表达培养基中，并在37℃、8％CO2气氛中以120rpm振荡孵育以确保必要数量的细胞。收获后，将ExpiCHO-S细胞以6×106个细胞/mL的密度接种在表达培养基中至终体积150mL。如手册所示，将100μg轻链载体和50μg重链载体与OptiPRO SFM和ExpiFectamine CHO试剂混合，得到混合物，其中载体的浓度为1.0μg/mL，轻链和重链保持2：1的比例。将制备用于转化的载体混合物加入到ExpiCHO-S细胞系中，并在8％CO2气氛中于37℃下以120rpm振荡孵育24小时。在孵育24小时后，进一步添加ExpiCHO增强剂和养料。在孵育后第5天，将孵育条件改变为32℃、5％CO2和120rpm。在新的条件下，将细胞与ExpiCHO养料一起孵育另外12天。
将由此获得的培养基过滤灭菌，并装入用蛋白A平衡缓冲液(20mM磷酸盐，pH7.4)平衡的HiTrap Protein A HP柱(GE医疗集团，目录号：11-0034-93)中，并通过将平衡缓冲液流动通过柱洗涤，然后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸pH3.0)回收抗体。将回收的抗体用磷酸盐缓冲盐水透析，以交换缓冲液用于后续测试。
1-2-3.测定嵌合抗CD40抗体的抗原结合力
通过ELISA测定实施例1-2-2中构建的三种抗CD40嵌合抗体IgG1、IgG2和IgG4的抗原反应性。将浓度为1.0μg/mL的重组抗原人CD40(中国生物公司，目录号：10774-H02H)稀释于磷酸盐缓冲盐水中，以100μL/孔接种到微量培养板中并在37℃下孵育1小时以包被培养板。然后，以每孔200μL的量加入1x封闭溶液(Sigma)，并在37℃下孵育1小时以封闭抗原。
将三种抗CD40嵌合抗体和对照抗体抗CD40人抗体CP870,893类似物(表2中的21.4.1抗体)中的每一种从10.0μg/mL的浓度连续稀释。以100μL/孔的量加入稀释液，在37℃下孵育1小时，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。用二抗山羊抗人IgGF(ab′)2-HRP(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-006)在37℃下处理抗体30分钟并用磷酸盐缓冲液盐水洗涤三次。在室温下在暗处每孔与100μL TMB单一溶液(生命科技，目录号：002023)反应4-10分钟后，用100μL 1.0N硫酸终止显色，然后测量450nm处的吸光度。
由此获得的嵌合抗体在450nm处的吸光度描绘于图2中((-)表示没有抗体处理的对照)。如图2所示，发现所有三种抗CD40嵌合抗体对CD40具有与对照抗体一样高或更高的亲和力。
1-3.人源化抗体的制备
基于抗CD40小鼠抗体5C2的氨基酸序列，构建抗CD40人源化抗体。
1-3-1.通过计算机人源化选择重组抗体序列
以计算机方式选择保留小鼠CD40抗体5C2的每条重链和轻链的CDR区序列的人源化抗体序列，其中基于人抗体基因的种系序列，重组构架区的序列。
首先，基于表1中引入的抗CD40小鼠抗体5C2的重链和轻链可变区确定重链CDR(互补决定区)和轻链CDR(参考IMGT/V-QUEST(http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/))，并总结在表4中，如下：
表4
在表5中总结了人抗体种系基因，由于其与小鼠CD40抗体5C2的每条重链和轻链的序列具有最高的相似性，因此其被用作人源化重组抗体序列的骨架：
表5
用于小鼠5C2抗体的人源化的人抗体种系基因
使用人抗体种系基因序列在计算机方法中选择用于人源化5C2抗体的六个重链可变区和两个轻链可变区，并总结于表6中，如下：
表6
在计算机中选择的5C2人源化抗体可变区序列
(CDR1、CDR2，CDR3(根据IMGT定义)依次加下划线)
1-3-2.人源化重组抗体的表达与分析
选择的计算机中的重链可变区序列与人IgG2恒定区连接以完成重链序列，而轻链可变区序列与κ轻链恒定区连接以完成轻链序列。将选择的氨基酸序列转化为编码其的基因序列，并合成具有该序列的基因片段(Cosmogenetech)。
将上面制备的重链和轻链的编码基因片段转移到各自的pCDNA3.4载体中。将四条重链(VH1、VH2、VH3、VH5)和两条轻链(L1、L2)组合以产生八种人源化抗体(VH1VL1：VH1和VL1的组合；VH2VL1：VH2和VL1的组合；VH3VL1：VH3和VL1的组合；VH5VL1：VH5和VL1的组合；VH6VL1：VH6和VL1的组合；VH1VL2：VH1和VL2的组合；VH2VL2：VH2和VL2的组合；VH3VL2：VH3和VL2的组合；VH5VL2：VH5和VL2的组合；VH6AVL2：VH6和VL2的组合)。借助于ViaFect转染试剂(Promega，目录号：D4981)引入抗体以在CHO细胞(Sigma，Cat.NO：85050302)中表达，并在取上清液之前再培养2天。
通过ELISA测定每种人源化抗体培养物对重组抗原人CD40(rCD40；R&D***，目录号：P25942)的反应性。对于该测定，将磷酸盐缓冲盐水中浓度为1.0μg/mL的rCD40稀释液以100μL/孔的密度铺板到微量培养板中，并在37℃下孵育1小时，以用抗原涂覆微量培养板。然后通过以每孔200μl的量添加lx封闭溶液(Sigma)并在37℃下孵育1小时进行封闭。
在37℃下与100μL每种人源化抗CD40抗体培养物一起孵育1小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤微量培养板三次。用二抗山羊抗人IgGF(ab′)2-HRP(Jackson Immunoresearch，目录号：109-035-006)在37℃处理30分钟，然后用磷酸盐缓冲液盐水进行三轮洗涤。然后，以每孔100μl的量加入TMB单一溶液(生命科技，目录号：002023)，并在室温下在暗处孵育5-10分钟。用100μL的1.0N硫酸终止显色，测定450nm处的吸光度。
图3中描绘了八种人源化抗体在450nm处的吸光度。如图3所示，观察到所有八种人源化抗体对CD40具有高反应性。
实施例2：抗CD40抗体5C2对CD40/CD40L结合亲和力的影响
进行封闭试验以检查5C2抗体(小鼠抗体)是否对人体中CD40和CD40L之间的相互作用有影响。
对于缓冲液变化，将5C2抗体和同种型对照抗体(Dinona，目录号：88020R)各自用0.1M碳酸氢钠缓冲液透析，制备1.0mg各抗体溶液。将DMSO(Sigma-Aldrich，目录号：276855)中浓度为2.6mg/mL的FITC异构体I(英杰公司，目录号：F1906)的溶液以20.0μL的量加入到每个抗体溶液中。通过在室温下搅拌使FITC缀合2小时后，将所得抗体溶液用磷酸盐缓冲盐水透析，得到FITC标记的抗体。
然后，将表达人CD40的5×106个Ramos细胞系(ATCC，ATCCCRL-1596)细胞在室温下与100μL浓度为15.0μg/mL的重组抗原CD40L(Peprotech，目录号：310-02)的稀释液孵育30分钟。用磷酸盐缓冲盐水洗涤后，使细胞与1.0μg/mL制备的FITC标记的5C2和FITC标记的同种型抗体在室温下各自反应15分钟。用磷酸盐缓冲盐水再次洗涤细胞，然后使用流式细胞术(Stratedigm，S1000EXi)进行荧光免疫测定。
由此获得的流式细胞术分析结果描绘于图4中。如图4所示，FITC标记的5C2的荧光仍然产生，尽管由于FITC标记的5C2的空间位阻在与重组抗原CD40L预孵育时比没有CD40L时略低。结果表明5C2抗体在不同于CD40/CD40L相互作用位点的位点识别CD40。
实施例3：用于激活树突细胞的测定
3-1.单核细胞衍生的树突细胞的制备
为了检查抗CD40抗体是否激活树突细胞，通过分化制备单核细胞衍生的树突细胞并用于测试抗CD40抗体的功效。
将从健康成年志愿者取样的全血转移至EDTA(乙二胺四乙酸)处理的管中，并与一体积的磷酸盐缓冲盐水混合。将全血混合物上样到Ficoll-Paque Plus(GE医疗集团，目录号：17-1440-03)上，并在室温下以700x g离心30分钟。离心后，仅将PBMC(外周血单核细胞)层转移到新管中并加入约2体积的磷酸盐缓冲盐水。在4℃以700g离心5分钟，形成PBMC沉淀物。将PBMC沉淀物在补充10％胎牛血清的RPMI培养基中的悬浮液在含有5％CO2的细胞培养皿(VOM塑料作物，目录号：V100D)中于37℃下培养4小时。
从细胞培养皿中除去非粘附细胞后，向培养皿中加入新鲜的补充10％胎牛血清的RPMI。为了分化为树突细胞，将贴壁细胞分别与5×103单位/mL的rhGM-CSF(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；JW creagene)和rhIL-4(JW creagene)孵育。在孵育后第3天和第6天，用新鲜的补充10％胎牛血清的RPMI培养基替换补充10％胎牛血清的RPMI培养基，rhGM-CSF和rhIL-4分别以5×103单位/mL的浓度加入。
在分化的第7天，用胰蛋白酶-EDTA缓冲液(Thermo，目录号：R001100)分离树突细胞，用补充10％胎牛血清的RPMI培养基洗涤，并等分到24或12孔细胞培养皿中。根据测试目的用抗CD40抗体和各种试剂处理细胞，并在分析树突细胞的变化之前再培养2至5天。
3-2.小鼠单克隆5C2对树突状细胞的活化
将实施例3-1中制备的单核细胞衍生的树突细胞的5×105个细胞用10μg/mL小鼠单克隆抗体5C2与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(Dionona)一起处理，进行交联，以放大功效。
在37℃下在5％CO2气氛中与抗体孵育2天后，用胰蛋白酶-EDTA(Thermo，目录号：R001100)分离树突细胞。通过用抗CD11c抗体-FITC(eBiosceince，目录号：11-0116-42)进行免疫染色鉴定树突细胞。通过共刺激因子CD80、CD83和CD86的表达水平来说明树突细胞的活化程度，该共刺激因子CD80、CD83和CD86的表达水平测量为在用抗CD80抗体-PECy5(eBiosceince，目录号：15-0809-42)、抗CD86抗体-PE(eBiosceince，目录号：12-0869-42)和抗CD83抗体-APC(eBiosceince，目录号：17-0839-42)中的每一种染色细胞后检测到的荧光强度。
将上面获得的荧光强度描绘为与图5(CD80的相对表达水平)、图6(CD86的相对表达水平)和图7(CD83的相对表达水平)(在图5至7中，GAM表示二抗山羊抗小鼠IgG(H+L))中的对照(未用抗体处理，100％)的相对值。如图5至7所示，发现5C2单克隆抗体诱导共刺激因子CD80、CD83和CD86的过表达，其效果通过与二抗交联而进一步增强。
3-3.Toll样受体配体联合使用对树突状细胞活化的影响
Toll样受体(TLR)通常在前哨细胞上表达，例如巨噬细胞和树突细胞，其解释了先天免疫。蛋白质负责识别来自微生物的分子并激活先天免疫的功能。脂多糖(LPS)，称为TLR-4识别的TLR配体，与5C2抗体组合使用，以评估树突细胞的活化。
为此，将实施例3-1中制备的5×105个单核细胞衍生的树突细胞与1.0ng/mL LPS(Sigma-Aldrich，目录号：L3024)在10μg/mL 5C2和20μg/mL二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(Dionona)的组合中孵育2天，然后用胰蛋白酶-EDTA分离树突细胞。用抗CD11c-FITC(eBiosceince，目录号：11-0116-42)染色树突细胞。
通过共刺激因子CD80和CD83的表达水平来说明树突细胞的活化程度，该共刺激因子CD80和CD83测量为用抗CD80抗体-PECy5(eBiosceince，目录号：15-0809-42)和抗CD86抗体-PE(eBiosceince，目录号：12-0869-42)中的每一种染色细胞后检测到的荧光强度。
将上面获得的荧光强度描绘为与图8(CD80的相对表达水平)和图9(CD86的相对表达水平)(在图8和9中，GAM表示二抗山羊抗小鼠IgG(H+L))中对照(未用抗体处理，100％)的相对值。如图8和9所示，LPS单独诱导CD80和CD83的过表达，但在交联5C2的条件下，LPS显著增强CD80和CD83的过表达。
3-4.通过嵌合5C2激活树突细胞
如实施例3-1中所述从5×105个单核细胞分化的树突细胞在没有二抗的情况下，用10μg/mL的两种嵌合5C2抗体(嵌合IgG2和嵌合IgG4)和CP870,893类似物(US7338660B2；21.4.1抗体；参见表3)中的每一个处理。在37℃下、5％CO2气氛中孵育5天后，用胰蛋白酶-EDTA(Thermo，目录号：R001100)分离树突细胞。
通过用抗CD11c抗体-FITC(eBiosceince，目录号：11-0116-42)进行免疫染色鉴定树突细胞。通过共刺激因子CD80、CD83和CD86的表达水平来说明树突细胞的活化程度，该共刺激因子CD80、CD83和CD86的表达水平测量为用抗CD80抗体-PECy5(eBiosceince，目录号：15-0809-42)、抗CD86抗体-PE(eBiosceince，目录号：12-0869-42)和抗CD83抗体-APC(eBiosceince，目录号：17-0839-42)中的每一种染色细胞后检测到的荧光强度。
将上面获得的荧光强度描绘为与图10(CD86的相对表达水平)和图11(CD83的相对表达水平)中对照(未用抗体处理，100％)的相对值。
观察到三种5C2衍生的嵌合抗体对人CD40的反应性没有太大差异，因为其相同的可变区(图2)，但是树突细胞的活化在同种型之间不同。对于小鼠5C2抗体，交联抗体对于诱导共刺激因子的过表达是必不可少的，但是发现IgG2或IgG4类型的嵌合抗体即使在没有交联抗体的情况下也引起树突细胞上的CD86和CD83的过表达。此外，与辉瑞(Pfizer)类似物CP870,893相比，5C2IgG4嵌合抗体表现出更高的树突细胞活化，其被称为激活树突细胞的最佳诱导物。
3-5.IFN-γ对树突状细胞活化的协同作用
树突细胞不可缺少地需要干扰素γ来诱导T细胞活化，以有效地攻击异物或癌细胞，并且已知干扰素γ直接参与树突细胞分化。
为了检测5C2嵌合抗体在干扰素γ(IFN)存在下对树突细胞活化和细胞因子变化的影响，将浓度为1000单位/mL的干扰素γ(Pepprotech，目录号：300-02)添加到实施例3-1中制备的5×105个单核细胞衍生的树突细胞中。
向所得细胞中加入浓度为10.0μg/mL的两种嵌合5C2抗体(嵌合IgG2和嵌合IgG4)和CP870,893类似物(US7338660B2；21.4.1抗体；参见表3)中的每一种。
将树突细胞与抗体在37℃下、5％CO2气氛中孵育2天，然后用胰蛋白酶-EDTA(Thermo，目录号：R001100)分离。通过用抗CD11c抗体-FITC(eBiosceince，目录号：11-0116-42)进行免疫染色鉴定树突细胞。通过共刺激因子CD86和CD83的表达水平来说明树突细胞的活化程度，该共刺激因子CD86和CD83测量为在用抗CD86抗体-PE(eBiosceince，目录号：12-0869-42)和抗CD83抗体-APC(eBiosceince，目录号：17-0839-42)中的每一种染色细胞后检测到的荧光强度。
将上面获得的荧光强度描绘为与图12(CD86的相对表达水平)和图13(CD83的相对表达水平)(N：既不用抗体也不用干扰素γ处理，N+IFN：仅用干扰素γ处理，IgG2：仅用IgG2嵌合抗体处理，IgG2+IFN：用IgG2嵌合抗体和干扰素γ处理联合处理，IgG4：仅用IgG4嵌合抗体处理，IgG4+IFN：用IgG4嵌合抗体和干扰素γ联合处理，CP8：仅用CP870,893类似物处理，CP8+IFN：用CP870,893类似物和干扰素γ联合处理)中对照(未用抗体处理，100％)的相对值。
如图12和13所示，观察到干扰素γ诱导CD86和CD83的过表达，并在与嵌合抗体、特别是IgG4同种型嵌合抗体组合中，对CD86和CD83的表达产生协同作用。
实施例4：树突状细胞对CD8T细胞的激活作用
在识别外部抗原后，树突细胞向T细胞呈递MHC/外来抗原。然后，T细胞识别MHC/外来抗原并被激活以有效去除外来抗原。为了检查本发明中提供的抗CD40抗体是否诱导T细胞活化，将Burkitt淋巴瘤细胞系Ramos用作T细胞活化测定中的外来抗原。
在10％胎牛血清RPMI培养基中培养后，将Ramos细胞系(ATCC，ATCCCRL-1596)重复冷冻并解冻两次并离心。在280nm下测量由此获得的上清液(Ramos裂解物)的吸光度，并以浓度单位“mg/mL”任意设定。
将如实施例3-1中所述从5×105个单核细胞分化的树突细胞以5×105个细胞/孔的密度接种到12孔培养皿中，然后以20μg/mL的浓度加入制备的Ramos裂解物。为了比较抗CD40抗体的作用，将细胞与10μg/mL的三种嵌合5C2抗体(嵌合IgG1、嵌合IgG2和嵌合IgG4)中的每一种和CP870,893类似物(US7338660B2；21.4.1抗体；参见表3)孵育。第二天，将PBMC(外周血单核细胞)与来自树突细胞供体的全血分离，然后与制备的树突细胞共培养。
通过用抗CD11c抗体-FITC(eBiosceince，目录号：11-0116-42)进行免疫染色鉴定树突细胞。通过共刺激因子CD86和CD83的表达水平来说明树突细胞的活化程度，该共刺激因子CD86和CD83测量为在用抗CD86抗体-PE(eBiosceince，目录号：12-0869-42)和抗CD83抗体-APC(eBiosceince，目录号：17-0839-42)中的每一种染色细胞后检测到的荧光强度。
将上面获得的荧光强度描绘为与图14(未处理：未用抗体处理，IgG2：用IgG2嵌合抗体处理，IgG4：用IgG4嵌合抗体处理，CP870893：用CP870,893类似物处理)中对照(未用抗体处理，100％)的相对值。当与PBMC共培养时，在单克隆抗体5C2的嵌合抗体存在下，树突细胞的CD86和CD83的表达水平增加，特别是在IgG4嵌合抗体的存在下观察到显著的增加。
对于T细胞活化测定，用抗体处理与树突细胞共培养的PBMC，并用抗CD8-FITC(Dinona，目录号：10143B)和抗CD69-PE(eBioscience，目录号：12-0699-42)一起进行免疫染色。参照检测到的荧光强度选择表达CD8的细胞(CD8-FITC阳性细胞)和表达CD69的细胞(CD69阳性细胞)。图15中描绘了选择的CD8-FITC阳性T细胞群中CD69阳性细胞的比例(基于细胞数的％)。如图15所示，活化的CD69阳性CD8细胞的比例随着单克隆抗体5C2的嵌合抗体的应用而增加。特别地，在用IgG4嵌合抗体处理后，观察到活化的CD69阳性CD8的比例达到峰值。
实施例5：细胞凋亡功效的测定
5-1.嵌合5C2抗体凋亡作用的测定
为了鉴定5C2抗体对肿瘤细胞系的直接细胞毒性，进行细胞凋亡试验。用磷酸盐缓冲盐水洗涤Ramos细胞系(ATCC，ATCCCRL-1596)，重悬于5.0％胎牛血清补充的RPMI中，并以2×105个细胞/孔的密度接种到微量培养板中。将细胞与1.0μg/mL的三种抗CD40嵌合抗体(IgG1、IgG2和IgG4)、CP870，893类似物和Rituxan各自在37℃下、5％CO2气氛中孵育2天。根据制造商的说明，在用FITC膜联蛋白-V(BD Pharmingen，目录号：51-65874X)和7-AAD(BDPharmingen，目录号：51-68981E)染色后，通过阳性细胞比例(％)测定细胞毒性作用。测试结果如图16所示。从图16中可以看出，5C2IgG2同种型显示出优异的抗肿瘤细胞毒性。
5-2.人源化抗体5C2的凋亡作用的测定
为了用于检测人源化抗体5C2的凋亡功效，将RajiBurkitt淋巴瘤细胞系(ATCC，ATCCCCL-86)用磷酸盐缓冲盐水洗涤，重悬于3.0％胎牛血清补充的RPMI培养基中，并在密度为2×105个细胞/孔到微量培养板中。将细胞与10.0μg/mL的7种人源化抗体5C2IgG2(VH1VL2、VH2VL1、VH2VL2、VH3VL1、VH3VL2、VH5VL1和VH5VL2)、CP870,893类似物和人IgG中的每一种在37℃下、5％CO2气氛中孵育两天。随后，如实施例5-1所述，用FITC膜联蛋白-V和7-AAD染色细胞以确定细胞凋亡作用。结果描绘于图17中。如图17所示，发现所有七种人源化抗体都具有比CP870,893类似物更高的凋亡效应。
实施例6：在超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在下通过5C2抗体激活T细胞
因为T细胞活化是以抗原特异性方式进行的，所以除非T细胞具有相同的TCR，否则一种抗原不能诱导活化。应该使用能够以非特异性方式活化T细胞的超抗原，例如SEB，以便在使用PBMC的体外测试中通常活化T细胞。
在该测试中，在检查用5C2抗体治疗是否进一步增强免疫反应之前，将SEB应用于PBMC以建立T细胞活化的条件。
从健康志愿者中分离全血后，将PBMC以1×106个细胞/孔的密度接种到微量培养板中。然后，将细胞用30ng/mL的SEB与10μg/mL的5种人源化抗体5C2(VH2VL1、VH2VL2、VH3VL1和VH3VL2)中的每一种、CP870,893类似物和人IgG一起于37℃、5％CO2气氛中处理三天。取出培养基上清液，并根据制造商的说明用于测量人IFN-γ(Affymetrix，目录号：88-7316-22)的量。由此获得的结果描绘在图18中。如图18所示，用5C2人源化抗体处理后产生的IFN-γ的量是对照的两倍或三倍，这意味着5C2刺激可以进一步增强免疫应答。
实施例7：动物模型中5C2的抗肿瘤作用的测定
由于能够通过树突细胞引入CD8T细胞活化，预期5C2抗体具有抗肿瘤效应物。此外，5C2抗体对表达CD40的肿瘤细胞系的细胞凋亡作用允许预期伴随的抗肿瘤效应物。
5C2抗体与小鼠CD40没有交叉反应性。因此，在两种模型中测试5C2抗体的作用：单独注射肿瘤细胞系以及与人树突细胞和外周血单核细胞(PBMC)组合注射。
将白血病细胞系Ramos(ATCC，ATCCCRL-1596)单独皮下注射或将人树突细胞和PBMC皮下注射至NSG(NOD.Cg-PrkdcscidI2rgtm1Wj1/SzJ)小鼠(Jackson Laboratory，25克，6-8周龄)。
在该测试中，通过从健康成年志愿者采集全血来制备树突细胞，借助于Ficoll-PaquePlus(GE医疗集团，目录号：17-1440-03)将PBMC与全血分离，并在rhGM-CSF(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；JW creagene)和rhIL-4(JW creagene)存在下，分化贴壁细胞，如实施例3-1中所述。在分化的第7天，分离树突细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并以5×105个细胞/小鼠的密度皮下注射到小鼠腹部。
通过借助Ficoll-PaquePlus(GE医疗集团，目录号：17-1440-03)的帮助，从与相同的树突细胞供体分离的全血中分离制备PBMC后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤PBMC并以2×106个细胞/小鼠密度皮下注射至小鼠腹部。
细胞注射后，腹膜内注射嵌合5C2IgG2抗体或磷酸盐缓冲盐水。在一周后，进一步注射抗体或磷酸盐缓冲盐水一次。测定程序总结在表7中，如下：
表7
动物实验中5C2抗肿瘤效应物的检测
施用抗体后，监测肿瘤体积(mm3)。
随时间变化的肿瘤体积(mm3)的平均值在表8中给出，并描绘于图19和20中。
表8
平均肿瘤体积(mm3)
如表8和图19所示，5C2抗体在单独注射肿瘤细胞的动物模型中显示出延迟肿瘤生长的作用(组2)。5C2抗体的细胞凋亡作用似乎有助于抗肿瘤作用。在从表8和图20中可以理解，在肿瘤细胞与树突细胞和PBMC一起注射的动物模型中，对照24天后肿瘤迅速增长至超过10,000mm3，但肿瘤生长被完全抑制，直至给予5C2抗体后的34天(第4组)。34天后，在一只小鼠中观察到肿瘤生长，因为注射的人树突细胞和PBMC的寿命在发明人看来到了最后。
韩国细胞系银行；韩国细胞系研究基金会，由WIPO批准的国际微生物保藏单位首尔国立大学癌症研究所医学学院，韩国首尔市钟路区，103Daehak-ro___________________________________________________________________________
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国际表格
细则第7.1条发出的原始存单
收件人：Song，Hyung Geun
韩国首尔市奥林匹克路43道，Asan生命科学机构11F，88
(邮编138-736)
表BP/4(KCLRF表17) 单页

Claims (20)

1.抗CD40抗体或其抗原结合片段，包含以下互补决定区(CDR)：
CDR-H1，包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：33的氨基酸序列，
CDR-H2，包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：34的氨基酸序列，
CDR-H3，包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，
CDR-L1，包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：35的氨基酸序列，
CDR-L2，包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：36的氨基酸序列，和
CDR-L3，包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，包含：
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2、29或30的氨基酸序列。
3.抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中，抗CD40抗体由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生。
4.抗CD40抗体或其抗原结合片段，所述抗CD40抗体包含由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生的抗CD40抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
5.抗CD40抗体或其抗原结合片段，所述抗CD40抗体包含由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生的抗CD40抗体的重链可变区和轻链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CD40抗体是动物抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是抗CD40抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，具有针对CD40的激动剂活性。
9.一种杂交瘤，以登记号为KCLRF-BP-00381保藏，用于生产抗CD40抗体。
10.一种药物组合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
11.用于预防或治疗选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷疾病中的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中，所述疾病是血癌。
13.编码选自由SEQ ID NO：17至22和33至36组成的组中的氨基酸序列的核酸。
14.编码以下之一或两者的核酸：
SEQ ID NO：1、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列；和
SEQ ID NO：2、29或30的氨基酸序列。
15.携带权利要求13或14的核酸的重组载体。
16.重组细胞，包含权利要求15所述的重组载体。
17.预防或治疗疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段给予需要预防或治疗所述疾病的受试者，其中，所述疾病选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷病。
18.权利要求17所述的方法，其中，所述抗-CD40抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列；和
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2、29或30的氨基酸序列。
19.预防或治疗疾病的方法，所述方法包括将抗CD40抗体或其抗原结合片段给予需要预防或治疗所述疾病的受试者，所述疾病选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷疾病，其中，抗CD40抗体选自由以下组成的组：
由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生的抗CD40抗体，或其抗原结合片段；
抗CD40抗体或其抗原结合片段，所述抗CD40抗体包含由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生的抗CD40抗体的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和
抗CD40抗体或其抗原结合片段，所述抗CD40抗体包含由登记号为KCLRF-BP-00381的杂交瘤产生的抗CD40抗体的重链可变区和轻链可变区。
20.根据权利要求1至5中任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段在预防或治疗选自癌症、癌症转移、感染和免疫缺陷疾病的疾病中的用途。
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