WO2018034332A1 - ＥｐｈＡ２ Ｎ末端フラグメント抗体 - Google Patents

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seq
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直彦 越川
元治 清木
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国立大学法人東京大学
地方独立行政法人神奈川県立病院機構
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to an N-terminal fragment of EphA2 cleaved by MT1-MMP and a method for producing the antibody.
  • EphA2 (Erythropoietin-producing hepatocellular receptor 2) is a member of the mammalian Eph receptor kinase family, including breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer, glioma, melanoma and ovarian adenocarcinoma It is overexpressed in various tumor tissues and is related to cancer progression and metastasis (Non-Patent Document 1). The tyrosine kinase activity of EphA2 is activated when a ligand such as ephrin A1 binds.
  • EphA2 In normal epithelial cells, ligand-induced autophosphorylation of the EphA2 tyrosine residue (Tyr 594 ) plays a role in suppressing the growth signal mediated by the Erb-B receptor and maintaining the cell in a normal state. Yes. That is, EphA2 has a tumor suppressor-like activity in normal cells, but promotes cancer progression when overexpressed in cancer cells. Recent studies have revealed that EphA2 has two opposing activities.
  • EphA2 Unlike EphA2, which functions in a ligand-dependent manner, EphA2 in the absence of a ligand phosphorylates a serine residue (Ser 897 ) by Ras / MAPK after stimulation of the ErbB receptor (Non-patent Document 2), and ephexin-4 It acts as a docking site with / RhoG and induces activation of Rac1 (Non-patent Document 3).
  • EphA2 has attracted attention as a molecular target for anticancer agents because of the elucidation of the mechanism of action of EphA2 in the progression of cancer.
  • MT1-MMP membrane-type 1-matrix metalloproteinase 1
  • MT1-MMP membrane metalloprotease known to be overexpressed in tumor cells.
  • MT1-MMP regulates tumor progression through the processing of physiologically active proteins and extracellular matrix around the cell, and activation of HIF transcription factors via the cytoplasmic terminal.
  • EphA2 is a substrate of MT1-MMP, which is cleaved with MT1-MMP to remove the EphA2 ligand binding domain (Non-patent document 4, Non-patent document 5) and converted to a structure in which a ligand cannot bind.
  • EphA2 that is MT1-MMP and co-expressed in cancer tissues and lacking the ligand binding domain of N-terminal side was found that Ser 897 is phosphorylated (non-patent Reference 5).
  • the mutant EphA2 that was not cleaved by MT1-MMP was forcibly expressed in the epithelial carcinoma A431 cell line, the cell morphology changed to an epithelial cell-like morphology, and tumor growth and lung metastasis were suppressed (Non-patent Document 5). ). Therefore, EphA2 processing by MT1-MMP in cancer cells is an event closely related to cancer progression.
  • the N-terminal fragment of EphA2 cleaved by MT1-MMP circulates in the bloodstream away from the cell, the N-terminal fragment can be detected at an early stage using a conventional blood test. It can be used as a marker (Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide an antibody that specifically binds to an N-terminal fragment of EphA2 cleaved with MT1-MMP and a method for producing the antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a method for examining cancer using the antibody. Furthermore, this invention aims at provision of the kit for a test
  • EphA2 has also been reported to exist in exosomes, and the N-terminal fragment of EphA2 cleaved with MT1-MMP in blood (hereinafter referred to as “MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment”) It was expected that full-length (intact) EphA2 was present.
  • MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment the N-terminal fragment of EphA2 cleaved with MT1-MMP in blood
  • the inventors have determined the structure of the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment, the structure of the N-terminal region of full-length EphA2, and the structure of the cleaved fragment if EphA2 is cleaved by membrane proteases (EphA2 extracellular).
  • EphA2 extracellular The preparation of an antibody that recognizes only the “MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment” is made based on the hypothesis that the domain fragments are different or that there is a specific epitope for each. Tried.
  • EphA2 and EphA2 extracellular domain fragments As a result of conducting extensive screening and antibody screening, the inventors did not recognize full-length EphA2 and EphA2 extracellular domain fragments, but specifically recognized only the “MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment”. The production of the antibody was successful and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by the 28th to Xth positions As a specific example of the protein, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) a protein comprising the 28th to 9
  • a test kit for cancer comprising the antibody according to any one of (1) to (3) above.
  • (10) A method of measuring MT1-MMP protease activity in a sample based on the amount of MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment measured by the measurement method of (9) above.
  • a method for producing an antibody comprising the following steps (i) and (ii): (I) a protein comprising an amino acid sequence represented by the 28th to Xth amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (where X is an integer of 328 to 435, the same shall apply hereinafter), represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence, or in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the antibody of the present invention can specifically bind to the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment. That is, the antibody of the present invention recognizes only the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment, not the full-length EphA2 or EphA2 extracellular domain fragment.
  • the antibody of the present invention it becomes possible to detect only the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment present in the sample, whether the subject from which the sample is derived is affected by cancer, cancer It is possible to examine and diagnose the degree of progression and the effect of cancer treatment.
  • EphA2 The structure of EphA2 and the reaction results of the antibody of the present invention and the antigen are shown.
  • A Schematic showing EphA2 domain and MT1-MMP cleavage site. “Recombinant antigen” is a figure showing to which region of EphA2 the prepared antigen protein corresponds. The arrow indicates the position reported to be cut by MT1-MMP. SP: Signal peptide, CRD; Cysteine-rich domain, TM; Transmembrane, Cytoplasmic; Recombinant antigen (Antigen # 1- # 5) produced by cytoplasmic region
  • B The results of detection by Western blotting using an anti-FLAG monoclonal antibody are shown.
  • the precipitate was analyzed by Western blotting using an anti-FLAG tag monoclonal antibody.
  • IP Immunoprecipitation, WB; Western blotting It is the result of having investigated the affinity with respect to the recombinant antigen (Antigens # 1-4) of the 46A1, 62A1, and 76A1 monoclonal antibodies by Western blotting (upper figure: reducing condition, lower figure; non-reducing condition). All antigens were detected under reducing conditions by anti-FLAG tag monoclonal antibody Results of sandwich ELISA assay.
  • (A) shows a standard curve of 76A1 binding reaction to Antigen # 1 (15-250 pg / mL).
  • the first embodiment of the present invention specifically binds to an MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment, does not bind to full-length (intact) EphA2, and the EphA2 extracellular domain An antibody that does not bind to fragments.
  • the inventors have previously found that the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment circulates in the bloodstream away from cancer cells, and this MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment It is clarified that it can be used as a detectable cancer marker (Patent Document 1).
  • an antibody prepared using the N-terminal fragment of EphA2 as an immunogen specifically recognizes the N-terminal fragment of EphA2, but at the same time, it is highly likely to recognize full-length EphA2.
  • Eph family molecules have been reported to be cleaved by membrane proteases (Bai G., Pfaff SL (2011). Protease regulation: the Yin and Yang of neural development and disease. Neuron 72, 9-21 ), EphA2 is also likely to be processed by membrane proteases, and antibodies produced simply using the N-terminal fragment as an immunogen recognizes fragments other than the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment. There was a possibility.
  • the inventors have identified the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment, and the EphA2 extracellular domain conformation that may occur when processed by full-length EphA2 and membrane proteases.
  • Antibodies that do not react to either full-length EphA2 or the extracellular domain of EphA2 among antibodies obtained using MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragments as immunogens considering the possibility of different structures Only tried to get.
  • a part of the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment is expressed in animal cells, and this is used as an immunogen to obtain several antibodies that can immunoprecipitate the fragment.
  • EphA2 did not immunoprecipitate full-length EphA2 from the extract of cells expressing full-length EphA2, and did not immunoprecipitate the extracellular domain of EphA2 expressed in animal cells.
  • the antibody obtained by the method as described above is confirmed to react specifically with a blood sample derived from a cancer patient, as shown in the examples below, and is expected to be used as a cancer marker. It specifically binds to the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment.
  • the first embodiment of the present invention is specifically an antibody that binds to the following protein (a) and does not bind to the proteins (b) and (c).
  • A a protein comprising an amino acid sequence represented by the 28th to Xth amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (where X is an integer of 328 to 435, the same shall apply hereinafter), represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence, or in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with the 28th to Xth amino acid sequences As a specific example of the protein, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a protein comprising an
  • the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment of EphA2 refers to, for example, the 28th to 385th amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. , Fragments containing the amino acid sequence from 28th to 395th, 28th to 432th, or 28th to 435th.
  • an antigen for producing an antibody that binds to the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment for example, the 28th to Xth amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (where X is 328 or more)
  • a protein consisting of an amino acid sequence represented by an integer of 435 or less (the same shall apply hereinafter), or adding or replacing one or several amino acids in the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein comprising an inserted or deleted amino acid sequence, or a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Can be used.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the 28th to 328th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as “Antigen # 1”) is described.
  • the antigen for producing an antibody that binds to the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment may be prepared in any way, but is preferably expressed in animal cells.
  • full-length (intact) intact EphA2 is a protein consisting of the 28th to 976th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the 28th to 976th amino acid sequence, or the 28th to 976th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And an amino acid sequence having 80% or more sequence identity.
  • “Full-length EphA2” refers to the full-length EphA2 functioning in the cell relative to the EphA2 fragment. EphA2 is expressed in the cell, or expressed in the cell. A protein that retains the three-dimensional structure of EphA2.
  • the “full-length EphA2” is, for example, preferably expressed in animal cells, and examples thereof include those present in cell extracts expressing EphA2.
  • EphA2 extracellular domain is a region of EphA2 protruding outside the cell.
  • it is represented by SEQ ID NO: 3 (the 28th to 537th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 with one or several amino acids added, substituted, inserted or deleted, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • an amino acid sequence having 80% or more sequence identity may be prepared in any way, but is preferably expressed in animal cells.
  • amino acid sequence having 80% or more sequence identity may be any percentage as long as it is an amino acid sequence having 80% or more sequence identity. For example, 90% or more 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the antibody according to the first embodiment of the present invention (which may be referred to as “the antibody of the present invention”) is, for example, “28th to Xth in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (where X Is a protein consisting of an amino acid sequence represented by an integer of 328 or more and 435 or less (the same shall apply hereinafter), and one or several amino acids in the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or several amino acids added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Several antibodies are produced using “a protein comprising a substituted, inserted or deleted amino acid sequence, or a protein comprising an amino acid sequence having
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted, or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the method for confirming the presence or absence of the binding between the antibody and the antigen protein is not particularly limited, and a method known to those skilled in the art may be adopted.
  • the binding to the antigen protein by immunoprecipitation or Western blotting may be employed.
  • the method of confirming the presence or absence can be mentioned.
  • the antibodies of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or fragments of these antibodies. In addition, so-called chimeric antibodies modified by genetic engineering are also included.
  • the antibody fragment of the present invention means a partial region of the antibody of the present invention. For example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv (variable fragment of antibody), single chain antibody (heavy chain, light chain) Chain, heavy chain variable region, light chain variable region, etc.), scFv, diabody (scFv dimer), dsFv (disulfide stabilization variable region), and a peptide containing CDR at least in part.
  • monoclonal is indicative of the properties of an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not intended to limit the production of antibodies by a particular method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention may be produced, for example, by the hybridoma method (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)) or the recombinant method (US Pat. No. 4,816,567).
  • Monoclonal antibodies of the present invention may also be isolated from phage antibody libraries (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581- 597 (1991)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • it can be prepared, for example, by injecting a mixture of an immunogen and an adjuvant into a mammalian host animal.
  • an immunogen and an adjuvants as immunogens are injected multiple times subcutaneously or intraperitoneally into the host animal.
  • adjuvants include complete Freud and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicorynomycolate (MPL-TDM).
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody
  • it can be prepared, for example, using a hybridoma method.
  • This method includes the following four steps: (1) immunize the host animal with the immunogen, (2) collect monoclonal antibody secreting (or potentially secreting) lymphocytes, (3 (1) fuse lymphocytes to immortalized cells; (4) select cells that secrete the desired monoclonal antibody; A mouse, rat, guinea pig, hamster or other suitable host animal is selected as the immunized animal and the immunogen is injected. After immunization, lymphocytes obtained from the host animal are fused with an immortalized cell line using a fusing agent such as polyethylene glycol in order to establish hybridoma cells.
  • a fusing agent such as polyethylene glycol
  • fusion cells for example, rat or mouse myeloma cell lines are used. After cell fusion, the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • Conventional techniques use parental cells that lack the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT). In this case, hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to a medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HGPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • hybridoma that produces a desired antibody is selected, and the target monoclonal antibody can be obtained from the medium in which the hybridoma grows according to a conventional method.
  • the hybridoma thus prepared can be cultured in vitro or in vivo in ascites such as mouse, rat, guinea pig, hamster, etc., and the desired antibody can be prepared from the culture supernatant or ascites.
  • the second embodiment of the present invention comprises a step of measuring the amount of the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment present in a sample derived from a subject using the antibody according to the first embodiment of the present invention. Including cancer screening methods.
  • the measurement of the amount of “MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment” by an antibody is carried out in a sample derived from a subject. It can be carried out by any method known to those skilled in the art, which can detect the fragment present in, for example, a method using an immunological technique.
  • an immunological method for example, immunochromatography, Western blotting, surface plasmon method, ELISA method (for example, directly) using the antibody of the present invention and, optionally, the detectably labeled antibody of the present invention.
  • ELISA immunochromatography
  • Western blotting Western blotting
  • surface plasmon method ELISA method (for example, directly) using the antibody of the present invention and, optionally, the detectably labeled antibody of the present invention.
  • Competitive ELISA for example, indirect competitive ELISA, sandwich ELISA, etc., radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), Quartz crystal microbalance (QCM) and methods using magnetic beads can be mentioned.
  • RIA radioimmunoassay
  • FFA fluorescent immunoassay
  • QCM Quartz crystal microbalance
  • the sandwich ELISA method is particularly preferable because it can be measured easily and quickly.
  • the antibody of the present invention (used as a capture antibody) is a solid phase carrier (for example, a microtiter plate made of glass, metal or resin, a substrate, a resin or magnetic bead, nylon or a membrane made of PVDF. Etc.), and the carrier part to which the antibody is not adsorbed is blocked. Then, a sample containing the antigen is added to the carrier for reaction, the carrier is then washed, and another antibody that recognizes the antigen (detection antibody) An antibody that binds to another epitope) is added to the carrier and allowed to react.
  • a solid phase carrier for example, a microtiter plate made of glass, metal or resin, a substrate, a resin or magnetic bead, nylon or a membrane made of PVDF. Etc.
  • an unlabeled primary antibody (detection antibody) is used to detect a signal derived from the enzyme-labeled secondary antibody, for example, as absorbance, and based on a standard curve, It is also possible to quantify the amount of antigen in it.
  • the label include HRP.
  • HRP 3,3′-diaminobenzidine
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD o -Phenylenediamine
  • p-nitrophenyl phosphate When labeling with alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate (NPP) or the like can be used as a substrate.
  • the antibody may be labeled via a biotin-avidin bond (ie, avidin-HRP or avidin-alkaline phosphatase is added to the biotinylated antibody).
  • the antibody of the present invention is an antibody that can be used for testing for cancer depends on a sample derived from a known cancer patient and a known healthy person (a person who is clearly not affected by the cancer to be tested). This can be determined by performing ROC analysis (Receiver operating characteristic analysis) based on the reactivity of the antibody to these samples using the samples derived from the samples.
  • ROC analysis Receiveiver operating characteristic analysis
  • the cancer testing method of the present invention compares the amount of MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment present in a subject-derived sample with the amount of the N-terminal fragment present in a healthy sample.
  • the amount of fragments present in the sample derived from the subject is significantly large, it can be determined that the subject may have cancer.
  • the inventors have found that when the expression of MT1-MMP is increased, the frequency of EphA2 cleavage is increased, the proliferation, survival and movement of cancer cells are promoted, and the progression of cancer cells to malignant traits progresses. (Patent Document 1 etc.). Therefore, by applying the cancer testing method of the present invention over time to a patient-derived sample, it is also possible to obtain data for determining the degree of cancer progression or the therapeutic effect of cancer treatment.
  • Examples of materials used in the cancer testing method of the present invention include blood, lymph, urine, saliva, sputum and other body fluids, feces, and cell and tissue extracts.
  • the cancer to be subjected to the cancer testing method of the present invention may be any cancer as long as cells expressing EphA2 are cancerated, such as pancreatic cancer, stomach cancer, and the like. Esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, uterine cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma or glioma it can.
  • the third embodiment of the present invention is a cancer test kit (also referred to as “cancer test kit of the present invention”).
  • the third embodiment of the present invention includes the antibody according to the first embodiment of the present invention.
  • reagents, instruments and the like used in the cancer testing method of the present invention may be included.
  • the cancer testing kit of the present invention includes, for example, the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal side in addition to the antibody of the present invention.
  • an antibody that binds to a fragment may be included.
  • a solid phase carrier for example, glass, metal, or resin
  • Microtiter plates, substrates, resins or magnetic beads, nylon, PVDF membranes, solid phase carrier blocking reagents, labeled secondary antibodies or labels used for antibody labeling eg HRP, alkaline phosphatase
  • Reagents, and substrates for color development eg, 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), o-phenyle Diamine (OPD), p-nitrophenyl phosphate (NPP), etc.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenyle Diamine
  • NPP p-nitrophenyl phosphate
  • the fourth embodiment of the present invention is a method for measuring the amount of the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment present in a sample using the antibody according to the first embodiment of the present invention.
  • the amount of the N-terminal fragment of the EphA2 protein present in the sample can be measured by an immunological method (for example, ELISA method) using the antibody of the present invention.
  • the activity of MT1-MMP is closely related to the onset of cancer and the progression of cancer, and MT1-MMP is considered to be important as a target molecule for anticancer agents.
  • MT1-MMP protease
  • MT1-MMP-cleaved EphA2- present in a sample (eg, body fluid) derived from a subject. It is possible to measure the amount of the N-terminal fragment and evaluate the MT1-MMP activity in the subject's living body based on the amount.
  • the MT1-MMP activity in the presence of anti-cancer drug candidate molecules is monitored by the above-described method, so that the anti-cancer drug candidate molecules become MT1-MMP activity. The impact can be evaluated.
  • the method according to the fourth embodiment of the present invention can also be used for screening anticancer drug candidate molecules.
  • the fifth embodiment of the present invention is a method for producing an antibody that specifically binds to an MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment.
  • the inventors have identified the three-dimensional structure of the extracellular domain of EphA2 that may occur when processed by MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment and full-length EphA2 and membrane proteases. Each was expected to be different.
  • an antibody preparation method including the following step (ii) is performed to obtain a full length (intact (intact)
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by the 28th to Xth amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (where X is an integer of 328 to 435, the same shall apply hereinafter), represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by positions 28 to X in the amino acid sequence, or in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • Producing an antibody that binds to any one of the proteins consisting of the amino acid sequence having 80% or more of the amino acid sequence represented by the 28th to Xth amino acids As a specific example of the protein, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted, inserted or deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the proteins (b) and (c) described in the antibody (ii) of the fifth embodiment are: The protein of (b) and (c) of each of the embodiments is the same.
  • the antibody obtained by the fifth embodiment specifically binds only to the MT1-MMP-cleaved EphA2-N terminal fragment, and was found to be very useful in cancer diagnosis (Examples). checking).
  • Steps (i) and (ii) included in the fifth embodiment of the present invention are not steps that require undue trial and error by those skilled in the art, and can be easily performed within the scope of ordinary practice in the art. Is possible.
  • EphA2 antibody anti- EphA2 monoclonal antibody (mAb) 96-1 and polyclonal antibody (pAb) C309 were provided by Daiichi Sankyo Co., Ltd. (Tokyo, Japan). It has been confirmed that the epitopes of mAb 96-1 and pAb C309 are present in the ligand binding domain and the cysteine-rich domain (CRD), respectively.
  • Other antibodies against EphA2, pAbs 371805 and pAbs C20 were purchased from R & D Systems (Minneapolis, Minn., USA) and Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA), respectively.
  • the epitopes of the pAbs 371805 and pAbs C20 antibodies are present in the EphA2 ligand binding domain and the cytoplasmic domain, respectively. All antibodies except pAb 309 can be used for immunoprecipitation.
  • Recombinant antigen human EphA2 cDNA was purchased from Open Biosystems (Huntsville, AL, USA).
  • the coding region of the FLAG tag is ligated to the 3 'end of the fragment corresponding to nucleotides 1-981 and nucleotides 1-1578 of the coding region (antigen # 1 and antigen # 5, respectively), and amplified by PCR Then, it was subcloned into pcDNA3.2 DEST mammalian-expression vector using Gateway System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (FIG. 1A).
  • Ephrin binding domain + CRD Antigen # 1
  • Ephrin binding domain + CRD + stem region Antigen # 5; EphA2 extracellular domain
  • the expressed recombinant antigen was collected in a serum-free conditioned medium and collected and purified using anti-FLAG agarose affinity chromatography. The purity of the recombinant antigen was confirmed by CBB staining after SDS-PAGE.
  • Immunization, cell fusion and hybridoma screening Ligand binding domain and Antigen # 1 are emulsified with an equal volume of complete Freund's adjuvant (Difco; Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) and 50 ⁇ g injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice did. Then boosted twice every 2 weeks with an equal volume of Antigen # 1 emulsified with incomplete Freund's adjuvant. Six weeks after the third immunization, the same amount of laminin- ⁇ 2 protein was injected intravascularly in the mice without adjuvant. Three days after the intravascular injection, the collected blood was centrifuged at 3,000 rpm at room temperature to obtain serum.
  • complete Freund's adjuvant Difco; Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA
  • the resulting serum showing specificity for the ligand binding domain was used as a positive control during hybridoma screening.
  • Cell fusion between the mouse myeloma cell line (P3U1) and spleen cells was performed according to the method reported by IBL Co. Ltd. (Gunma, Japan).
  • the prepared hybridoma cells were cultured in a HAT selection medium for 10 days, and then re-plated into a 96-well plate. The supernatant of each well containing proliferating cells was used to confirm the produced antibody by ELISA using Antigen # 1 as an antigen.
  • Cell limiting dilution and cloning were repeated twice, resulting in three hybridomas (mAb 46A1, 62A1 and 76A1) producing antibodies against Antigen # 1.
  • Western blotting was performed using non-reducing conditions and reducing conditions using recombinant antigens (Antigens # 2, # 3 and # 4).
  • Immunoprecipitation radioimmunoprecipitation assay (RIPA; radioimmunoprecipitation assay) buffer (final volume; 200 [mu] L) in, Antigen # 1 included in the A431 cell extract: the (1 [mu] g) or full-length EphA2 protein: (1 ⁇ g), Antigen # 5 Incubate overnight at 4 ° C. with monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the suspended Protein-G magnetic beads were then added to 40 ⁇ L of the incubation mixture and incubated for 1 hour at 4 ° C. with agitation. Protein-G magnetic beads were washed three times with RIPA buffer, and the beads containing the antigen / antibody complex were removed with a magnetic rack. The precipitated antigen / antibody complex was released from the magnetic beads by adding 2 ⁇ SDS sample buffer containing 5% ⁇ 2-mercaptoethanol.
  • Sandwich ELISA 96-well plates were treated overnight at 4 ° C. with mAb 76A1 or mAb 46A1 (20 ⁇ g / mL in PBS), preimmune serum as a negative control. Next, at room temperature, the wells were blocked with protein-free locking buffer (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) for 1 hour and then dried for 40 minutes. Each well was washed with PBS / 0.05% Tween-20 Tris, added to each well with increasing amounts of MT1-MMP cleavage fragment (Antigen # 1: 0-1,000 pg / mL), then biotinylated mAb The mixture was reacted with 62A1 at 37 ° C for 1 hour.
  • EphA2 extracellular domain present following the purified SP of the recombinant antigen (signal peptide, amino acids 1-27; SEQ ID NO: 1) consists of a ligand (Ephrin) binding domain (amino acids 28-201), CRD in order from the N-terminal side. (Cysteine rich domain, amino acids 202-328) and a stem region (amino acids 329-537) (FIG. 1A).
  • MT1-MMP cleavage sites mapped by the inventors and other researchers are indicated by arrows.
  • Antigens used for antibody preparation were expressed in HKE293 cells with amino acid 28-328 (Antigen # 1) and amino acid 28-537 (Antigen # 5) bound to the C-terminus of the FLAG tag. (FIG. 1A). Each antigen was purified using anti-FLAG mAb and Western blotted with anti-FLAG mAb (FIG. 1B). Furthermore, three types of antigens (Antigen # 2, # 3, and # 4) with a FLAG tag at the C terminus and a GST tag at the N terminus were expressed in E. coli. Each antigen was purified using anti-FLAG mAb, and the purity was confirmed by Western blotting using anti-FLAG mAb (FIG. 1B).
  • a monoclonal antibody mouse against the cleaved fragment of EphA2 was immunized with Antigen # 1 (5 ⁇ g / mouse) to obtain 400 hybridoma cells.
  • Antibodies secreted from each hybridoma were screened by ELISA using plates coated with Antigen # 1 (0.5 ⁇ g / plate).
  • three hybridoma clones (46A1, 62A1 and 76A1) producing the IgG1 class were obtained and further analyzed.
  • immunoprecipitation was performed with the antibody obtained with Antigen # 1, the precipitate was subjected to PAGE under reducing conditions, and then Western blotting was performed using anti-FLAG mAb (FIG. 2A).
  • the extracellular domain of A431 cells expressing endogenous EphA2 and the EphA2 FLAG-labeled EphA2 was prepared.
  • the prepared cell extract was subjected to an immunoprecipitation experiment using the monoclonal antibody prepared here, and the precipitate was subjected to PAGE under non-reducing conditions.
  • Positive control antibodies (96-1, 371805 and C20) were immunoprecipitated with full-length EphA2 and detected by Western blotting using C20 antibody (FIG. 2B).
  • 46A1 binds to both full-length EphA2 and extracellular domain (Antigen # 5) in addition to the MT1-MMP cleaved form (Antigen # 1), and 62A1 cleaves to MT1-MMP (Antigen # 1) It was found to bind to the extracellular domain (Antigen # 5).
  • Antigen # 5 antibodies that do not bind to the full-length EphA2 or EphA2 extracellular domain (Antigen # 5) are screened among antibodies obtained using MT1-MMP-cleaved EphA2 fragment (Antigen # 1) as an immunogen.
  • MT1-MMP-cleaved EphA2 fragment Antigen # 1
  • the AUC area under the curve
  • the sensitivity and specificity of serum samples from pancreatic cancer patients relative to serum samples from healthy subjects were 89.0% and 90.0%, respectively (FIG. 5A).
  • the sensitivity and specificity of the serum samples from gastric cancer patients relative to the serum samples from healthy subjects were 88.2% and 84.0%, respectively (FIG. 5B).
  • the level of CA19-9 a known marker for digestive system tumors (including pancreatic cancer), was measured (FIG. 5C).
  • the detection sensitivity and specificity of CA19-9 for sera from patients with pancreatic cancer were 88.9% and 72.0%, respectively.
  • the AUC of CA19-9 was 0.83. From this result, it is clear that the diagnostic accuracy of pancreatic cancer based on the result of measuring the amount of soluble EphA2 fragment using the antibody of the present invention is superior to the diagnostic accuracy based on detecting CA19-9. (FIGS. 5A and C).
  • the antibody of the present invention that is, an antibody that specifically recognizes only EphA2 cleaved fragment by MT1-MMP
  • the antibody of the present invention specifically binds to an N-terminal fragment of EphA2 useful as a cancer marker.
  • diagnosis of cancer for example, pancreatic cancer

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Abstract

本発明は、MT1-MMPによって切断されるEphA2のN末端側フラグメントと特異的に結合する抗体の提供を目的とするもので、以下の（ａ）のタンパク質と結合し、かつ（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体である。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、 （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質

Description

ＥｐｈＡ２　Ｎ末端フラグメント抗体
　本発明は、MT1-MMPによって切断されるEphA2のN末端側フラグメントと特異的に結合する抗体および該抗体の作製方法に関する。
　EphA2（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor 2）は、哺乳類Eph受容体キナーゼファミリのメンバーで、乳がん、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、胃がん、神経膠腫、黒色腫および卵巣腺がんなどの種々の腫瘍組織において過剰発現しており、がんの進行および転移に関係している（非特許文献１）。
　EphA2のチロシンキナーゼ活性は、ephrin A1などのリガンドが結合すると活性化される。正常な上皮細胞では、EphA2のチロシン残基（Tyr594）のリガンド誘導的な自己リン酸化がErb-B受容体によりメディエートされる増殖シグナルを抑制し、細胞を正常な状態に維持する役割を果たしている。つまり、EphA2は正常細胞において腫瘍サプレッサー様活性を有しているが、がん細胞において過剰に発現するとがんの進行を促進する。
　最近の研究により、EphA2は相反する２つの活性を有していることが明らかになってきた。リガンド依存的に機能するEphA2とは異なり、リガンド非存在下でEphA2は、ErbB受容体の刺激後Ras/MAPKによりセリン残基（Ser897）がリン酸化され（非特許文献２）、ephexin-4/RhoGとのドッキングサイトとして作用し、Rac1の活性化を誘導する（非特許文献３）。このように、がんの進行におけるEphA2の作用機序が解明されてきたことにより、EphA2は抗がん剤の分子標的として注目されている。
　他方、MT1-MMP（membrane-type 1-matrix metalloproteinase 1）は、腫瘍細胞において過剰発現することが知られている膜メタロプロテアーゼである。MT1-MMPは、細胞周辺の生理活性タンパク質や細胞外マトリックスのプロセッシング、また、細胞質側末端を介したHIF転写因子の活性化を通じて、腫瘍の進行を制御している。EphA2はMT1-MMPの基質であり、MT1-MMPで切断されてEphA2リガンド結合ドメインが除去され（非特許文献４、非特許文献５）、リガンドが結合できない構造に変換される。発明者らは、がん組織においてMT1-MMPと共発現されるEphA2のほとんどがN末端側のリガンド結合ドメインを欠失しており、Ser897がリン酸化されていることを見いだした（非特許文献５）。MT1-MMPで切断されない変異体EphA2を上皮癌腫A431細胞株内で強制発現させると、細胞の形態が上皮細胞様の形態に変化し、腫瘍の増殖と肺転移が抑制された（非特許文献５）。従って、がん細胞中でのMT1-MMPによるEphA2のプロセッシングは、がんの進行と深く関係する事象である。そして、MT1-MMPによって切断されたEphA2のN末端側フラグメントが細胞から離れ血流中を循環していれば、そのN末端側フラグメントは、従来の血液テストを用いて早期に検出可能ながんマーカーとして使用することが可能である（特許文献１）。
特願2013-206511
Pasquale, Nat Rev Mol Cell Biol 6:462-475 2005 Mianoら, Cancer Cell 16:9-20 2009 Hiramoto-Yamakiら, J Cell Biol 190:461-477 210 Sugiyamaら, J Cell Biol 201:467-484 2013 Koshikawa, Cancer Res 75:3327-3339 2015
　上述の通り、MT1-MMPで切断されたEphA2のN末端側フラグメントは、がんマーカーとして利用できることが示されている。しかしながら、そのようなEphA2フラグメントを特異的に検出する手段（たとえば、抗体など）および方法は未だに確立されていないのが現状である。
　このような事情に鑑み、本発明者らは、MT1-MMPで切断されたEphA2のN末端側フラグメントのみを特異的に認識する抗体の作製を解決課題として研究を進めた。
　すなわち、本発明は、MT1-MMPで切断されたEphA2のN末端側フラグメントと特異的に結合する抗体および該抗体の作製方法の提供を目的とする。
　また、本発明は前記抗体を用いたがんの検査方法の提供を目的とする。
　さらに、本発明は前記抗体を含むがんの検査用キットの提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、EphA2のN末端側フラグメントを抗原として、モノクローナル抗体の作製を試みた。
　EphA2はエクソソーム（exosome）にも存在していることが報告されており、血中にMT1-MMPで切断されたEphA2のN末端側フラグメント（以下、「MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント」とも記載する）以外にも、完全長の（無傷の）EphA2が存在していることが予想された。また、他のEphファミリー分子は膜プロテアーゼで切断されることが報告されており、EphA2についても、膜プロテアーゼによってプロセッシングを受ける可能性も否定できず、膜プロテアーゼでプロセッシングを受けたフラグメントが血中に存在していることも予想された。
　すなわち、単に、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントを免疫して得られた抗体が、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントのみを特異的に認識する保証はなく、抗体のスクリーニングの段階で新たな知見等に基づいた方法を検討する必要があった。
　発明者らは、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの構造と、完全長EphA2のN末端側領域の構造およびEphA2が膜プロテアーゼで切断されるのであればその切断フラグメントの構造（EphA2細胞外ドメインフラグメント）が異なるのではないか、あるいは、各々に特異なエピトープが存在するのではないかとの作業仮説を立て、「MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント」のみを認識する抗体の調製を試みた。
　発明者らは、鋭意検討を行い抗体のスクリーニングを行った結果、完全長EphA2とEphA2細胞外ドメインフラグメントは認識せず、「MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント」のみを特異的に認識する抗体の作製に成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１２）に関する。
（１）MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合し、完全長のEphA2とは結合せず、かつ、EphA2細胞外ドメインフラグメントにも結合しない抗体。
（２）以下の（ａ）のタンパク質と結合し、かつ（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しないことを特徴とする上記（１）に記載の抗体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
　前記タンパク質について具体的な一例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（３）前記（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）に記載のタンパク質が動物細胞で発現したものであることを特徴とする上記（２）に記載の抗体。
（４）被験者由来の試料中のMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント量を、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗体を用いて測定する工程を含むがんの検査方法。
（５）前記がんが、EphA2を発現していることを特徴とする上記（４）に記載のがんの検査方法。
（６）前記がんが、すい臓がんおよび胃がんであることを特徴とする上記（４）または（５）に記載のがんの検査方法。
（７）前記試料が、血液、リンパ液、唾液、痰、尿または糞便から選択される少なくとも１つであることを特徴とする上記（４）ないし（６）のいずれかに記載のがんの検査方法。
（８）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗体を含むがんの検査用キット。
（９）試料中に存在するMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量を上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗体で測定する方法。
（１０）上記（９）の測定方法で測定したMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量に基づいて、試料中のMT1-MMPプロテアーゼ活性を測定する方法。
（１１）前記試料が、MT1-MMPおよびEphA2を共発現する細胞を培養した培養液であることを特徴とする上記（１０）に記載の方法。
（１２）以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む、抗体の作製方法。
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかに結合する抗体を作製する工程、
　前記タンパク質について具体的な一例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかに結合する抗体を作製する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で作製した抗体のうち、下記の（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体を選択する工程
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　本発明の抗体は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合することができる。すなわち、本発明の抗体は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントのみを認識し、完全長EphA2およびEphA2細胞外ドメインフラグメントなどは認識しない。
　本発明の抗体を使用することで、試料中に存在する、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントのみを検出することが可能となり、試料が由来する被験者のがんによる罹患の有無、がんの進行度、がん治療の効果などにつき、検査、診断することができる。
EphA2の構造と本発明の抗体と抗原との反応結果を示す。（Ａ）EphA2のドメインおよびMT1-MMP切断サイトを示した概略図。「組換え抗原」は、作製した抗原タンパク質がEphA2のどの領域に相当するかを示した図である。矢印は、MT1-MMPによって切断されることが報告されている位置を示す。SP; シグナルペプチド（Signal peptide）、CRD; システインリッチドメイン（Cysteine rich domain）、TM; 膜貫通領域（Transmembrane）、Cytoplasmic; 細胞質領域（Ｂ）作製した組換え抗原（Antigen #1～#5）を、抗FLAGモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す。 Antigen #1、完全長（Intact form）EphA2およびAntigen #5（EphA2細胞外ドメインフラグメント）を抗EphA2抗体で免疫沈降した結果を示す。（Ａ）37-kDaのバンドがAntigen #1に対応し、抗FLAGモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロッティングにより検出した。（Ｂ）完全長EphA2を発現するA431細胞の抽出液から、完全長EphA2免疫沈降した。沈降物は、抗EphA2細胞質ドメインポリクローナル抗体（C20）を使用し、ウエスタンブロッティングで分析した。（Ｃ）Antigen #5を発現・分泌するA431細胞の培養液から、Antigen #5を免疫沈降した。沈降物は、抗FLAGタグモノクローナル抗体を使用し、ウエスタンブロッティングで分析した。IP; 免疫沈降（Immunoprecipitation）、WB; ウエスタンブロッティング（Western blotting） 46A1、62A1および76A1モノクローナル抗体の組換え抗原（Antigens #1～4）に対する親和性をウエスタンブロッティングで検討した結果である（上図；還元条件、下図；非還元条件）。すべての抗原は、抗FLAGタグモノクローナル抗体により、還元条件下で検出された サンドイッチELISAアッセイの結果。（Ａ）Antigen #1（15-250 pg/mL）に対する76A1の結合反応の標準曲線を示す。（Ｂ）血清サンプルが由来するがんの種類と血清サンプルに対する76A1の反応性のポジティブ比。（Ｃ）がん患者の血清中における可溶性EphA2フラグメント（76A1が結合するEphA2フラグメント）の濃度。カットオフ値は、平均値±2SD（350 pg/mL）とした。 （ＡおよびＢ）76A1を用いた可溶性EphA2フラグメントの検出結果に基づく、すい臓がん（Ａ）および胃がん（Ｂ）の診断に関するROC解析の結果を示す。すい臓がんおよび胃がんに関するAUCは、各々、0.89および0.88であった。p>0.001（Ｃ）CA19-9の検出によるすい臓がんの診断に関するROC曲線解析。 捕捉抗体として46A1（左のグラフ）と76A1（右のグラフ）を、検出抗体として62A1を使用し、健康な被験者由来の血清サンプルに対してサンドイッチELISAを行った結果を示す。
　本発明の第１の実施形態は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合し、完全長の（インタクト（無傷）の）EphA2とは結合せず、かつ、EphA2細胞外ドメインフラグメントにも結合しない抗体である。
　発明者らは、これまでに、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントが、がん細胞から離れ血流中を循環することを見いだし、このMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントが、早期に検出可能ながんマーカーとして使用し得ることを明らかにしている（特許文献１）。しかしながら、EphA2のN末端側フラグメントを免疫原として作製した抗体は、EphA2のN末端側フラグメントを特異的に認識するものではあるが、同時に、完全長のEphA2をも認識する可能性が高かった。しかも、血中には、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントのみならず、完全長のEphA2も存在している可能性が示唆されており（Proceedings: AACR 106th Annual Meeting 2015; April 18-22, 2015; Philadelphia, PA）、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと完全長のEphA2を区別して認識する抗体を取得する必要があった。さらに、Ephファミリー分子は膜プロテアーゼで切断されることが報告されていることから（Bai G., Pfaff S. L. (2011). Protease regulation: the Yin and Yang of neural development and disease. Neuron 72, 9-21）、EphA2についても、膜プロテアーゼによってプロセッシングを受ける可能性が考えられ、単にN末端側フラグメントを免疫原として作製した抗体は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント以外のフラグメントをも認識してしまう可能性があった。
　以上のような状況において、発明者らは、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと、完全長のEphA2および膜プロテアーゼによってプロセッシングを受けた場合に生じる可能性のあるEphA2の細胞外ドメインの立体構造が、各々、相違する可能性を考え、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントを免疫原として取得した抗体の中から、完全長のEphA2およびEphA2の細胞外ドメインのいずれにも反応しない抗体のみを取得することを試みた。具体的には、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの一部を動物細胞中で発現させ、これを免疫原とし、当該フラグメントを免疫沈降することのできる抗体をいくつか取得し、得られた抗体の中から、完全長のEphA2を発現する細胞の抽出物から完全長のEphA2を免疫沈降させず、かつ、動物細胞中で発現させたEphA2の細胞外ドメインも免疫沈降させない抗体を取得した。
　上記のような方法で取得した抗体は、後述の実施例に示すように、がん患者由来の血液サンプルに特異的に反応することが確認され、がんマーカーとしての利用が期待されている、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合するものである。
　すなわち、本発明の第１の実施形態を具体的には、たとえば、以下の（ａ）のタンパク質と結合し、かつ（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
　前記タンパク質について具体的な一例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　ここで、EphA2（なお、特記しない限り、EphA2タンパク質のことを表す）のMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントとは、たとえば、配列番号１に示されるアミノ酸配列中、28番目～385番目まで、28番目～395番目まで、28番目～432番目まで、または28番目～435番目までのアミノ酸配列を含むフラグメントのことである。したがって、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントに結合する抗体を作製するための抗原としては、たとえば、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることができる。前記抗原の一例として、配列番号２（配列番号１で表されるアミノ酸配列中、28番目～328番目のアミノ酸配列）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「Antigen #1」と記載する）、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。
　MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントに結合する抗体を作製するための抗原は、どのように調製したものであってもよいが、動物細胞内で発現したものが好ましい。
　本明細書において完全長（インタクト（無傷）の）のEphA2とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のことである。「完全長のEphA2」とは、EphA2のフラグメントに対して、細胞内で機能しているEphA2全長のことを指し、細胞内で発現している状態のEphA2、または、細胞内で発現しているEphA2の立体構造等を保持しているタンパク質のことである。「完全長のEphA2」とは、たとえば、動物細胞内で発現したものが好ましくは、たとえば、EphA2を発現させた細胞抽出液物中に存在するものを挙げることができる。
　また、EphA2細胞外ドメインとは、EphA2の細胞外に突出した領域のことであり、たとえば、配列番号３（配列番号１で表されるアミノ酸配列中、28番目～537番目のアミノ酸配列）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のことである。EphA2の細胞外ドメインとは、どのように調製したものであってもよいが、動物細胞内で発現したものが好ましい。
　本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配」と記す場合、付加、置換、挿入または欠失したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個程度が好ましい。また、本明細書において、「80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよいが、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。
　本発明の第１の実施形態にかかる抗体（「本発明の抗体」と記載する場合もある）は、たとえば、「配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」、より具体的には、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」を免疫原として、いくつかの抗体を作製し、作製した抗体の中から、「配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」および「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」のいずれにも結合しない抗体のみを選択して、本発明の抗体とすることができる。
　抗体と抗原タンパク質との結合の有無を確認する方法としては、特に限定されず、当業者において公知の方法を採用すればよいが、たとえば、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法により抗原タンパク質との結合の有無を確認する方法を挙げることができる。
　本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはそれら抗体の断片が含まれる。また、遺伝子工学的に修飾した、いわゆる、キメラ抗体も含まれる。
　本発明の抗体断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、たとえば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化可変領域）、ならびに、CDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
　ここで、「モノクローナル」というのは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。たとえば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、たとえばハイブリドーマ法（Kohler and Milstein,Nature256:495(1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、本発明のモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)）。
　本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、たとえば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原および／またはアジュバントを宿主動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイトおよびモノホスホリル脂質Ａ合成－トレハロースジコリノミコレート（MPL-TDM）が含まれる。
　また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、たとえば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
　この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（1）宿主動物に免疫原を免疫する、（2）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（3）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（4）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
　マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたは他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。
　免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、たとえば、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する１または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
　このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、または、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、また、腹水から調製することができる。
　本発明の第２の実施形態は、被験者由来の試料中に存在するMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量を、本発明の第１の実施形態にかかる抗体を用いて測定する工程を含む、がんの検査方法である。
　本発明の第２の実施形態（「本発明のがんの検査方法」とも記載する）において、「MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント」の量の抗体による測定は、被験者由来の試料中に存在する当該フラグメントを検出し得る、当業者において公知のあらゆる方法により実施することができ、たとえば、免疫学的手法を利用した方法により行うことができる。免疫学的手法としては、本発明の抗体、場合によっては、検出可能に標識した本発明の抗体を用いて、たとえば、免疫クロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン法、ELISA法（たとえば、直接競合ELISA、間接競合ELISA、サンドイッチELISAなど）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、水晶振動子マイクロバランス法（Quartz crystal microbalance; QCM）および磁性ビーズを使用した方法などを挙げることができる。
　免疫学的手法の中でも、特に、サンドイッチELISA法が簡便かつ速やかに測定することができるため好ましい。サンドイッチELISA法は、たとえば、本発明の抗体（捕捉抗体として使用）を固相担体（たとえば、ガラス製、金属製または樹脂製のマイクロタイタープレート、基板、樹脂または磁気ビーズ、ナイロン、PVDF製のメンブレンなど）に吸着させ、抗体が吸着していない担体部分をブロッキングした後、抗原を含む試料を担体に添加して反応させ、その後担体を洗浄し、さらに、抗原を認識する別の抗体（検出抗体；別のエピトープに結合する抗体）を担体に添加して反応させる。反応後、抗体に結合させた標識からのシグナルなどを検出し、試料中の抗原の存在量を測定する。
　捕捉抗体と結合した抗原の検出は、非標識の１次抗体（検出抗体）を使用して、酵素標識した２次抗体由来のシグナルを、たとえば、吸光度として検出し、標準曲線に基づいて、試料中の抗原量を定量することもできる。標識としては、HRPなどを例示することができ、この場合、HRPの基質として、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（TMB）、o-フェニレンジアミン（OPD）などを使用することができる。また、アルカリホスファターゼで標識する場合には、基質としてp-ニトロフェニルホスフェート（NPP）などを使用することができる。
　なお、抗体の標識は、ビオチン－アビジン結合を介して行ってもよい（すなわち、ビオチン化した抗体にアビジン-HRPまたはアビジン-アルカリホスファターゼを添加する）。
　本発明の抗体が、がんの検査に使用できる抗体であるかどうかは、既知のがん患者由来の試料と既知の健康者（検査対象のがんに罹患していないことが明らかな者）由来の試料を用いて、これらの試料に対する抗体の反応性に基づいたROC解析（Receiver operating Characteristic analysis）を実施することで、判断することができる。
　本発明のがんの検査方法は、被験者由来の試料中に存在する、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量と健康者の試料中に存在する当該N末端側フラグメントの量を比較し、被験者由来の試料中に存在するフラグメントの量が有意に多い場合に、当該被験者ががんに罹患している可能性があると判断することができる。
　また、発明者らは、MT1-MMPの発現が亢進するとEphA2の切断頻度が高まり、がん細胞の増殖、生存および運動が促進され、がん細胞の悪性形質への進行が進むことを見いだしている（特許文献１など）。したがって、患者由来の試料について、経時的に本発明のがんの検査方法を適用することにより、がんの進行度またはがん治療の治療効果の判断資料を得ることも可能である。
　本発明のがんの検査方法に使用される資料は、たとえば、血液、リンパ液、尿、唾液、痰などの体液、糞便、細胞や組織の抽出物などを挙げることができる。
　また、本発明のがんの検査方法の対象となるがんは、EphA2が発現している細胞ががん化したものであれば、いかなるものであってもよく、たとえば、すい臓がん、胃がん、食道がん、大腸がん、肝臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、子宮がん、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、黒色腫またはグリオーマなどを挙げることができる。
　本発明の第３の実施形態は、がん検査用キットである（「本発明のがん検査用キット」とも記載する）。本発明の第３の実施形態には、本発明の第１の実施形態にかかる抗体が含まれる。また、本発明の抗体の他、本発明のがんの検査方法に使用する試薬、器具などが含まれていてもよい。たとえば、本発明のがんの検査方法が、サンドイッチELISA法によって実施される場合、本発明のがん検査用キットには、本発明の抗体の他、たとえば、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと結合する抗体（検出抗体；固相担体に吸着させる抗体とは異なるエピトープを認識する抗体であって、市販の抗体を含む）、固相担体（たとえば、ガラス製、金属製または樹脂製のマイクロタイタープレート、基板、樹脂または磁気性ビーズ、ナイロン、PVDF製のメンブレンなど）、固相担体のブロッキング用試薬、標識済み2次抗体または抗体標識のために使用する標識（たとえば、HRP、アルカリホスファターゼ）や試薬類、標識を発色させるための基質（たとえば、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（TMB）、o-フェニレンジアミン（OPD）、p-ニトロフェニルホスフェート（NPP）など）が含まれていてもよい。
　本発明の第４の実施形態は、試料中に存在するMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量を本発明の第１の実施形態にかかる抗体を使用して測定する方法である。上述のとおり、試料中に存在する当該EphA2タンパク質のN末端側フラグメントの量は、本発明の抗体を使用して、免疫学的方法（たとえば、ELISA法など）により測定することができる。
　MT1-MMPの活性はがんの発症およびがんの進行と密接な関連性を有しており、MT1-MMPは抗がん剤の標的分子としても重要であると考えられている。これまで、インビボにおけるMT1-MMP（プロテアーゼ）活性を測定する手段はなかったが、本発明の抗体を使用して、被験者由来の試料（たとえば、体液など）中に存在するMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量を測定し、その量に基づいて被験者の生体内におけるMT1-MMP活性を評価することが可能である。
　また、抗がん剤の候補分子をスクリーニングする目的で、抗がん剤候補分子存在下におけるMT1-MMP活性を上述の方法でモニターすることにより、抗がん剤候補分子がMT1-MMP活性に与える影響を評価することができる。より具体的には、MT1-MMPおよびEphA2を共発現する細胞をMT1-MMPを標的とする候補分子の存在下で培養し、その培養液を試料としてMT1-MMPの活性を評価すれば、その候補分子のMT1-MMPに対する影響を調べることができる。したがって、本発明の第４の実施形態にかかる方法は、抗がん剤候補分子のスクリーニングにも使用することができる。
　本発明の第５の実施形態は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合する抗体の製造方法である。
　上述の通り、発明者らは、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと、完全長のEphA2および膜プロテアーゼによってプロセッシングを受けた場合に生じる可能性のあるEphA2の細胞外ドメインの立体構造が、各々、相違すると予想した。そして、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントを免疫原として作製したいくつかの抗体の中から、下記の（ｉｉ）の工程を含む抗体作製方法を行うことにより、完全長（インタクト（無傷））のEphA2およびEphA2の細胞外ドメインのいずれにも反応しない抗体を調製することに初めて成功した。
　すなわち、本発明の第５の実施形態は、以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む、抗体の作製方法である。
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかに結合する抗体を作製する工程、
　前記タンパク質について具体的な一例として、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかに結合する抗体を作製する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で作製した抗体のうち、下記の（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体を選択する工程
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
　第５の実施形態の抗体（ｉｉ）に記載される（ｂ）および（ｃ）のタンパク質は、第１の実施形態の（ｂ）および（ｃ）のタンパク質と、各々、同一である。
　上記第５の実施形態により得られた抗体は、MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントのみと特異的に結合し、がんの診断において非常に有用であることが明らかとなった（実施例を参照のこと）。
　本発明の第５の実施形態に含まれる工程（ｉ）および（ｉｉ）は、当業者において過度の試行錯誤が必要となる工程ではなく、当該技術分野において通常の実施の範囲内において、容易に行うことが可能である。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．方法
EphA2抗体
　抗-EphA2モノクローナル抗体（mAb）96-1およびポリクローナル抗体（pAb）C309は、第一三共株式会社から供与された（Tokyo, Japan）。mAb 96-1およびpAb C309のエピトープは、各々、リガンド結合ドメインおよびシステインリッチドメイン（CRD; cysteine-rich domain）に存在することが確認されている。
　EphA2に対する他の抗体、pAbs 371805およびpAbs C20は、各々、R&D Systems（Minneapolis, MN, USA）およびSanta Cruz Biotechnology（Dallas, TX, USA）から購入した。pAbs 371805およびpAbs C20抗体のエピトープは、各々、EphA2リガンド結合ドメインおよび細胞質ドメインに存在する。
　pAb 309以外のすべての抗体は、免疫沈降に使用することができる。
組換え抗原
　ヒトEphA2 cDNAはOpen Biosystems（Huntsville, AL, USA）から購入した。コード領域の1-981番目までのヌクレオチドおよび1-1578番目までのヌクレオチド（各々、Antigen　#1およびAntigen #5）に相当するフラグメントの3’末端にFLAGタグのコード領域を連結させ、PCRで増幅し、Gateway System（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して、pcDNA3.2 DEST mammalian-expression vectorにサブクローニングした（図１Ａ）。Ephrin結合ドメイン＋CRD（Antigen #1）またはEphrin結合ドメイン＋CRD＋stem領域（Antigen #5；EphA2細胞外ドメイン）の発現ベクターは、血清フリーの条件下でHEK293細胞に一過的にトランスフェクトした。発現した組換え抗原は、血清フリー条件培地中に分泌されたものを回収し、抗FLAGアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。組換え抗原の純度は、SDS-PAGE後CBB染色を行い確認した。
　抗体のエピトープマッピングを行うために、EphA2の28番目～125番目 (Antigen #2)、101番目～250番目 (Antigen #3)および226番目～328番目 (Antigen #4)のアミノ酸配列に対応する塩基配列のC末端にFLG配列を付してPCRで増幅し、Gateway System を用いてpET160ベクターにサブクローニングした（図１Ａ）。組換え抗原は、大腸菌中で発現させ、抗FLAGモノクローナル抗体結合アガロースクロマトグラフィーで精製した。
免疫、細胞融合およびハイブリドーマのスクリーニング
　リガンド結合ドメインとAntigen #1を等量の完全フロイントアジュバント（Difco; Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA）でエマルジョン化し、50μgをBALB/cマウスの腹腔内にインジェクトした。その後、不完全フロイントアジュバントでエマルジョン化した等量のAntigen #1で、２週間毎に２回ブーストした。３回目の免疫から６週間後、アジュバント無しで、同量のラミニン‐γ2タンパク質をマウスの血管内に注射した。血管内注射から3日後、採血した血液を、室温にて3,000rpmで遠心し血清を得た。得られたリガンド結合ドメインに対する特異性を示す血清は、ハイブリドーマのスクリーニングの間、ポジティブコントロールとして使用した。
　マウスミエローマ細胞株（P3U1）と脾臓細胞との細胞融合は、IBL Co. Ltd.（Gunma, Japan）から報告されている方法に従って行った。調製したハイブリドーマ細胞はHAT選択培地中、10日間培養し、その後、96ウェルプレートにまき直した。増殖している細胞を含む各ウェルの上清は、Antigen #1を抗原とするELISA法により、生産された抗体の確認に使用した。細胞の限界希釈およびクローニングを２回繰り返し、Antigen #1に対する抗体を生産する３つのハイブリドーマ（mAb 46A1、62A1および76A1）を得た。得られたモノクローナル抗体のエピトープ解析行うために、組換え抗原（Antigens #2、#3および#4）を用い、非還元条件および還元条件でウエスタンブロッティングを行った。
免疫沈降
　放射免疫沈降アッセイ（RIPA ; radioimmunoprecipitation assay）バッファー（最終体積；200μL）中、A431細胞抽出物に含まれるAntigen #1:（1μg）、Antigen #5:（1μg）または完全長のEphA2タンパク質を、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。次に、懸濁したProtein-G磁気ビーズを40μLのインキュベーション混合物に添加し、撹拌しながら4℃で1時間インキュベートした。Protein-G磁気ビーズをRIPAバッファーで3回洗浄し、抗原／抗体複合体を含むビーズを磁気ラックで除去した。沈降させた抗原／抗体複合体は、5 % β2-メルカプトエタノールを含む2 x SDSサンプルバッファーを添加し、磁気ビーズから遊離させた。
サンドイッチELISA
　96ウェルプレートをmAb 76A1またはmAb 46A1（PBS中、20μg/mL）、ネガティブコントロールとしての免疫前血清で、4℃で一晩処理した。次に、室温にて、ウェルをタンパク質フリーのlocking buffer（Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA）で1時間ブロッキングし、その後40分間乾燥させた。各ウェルは、PBS/0.05% Tween-20 トリスで洗浄後、MT1-MMP切断フラグメントの量を増加させながら（Antigen #1: 0-1,000 pg/mL）各ウェルに添加し、次いで、ビオチン化mAb 62A1と37℃で1時間反応させた。その後ウェルを洗浄した後、結合した抗原をアビジン-D-HRP (0.1μg/mL)で検出した。1 N H2SO4で反応を停止させた後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを添加し、ウェルの吸光度／リファレンス（590 nm/620 nm）をBio-Rad spectrophotometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して測定した。
臨床試料
　すい臓がん患者由来の血清（10ケース）をProMedDx（Norton, MA, USA）から入手した。胃（17ケース）、食道（8ケース）、胃食道（1ケース）および頭頸部（9ケース）の各がん患者由来の血清、および健康者由来の血清（50ケース）は、Kokusai Bio, Inc.（Tokyo, Japan）から入手した。また、コントロールとして、すい臓がん患者および健康者由来の血清試料に対して、消化器系がんマーカーであるCA19-9の解析を行った。
２．結果
組換え抗原の精製
　SP（シグナルペプチド、アミノ酸1-27；配列番号１）に続いて存在するEphA2細胞外ドメインは、N末側から順に、リガンド（Ephrin）結合ドメイン（アミノ酸28-201）、CRD（システインリッチドメイン、アミノ酸202-328）およびステム領域（アミノ酸329-537）から構成されている（図１Ａ）。発明者らおよび他の研究者によりマッピングされたMT1-MMP切断サイトを矢印で示した。
　抗体の調製に使用する抗原として、アミノ酸28-328（Antigen #1）およびアミノ酸28-537（Antigen #5）の各領域のC末端にFLAGタグを結合したものを、HKE293細胞中で発現させた（図１Ａ）。各抗原は、抗FLAG mAbを使用して精製し、抗FLAG mAbでウエスタンブロッティングを行った（図１Ｂ）。さらに、C末端にFLAGタグを、N末端にGSTタグを付した3種類の抗原（Antigen #2、#3および#4）を大腸菌中で発現させて調製した。各抗原は、抗FLAG mAbを用いて精製し、その純度は抗FLAG mAbを使用してウエスタンブロッティングを行い確認した（図１Ｂ）。
EphA2の切断フラグメントに対するモノクローナル抗体
　マウスをAntigen #1（5μg/マウス）で免疫し、400個のハイブリドーマ細胞を得た。Antigen #1（0.5μg/プレート）でコートしたプレートを用いて、各ハイブリドーマから分泌される抗体をELISA法でスクリーニングした。その結果、IgG1クラスを産生する3つのハイブリドーマクローン（46A1、62A1および76A1）を取得し、さらに解析を行った。抗体の反応性を確認するために、Antigen #1を取得した抗体で免疫沈降させ、沈降物を還元条件でPAGEを行い、その後、抗FLAG mAbを用いてウエスタンブロッティングを行った（図２Ａ）。異なるハイブリドーマクローン由来の3種類のモノクローナル抗体は、ポジティブコントロール抗体（371805および96-1）を用いた結果と同様にAntigen #1を沈降させたが、ネガティブコントロール抗体（C309、マウスIgG、抗FLAG mAb）はAntigen #1を沈降させなかった（図２Ａ）。
　エピトープマッピングを行うために、4つの組換えEphA2フラグメント（Antigens #1、#2、#3および#4）を還元および非還元条件下でPAGEを行い、ウエスタンブロッティングにより解析した（図３）。すべてのモノクローナル抗体（46A1、62A1および76A1）は非還元条件下でAntigen #1を検出した（図２Ａ）が、mAb 46A1は還元条件下ではAntigen #1を検出することができなかった。62A1はAntigen #3に反応したが、46A1と76A1は、Antigen #2、#3および#4と反応しなかった。したがって、46A1と76A1に対するAntigen #1のエピトープは、Antigens #2、#3または#4上にオーバーラップして存在しないと考えられる。特に、46A1はエピトープの構造を認識している可能性がある。
　完全長EphA2およびEphA2の細胞外ドメイン（Antigen #5）に対する調製したモノクローナル抗体の反応性を確認するために、内在性EphA2を発現するA431細胞およびC末端側にFLAG標識したEphA2の細胞外ドメイン（Antigen #5）を発現・分泌するA431細胞の無血清培養液を作製した。作製した細胞抽出物に対し、ここで作製したモノクローナル抗体を使用して免疫沈降実験を行い、沈降物を非還元条件下でPAGEを行った。ポジティブコントロール抗体（96-1、371805およびC20）は、完全長のEphA2を免疫沈降させ、C20抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出された（図２Ｂ）。興味深いことに、46A1は完全長EphA2を免疫沈降させたが、62A1および76A1の完全長EphA2に対する反応性は非常に弱かった。これに対し、また、62A1はEphA2の細胞外ドメイン（Antigen #5）を免疫沈降させたが、76A1のEphA2の細胞外ドメイン（Antigen #5）を免疫沈降させなかった（図２Ｃ）。したがって、76A1は、完全長EphA2および細胞外ドメイン（Antigen #5）とは結合せずに、MT1-MMPによる切断フォーム（Antigen #1）と特異的に結合する。他方、 46A1は、MT1-MMPによる切断フォーム（Antigen #1）以外にも完全長EphA2および細胞外ドメイン（Antigen #5）の両方と結合し、62A1はMT1-MMPによる切断フォーム（Antigen #1）の他に細胞外ドメイン（Antigen #5）と結合することが分かった。
以上のことから、MT1-MMPによるEphA2の切断フラグメント（Antigen #1）を免疫原として得られた抗体のうち、完全長EphA2およびEphA2の細胞外ドメイン（Antigen #5）に結合しない抗体をスクリーニングすることで、MT1-MMPによるEphA2の切断フラグメントのみを特異的に認識する抗体の取得が可能であることが分かった。
がん患者の血清中に存在する可溶性EphA2フラグメント（MT1-MMPによるEphA2の切断フラグメント）の解析
　サンドイッチELISA法の実施にあたり、捕捉抗体として76A1を、検出抗体として62A1を使用した。抗原量を増大させた場合のELISAの定量的反応性の程度を確認するために、Antigen #1を血清に添加（0-250 pg/mL）し、その血清をアッセイに供した。標準曲線は用量依存的な直線性を示し（図４Ａ）、10 ng/mLのAntigen #1を添加しても飽和しなかった。そこで、胃がん患者17人、すい臓がん患者9人、食道がん患者8人、胃食道がん患者1人、頭頸部のがん患者9人に由来する血清サンプル、および50人（男性25人、女性25人）の健康な被験者由来の血清サンプルに対し、ELISAを行った（図４ＢおよびＣ）。健康な被験者のサンプル中の可溶性EphA2の平均濃度は、95.6±13.04 pg/mLであったので、カットオフ値を350 pg/mL（平均値±2SDs）に設定した。興味深いことに、より高い可溶性EphA2濃度が、胃がんサンプル（460.0±379.2 pg/mL）とすい臓がんサンプル（950.7±316.9 pg/mL）において検出された。特に、すい臓がんの9患者のうち8患者のサンプルにおいて、可溶性EphA2濃度がカットオフ値を超えていた（図４ＢおよびＣ）。
　予備的なROC解析の結果から、すい臓がんおよび胃がん患者の血清中の可溶性EphA2フラグメントを検出した場合のAUC（area under the curve）は、各々、0.89および0.88であった。健康な被験者由来の血清サンプルに対するすい臓がん患者由来の血清サンプルの感度および特異性は、各々、89.0 %および90.0 %であった（図５Ａ）。また、健康な被験者由来の血清サンプルに対する胃がん患者由来の血清サンプルの感度および特異性は、各々、88.2 %および84.0 %であった（図５Ｂ）。
　比較のために、既知の消化器系腫瘍（すい臓がんを含む）マーカーであるCA19-9のレベルを測定した（図５Ｃ）。すい臓がん患者由来の血清に対するCA19-9の検出感度および特異性は、各々、88.9%および72.0%であった。また、CA19-9のAUCは、0.83であった。この結果から、可溶性EphA2フラグメントの量を本発明の抗体を用いて測定した結果に基づくすい臓がんの診断精度は、CA19-9を検出することに基づく診断精度よりも優れていることが明らかとなった（図５ＡおよびＣ）。
本発明の抗体の血中可溶性EphA2フラグメントの検出精度の検討
　可溶性EphA2フラグメントの検出を行う際に、本発明の抗体（すなわち、MT1-MMPによるEphA2の切断フラグメントのみを特異的に認識する抗体）を用いた場合と、野生型EphA2も認識する既存の抗体を用いた場合とで、血中の可溶性EphA2フラグメントの検出精度にどのような違いが生じるか検討を行った。
　捕捉抗体として46A1（野生型EphA2と可溶性EphA2の両方に反応する）と76A1（可溶性EphA2フラグメントのみに反応する）を、検出抗体として62A1を使用し、健康な被験者由来の血清サンプルに対してサンドイッチELISAを行った。その結果、捕捉抗体として46A1を用いた測定結果から、健常人血清の幾つかのサンプルで高値のEphA2を含むことが明らかとなった（図６左）。捕捉抗体として76A1を用いたEphA2遊離断片特異的なELISAでは、これらのサンプルは陽性を示さなかった（図６右）。
　これらの結果から、既存の汎用抗体（野生型EphA2と可溶性EphA2の両方に反応する）を用いると、エクソソーム等に含まれる野生型EphA2を検出する可能性があり、がんの検査において、可溶性EphA2フラグメントを特異的に検出する抗体（すなわち、本発明の抗体）を使用することの重要性が確認できた。
　本発明の抗体は、がんマーカーとして有用なEphA2のN末端側フラグメントと特異的に結合する。本発明の抗体を使用することで、これまで早期発見が困難であったがん（たとえば、すい臓がんなど）の診断も簡便かつ迅速に行い得るため、がんの診断および治療の分野において大きな効果をもたらすことが期待される。

Claims (12)

  1. 　MT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントと特異的に結合し、完全長のEphA2とは結合せず、かつ、EphA2細胞外ドメインフラグメントにも結合しない抗体。
  2. 　以下の（ａ）のタンパク質と結合し、かつ（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
  3. 　前記（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）に記載のタンパク質が動物細胞で発現したものであることを特徴とする請求項２に記載の抗体。
  4. 　被験者由来の試料中のMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメント量を、請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体を用いて測定する工程を含むがんの検査方法。
  5. 　前記がんが、EphA2を発現していることを特徴とする請求項４に記載のがんの検査方法。
  6. 　前記がんが、すい臓がんおよび胃がんであることを特徴とする請求項４または５に記載のがんの検査方法。
  7. 　前記試料が、血液、リンパ液、唾液、痰、尿または糞便から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項４ないし６のいずれかに記載のがんの検査方法。
  8. 　請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体を含むがんの検査用キット。
  9. 　試料中に存在するMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量を請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体で測定する方法。
  10. 　請求項９の測定方法で測定したMT1-MMP切断EphA2-N末側フラグメントの量に基づいて、試料中のMT1-MMPプロテアーゼ活性を測定する方法。
  11. 　前記試料が、MT1-MMPおよびEphA2を共発現する細胞を培養した培養液であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 　　以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む、抗体の作製方法。
    （ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目（ここで、Xは328以上435以下の整数、以下同じ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～X番目で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかに結合する抗体を作製する工程、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で作製した抗体のうち、下記の（ｂ）および（ｃ）のタンパク質とは結合しない抗体を選択する工程
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列中28番目～976番目のアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
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