KR20220157443A

KR20220157443A - Xix형 콜라겐 분석

Info

Publication number: KR20220157443A
Application number: KR1020227036335A
Authority: KR
Inventors: 니콜라스 빌룸센; 예페 또르라시우스-우싱
Original assignee: 노르딕 바이오사이언스 에이/에스
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-11-29
Also published as: AU2021241773A1; JP2023518489A; GB202004195D0; WO2021191167A1; CN115667295A; EP4126935A1

Abstract

본 발명은 콜라겐 XIX형을 표적으로 하는 단클론성 항체, 및 상기 항체를 이용하는 면역에세이 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 분석법은 암의 진단 및 모니터링에 사용될 수 있다.

Description

XIX형 콜라겐 분석

본 발명은 콜라겐 XIX형을 표적으로 하는 단클론성 항체, 및 상기 항체를 이용하는 면역에세이(immunoassay) 및 키트에 관한 것이다.

XIX형 콜라겐은 기저막과 연관된 특징이 잘 알려지지 않은 콜라겐이다. 이는 유방암 진행 동안 변경된 조절을 나타내었고 NC1(XIX) 도메인은 항종양 신호전달 특성을 나타내었다. 그러나, 암에서 콜라겐 XIX의 바이오마커 잠재력에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

폐암은 가장 흔하게 진단되는 암이며 암 사망의 주요 원인이다¹. 비소세포폐암(NSCLC)은 모든 폐암 사례의 대략 85%를 나타내며, 여기서 선암종(AC)과 편평세포암종(SCC)이 가장 흔한 아형이다^2,3. 대부분의 폐암 사례는 후기 단계에서 진단되어 전체 5년 생존율이 19%로 암울하다⁴. 그러나, 대부분의 환자가 외과적 절제의 이익을 받을 수 있는 국소 단계에서 진단된 환자의 경우, 5년 생존율은 56%이다^2,4. 따라서 조기 발견은 폐암 환자의 생존을 개선시키는 주요 방법 중 하나이다.

종양 미세 환경은 암 진행을 좌우하는 전통적인 특징과 복잡하게 연결되어 있다⁵. 종양 미세 환경의 주요 구성요소 중 하나는 조직의 비세포 부분인 세포외 기질(ECM)이며, 이는 이러한 특징의 거의 전부에 영향을 미친다⁶. ECM에서 가장 지배적인 단백질은 콜라겐이며, 이에는 28가지의 상이한 유형이 있다⁷. XIX형 콜라겐은 400 kDa 동종삼량체를 형성하는 3개의 α1(XIX) 사슬을 포함하는 소수 콜라겐이다. 각각의 사슬은 6개의 비콜라겐성 도메인이 산재된 5개의 콜라겐성 삼중 나선 도메인을 포함한다. 주요 서열을 기반으로 하여, XIX형 콜라겐은 원섬유 콜라겐과 다른 ECM 구성요소 사이의 상호 작용을 매개하는 중단된 삼중 나선 콜라겐 패밀리가 있는 원섬유-연관 콜라겐에 속한다^8-10.

콜라겐 XIX 발현은 발달 중인 마우스에서 널리 퍼져 있지만 성체에서는 더 제한적이며 대부분 뇌 조직에 축적된다¹¹. 인간 성인에서, 발현은 뇌, 골격근, 비장, 전립선, 신장, 간, 태반, 결장, 피부 및 유방 조직에서 발견된다^12,13. 콜라겐 XIX의 기능이 완전히 이해되지는 않았지만, 발달상의 역할이 있다는 것은 분명한 것으로 보인다. 콜라겐 XIX는 배아 근육 분화 및 식도 발달에 관여한다^10,14,15. 콜라겐 XIX는 해마의 시냅스 형성과 척수 뉴런의 축삭 형성에도 또한 관여한다^16,17. 근위축성 측색 경화증(ALS) 환자의 근육에서 콜라겐 XIX의 과발현도 또한 설명된 바 있으며 더 나쁜 예후와 연관되어 있었다^18,19.

전반적으로, 콜라겐 XIX 단백질의 조직 국소화는 대부분 혈관, 신경, 근육 및 일부 상피 기저막 영역(BMZ)과 연관되어 있다¹². 흥미롭게도, 유방 암종의 상피 BMZ에서 XIX형 콜라겐의 단백질 염색은 국소화된 유관 암종에서 부분적으로 손실되고 침습성 암종에서는 완전히 없다. 이러한 손실은 IV형 콜라겐과 라미닌의 손실보다 더 일찍 발생하며, 이는 콜라겐 XIX 수준의 감소가 침습 전 종양에서 BMZ 리모델링의 초기 단계의 결과임을 시사한다¹³.

IV형, XV형 및 XVIII형 콜라겐의 NC1 도메인으로부터 매트리킨의 방출과 유사하게, 콜라겐 XIX의 C-말단 NC1 도메인은 절단되어 방출될 수 있다. 생성된 펩타이드는 생체 내에서 흑색종의 성장 및 혈관신생을 저해하고 시험관 내 침습성을 저해할 수 있다²⁰. NC1 도메인은 플라스민 프로테아제에 의해 절단되고 αvβ3 인테그린과 상호작용하여 FAK/PI3K/Akt/mTOR 신호전달 경로를 저해할 뿐만 아니라 GSK3β 인산화를 저해한다^21,22. 흥미롭게도, NC1 도메인은 상이한 인테그린 수용체인 α5β1과 상호작용하지만, 그렇게 할 때, 또한 저해성 신경 말단의 형성을 촉발한다²³.

본 발명자들은 XIX형 콜라겐, 특히 α1 사슬의 C 말단을 특이적으로 인식하는 단클론성 항체; 및 면역에세이, 구체적으로 생체액 샘플에서 XIX형 콜라겐을 검출하기 위한 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 개발하였다. 본 발명자들은 XIX형 콜라겐이 암 검출을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 결정하였다. 구체적으로 PRO-C19는 NSCLC와 건강한 대조군을 구별하는 데 특히 뛰어나며, NSCLC의 조기 검출을 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.

따라서, 제1 양태에서 본 발명은 XIX형 콜라겐 α1 사슬(또한 본 명세서에서 표적 펩타이드로도 지칭됨)의 C-말단을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단클론성 항체에 관한 것으로서, C-말단은 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)(또한 본 명세서에서 표적 서열로도 지칭됨)을 갖는다.

바람직하게는, 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 합성 펩타이드에 대해 생성된 단클론성 항체이다. 항체를 생성하는 데 사용되는 합성 펩타이드는 N-말단에서 담체 단백질에 연결된 합성 펩타이드일 수 있다. 예시적인 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH)과 같은 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합성 펩타이드는 임의의 적합한 연결을 통해 담체 단백질에 연결될 수 있으며, 이는 펩타이드의 N-말단에 하나 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 단클론성 항체는 마우스 또는 다른 포유동물을 면역화하고, 면역화된 포유동물로부터 비장 세포를 단리하고 하이브리도마 세포와 융합시킨 다음, 생성된 하이브리도마 세포를 배양하여 단클론성 성장을 확보하는 것과 같은(이에 제한되지 않음) 당업자에게 알려진 적합한 기법을 통해 생성될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNX(서열번호 2)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않으며, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 따라서, 단클론성 항체는 바람직하게는 표적 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산만큼 C-말단에서 연장된 표적 펩타이드의 연장된 변이체를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 단클론성 항체는 바람직하게는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNA(서열번호 3)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는다.

바람직한 실시형태에서, 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGG(서열번호 4)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는다. 따라서, 단클론성 항체는 바람직하게는 표적 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산만큼 C-말단에서 절단된 표적 펩타이드의 단축된 변이체를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는다.

바람직한 실시형태에서, 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 GVAPGIGPGG(서열번호 5)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 결합하지 않는다. 따라서, 단클론성 항체는 바람직하게는 넌센스 표준 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는다.

제2 양태에서, 본 발명은 인간 생체액 샘플에서 XIX형 콜라겐을 검출하기 위한 면역에세이 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 인간 생체액 샘플을 본 발명의 제1 양태에 따른 단클론성 항체와 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 단클론성 항체와 펩타이드 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 검출은 정량적이다. 따라서, 방법은 샘플 내의 단클론성 항체와 펩타이드 사이의 결합량을 검출하고 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 면역에세이는 경쟁적 면역에세이이다.

바람직하게는, 면역에세이는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)이다. 바람직하게는 ELISA는 경쟁적 ELISA이다.

인간 생체액 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다. 바람직하게는 샘플은 혈청 또는 혈장이다.

인간 생체액 샘플은 암을 나타내는 의학적 징후 또는 증상을 갖는 인간 환자 유래의 샘플일 수 있다. 바람직하게는 생체액 샘플은 췌장, 결장-직장, 신장, 위, 난소, 유방, 방광, 폐, 두경부, 전립선, 또는 간의 암 또는 흑색종, 바람직하게는 유방, 폐 또는 난소의 암, 구체적으로 폐암, 특히 비소세포폐암(NSCLC)을 나타내는 의학적 징후 또는 증상을 갖는 인간 환자 유래의 샘플이다.

방법은 환자의 암 가능성을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 평가하기 위한 면역에세이 방법일 수 있으며, 상기 방법은 상기 환자로부터 수득한 생체액 샘플을 단클론성 항체와 접촉시키는 단계, 샘플 내의 단클론성 항체와 펩타이드 사이의 결합량을 검출 및 결정하는 단계, 및 상기 결합량을 정상적인 건강한 대상체와 연관된 값 및/또는 알려진 질환 중증도와 연관된 값 및/또는 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값과 상관시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는 암은 췌장, 결장-직장, 신장, 위, 난소, 유방, 방광, 폐, 두경부, 전립선, 또는 간의 암 또는 흑색종, 더 바람직하게는 유방, 폐 또는 난소의 암, 구체적으로 폐암, 특히 비소세포폐암(NSCLC)이다.

제2 양태에 따른 방법의 일부 실시형태에서, C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 XIX형 콜라겐 펩타이드의 에피토프에 특이적인 단클론성 항체의 결합량은 하나 이상의 미리 결정된 컷오프 값과 상관관계가 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "컷오프 값"은 대상체가 암에 걸릴 가능성이 높음을 나타내는 것으로 통계적으로 결정된 결합량을 의미한다. 통계적 컷오프 값 이상인 환자 샘플에서 바이오마커 결합의 측정된 값은 암의 존재 또는 가능성의 적어도 70% 확률, 바람직하게는 적어도 80% 확률, 바람직하게는 적어도 85% 확률, 더 바람직하게는 적어도 90% 확률, 가장 바람직하게는 적어도 95% 확률에 해당할 수 있다. "컷오프 값"은 암으로 진단받은 환자 및 건강한 대조군으로부터 얻은 결과를 비교함으로써 계산될 수 있다.

C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 결합량에 대한 미리 결정된 컷오프 값은 50.0 내지 200.0 ng/㎖ 범위 내일 수 있다. 바람직하게는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 결합량에 대한 미리 결정된 컷오프 값은 75.0 내지 150.0 ng/㎖ 범위, 더 바람직하게는 90.0 내지 120.0 ng/㎖ 범위, 가장 바람직하게는 적어도 118.9 ng/㎖이다. 이와 관련하여, 통계적 분석의 사용을 통해 50.0 내지 200.0 ng/㎖ 범위, 구체적으로 적어도 118.9 ng/㎖ 이상의 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 측정된 결합량이 암, 구체적으로 폐암, 예컨대, NSCLC에 걸릴 가능성이 있는 환자의 결정 요인일 수 있음이 발견되었다. 50.0 내지 200.0 ng/㎖, 구체적으로 적어도 118.9 ng/㎖ 범위의 통계적 컷오프 값을 가짐으로써, 본 발명의 방법을 이용하여 높은 신뢰 수준으로 암 진단의 예측을 제공하는 것이 가능하다. 구체적으로, 50.0 내지 200.0 ng/㎖ 범위, 구체적으로 적어도 118.9 ng/㎖ 이상의 값은 NSCLC 환자의 결정 요인일 수 있다. 이와 같은 통계적 컷오프 값의 적용으로 독립형 진단 분석 결과가 나오기 때문에 특히 유리하며; 즉, 진단적 결론에 도달하기 위해 건강한 개체 및/또는 암에 걸린 것으로 알려진 환자와의 임의의 직접적인 비교의 필요성을 제거한다. 신속하고 결정적인 예측은 환자가 더 이른 단계에서 치료를 받는 결과를 초래할 수 있으며, 이는 결국 전체 생존 가능성을 개선시키고/거나 입원 위험을 감소시킬 수 있다.

폐암, 구체적으로 NSCLC로 진단된 환자에서, C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 결합량에 대한 미리 결정된 컷오프 값은 암 병기의 표시를 제공하는 데 사용될 수 있다. C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열 번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 결합량에 대한 미리 결정된 컷오프 값은 40.0 내지 75.0 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 55.6 ng/㎖ 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 통계적 분석의 사용을 통해, 40.0 내지 75.0 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 55.6 ng/㎖ 이상 범위의 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)에 특이적인 단클론성 항체의 측정된 결합량은 III기 또는 IV기 NSCLC에서 말기 암에 걸릴 가능성이 있는 환자의 결정 요인일 수 있다. 40.0 내지 75.0 ng/㎖, 구체적으로 적어도 55.6 ng/㎖ 범위의 통계적 컷오프 값을 가짐으로써 본 발명의 방법을 이용하여 높은 신뢰 수준으로 암 병기와 진행의 예측을 제공하는 것이 가능하다. 구체적으로, 40.0 내지 75.0 ng/㎖, 바람직하게는 적어도 55.6 ng/㎖ 이상 범위의 값은 적어도 III기 NSCLC 환자의 결정 요인일 수 있다. 신속하고 결정적인 예측은 환자의 암 진행을 모니터링하고, 치료 효과를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있다. 컷오프 값이 사용은 치료 요법이 효과가 없고 암이 진행중인지 여부를 확인하는 데 도움이 될 수 있으므로, 초기 단계에서 대체 치료를 찾을 수 있으며, 이는 결국 전체 생존 가능성을 개선시킬 수 있다.

제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 단클론성 항체, 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 분석 키트에 관한 것이다:

- 스트렙타비딘 코팅 웰 플레이트;

- C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 N-말단 바이오티닐화 펩타이드; 및

- C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 교정용 펩타이드.

키트는 바람직하게는 본 발명의 제2 양태에 따른 방법과 함께 암의 위험을 진단하거나 예측하는 데 사용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 암은 췌장, 결장-직장, 신장, 위, 난소, 유방, 방광, 폐, 두경부, 전립선, 또는 간의 암 또는 흑색종, 더 바람직하게는 유방, 폐 또는 난소의 암, 구체적으로 폐암, 특히 비소세포폐암(NSCLC)이다.

정의

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 동의어로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 전체 항체 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 이의 단편, 예컨대, Fab 단편, Fv 단편, 또는 당업자에게 알려진 기타 이와 같은 단편을 모두 지칭한다. 동일한 결합 특이성을 유지하는 항체는 동일한 상보성-결정 영역(CDR)을 함유할 수 있다. 항체의 CDR은 Kabat et al.[38]에 의해 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

항체는 실시예에 기재된 바와 같이 B 세포 클론으로부터 생성될 수 있다. 항체의 아이소타입은 인간 IgM, IgG 또는 IgA 아이소타입, 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위부류에 특이적인 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 다른 적합한 방법이 아이소타입을 확인하는 데 사용될 수 있다.

생성된 항체의 아미노산 서열은 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, RNA는 세포로부터 단리되고 역전사에 의해 cDNA를 생성하는 데 사용될 수 있다. 그 다음 cDNA는 항체의 중쇄 및 경쇄를 증폭하는 프라이머를 사용하여 PCR에 적용된다. 예를 들어, 모든 VH(가변 중쇄) 서열에 대한 리더 서열에 특이적인 프라이머는 미리 결정된 아이소타입의 불변 영역에 위치한 서열에 결합하는 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 경쇄는 V 카파 또는 V 람다 리더 서열에 어닐링하는 프라이머와 함께 카파 또는 람다 사슬의 3' 말단에 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 전장 중쇄 및 경쇄를 생성하고 서열결정할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "C-말단"은 폴리펩타이드의 말단, 즉 폴리펩타이드의 C-말단 단부를 지칭하고, 이의 일반적인 방향에서의 의미로 해석되어서는 안 된다. 유사하게, 용어 "N-말단"은 폴리펩타이드의 말단, 즉 폴리펩타이드의 N-말단 단부를 지칭하고, 이의 일반적인 방향에서의 의미로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어, 용어 "경쟁적 면역에세이"는 샘플에 존재하는 표적 펩타이드(존재하는 경우)가 항체에 대한 결합을 위해 알려진 양의 펩타이드 표적(이는, 예를 들어 고정된 기질에 결합되거나 표지화됨)과 경쟁하는 면역에세이를 지칭하며, 이는 당업자에게 알려진 기법이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "ELISA"(효소-결합 면역흡착 분석법)는 샘플에 존재하는 표적 펩타이드(존재하는 경우)가 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소에 연결된 항체를 사용하여 검출되는 면역에세이를 지칭한다. 그 다음 효소의 활성은 측정 가능한 생성물을 생성하는 기질과 함께 인큐베이션함으로써 평가된다. 이에 의해 샘플에서 표적 펩타이드의 존재 및/또는 양이 검출 및/또는 정량화될 수 있다. ELISA는 당업자에게 알려진 기법이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "결합량"은 단클론성 항체와 표적 펩타이드 사이 결합의 정량화를 지칭하며, 상기 정량화는 생체액 샘플에서 표적 펩타이드의 측정된 값을 검량선과 비교함으로써 결정되며, 여기서 검량선은 알려진 농도의 표적 펩타이드의 표준 샘플을 사용하여 생성된다. C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 생체액 표적 펩타이드를 측정하는 본 명세서에 개시된 특정 분석법에서, 검량선은 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1, (그리고 이는 구체적으로 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)로 이루어질 수 있음))을 갖는 알려진 농도의 교정용 펩타이드의 표준 샘플을 사용하여 생성된다. 생체액 샘플에서 측정된 값은 샘플에서 표적 펩타이드의 실제 양을 결정하기 위해 검량선과 비교된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PRO-C19"는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 XIX형 콜라겐을 지칭한다.

본 발명은 다음 도면을 참조하는 하기 실시예에서 설명될 것이다:
도 1은 PRO-C19 분석 특이성을 나타내는 도면. 표준 펩타이드(SHAHQRTGGN 서열번호 1), 연장된 펩타이드(SHAHQRTGGNA 서열번호 3), 절단된 펩타이드(SHAHQRTGG 서열번호 4)뿐만 아니라, 넌센스 표준 펩타이드(GVAPGIGPGG 서열번호 5) 및 넌센스 코터 펩타이드(바이오틴-GVAPGIGPGG)에 대한 저해 곡선. 펩타이드를 연속으로 2배로 희석하여 항체 결합에 대해 경쟁하는 펩타이드의 경향을 평가하였다. 신호는, 대수 규모에서 펩타이드 농도의 함수로서, 분석 완충액에 해당하는 배경 흡광도(B0)의 일부로 나타난다. 오차 막대는 중복 측정의 표준 편차를 표시한다.
도 2는 PRO-C19 병렬성을 나타내는 도면. 희석물의 선형성 또는 병렬성을 평가하기 위해 2배로 희석된 표준 펩타이드 및 인간 혈청 샘플에 대한 저해 곡선. 신호는, 희석 단계에 따라서, 분석 완충액에 해당하는 배경 흡광도(B0)의 일부로 나타난다. 오차 막대는 중복 측정의 표준 편차를 표시한다.
도 3은 코호트 1의 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=38) 및 NSCLC(n=11), 난소(n=8), SCLC(n=7), 유방(n=12), 결장(n=7), 췌장(n=2), 전립선(n=13), 흑색종(n=6), 위(n=9)를 포함한 다양한 암 유형의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. PRO-C19 수준의 차이는 던네트 검증(Dunnett test)을 이용한 다중 비교를 위해 보정된 일반 일원 분산분석(ANOVA)에 의해 평가되었다. ****는 0.0001 미만의 p-값을 표시한다. ***는 0.001 미만의 p-값을 표시한다. ** 0.01 미만의 p-값을 표시한다.
도 4는 코호트 2의 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=24) 및 NSCLC(n=40)의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. PRO-C19 수준의 차이는 양측 비대응표본 t-검증(two-tailed unpaired t-test)에 의해 평가되었다. ****는 0.0001 미만의 p-값을 표시한다.
도 5는 코호트 2의 병기에서 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=24) 및 NSCLC III기(n=20) 및 IV기(n=20)의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. PRO-C19 수준의 차이는 던네트 검증을 이용한 다중 비교를 위해 보정된 일반 일원 분산분석(ANOVA)에 의해 평가되었다. ****는 0.0001 미만의 p-값을 표시한다.
도 6은 코호트 3의 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=30) 및 NSCLC(n=34)의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. PRO-C19 수준의 차이는 양측 비대응표본 t-검증에 의해 평가되었다. ****는 0.0001 미만의 p-값을 표시한다.
도 7은 코호트 3의 병기에서 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=30) 및 NSCLC I기(n=10), II기(n=10), III기(n=9) 및 IV기(n=5)의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. PRO-C19 수준의 차이는 던네트 검증을 이용한 다중 비교를 위해 보정된 일반 일원 분산분석(ANOVA)에 의해 평가되었다. **는 0.01 미만의 p-값을 표시한다.
도 8은 코호트 4의 PRO-C19를 나타내는 도면. 건강한 대조군(n=33) 및 췌장암(n=20), 결장직장암(CRC, n=20), 신장암(n=20) 위암(n=20), 난소암(n=20), 유방암(n=20), 방광암(n=20), 폐암(n=20), 흑색종(n=20), 두경부암(H&N, n=20), 전립선암(n=20) 및 간암(n=3)의 혈청에서 PRO-C19의 정량화. PRO-C19 수준이 로그 변환되었으며 평균 및 표준 편차로 제시되어 있다. LLMR 미만으로 측정된 샘플에는 PRO-C19의 검증에서 결정된 바와 같이, LLMR 값이 제공되었다. 암과 건강한 대조군 사이의 PRO-C19 수준의 차이는 던네트 검증을 이용한 다중 비교를 위해 보정된 일반 일원 분산분석에 의해 평가되었다. ****는 암과 건강한 대조군 사이의 비교를 위해 0.0001 미만의 p-값을 표시한다.

방법

PRO-C19 ELISA 프로토콜:

XIX형 콜라겐(UniProtKB: Q14993)의 C-말단에서 발견되는 10개의 아미노산 펩타이드 ₁₁₃₃SHAHQRTGGN₁₁₄₂(서열번호 1)를 Genscript(미국 뉴저지주 피스카타웨어 소재)에서 구입하여 면역화에 사용하였다. 단클론성 항체의 생산은 다른 곳에 기재하였다²⁴. 분석 완충액, 인큐베이션 시간 및 온도뿐만 아니라, 항체 및 펩타이드 농도의 선택을 포함하여 ELISA에 여러 최적화가 이루어졌다. 최종 PRO-C19 프로토콜을 다음과 같이 수행하였다: 96-웰 스트렙타비딘-코팅 ELISA 플레이트를 분석 완충액(25 mM TBS, 1% BSA(w/v), 0.1% Tween-20(w/v), 2 g/ℓ NaCl, pH 8.0)에 용해된 100 ㎕/웰의 2.5 ng/㎖ 바이오티닐화 SHAHQRTGGN 펩타이드로 코팅하고 300 RPM에서 진탕하면서 20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액(25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2)으로 5회 세척한 후, 20 ㎕/웰의 샘플을 이중으로 첨가한 다음, 분석 완충액 중 100 ㎕/웰의 60 ng/㎖ HRP-표지화 단클론성 항체를 첨가하고 300 RPM에서 진탕하면서 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 두 번째 세척 주기 후, 100 ㎕/웰의 TMB를 첨가하고 300RPM에서 진탕하면서 20℃의 어둠 속에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕/웰의 1% H₂SO₄를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 650 nm를 참조로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선을 생성하기 위해, 20 ㎕/웰의 2배로 연속 희석된 500 ng/㎖ SHAHQRTGGN(서열번호 1) 펩타이드를 적절한 웰에 첨가하고 4-매개변수 수학적 피팅을 사용하여 곡선을 생성하였다. 각각의 플레이트는 1가지 인간 혈청, 1가지 말 혈청, 1가지 소 연골 외식편 및 2가지 분석 완충제 중 펩타이드의 샘플을 포함하는 5개의 품질 관리 샘플을 포함하여 분석 내 및 분석 간 변동을 모니터링하였다.

PRO-C19 ELISA의 기술 검증:

표준 펩타이드(SHAHQRTGGN - 서열번호 1), 연장된 펩타이드(SHAHQRTGGNA - 서열번호 3), 절단된 펩타이드(SHAHQRTGG - 서열번호 4)뿐만 아니라, 넌센스 표준 펩타이드(GVAPGIGPGG 서열번호 5) 및 넌센스 코터 펩타이드(바이오틴-GVAPGIGPGG)의 2배 희석물에 의한 신호의 저해에 의해 항체 특이성을 테스트하였다. 인간 혈청 샘플을 2배로 연속적으로 희석하고 희석물에 대한 회수 백분율을 계산함으로써 선형성 또는 병렬성을 테스트하였다. 표준 펩타이드를 인간 혈청 샘플에 스파이킹하고(spiking) 스파이킹된 샘플에서 펩타이드 회수 백분율을 계산함으로써 정확도를 테스트하였다. 헤모글로빈, 지질 및 바이오틴을 포함한 일반적인 간섭 물질의 영향을 높거나 낮은 농도의 간섭 작용제(헤모글로빈 낮음=2.5 ㎎/㎖, 높음=5 ㎎/㎖; 지질 낮음=1.5 ㎎/㎖, 높음=5 ㎎/㎖; 바이오틴 낮음=3 ng/㎖, 높음=9 ng/㎖)가 스파이킹된 인간 혈청에서 평가하였다. 스파이킹되지 않은 샘플에 대한 스파이킹된 샘플의 회수 백분율로서 분석 간섭을 계산하였다. 이중 결정에서 실행되는 10개의 품질 관리 샘플을 사용하여 10개의 독립적 실행으로 분석 변동을 테스트하였다. 품질 관리 샘플 중 5개는 인간 혈청, 1개는 말 혈청, 1개는 소 연골 외식편, 3개는 다양한 농도의 분석 완충액 중 표준 펩타이드였다. 10회 실행 각각의 이중 결정에 대한 평균 분산 계수(CV%)로 분석 내 변동을 계산하였다. 10회 실행에 걸친 전체 CV%로 분석 간 변동을 계산하였다. 10개의 독립적인 실행에 걸쳐 측정 범위의 하한 및 상한(각각, LLMR 및 ULMR)을 결정하였으며 표준 곡선의 선형 범위 경계를 나타낸다. 2, 4, 24 또는 48시간 동안 4 또는 20℃에서 인큐베이션한 3개의 인간 혈청 샘플에 대해 분석물의 안정성을 결정하였다. -20℃에서 유지된 대조군 샘플에 대한 인큐베이션된 샘플의 회수 백분율로 안정성을 계산하였다. 최대 4 사이클까지 인간 혈청 샘플을 동결 및 해동함으로써 동결-해동 안정성을 평가하였다. 1회의 동결-해동 주기를 거친 샘플에 대한 해동된 샘플의 회수 백분율로 안정성을 계산하였다. 3개의 표준 편차가 추가된 분석 완충액을 함유하는 21개의 블랭크 샘플의 평균 농도로 검출 하한을 계산하였다. 3개의 표준 편차를 뺀 10개의 독립적인 실행에 걸쳐 표준 곡선의 최고 농도에 해당하는 표준 펩타이드의 평균 농도로 검출 상한을 계산하였다.

환자 샘플:

제1 코호트는 상업적 공급업체인 Asterand Bioscience(미국 미시간주 디트로이트 소재)로부터 입수하였다. 이는 유방암(n=12), 결장암(n=7), 위암(n=9), 흑색종(n=6), NSCLC(n=11), 난소암(n=8), 췌장암(n=2), 전립선암(n=13), 소세포폐암(SCLC)(n=7)을 포함하는 75명의 암 환자와 함께 상업적 공급업체인 Valley Biomedical(미국 버지니아주 윈체스터 소재)의 38명의 건강한 대조군 유래의 혈청을 포함하였다.

제2 및 제3 코호트는 상업적 공급업체인 Proteogenex(미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)로부터 부분적으로 입수하였다. 제2 코호트는 40명의 NSCLC 환자를 포함하였으며, 이 중 20명은 III기이고 20명은 IV기이었다. 이는 또한 Valley Biomedical로부터 입수한 24명의 건강한 대조군도 포함하였다. 제3 코호트는 34명의 NSCLC 환자를 포함하였으며, 이 중 10명은 I기, 10명은 II기, 9명은 III기, 5명은 IV기이었다. 또한 이는 Proteogenex 및 Valley Biomedical로부터 입수한 30명의 건강한 대조군을 포함하였다.

제4 코호트는 췌장암, 결장직장암, 신장암, 위암, 난소암, 유방암, 방광암, 폐암, 흑색종, 두경부암 및 전립선암 각각의 20명의 환자를 포함하였다. 이는 또한 3명의 간암 환자와 33명의 건강한 대조군을 포함하였다. 모든 암 샘플은 Proteogenex로부터 입수하였고 건강한 대조군은 BioIVT(미국 뉴욕주 웨스트버리 소재)로부터 입수하였다.

공급업체에 따르면, 샘플 수집은 임상 연구 심의 위원회(Institutional Review Board) 또는 독립적인 윤리 위원회(Independent Ethical Committee)의 승인을 받았으며 환자는 사전 동의를 제공하였다. 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 모든 조사를 수행하였다.

통계:

PRO-C19 수준을 로그 변환하고 다구스티노-피어슨(D'Agostino-Pearson omnibus) 옴니버스 테스트에 의해 정규성에 대해 테스트하였다. 비대응표본 양측 t-검증을 사용하여 건강한 대상체와 NSCLC 사이의 PRO-C19 수준과 NSCLC 하위유형 사이의 PRO-C19 수준의 비교를 수행하였다. 던네트 검증을 사용한 다중 비교를 위해 보정된 일반 일원 분산분석을 사용하여 여러 그룹에 걸친 PRO-C19 수준의 비교를 수행하였다. 비대응표본 양측 t-검증을 사용하여 그룹 간의 연령 차이를 평가하였다. 피셔의 정확도 검정(Fisher's exact test)을 사용하여 성별 및 인종의 차이를 평가하였다. 선형 회귀를 사용하여 PRO-C19 수준과 BMI, 연령, 흡연 및 샘플 수집 날짜 간의 상관관계를 평가하였다. 수신자 작용 특징 곡선 하의 면적(area under receiver operating characteristics(AUROC) curve)에 의해 진단 정확도를 테스트하였다. 유덴 지수(Youden Index)에 따라 추정된 최적의 컷오프 값에서 민감도 및 특이성을 결정하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 간주하였다. 별표는 다음 유의 수준을 표시한다: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. 다중 비교 테스트를 수행할 때, 다중도 조정 p-값을 기록한다. GraphPad Prism(Windows용 버전 8.2, GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재, www.graphpad.com) 및 MedCalc(MedCalc Statistical Software 버전 18.11.6, MedCalc Software bvba, 벨기에 오스텐더 소재; https://www.medcalc.org; 2019)로 통계 분석 및 그래프를 수행하였다.

결과

단클론성 항체에 대한 결합에 대해 경쟁하는 펩타이드의 숙련도에 의해 PRO-C19 분석의 특이성을 평가하였다. 테스트된 펩타이드는 표준 펩타이드(SHAHQRTGGN - 서열번호 1), 연장된 펩타이드(SHAHQRTGGNA - 서열번호 3), 절단된 펩타이드(SHAHQRTGG - 서열번호 4), 넌센스 펩타이드(GVAPGIGPGG - 서열번호 5) 및 넌센스 코터 펩타이드(바이오틴-GVAPGIGPGG)를 포함하였다. 표준 펩타이드만 용량 의존적으로 신호를 저해하였다(도 1은 PRO-C19 분석 특이성을 나타냄). 넌센스 코터 펩타이드는 검출 가능한 신호를 생성하지 않았다. 전체적으로, 이는 분석이 XIX형 콜라겐의 SHAHQRTGGN(서열번호 1) 에피토프에 특이적임을 표시한다.

PRO-C19 분석의 기술적 검증이 표 1에 요약되어 있다. 혈청 샘플이 1:4로 희석되면 희석물의 선형성 및 병렬성이 허용 가능하였으며, 이 후 평균 희석 회수율은 101.7%이었다(도 2). 혈청의 매트릭스 정확도는 1:4의 최종 희석에서 인간 혈청 샘플에 스파이킹된 표준 펩타이드를 사용하여 118.6%의 평균 스파이크 회수율로 허용 가능하였다. 헤모글로빈, 지질 및 바이오틴을 포함한 일반적인 간섭 작용제의 영향은 관찰되지 않았다. 분석 간 변동은 10.9%이었고 분석 내 변동은 6.6%이었다. 측정 범위는 3.31 내지 214.3 ng/㎖로, 검출 한계는 1.23 내지 443.5 ng/㎖로 결정되었다. 분석물의 안정성은 4℃에서 최대 24시간, 20℃에서 최대 4시간 동안 허용 가능하였다. 동결-해동 안정성은 4회 초과의 동결-해동 주기에 대해 허용 가능하였다.

암 맥락에서 PRO-C19의 유용성을 탐색하기 위해, 12명의 유방암 샘플, 7명의 결장암, 9명의 위암, 6명의 흑색종, 11명의 NSCLC, 8명의 난소암, 2명의 췌장암, 13명의 전립선암, 7명의 SCLC를 포함한 다양한 암 유형뿐만 아니라, 38명의 건강한 대조군으로 이루어진 코호트에서 PRO-C19를 평가하였다(표 2). 암 그룹에서 PRO-C19 수준과 연령, BMI 또는 흡연 이력 사이에는 유의한 연관성이 없었다. PRO-C19 수준은 NSCLC(p<0.0001), SCLC(p=0.0081), 유방암(p=0.0005) 및 난소암(p<0.0001)에서 유의하게 상승하였다(도 3). 유의하지는 않았지만, 건강한 대조군과 비교하여 결장암 및 췌장암 그룹도 또한 평균 PRO-C19 수준이 더 높은 반면, 위암은 평균 PRO-C19 수준이 더 낮았다. 컷오프가 63.3 ng/㎖인 PRO-C19는 0.995의 AUROC로 건강한 대상체와 비소세포폐암을 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 100%이고 특이성은 94.74%이었다(표 5). PRO-C19는 또한 54.3 ng/㎖의 컷오프에서 0.808의 AUROC로 건강한 대상체와 SCLC를 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 71.4%이고 특이성은 84.2%이었다. PRO-C19는 또한 41.85 ng/㎖의 컷오프에서 0.814의 AUROC로 건강한 대상체와 유방암을 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 75%이고 특이성은 78.9%이었다. 마지막으로 PRO-C19는 60.31 ng/㎖의 컷오프에서 0.839의 AUROC로 건강한 대상체와 난소암을 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 75%이고 특이성은 92.1%이었다. 전반적으로, 콜라겐 XIX의 혈액 순환 수준은 여러 상이한 암 유형에서 상승된 것으로 보인다. 그 다음 NSCLC에서 PRO-C19의 역할을 탐구하였다.

20명의 III기 및 20명의 IV기 환자를 포함한 NSCLC 환자뿐만 아니라, 24명의 건강한 대조군으로 이루어진 코호트에서 PRO-C19를 평가하였다(표 3). 대조군은 NSCLC 그룹과 비교하여 상당히 더 젊고, 남성 비율이 더 작았으며, 백인 인종 비율이 더 작았다. NSCLC 그룹 자체 내에서, PRO-C19 수준과 샘플 수집 날짜, 성별, 연령, BMI, 흡연 이력, 종양 등급 또는 조직학적 하위유형(AC 및 SCC) 사이에는 유의한 연관성이 없었다. 평균 PRO-C19 수준은 대조군과 비교하여 NSCLC 그룹의 경우 최대 3.5배까지 유의하게 상승하였다(p<0.0001)(도 4). 55.6 ng/㎖의 컷오프에서, PRO-C19는 0.980의 AUROC로 건강한 대상체와 NSCLC을 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 97.5%이고 특이성은 91.67%이었다(표 5). III기 및 IV기로 나누어, 각각의 병기에 대한 PRO-C19 수준도 또한 건강한 대조군과 비교하여 유의하게 상승하였다(p<0.0001)(도 5). 이러한 결과는 PRO-C19 수준이 NSCLC 환자의 혈액 순환에서 상승된다는 것을 확인시켜준다.

다음으로, NSCLC의 초기 단계에서 PRO-C19의 사용을 탐구하였다. 이를 위해, 10명의 I기, 10명의 II기, 9명의 III기, 5명의 IV기를 포함한 NSCLC 환자뿐만 아니라, 30명의 건강한 대조군으로 이루어진 별도의 코호트에서 PRO-C19를 평가하였다(표 4). 대조군은 NSCLC 그룹과 비교하여 상당히 더 젊고, 백인 비율이 더 작았다. 두 그룹 간에 성별에는 유의한 차이가 없었다. NSCLC 그룹 내에서, 샘플 수집 날짜, 성별, 연령, BMI, 흡연 이력, 종양 등급 또는 조직학적 하위유형(AC 및 SCC)과 유의한 연관성이 없었다. 평균 PRO-C19 수준은 대조군과 비교하여 NSCLC에서 최대 2배까지 유의하게 상승되었다(p<0.0001)(도 6). 118.9 ng/㎖의 컷오프에서, PRO-C19는 0.823의 AUROC로 건강한 대상체와 NSCLC을 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 82.4%이고 특이성은 76.7%이었다(표 5). 개별 병기를 건강한 대조군과 비교하면, PRO-C19도 또한 건강한 대조군과 비교하여 II기(p=0.0011), III기(p=0.0012) 및 IV기(p=0.0041)에서 유의하게 상승되었다(도 7). 더 높은 병기에서 더 높은 평균 PRO-C19 수준을 향하는 경향이 있었다. NSCLC의 조기-검출 마커로서 PRO-C19를 평가하기 위해, I+II기의 진단 정확도를 평가하였다. PRO-C19는 118.9의 컷오프에서 0.762의 AUROC로 건강한 대상체와 I+II기를 구별할 수 있었으며, 이 때 해당 민감도는 70.0%이고 특이성은 76.7%이었다(표 5). 96.7%의 더 높은 특이성에서 민감도는 35%로 떨어졌다.

마지막으로, 20명의 췌장암, 결장직장암(CRC), 신장암, 위암, 난소암, 유방암, 방광암, 폐암, 흑색종, 두경부(H&N) 암, 전립선암 및 마지막으로 3명의 간암 환자뿐만 아니라, 33명의 건강한 대조군을 포함하는 별도의 암 코호트에서 PRO-C19를 평가하였다(표 6). 암과 건강한 대조군 간에 연령 또는 성별 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 암 샘플은 오로지 백인 환자 유래의 것인 반면, 건강한 대조군은 백인, 흑인 및 히스패닉 인종이 혼합되어 있었다. 샘플 수집 날짜, 성별, 연령 또는 BMI와 PRO-C19 수준의 유의한 연관성은 없었다. 평균 PRO-C19 수준은 대조군과 비교하여 모든 암에서 유의하게 상승되었다(도 8). PRO-C19는 일반적으로 모든 암 유형에 대해 건강한 대상체와 암을 구별하는 데 탁월하였다. 이는 표 7에 요약되어 있다.

논의

현재 연구는 PRO-C19로 명명된 XIX형 콜라겐의 C-말단을 측정하는 ELISA의 기술적 검증을 입증한다. PRO-C19는 의도된 에피토프에 특이적이었고 기술적으로 강력하였다. 생물학적 관련성과 바이오마커 잠재력을 입증하기 위해 건강한 개체와 암 환자 유래의 혈청 샘플 패널에서 PRO-C19를 평가하였다. PRO-C19 수준은 여러 유형의 암에서 유의하게 상승되었으며, NSCLC와 건강한 개체를 구별하는 데 탁월함이 입증되었고, NSCLC의 초기 단계에서 중간 정도의 진단 정확도를 나타내었다.

인간 성인에서, 콜라겐 XIX 발현은 XIX형 콜라겐이 차지하는 탯줄 조직의 건조 중량의 10^-6%에 의해 예시되는 바와 같이 매우 제한될 수 있다²⁵. 그러나, 상이한 조직 추출물과 생물학적 유체에서 콜라겐 XIX를 정량화하는 별도의 연구에서는 상기 콜라겐이 혈액 순환에서 검출 가능함을 발견하였다²⁶. 데이터를 기반으로 하면, 콜라겐 XIX는 건강한 성인의 혈액 순환으로 적당한 양으로 방출되며 순환하는 콜라겐 XIX 수준은 일부 암 유형에서 상당히 증가된다. 콜라겐 XIX는 이전에 유방암 진행과 관련이 있었다. 이와 관련하여, 유방암이 진행되는 동안 유방암을 둘러싼 BMZ가 분해됨에 따라, 콜라겐 XIX 단백질의 염색도 또한 손실되었다¹³. 콜라겐 XIX 발현은 일반적으로 BMZ와 강하게 연관되어 있으며 유방의 상피 및 혈관 BMZ의 분해는 XIX형 콜라겐의 혈액 순환으로의 방출을 야기할 수 있었다. 데이터를 기반으로 하면, 순환 콜라겐 XIX 수준의 증가도 또한 유방암과 관련이 있다. 예를 들어, 상이한 종양 유형의 BMZ 조직에는 뚜렷한 차이가 있을 수 있다. 상피 BMZ는 유방의 침습성 암종 주변에서 분해되는 반면, 결장, 전립선 및 폐 상피 악성 종양의 침습성 샘 주위에는 손상되지 않은 채로 남아 있을 수 있다^13,27. 콜라겐 XIX 정량화에 대한 이러한 접근법의 한계는 종양이 발견된 조직이 원인 제공자인 가능성이 있음에도 불구하고 공급원 조직을 결정할 수 없다는 것이다.

콜라겐 XIX는 또한 근위축성 측색 경화증(ALS) 및 파킨슨병을 포함한 신경퇴행성 질환과 관련이 있었다. 콜라겐 XIX 발현은 파킨슨병 환자의 말초 혈액에서 하향조절된다³⁵. 대조적으로, ALS에서 콜라겐 XIX는 질병이 진행됨에 따라 증가하고 사망 위험이 증가하였다^18,36,37. 따라서 PRO-C19 분석은 또한 근위축성 측색 경화증(ALS) 및 파킨슨병을 포함한 신경퇴행성 질환을 검출하고 진단하는 데에도 사용될 수 있었다.

폐암과 관련된 XIX형 콜라겐의 존재는 이전에 입증되지 않았다. 이는 마우스 배아의 폐에서 적당한 양으로 관찰된 반면, 성체에서는 미량만 관찰되었으며, 이는 폐에서 콜라겐 XIX의 발달 역할을 시사할 수 있다¹¹. 이와 같은 발현 패턴은 암 진행에 중요한 여러 단백질 및 경로에서 보이며, 실제로 EMT를 포함하여 발달 과정의 여러 양태가 종양형성 동안 재활성화된다. 따라서 발달에서의 역할은 암에서의 역할도 또한 암시할 수 있다^28-30.

항종양 특성을 콜라겐 XIX에 할당하였다. 흥미롭게도, NC1 도메인은 일단 절단되면, 흑색종에서 침습 및 혈관신생을 저해할 수 있다²². 이는 NC1(XIX) 펩타이드가 종양 성장을 저해하고 NC1(XIX) 펩타이드가 MMP-14 및 VEGF 저해에 의한 혈관신생을 저해하는 생체 내 마우스 모델에서 입증되었다²⁰. 나중에 NC1(XIX) 신호전달이 αvβ3 인테그린에 의해 매개될 가능성이 있다는 것이 발견되었다³¹. 별도의 연구에서, NC1(XIX) 펩타이드가 α5β1 인테그린을 통해 저해성 신경 말단의 형성을 촉진시킬 수 있음이 입증되었다²³. 이러한 인테그린 수용체는 상피 및 내피 폐 세포 둘 모두에서 발현되고 NSCLC에서 역할을 하므로, 폐암에서 NC1(XIX) 펩타이드의 효과를 보는 것은 흥미로울 것이다^32~34.

PRO-C19 분석은 플라스민 절단 및 NC1 도메인의 후속 방출 동안 생성된 네오-에피토프에 대해 특이적이지 않다. 그러나, 이는 C-말단 에피토프를 함유하는 임의의 단편을 정량화할 수 있다. 콜라겐 XIX가 절단되거나 그 외에 처리되는 방법에 대한 지식이 부족하므로, PRO-C19는 모두 C-말단 에피토프를 함유하는 콜라겐 XIX 단편의 크고 다양한 집단을 가설적으로 측정할 수 있다. 콜라겐 XIX가 처리되는 방법과 혈액 순환에서 임의의 단편을 정량화할 수 있는지에 대한 추가 조사가 정당한 것으로 인정된다. 플라스민 절단 동안 생성된 네오-에피토프에 대해 특이적인 별도의 분석이 이와 관련하여 도움이 될 수 있다.

진단 정확도 측면에서, PRO-C19는 NSCLC 환자의 I기 및 II기에서 적당하게 수행하였다. 작은 샘플 크기를 고려해 볼 때, 상대적으로 넓은 신뢰 구간은 불량 진단 성능에 해당하는 0.62에서 우수한 성능에 해당하는 최대 0.87까지 범위의 AUC 값을 포함하였다. PRO-C19의 진단 정확도를 검증하고 정확히 보이기 위한 후속 연구가 필요하다. 추가적으로, 진단 테스트가 보통 가장 관련성이 높은 95% 초과의 높은 특이성, 초기 NSCLC에서 PRO-C19의 민감도는 35%로 떨어졌다. 향후 연구에서는 전체 정확도를 개선하기 위해 PRO-C19를 다른 NSCLC 바이오마커와 결합하는 것도 또한 조사해야 한다. 또한, 조기 발견에 대한 향후 연구는 최종 NSCLC 진단 전에 고위험 개체에서 PRO-C19를 평가할 수도 있다.

이 연구에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있다: 이 연구의 엄격한 탐색적 특성을 고려해 볼 때, 소위 "편의의 샘플"과 사후 분석의 사용은 편향을 유도할 수 있다. 숫자로 볼 때, 이러한 편향은 비교 그룹의 샘플 크기, 연령, 성별 및 인종의 차이에 의해 입증된다. 연구 참가자의 임상 데이터도 제한적이므로 추가적인 숨겨진 편향이 또한 발생할 수 있다. 따라서 이 연구의 결과와 결론은 단지 암에서 콜라겐 XIX의 생물학을 조사하려는 본 발명자들의 첫 번째 시도일 뿐이다.

결론적으로 PRO-C19로 명명된 XIX형 콜라겐의 C-말단을 표적으로 하는 ELISA를 개발하고 검증하였다. PRO-C19는 암 환자의 혈청에서 콜라겐 XIX를 정량화하는 데 사용되었으며, 여기서 건강한 대조군과 비교하여 조사된 모든 암 유형에서 유의하게 상승되었다. 2개의 개별 NSCLC 코호트에서 PRO-C19를 후속적으로 평가하였으며, 여기서 이는 또한 초기 NSCLC에서도 유의하게 상승되고 중간 정도의 진단 정확도를 나타내었다. 전체적으로, PRO-C19와 콜라겐 XIX는 암 바이오마커로서의 잠재력을 나타낸다.

참고문헌

<110> Nordic Bioscience A/S <120> Type XIX collagen Assay <130> 2022-FPA-1724 <150> GB2004195.0 <151> 2020-03-23 <160> 5 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Ser His Ala His Gln Arg Thr Gly Gly Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> X = any amino acid <400> 2 Ser His Ala His Gln Arg Thr Gly Gly Asn Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ser His Ala His Gln Arg Thr Gly Gly Asn Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Ser His Ala His Gln Arg Thr Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly 1 5 10

Claims

C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단클론성 항체.
청구항 1에 있어서,
상기 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 합성 펩타이드에 대해 생성된 단클론성 항체인 단클론성 항체.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNX(서열번호 2)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않고, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내는 단클론성 항체.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNA(서열번호 3)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 단클론성 항체.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGG(서열번호 4)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 단클론성 항체.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 GVAPGIGPGG(서열번호 5)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 단클론성 항체.
인간 생체액 샘플에서 XIX형 콜라겐을 검출하기 위한 면역에세이 방법으로서,
상기 방법은 인간 생체액 샘플을 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 단클론성 항체와 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 단클론성 항체와 펩타이드 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 검출은 정량적인 방법.
청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
상기 면역에세이는 경쟁적 면역에세이인 방법.
청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 합성 펩타이드에 대해 생성된 단클론성 항체인 방법.
청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNX(서열번호 2)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않고, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내는 방법.
청구항 7 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNA(서열번호 3)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 방법.
청구항 7 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGG(서열번호 4)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 방법.
청구항 7 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 GVAPGIGPGG(서열번호 5)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 방법.
청구항 7 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 생체액 샘플은 암을 나타내는 의학적 징후 또는 증상을 갖는 인간 환자 유래의 것인 방법.
청구항 7 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 환자의 암 가능성을 진단 및/또는 모니터링 및/또는 평가하기 위한 면역에세이 방법이고, 상기 방법은 상기 환자로부터 수득한 생체액 샘플을 단클론성 항체와 접촉시키는 단계, 샘플 내의 단클론성 항체와 펩타이드 사이의 결합량을 검출 및 결정하는 단계, 및 상기 결합량을 정상적인 건강한 대상체와 연관된 값 및/또는 알려진 질환 중증도와 연관된 값 및/또는 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값과 상관시키는 단계를 포함하는 방법.
청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
상기 암은 유방, 폐, 결장, 결장직장, 두경부, 신장, 간, 췌장, 전립선, 위, 흑색종, 방광 또는 난소의 암인 방법.
C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단클론성 항체, 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 분석 키트:
- 스트렙타비딘 코팅 웰 플레이트;
- C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 N-말단 바이오티닐화 펩타이드; 및
- C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 교정용 펩타이드.
청구항 18에 있어서,
상기 단클론성 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGN(서열번호 1)을 갖는 합성 펩타이드에 대해 생성된 단클론성 항체인 분석 키트.
청구항 21 또는 청구항 22에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNX(서열번호 2)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않고, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타내는 분석 키트.
청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGGNA(서열번호 3)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 분석 키트.
청구항 18 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 SHAHQRTGG(서열번호 4)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 분석 키트.
청구항 18 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 C-말단 아미노산 서열 GVAPGIGPGG(서열번호 5)를 갖는 펩타이드를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 분석 키트.