WO2017131488A1 - 이소프렌의 생산 방법 - Google Patents

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WO2017131488A1
WO2017131488A1 PCT/KR2017/000990 KR2017000990W WO2017131488A1 WO 2017131488 A1 WO2017131488 A1 WO 2017131488A1 KR 2017000990 W KR2017000990 W KR 2017000990W WO 2017131488 A1 WO2017131488 A1 WO 2017131488A1
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WO
WIPO (PCT)
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isoprene
coli
seq
gene encoding
gene
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PCT/KR2017/000990
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English (en)
French (fr)
Inventor
김선원
김정헌
차명석
장희정
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경상대학교산학협력단
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing isoprene.
  • Isoprene is a major component of natural rubber and a base chemical for synthetic rubber production. Isoprene is mainly used to make tires, medical supplies and adhesives. Currently, isoprene is obtained through the refining process of petroleum, and isoprene prices are steadily rising due to the recent fluctuations in petroleum prices, refining processes focusing on the production of fuel materials excluding isoprene, and increasing demand for synthetic rubber. In addition, isoprene can be used as a transport fuel and jet fuel, and has high energy efficiency and low greenhouse gas emission compared to other biofuels, making it suitable as a drop-in biofuel.
  • isoprene using microorganisms is very high in purity and does not require a high level of purification, it can be produced from renewable resources and low cost raw materials, and can be easily converted into biofuels and biochemicals.
  • isoprene is made from isoprene synthase with precursors of DMAPP made from the MVA and MAP pathways (FIG. 1). Since the first reports of isoprene production and release from poplar and willow species, research on isoprene release mechanisms and related enzymes in plants has continued, but studies on isoprene production and microbial isoprene production in microorganisms It's only recently.
  • isoprene has been produced from a microbial host by combining isoprene synthase with the mevalonate pathway, a precursor biosynthetic pathway, and simply optimizing these pathways through metabolic engineering.
  • This technique does not consider the overall metabolic pathway efficiency of isoprene-producing host microorganisms, resulting in higher production costs due to lower isoprene production yields compared to the input carbon substrate.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing isoprene that can maximize the isoprene productivity by engineering the intrinsic metabolic pathway of E. coli.
  • a method for producing isoprene according to an embodiment of the present invention includes a step of culturing E. coli, which has isoprene production ability and has attenuated or deleted a gene encoding a recA (recombinase A) protein, in a medium containing a carbon source.
  • E. coli strains such as DH5 ⁇ , MG1655, BL21 (DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 are widely used in the production of enzymes by biotransformation reaction, of which DH5 ⁇ is used in productivity.
  • the DH5 ⁇ strain is a thiamin biosynthetic gene deletion strain, there is a problem that can not produce thiamin by itself. Therefore, there is a cost burden of adding thiamin to the medium when using DH5 ⁇ .
  • MG1655 has a disadvantage in that the growth rate is high while the isoprene material production rate is slow.
  • the present inventors studied what factors caused the difference in the production rate of isoprene material between E. coli and discovered that the recA protein is a factor influencing the isoprene production rate.
  • the recA protein is about 38 kDa protein required for repair and maintenance of DNA damage. It activates by binding to single stranded DNA in the presence of ATP, indicating the action of ATPase, and partially rewinding the double stranded DNA to complement the outer strand. It is known to induce DNA combination by forming hydrogen bond with.
  • the inventors of the present invention devised the present invention by focusing on the fact that E. coli, which is deficient in the recA protein, exhibited higher isoprene production.
  • the term “attenuation” refers to a decrease in the expression of the gene of interest compared to the parent strain.
  • deletion refers to the loss of expression of a gene of interest.
  • Such attenuation or deletion may be caused by mutations in the gene sequence, eg, substitutions, deletions, insertions or combinations thereof.
  • the attenuation or deletion may be caused by a change in the sequence of the gene regulatory moiety, eg, substitution, deletion, insertion or combination thereof.
  • the Escherichia coli may be, for example, DH5 ⁇ , MG1655, BL21 (DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113, or a combination thereof, and may be preferably MG1655 in terms of cell growth rate and isoprene productivity.
  • the gene encoding the recA protein may be a gene encoding the recA protein of the E. coli strain. This is known from the NCBI genbank and the like.
  • the gene encoding the recA protein of the MG1655 strain may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 76.
  • E. coli has isoprene production capacity.
  • E. coli having an isoprene producing ability refers to a microorganism that expresses enzymes necessary for isoprene production or that genes encoding these enzymes are introduced to express these enzymes.
  • the recA protein is involved in DNA homologous recombination. If a gene encoding an enzyme necessary for isoprene production is introduced herein, they are not homologous to the E. coli native gene and homologous recombination cannot occur. Isoprene production increased. In other words, the increase in isoprene production is believed to be caused by a separate pathway rather than by DNA homologous recombination inhibition. This was not observed in other isoprenoids other than isoprene.
  • Enzymes required for isoprene production include, for example, enzymes involved in the isoprene synthase and mevalonate pathways.
  • the Escherichia coli may have a gene encoding isoprene synthase derived from Populus trichocarpa of SEQ ID NO: 1 as an gene encoding isoprene synthase, or may be internally or by introduction of a gene encoding isoprene synthase.
  • Introduction of the gene encoding isoprene synthase can be carried out, for example, by transforming E. coli with a plasmid enriched in the corresponding ribosomal binding site.
  • the ribosomal binding site is a site where mRNA binds to ribosomes at the start of protein biosynthesis. If the ribosomal binding site is strengthened, the expression of isoprene synthase may increase.
  • Enhancement of the ribosomal binding site can be performed, for example, by improving the value of Translation Initiation Rate (TIR) of the ribosomal binding site sequence.
  • TIR Translation Initiation Rate
  • the gene encoding the isoprene synthase may be introduced into a plasmid having a transcription initiation ratio value of a corresponding ribosome binding site sequence of 3,000 au or more.
  • 5,000 au more preferably 10,000 au, more preferably 30,000 au.
  • the expression level of isoprene synthase can be significantly increased.
  • the upper limit is not particularly limited but may be, for example, 100,000 au.
  • Transcription start ratio values can be adjusted by altering the sequence between the ribosomal binding site and the transcription start time. For example, in the case of a gene encoding isoprene synthase derived from Populus trichocarpa of SEQ ID NO: 1, the sequence from the ribosome binding site and the ATG, which is the transcription start point, is transferred to the existing AGGAAACAGACC (transcription start ratio value 217 au). Can be adjusted by changing to AGGAGGTAATAAACC (39,327 au).
  • pTrc99SN vector enriched by altering the ribosomal binding site sequence in the pTrc99A vector to AGGAGGTAATAAACC to increase expression of isoprene synthase from Populus trichocarpa of SEQ ID NO: 1, It is not limited.
  • a sequence having a specific transcription start ratio value for a specific gene may be generated using the Reverse Engineer RBSs program of https://www.denovodna.com.
  • FIG. 1 shows an isoprene biosynthetic pathway including a mevalonate (MVA) pathway and a map (MEP) pathway.
  • MVA mevalonate
  • MEP map
  • the enzymes involved in the mevalonate pathway are acetoacetyl-CoA synthase / HMG-CoA reductase, HMG. -CoA synthase, mevalonate kinase, mevalonate diphosphate carboxylase, phosphomevalonate kinase and isoprenyl pyrophosphate isomerase.
  • the Escherichia coli may be, for example, an enzyme that is involved in the methalonate pathway of Enterococcus or Streptococcus or a combination thereof.
  • a gene encoding an enzyme involved in the mevalonate pathway which encodes an enzyme having the functions of both acetoacetyl-CoA synthase and HMG-CoA reductase from Enterococcus faecalis of SEQ ID NO: 2
  • gene encoding mevalonate kinase from Streptococcus pneumoniae of SEQ ID NO: 4 A gene encoding a mevalonate diphosphate carboxylase derived from Streptococcus pneumoniae of SEQ ID NO: 5 and a phosphomevalonate kinase derived from Streptococcus pneumoniae of SEQ ID NO: 6 Isoprenyl wave from E. coli MG1655 (Escherichia coli MG1655)
  • the gene encoding the irophosphate isomerase may be either internally or by introduction
  • the gene encoding the enzyme involved in the mevalonate pathway may be amplified or introduced into the amplified state through the vector.
  • the expression of enzymes involved in the mevalonate pathway can be increased to provide sufficient DMAPP for cell growth.
  • amplification refers to an increase in gene copy and / or an increase in the expression level of a gene.
  • the amplification may be in one aspect by introducing a foreign gene or by increasing the number of copies of an endogenous gene.
  • a promoter or a ribosomal binding site (RBS) may be substituted to increase the expression level of the gene for the amplification.
  • E. coli is a gene encoding an enzyme involved in the mevalonate pathway, a gene encoding isoprenyl pyrophosphate isomerase derived from Synechocystis sp. PCC6803 of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: Gene coding for isoprenyl pyrophosphate isomerase from Streptococcus pneumoniae of 9 and isoprenyl pyrophosphate from Haematococcus plavialis of SEQ ID NO: 10 It may further have a gene selected from among the genes encoding isomerase, either internally or by introduction, preferably isoprenyl pyrophosphate isomer derived from Synechocystis sp. PCC6803 of SEQ ID NO: 8 It may further have a gene encoding the agent.
  • the E. coli may have a gene encoding a fusion protein of isoprene synthase and isoprenyl pyrophosphate isomerase instead of a gene encoding a gene encoding isoprene synthase.
  • isoprene production capacity can be further improved.
  • the gene of interest can be obtained by designing the expression of one protein by cloning two genes in a vector. The order is not particularly limited, and the gene encoding isoprene synthase can be designed to be before or after the gene encoding isoprenyl pyrophosphate isomerase.
  • Escherichia coli isoprene synthase derived from Poplar tricocapa of SEQ ID NO: 11 in place of the gene encoding the gene encoding isoprene synthase from Populus trichocarpa of SEQ ID NO:
  • isoprenyl pyrophosphate isomerase SEQ ID NO: 7
  • isoprene synthase SEQ ID NO: 1 derived from poplar tricocapa.
  • the gene encoding isoprene synthase is the genetic code encoding isoprenyl pyrophosphate isomerase.
  • a gene encoding isoprene synthase (SEQ ID NO: 1) derived from poplar tricocapa (SEQ ID NO: 13) and a fusion protein of cinecocistis isoprenyl pyrophosphate isomerase (SEQ ID NO: 8)
  • the gene encoding the synthase precedes the gene encoding isoprenyl pyrophosphate isomerase) or the cineco cistis isoprenyl pyrophosphate isomerase (SEQ ID NO: 8) and poplar tricot It may have a gene encoding a fusion protein of isoprene synthase (SEQ ID NO: 1) derived from kappa (the gene encoding isoprene synthase is located after the gene encoding isoprenyl pyrophosphate isomerase).
  • it may have a gene encoding a fusion protein of isoprenyl pyrophosphate isomerase (SEQ ID NO: 7) derived from E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 12) and isoprene synthase derived from poplar tricocapa (SEQ ID NO: 1). have.
  • Genes encoding enzymes involved in the isoprene synthase and mevalonate pathways can be introduced into E. coli via each or one plasmid.
  • the integrated plasmid may contain an ampicillin resistance gene (SEQ ID NO: 18) as a kanamycin resistance gene ( nptII) (SEQ ID NO: 19). In such cases, isoprene production can be increased by improving the stability of the plasmid.
  • plasmid containing a gene encoding an enzyme involved in the mevalonate pathway may be further introduced at the time of introduction of the integrated plasmid.
  • the E. coli may be a degenerate or deleted gene encoding the fermentation by-product generating enzyme.
  • By-products of fermentation during the isoprene production reaction may produce acetate, alcohol, lactate, acetoacetate, phosphoenol paruvate and the like, which consumes acetyl-CoA, a precursor of the mevalonate pathway.
  • Fermentation can be, for example, a fermentation in which mixed organic acids are produced in addition to isoprene production.
  • genes encoding fermentation by-product generating enzymes include dld involved in lactate production, atoD involved in acetoacetate production, atoA, pps involved in phosphoenol paruvate production, and the like.
  • the Escherichia coli may be one in which one or more of these genes are attenuated or deleted. Preferably, all of the genes may be attenuated or deleted.
  • the gene may be a sequence derived from the E. coli strain, and specific examples in the case of MG1655 may include dld having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52, atoAD having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53, and pps having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54 Can be.
  • the Escherichia coli may be one in which one or more of these genes are attenuated or deleted. Preferably, all of the genes may be attenuated or deleted.
  • the gene may be a sequence derived from the E. coli strain, and for example, in the case of MG1655, ackA - p ta is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48, poxB is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49, and adhE is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 , ldhA may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51.
  • E. coli may be attenuated or deleted a gene encoding the NudB protein.
  • NudB protein is an endogenous (or native) enzyme of E. coli, which catalyzes the conversion of isoprene precursors IPP and DMAPP to 3-methyl-3-buten-1-ol and 3-methyl-2-buten-1-ol, respectively do.
  • the present invention can further increase isoprene production by reducing or deleting a gene encoding NudB protein.
  • the gene encoding the NudB protein may be a known NudB sequence of Escherichia coli, and for example, the MG1655 strain may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 77, but is not limited thereto.
  • E. coli may be inactivated or removed flagella (flagellar).
  • the flagella is the movement of Escherichia coli, and E. coli is a swimming exercise.
  • the inventors have devised the present invention by discovering that isoprene production can be further increased by inactivating or removing flagella.
  • the method is not particularly limited as long as the flagella can be inactivated or removed, and can be performed, for example, by attenuating or deleting genes that promote the formation of flagella, which are essential for the formation of the flagella.
  • one or more genes selected from the group consisting of fliF, fliG, fliH, fliI, fliJ, and fliK may be deleted or inactivated.
  • fliF may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87, fliG is SEQ ID NO: 88, fliH is SEQ ID NO: 89, fliI is SEQ ID NO: 90, fliJ is SEQ ID NO: 91, and fliK is SEQ ID NO: 92.
  • the operon including the sequences may be deleted or inactivated.
  • the operon comprising the sequences may have, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 93.
  • Cultivation can be carried out on synthetic, semisynthetic, or complex culture media.
  • a culture medium a medium consisting of a carbon source, a nitrogen source, vitamins and minerals can be used.
  • TB Terrific medium
  • liquid medium and liquid medium to which the protein expression substance is added can be used.
  • the carbon source may be one selected from the group consisting of starch, glucose, sucrose, galactose, fructose, glycerol and mixtures thereof, preferably glycerol.
  • the nitrogen source may be selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate, glutamic acid, casamino acid, yeast extract, peptone, tryptone, soybean meal and mixtures thereof, preferably tryptone.
  • Cultivation may be carried out under conventional E. coli culture conditions. Incubation is for example about 15-45 °C, for example 15-44 °C, 15-43 °C, 15-42 °C, 15-41 °C, 15-40 °C, 15-39 °C, 15-38 °C, 15-37 ° C, 15-36 ° C, 15-35 ° C, 15-34 ° C, 15-33 ° C, 15-32 ° C, 15-31 ° C, 15-30 ° C, 20-45 ° C, 20-44 ° C, 20-43 ° C, 20-42 ° C, 20-41 ° C, 20-40 ° C, 20-39 ° C, 20-38 ° C, 20-37 ° C, 20-36 ° C, 20-35 ° C, 20-34 ° C, 20-33 ° C, 20-32 ° C, 20-31 ° C, 20-30 ° C, 25-45 ° C, 20
  • Centrifugation or filtration may be performed to remove the culture medium in the culture and recover or remove only the concentrated cells, and this step may be performed according to the needs of those skilled in the art.
  • the concentrated cells can be preserved so as not to lose their activity by freezing or lyophilizing according to a conventional method.
  • the culture may be in a medium containing glycerol as a carbon source.
  • Glycerol may be the only carbon source in the medium.
  • 0.5-5.0% (w / v), e.g. 0.5-4.5% (w / v), 0.5-4.0% (w / v), 0.5-3.5% (w / v), 0.5-3.0% (w / v), 0.5-2.5% (w / v), 0.5-2.0% (w / v), 1-5.0% (w / v), 1-4.5% (w / v), 1-4.0% (w / v), 1-3.5% (w / v), 1-3.0% (w / v) or 1-2.5% (w / v) may be made in a medium containing glycerol.
  • the medium may be TB medium to which glycerol is added.
  • TB medium is 24g yeast extract, 12g tryptone, 9.4g K2HPO4, 2.2
  • the medium comprises glycerol at a concentration of 1 to 3.0% by volume
  • the Escherichia microorganism is E. coli MG1655
  • the culturing step is TB medium 50 ml
  • the medium may further include an expression inducing agent for increasing the amount of expression of proteins required for isoprene production of E. coli.
  • the expression inducing agent may be used without limitation, known in the art, for example, may be IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside), lactose, and preferably lactose.
  • the expression inducing agent may be included, for example, in an amount of 1 g / l to 20 g / l, specifically 1 g / l to 10 g / l, but is not limited thereto.
  • the medium may further comprise a Mg + 2.
  • Mg 2 + for example, may be included 5mM or more, specifically more than 10mM, 20mM or more and more specifically, the upper limit may be, for example, 30mM is not particularly limited. If Mg 2 + is included in the above range, isoprene productivity may be maximized.
  • the culturing may be carried out in a culture medium in the presence of a lipophilic substance, for example, with a dodecane phase of a lipophilic substance placed on the surface of the medium.
  • the lipophilic material may be octane, decane, dodecane, tetradecane, phytoscualan, mineral oil, isopropyl myristate, cetyl ethylhexanoate, dioctanoyl decanoyl glycerol, squalane, or a combination thereof.
  • lipophilic substances can increase the productivity of isoprene by E. coli.
  • the lipophilic substance may be one that does not affect the growth of E. coli or has little effect.
  • Cultivation can be carried out while being agitated.
  • 100 to 300 rpm for example, 100 to 280 rpm, 100 to 260 rpm, 100 to 240 rpm, 100 to 220 rpm, 100 to 200 rpm, 100 to 180 rpm, 100 to 160 rpm, 100 to 140 rpm, 100 to 120 rpm, 120 to 120 300 rpm, 120 to 280 rpm, 120 to 260 rpm, 120 to 240 rpm, 120 to 220 rpm, 120 to 200 rpm, 120 to 180 rpm, 120 to 160 rpm, 120 to 140 rpm, 150 to 300 rpm, 150 to 280 rpm, 150 to 260 rpm, 150 to 240 rpm, It may be stirred at 150 to 220 rpm, 150 to 200 rpm, 150 to 180 rpm, 140 to 160 rpm, 200 to 300 rpm, 200 to 280 rpm, 200 to 260 rpm, 200 to 260
  • the lipophilic material such as dodecane
  • the lipophilic substance can be dispersed in the medium to increase the area in contact with the microorganisms so that isoprene can be efficiently separated from the cells during the culturing to stabilize and / or lyse.
  • the lipophilic material such as the dodecane phase, may be one that is hydrophobic and has low volatility for extraction of hydrophobic isoprene without affecting the cell growth of Escherichia coli.
  • the volume ratio of the medium to the lipophilic material is not limited to a specific range of ratios, for example, the volume ratio of the medium to the lipophilic material is 1: 0.1-3.0, 1: 0.2-3.0, 1: 0.5-3.0, 1: 1.0-3.0, 1: 1.5-3.0, 1: 2.0-3.0, 1: 2.5-3.0, 1: 0.2-2.5, 1: 0.2-2.0, 1: 0.2-1.5, 1: 0.2-1.0, 1: 0.2-0.5, 1: 0.5-2.5, 1: 0.5-2.0, 1: 0.5-1.5, 1: 0.5-1.0, 1: 0.8-2.5, 1: 0.8-2.0, 1: 0.8-1.5, 1: 0.8-1.2, 1: 0.8- 1.0 and the like are possible.
  • Escherichia coli for isoprene production is E. coli having an isoprene producing ability and a gene encoding a recA (recombinase A) protein is attenuated or deleted.
  • the Escherichia coli may be, for example, DH5 ⁇ , MG1655, BL21 (DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113, or a combination thereof, and may be preferably MG1655 in terms of cell growth rate and isoprene productivity.
  • the gene encoding the recA protein may be a gene encoding the recA protein of the E. coli strain. This is known from the NCBI genbank and the like.
  • the gene encoding the recA protein of the MG1655 strain may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73.
  • the E. coli can express the enzymes necessary for the production of isoprene described above, or genes encoding these enzymes can be introduced to express these enzymes.
  • the genes may be introduced into the plasmid described above.
  • the E. coli may be attenuated or deleted the gene encoding the above-described fermentation by-product generating enzyme.
  • E. coli may be attenuated or deleted the gene encoding the above-described NudB protein.
  • Escherichia coli may be one in which the flagella is inactivated or removed.
  • the production method of isoprene of the present invention is very excellent in isoprene productivity. Accordingly, a large amount of isoprene can be produced in a short time, and the production cost can be greatly reduced.
  • E. coli for isoprene production of the present invention is excellent in isoprene productivity, it is possible to produce a large amount of high-purity isoprene.
  • Figure 2 shows the cell growth and isoprene production of E. coli strains in which the plasmid containing artificially synthesized poplar tricokappa isoprene synthase and the plasmid containing the mevalonate pathway were simultaneously introduced.
  • Figure 3 shows isoprene productivity by integrating plasmids having isoprene synthase and mevalonate pathways simultaneously.
  • Figure 4 shows the plasmid stability in E. coli of the integrated plasmid having both isoprene synthase and mevalonate pathways at the same time.
  • Figure 5 shows the cell growth, isoprene productivity and plasmid stability of E. coli transformants introduced plasmid to improve the stability of the integrated plasmid.
  • Figure 6 shows the difference in isoprene production capacity between E. coli DH5 ⁇ and MG1655.
  • Figure 7 shows the result of comparing the isoprene productivity of recA and relA defective strains of MG1655.
  • Figure 11 shows the production process of the AceCo strain, and shows the genes to be removed for the production of acetyl-CoA and pyruvate metabolic pathways and AceCo strains.
  • FIG. 12 compares cell growth, isoprene productivity, and organic acid productivity of AceCo strains with improved carbon source efficiency, wild-type strains as a control group, and strains lacking ackA-pta gene as an acetic acid biosynthetic pathway.
  • Figure 13 is the result of confirming the improvement of isoprene productivity by introducing an additional idi gene into the isoprene production plasmid.
  • Figure 14 shows the results of the improvement of isoprene productivity using IspS and IDI fusion protein.
  • Figure 16 shows the result of comparing the isoprene productivity with or without Mg 2 + in the culture medium for isoprene production.
  • isoprene biosynthesis the amplified gene or gene combination was introduced into a pTrc99A vector (Bacterial expression vector with inducible lacI promoter; amp resistance; restriction enzyme cloning) to produce four types of isoprene production vectors.
  • Isoprene synthase from Populus trichocarpa (ispS) was artificially synthesized for codons of Escherichia coli (SEQ ID NO: 1).
  • the base sequence for artificial synthesis was prepared using DNA2.0 program, and the artificial synthesis of gene was commissioned by Genescript (USA).
  • pTrc99SN was enriched with a ribosomal binding site in the pTrc99A vector (SEQ ID NO: 15), and amplified by PCR using primers sPtispS-F and sPtispS-R shown in Table 2, and then artificially synthesized poplar tricocapa isoprene synthase was inserted.
  • PTSN-sPtispS was prepared.
  • the entire mevalonate pathway was amplified from pS-NA, the plasmid into which the mevalonate pathway was introduced (SEQ ID NOS: 2-7), and introduced into the XbaI site of the prepared pTSN-sPtispS plasmid to obtain pTSN-sPtispS-MVA.
  • the ampicillin resistance gene (SEQ ID NO: 18) of the prepared pTSN-sPtispS-MVA was removed using restriction enzymes BglII and BspHI, and the kanamycin resistance gene (SEQ ID NO: 19) was inserted at the same position to insert pTSNK-sPtispS-. MVA was produced.
  • the recombinant plasmids pT-sPtispS, pTSN-sPtispS, pTSN-sPtispS-MVA and pTSNK-sPtispS-MVA and pTrc99A vector, which are negative controls, were transformed into E. coli DH5 alone or simultaneously with pS-NA plasmid.
  • the transformation method used followed the conventional method specified in Sambrook and Russell (2001).
  • the recombinant plasmid pT-sPtispS, pTSN-sPtispS and pS-NA (SEQ ID NOS: 2 to 7 genes), which are the recombinant plasmids prepared above, are simultaneously introduced with glycerol. It contains the contents produced by isoprene by culturing in the medium.
  • PT-sPtispS and pTSN-sPtispS were simultaneously introduced into Escherichia coli DH5 ⁇ and pS-NA, which is a melonate pathway plasmid, to determine the difference in isoprene productivity according to the ribosome binding strength.
  • Transformants with isoprene-producing ability were treated with 5 ml of TB medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 50 ⁇ g / ml of chromamphenicol (24 g yeast extract, 12 g tryptone per liter, 9.4 g K 2 HPO 4 , 2.2 g KH 2 PO 4 ) inoculated at 30 ° C. and 250 rpm, followed by culturing at 50 ° C., followed by 50 ml containing 20 g / L glycerol, 100 ⁇ g / ml ampicillin and 50 ⁇ g / ml chromamphenicol.
  • the main culture was inoculated in TB medium.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • an expression inducing agent was added at a final concentration of 0.1 mM.
  • the main culture used a slotted 250 ml Erlenmeyer flask, which was incubated at 30 ° C. and 150 rpm for 36 hours.
  • the temperature of the oven started at the first 50 ° C. and allowed to rise to 250 ° C. at a rate of 30 ° C. per minute for 2 minutes. Nitrogen was used as the carrier gas and the gas inlet pressure was set to 15.345 psi. A FID (flame ionization detector) detector was used and the temperature was set to 280 ° C. The separation time of isoprene was 1.53 minutes and isoprene standards for quantification were purchased from Sigma, USA.
  • FIG. 2 The culture results are shown in FIG. Referring to FIG. 2, about 450 mg / L isoprene was produced in a transformant co-introduced with plasmids pTSN-sPtispS and pS-NA having strong ribosomal binding sites in IPTG-free culture, which was about 280 mg /
  • the pT-sPtispS and pS-NA which produced L isoprene were about 1.6 times higher than the transformants co-introduced.
  • the maximum isoprene yield per hour between the two strains was about 10 mg / L / hr, and there was little difference in cell growth rate and the final optical density (OD) was about 25.
  • the cause of the initial cell growth inhibition in the culture of IPTG addition to increase the protein expression level is as follows.
  • the expression of isoprene synthase cloned into a vector with a strong promoter and high plasmid copy number is significantly higher than the mevalonate pathway cloned into a vector with a relatively weak promoter and plasmid copy number.
  • DMAPP deficiency required for cell growth by consuming excessive precursor DMAPP.
  • the content of isoprene productivity is improved by utilizing the plasmid with the increased expression level of the mevalonate pathway.
  • E. coli DH5 ⁇ transformants with pTSN-sPtispS-MVA with increased expression of mevalonate pathway were made and transformants with pTSN-sPtispS and pS-NA introduced at the same time were used as a control to confirm the improvement of isoprene productivity. Cultivation was performed.
  • the culture results are shown in FIG. 3.
  • the strain incorporating the integrated plasmid with the increased expression of the mevalonate pathway showed 1.25 g / L isoprene production, which was about three times higher than the control group.
  • Isoprene production per hour up to about 90 mg / L / hr
  • isoprene production per unit cell up to about 5.5 mg / L / hr / OD600nm
  • the improvement of isoprene productivity can be said to be a result of overcoming the problem of DMAPP deficiency of Example 1- (2) through increased expression of the mevalonate pathway, which is a precursor production pathway, and isoprene due to balanced expression of IspS and MVA pathways. This is the result of productivity improvement.
  • bla (SEQ ID NO: 18) encoding the kanamycin resistance gene encoding the ampicillin resistance gene on the integration plasmid in order to solve the problem that the integrated plasmid used in Example 1- (3) is lost in culture. Includes information on improving isoprene productivity using plasmids replaced with nptII (SEQ ID NO: 19).
  • the loss of the plasmid was confirmed during the E. coli culture including the integrated plasmid.
  • the stability of the plasmid was measured by diluting the culture medium incubated with the medium every 6 hours in the culture process and smearing the same amount on the solid medium without antibiotics and the solid medium containing the antibiotics.
  • the stability calculation of the plasmid indicated the colony number of the medium without antibiotics as 100% and the colony number of the medium containing antibiotics in%.
  • Plasmid stability confirmation results are shown in FIG. Referring to FIG. 4, as a result of confirming the plasmid stability, the number of Escherichia coli containing the plasmid was 50% or less at 36 hours of the end of the culture in the culture without the IPTG, and the plasmid was significantly higher in the culture with the IPTG added. It was confirmed that is lost.
  • a new pTSNK-sPtispS-MVA plasmid was constructed by replacing bla encoding an ampicillin resistance gene on an integrated plasmid with nptII encoding a kanamycin resistance gene. The culture was carried out to confirm the change in isoprene productivity according to the improvement of plasmid stability.
  • FIG. 5 The culture results are shown in FIG. Referring to FIG. 5, about 1.6 g / L isoprene was produced in the strain having the improved safety plasmid, which is about 1.3 times higher than the control group. Plasmid stability was also significantly higher than that of the control group, and the plasmid was maintained at more than 90% at 36 hours of incubation. After 14 hours of culture, it was confirmed that the isoprene production per hour and the isoprene production per unit cell were increased in the plasmid containing the kanamycin resistance gene. This can be said to be the result of improved stability of the plasmid.
  • E. coli strain DH5 ⁇ used in Example 1 is a thiamin (thiamine) biosynthetic gene-deficient strain, so can not produce thiamin by itself. For this reason, there is a cost burden of adding thiamine in the medium. In addition, the growth rate is slow compared to E. coli MG1655 strain that is widely used industrially.
  • Example 2 the isoprene production capacity between the host E. coli DH5 ⁇ and MG1655 strains mentioned in Example 1 was compared, and the genetic factor that influences the isoprene productivity between the two host E. coli strains was compared to isoprene. Includes information used as a host strain for production.
  • pTSNK-sPtispS-MVA was introduced into E. coli DH5 ⁇ and MG1655 strains to make E. coli transformants.
  • the E. coli DH5 ⁇ transformant showed about 3.2 times higher isoprene production than the MG1655 transformant.
  • the cell growth was faster in the MG1655 transformant, but the final cell growth was slightly lower with the rapid drop in pH.
  • isoprene productivity is judged to be a result of genetic characteristics between Escherichia coli strains, and in the case of MG1655 strain, excessively rapid consumption of carbon sources produces and accumulates fermentation by-products such as organic acids, resulting in a rapid drop in pH. It is thought that it caused a decrease in productivity.
  • the isoprene productivity is changed by determining the genetic factors representing the difference in the isoprene productivity of the host E. coli DH5 ⁇ and MG1655 strains based on the results of Example 2- (1). It is intended to include similar or improved results.
  • MG1655 ⁇ recA and MG1655 ⁇ relA strains in which recA (SEQ ID NO: 76) and relA, which are genes missing in the E. coli DH5 ⁇ strain, were deleted in the wild-type MG1655 strain, respectively, were prepared.
  • Gene deletion was performed using the gene deletion kit (Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit By Red® / ET® Recombination, Gene Bridges, Germany), and the gene was deleted according to the method of use of the kit.
  • E. coli transformants were co-introduced into pSNK-sPtispS-MVA and pS-NA in each of the E. coli strains, and then the isoprene productivity was compared using wild type E. coli MG1655 and DH5 ⁇ transformants as controls.
  • the medium, the culture conditions, and the isoprene quantification method for culturing were the same as those of Example 1- (2), and no IPTG was added.
  • the MG1655 recA strain showed about 4.6 times and about 1.3 times higher isoprene production than the wild type MG1655 and DH5 ⁇ strains, respectively.
  • the relA-deficient strain showed no difference in isoprene productivity from wild-type MG1655.
  • recA is the genetic factor that indicates the difference in isoprene productivity between DH5 ⁇ and MG1655 (DE3).
  • isoprene productivity is reduced by the loss of nudB, a gene that converts IPP and DMAPP, precursors of isoprene, to 3-methyl-3-buten-1-ol and 3-methyl-2-buten-1-ol, respectively. Includes improvements and results.
  • PCR primers for gene deletion are shown in Table 3.
  • the deletion strain was prepared in the same manner as in Example 2- (2), and the resulting strain was named MG1655 ⁇ nudB.
  • E. coli transformants were prepared by introducing pTSNK-sPtispS-MVA into the MG1655 ⁇ nudB strain and then comparing the isoprene productivity using the wild type E. coli MG1655 transformant as a control.
  • Transformants with isoprene-producing ability were inoculated in 5 ml of TB medium (24 g yeast extract, 12 g tryptone, 9.4 g K2HPO4, 2.2 g KH2PO4) containing 50 ⁇ g / ml kanamycin at 37 ° C and 250 rpm. After culturing under conditions, the cultures were inoculated in 50 ml of TB medium containing 20 g / L glycerol and 50 ⁇ g / ml of kanamycin. In order to increase the amount of protein expression, lactose, an expression inducing agent, was added at a final concentration of 5 g / l.
  • the main culture used a slotted 250 ml Erlenmeyer flask, which was incubated at 30 ° C. and 150 rpm for 36 hours.
  • the isoprene quantification method is the same as that of Example 1- (2) above, and IPTG was not added.
  • the culture results are shown in FIG. 8. Referring to FIG. 8, it was confirmed that the MG1655 nudB strain exhibited about 1.35 times higher isoprene production than the wild-type MG1655 strain. These results confirmed that nudB deficiency may help to improve isoprene productivity.
  • the present example includes the results and the results of improving isoprene productivity by deficiting nudB and recA based on the results of Examples 2- (2) and 2- (3).
  • MG1655 ⁇ nudB recA strains were integrated into the MG1655 ⁇ nudB strain through P1 transduction to produce MG1655 ⁇ nudB, recA strains, and pTSNK-sPtispS-MVA was introduced into the MG1655 ⁇ nudB, recA strains to make E. coli transformants. Isoprene productivity was compared using MG1655 ⁇ recA and MG1655 ⁇ nudB strain transformants.
  • Example 2- (3) Culture medium and culture conditions for the culture are the same as in Example 2- (3), isoprene quantification method is the same as the method of Example 1- (2).
  • the culture results are shown in FIG. 9. 9, it was confirmed that the MG1655 nudB and recA strains exhibited about 1.4 times and about 2.15 times higher isoprene production than the MG1655 ⁇ recA and MG1655 ⁇ nudB strains, respectively. These results confirm that simultaneous deletion of nudB and recA may help to improve isoprene productivity.
  • genes involved in flagella formation (fliF (SEQ ID NO: 87), fliG (SEQ ID NO: 88), fliH (SEQ ID NO: 89), fliI (SEQ ID NO: 90), fliJ (SEQ ID NO: 91), It contains the results and results of improving isoprene productivity by deficiency of operon (SEQ ID NO: 93), including fliK (SEQ ID NO: 92).
  • the flagella operation is not essential in a culture environment suitable for the growth of artificially controlled microorganisms rather than wild.
  • the MG1655 strain was prepared by removing operons of genes involved in flagella formation of wild type MG1655 strain.
  • PCR primers for gene deletion are shown in Table 3.
  • the deletion strain was prepared in the same manner as in Example 2- (2), and the resulting strain was named MG1655 ⁇ fli operon.
  • E. coli transformants were prepared by introducing pTSNK-sPtispS-MVA into the MG1655 ⁇ fli operon strain and then comparing the isoprene productivity with the wild type E. coli MG1655 transformant as a control.
  • Transformants with isoprene-producing ability were seeded in 5 ml of 2YT medium (10 g yeast extract, 16 g tryptone, 5 g NaCl per liter) containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured at 37 ° C and 250 rpm.
  • 2YT medium (10 g yeast extract, 16 g tryptone, 5 g NaCl per liter) containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured at 37 ° C and 250 rpm.
  • lactose an expression inducing agent
  • the main culture used a slotted 250 ml Erlenmeyer flask and incubated for 48 hours at 30 °C, 150 rpm conditions.
  • the isoprene quantification method is the same as that of Example 1- (2) above, and IPTG was not added.
  • This example includes the contents related to the production of E. coli MG1655 strain with improved carbon source utilization efficiency.
  • AckA-pta SEQ ID NO: 48 and poxB (SEQ ID NO: 49), adhE (SEQ ID NO: 50), and ldhA (SEQ ID NO: 51) and dld, which are involved in the production of lactate, of wild type MG1655 (SEQ ID NO: 52), atoDA (SEQ ID NO: 53) involved in the production of acetoacetate, and pps (SEQ ID NO: 54) involved in the production of phosphoenolpyruvate were removed.
  • Defective strains can be produced by homologous recombination using ⁇ -Red recombinase, and the strains of each gene are deleted, and additional gene-defective strains are produced based on the gene-deficient strains. Since the back light already exists in the strain and cannot use the method of recombination, each gene defect was combined with each other through P1 transduction. Finally, a strain lacking nine genes related to fermentation byproducts was produced, and the strain was named MG1655 AceCo.
  • PCR primers used in the AceCo strain preparation process and the final AceCo preparation process are shown in Table 4 and FIG.
  • FIG. For example, in detail describing the production process of the IS1 strain, promoters and markers using primers ⁇ ackA-pta-F and ⁇ ackA-pta-R, which contain 50 bp of edges of the ackA-pta gene (SEQ ID NO: 48) of E. coli, respectively.
  • a gene group including the gene, FRT site, and terminator SEQ ID NO: 55 was amplified by PCR, and amplified DNA fragments were introduced into E. coli to induce homologous recombination through ⁇ -Red recombinase.
  • the selection of the gene deletion strains was carried out via solid antibiotic medium corresponding to the antibiotic resistance gene introduced first, and the final deletion strains were identified by PCR using ackA-ptaCF-F and ackA-ptaCF-R primers. It was confirmed.
  • a strain in which one gene or an operon is deleted is prepared by a homologous recombination method.
  • Combined IS8 strains were made.
  • IS9 to IS12 strains were prepared by sequentially integrating IS3 to IS6 strains through P1 transduction into the IS8 strains thus prepared, and AceCo strains were prepared by integrating the final IS12 and IS7 strains.
  • This example includes the results of confirming the improvement of isoprene productivity and the production of fermentation byproducts by introducing the pTSNK-sPtispS-MVA plasmid of Example 1- (4) into the MG1655 AceCo strain prepared in Example 3- (1). Doing.
  • the culture medium, the culture conditions, and the isoprene quantitative method for culturing were the same as those of Example 1- (2), but no IPTG was added. Fermentation by-product analysis was performed using Shimadzu liquid chromatography (HPLC, LC-20A). As a column for material separation, an ion exchange column (AminexR, HPX-87H, 7.8 ⁇ 300 mm) manufactured by BIO-RAD was used. 5 mM sulfuric acid was used as the mobile phase and was moved at a rate of 0.6 ml per minute. The temperature of the oven was maintained at 40 ° C.
  • the culture results are shown in FIG. Referring to FIG. 12, the production of isoprene showed that the AceCo strain produced about 3.5 times higher than the wild type MG1655, and about 2.6 times higher than the ackA-pta-deficient strain. On the other hand, the amount of acetic acid produced by fermentation by-product produced 1.3 g / L, which was about 5.6 times lower than that of wild type MG1655 and 5.0 times lower than that of ackA-pta-deficient strain.
  • the concentration of pyruvate a precursor of intracellular acetyl-CoA concentration, was found to be 3.1 g / L in AceCo strains, which was significantly higher than that of the control wild-type MG1655 and ackA-pta-deficient strains.
  • the results of the study showed that blocking the fermentation by-product biosynthesis pathway prevents unnecessary consumption of acetyl-CoA, a precursor of the MVA pathway, and significantly improves isoprene productivity when carbon utilization efficiency is improved. Deletion of only the ackA and pta genes involved in acetic acid biosynthesis has no effect on inhibiting acetic acid production and does not help to improve isoprene productivity.
  • Example 2 a variety of microorganism-derived idi genes are added to the plasmid prepared in Example 1 to prepare a new plasmid, and the culture results for confirming isoprene productivity improvement using the same are included.
  • genus Escherichia SEQ ID NO: 7
  • genus Hematococcus SEQ ID NO: 10
  • genus Sinecasistis SEQ ID NO: Number 8
  • genus Streptococcus SEQ ID NO: 9
  • Amplification of the gene from the genome of Escherichia coli using primers Ecidi-F and Ecidi-R is performed, and the amplified gene is introduced into the XbaI site of pTSN-sPtispS. It was.
  • the four idi genes were produced by the same method, resulting in pTSN-sPtispS-Ecidi, pTSN-sPtispS-HPidi, pTSN-sPtispS-Syidi and pTSN-sPtispS-Snidi plasmids.
  • PCR primers used for further introduction of gene idi are shown in Table 5.
  • the plasmids were introduced into the E. coli MG1655 AceCo ⁇ recA strain together with pS-NA to make a transformant and confirmed the improvement of isoprene productivity.
  • the culture medium, the culture conditions, and the isoprene quantification method for culturing were the same as those of Example 1- (2), and were cultured by adding 0.5 mM IPTG.
  • the culture results are shown in FIG. Referring to FIG. 13, the strain to which the idi gene of Synecosisis was additionally introduced showed the highest isoprene production, and the strain to which the remaining idis were added also showed higher isoprene production compared to the control.
  • a fusion protein is obtained by fusion of the genus Escherichia coli idiom and the genus Escherichia coli idi, showing isoprene productivity improvement based on the results of Example 4- (1). It is produced and contains the result of improving isoprene productivity using the same.
  • Isoprene synthase termination codons were removed (amplified by PCR using primers FispS-F and FispS-R) and cloned into the NcoI and XbaI sites of the pTrc99SN vector, followed by the idi gene containing the serine-glycine linker (primer REcidi-F And amplified by PCR using REcidi-R or RSyidi-F and RSyidi-R) were inserted into the back of the isoprene synthase using the XbaI site to express two genes as one protein.
  • plasmids were named pTSN-sPtispS-L-Sydid and pTSN-sPtispS-L-Ecidi, respectively.
  • idi amplified by PCR using primers FEcidi-F and FEcidi-R or FSyidi-F and FSyidi-R
  • PCR primers used to construct the gene encoding the fusion protein are shown in Table 6.
  • the plasmids containing the genes encoding the four fusion proteins thus prepared were simultaneously introduced into pS-NA and Escherichia coli DH5 ⁇ , and cultured to confirm the improvement of isoprene productivity.
  • the medium, the culture conditions, and the isoprene quantification method for culturing were the same as those of Example 1- (2), and no IPTG was added.
  • the culture results are shown in FIG. Referring to FIG. 14, the culture results showed that the IspS and Escherichia spp IDI fusion proteins showed higher isoprene production compared to the Cynecocytis spp IDI fusion protein, particularly in the form in which the Escherichia spp IDI was fused to the front of IspS. It showed high isoprene productivity and about 2.4 times higher isoprene production than the control group.
  • This example includes the results for checking isoprene productivity according to the type of expression inducing agent to increase the amount of protein expression.
  • Lactose is broken down into glucose and galactose by ⁇ -galactosidase.
  • glucose and galactose are sometimes synthesized as lactose by the reverse reaction of ⁇ -galactosidase.
  • allolactose is produced with a certain probability, and this allolactose acts as an expression inducing agent.
  • E. coli transformants were introduced by introducing pTSNK-sPtispS-MVA into the MG1655 ⁇ recA strain, and 5 ml of TB medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin (24 g yeast extract per liter) was obtained. , 12 g tryptone, 9.4 g K2HPO4, 2.2 g KH2PO4) and seeded at 37 °C, 250 rpm conditions, and then inoculated in 50 ml TB medium containing 20 g / L glycerol and 50 ⁇ g / ml kanamycin The main culture.
  • IPTG was added at a final concentration of 0.03 mM and Lactose was added at a final concentration of 5 g / l, 10 g / l, and 20 g / l, respectively. Glycerol was not added under the condition that 20 g / l of lactate was added.
  • the main culture used a slotted 250 ml Erlenmeyer flask, which was incubated at 30 ° C. and 150 rpm for 36 hours.
  • the isoprene quantification method is the same as that of Example 1- (2) above, and IPTG was not added.
  • the culture results are shown in FIG. 15. Referring to FIG. 15, it was confirmed that the yield of isoprene was about 2.3 times higher than that of IPTG under the condition of adding lactose with glycerol. These results confirm that the addition of lactose as an expression inducer is helpful in improving isoprene productivity.
  • Isoprene synthase is reported to exhibit an optimal activity under the conditions of 20 mM Mg + 2 are present as auxiliary factor. Therefore, the isoprene productivity was confirmed by the addition of excess amount of Mg + 2.
  • E. coli transformants were introduced by introducing pTSNK-sPtispS-MVA into the MG1655 ⁇ recA strain, and 5 ml of 2YT medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin (10 g yeast extract per liter) was obtained.
  • the main culture used a slotted 250 ml Erlenmeyer flask and incubated at 30 ° C. and 150 rpm for 60 hours.
  • the isoprene quantification method is the same as that of Example 1- (2) above, and IPTG was not added.

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Abstract

본 발명은 이소프렌 생산능을 가지며 recA 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 대장균을 탄소원을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함함으로써, 짧은 시간 내에 많은 양의 이소프렌을 생산할 수 있어, 이소프렌 생산 단가를 크게 낮출 수 있는 이소프렌의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

이소프렌의 생산 방법
본 발명은 이소프렌의 생산 방법에 관한 것이다.
이소프렌은 천연고무의 주요 구성성분인 동시에 합성고무 생산을 위한 기반화학물질이다. 이소프렌은 주로 타이어, 의료용품, 접착제 등을 만드는데 사용된다. 현재 이소프렌은 석유의 정제 과정을 통해 얻어지며, 최근 석유 가격의 등락, 이소프렌이 배제된 연료물질 생산에 초점을 맞춘 정제공정 그리고 합성고무의 수요 증가로 인하여 이소프렌의 가격은 꾸준히 상승하고 있는 추세이다. 또한 이소프렌은 수송용 연료와 제트연료로 사용이 가능하고, 다른 바이오연료에 비해 높은 에너지 효율과 낮은 온실가스를 배출하는 특징을 지니고 있어 드랍인(drop-in) 바이오 연료로서 적합하다.
미생물을 이용한 이소프렌의 생산은 순도가 매우 높아 고도의 정제과정이 필요 없고, 재생 가능한 자원과 단가가 낮은 원료로 생산이 가능하며 손쉽게 바이오연료와 바이오케미컬로 전환이 가능하다는 장점을 가지고 있다.
생물학적으로 이소프렌은 메발로네이트 경로(MVA pathway)와 맵 경로 (MEP pathway)에서 만들어진 DMAPP를 전구체로 이소프렌 신타제로부터 만들어진다(도 1). 포플러 종과 버드나무 종에서 이소프렌 생산과 방출에 대해서 처음 보고된 이후, 식물에서 이소프렌 배출 기작과 관련 효소에 대한 연구는 꾸준히 이어졌지만 미생물에서 이소프렌 생산과 미생물을 숙주로 활용한 이소프렌 생산에 대한 연구는 최근에서야 이루어지고 있다.
최근 세계적인 타이어제조 기업과 발효기업이 합작하여 석유 이외의 물질로부터 이소프렌을 대량 생산하는 방법에 대한 연구가 진행 중이다. 그 중 대표적인 그룹이 듀폰과 굿이어이다. 듀폰과 굿이어가 2008년 합작하여 미생물로부터 이소프렌 대량 생산을 위한 연구를 현재까지 수행 중이다. 이들은 다양한 포플러 종과 버드나무 종으로부터 이소프렌 신타제를 분리하여 효율을 비교하였으며, 전구물질 공급을 위한 다양한 대사경로를 조합하고 시험하였다. 현재 산업화의 80% 수준의 공정이 진행되었다고 보고되고 있다. 그러나, 이소프렌 생산성은 비록 높지만 많은 양의 탄소원을 소비하여 이루어지기 때문에 생산 효율이 낮은 문제점이 있다.
중국의 칭따오과학기술대학에서는 2012년부터 미생물을 이용한 이소프렌 생산 연구를 가속화하고 있다. 이들은 포플러 알바(Populus alba) 이소프렌 신타제와 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 MVA 경로를 조합하여 대장균에서 최고 6.3g/L 생산을 달성하였다. 그러나, 단순 이소프렌 신타제와 전구체경로의 조합을 도입한 대장균 숙주로부터 이소프렌을 생산하였으며, 이소프렌 생산을 증가시키기 위해 이소프렌 생산에 영향을 미치는 숙주 미생물 고유 대사경로의 대사공학에 대한 고려를 하지 않아 배지에 첨가한 탄소원에 비해 낮은 이소프렌 생산성을 나타내는 단점이 있다.
그 외 다른 이소프렌 생산을 위한 다양한 생명공학 기업들과 석유화학 기업들간의 합작 연구들이 진행되고 있으나, 구체적인 연구결과들은 보고되고 있지 않다.
이러한 종래 기술에 의하면, 이소프렌 신타제와 전구체 생합성 경로인 메발로네이트 경로를 조합하고 대사공학 방법을 통해 이들 경로를 단순 최적화하는 방법을 통하여 미생물 숙주로부터 이소프렌을 생산해왔다. 이 같은 기술은 이소프렌을 생산하는 숙주 미생물의 전체적인 대사경로 효율성을 고려하지 않아서 투입되는 탄소원 기질에 비해 낮은 이소프렌 생산수율로 인하여 생산단가의 상승을 초래한다.
따라서, 미생물 발효를 통한 바이오연료 및 바이오케미칼 생산에서의 기질 비용이 차지하는 비중이 매우 높은 것을 고려할 때에 이소프렌 신타제와 전구체 생합성경로의 최적화 이외에 이소프렌 생산성에 영향을 미치는 숙주 미생물 고유대사경로의 엔지니어링을 통하여 이소프렌 생산성을 향상시키는 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 대장균의 고유 대사 경로를 엔지니어링하여 이소프렌 생산성을 극대화할 수 있는 이소프렌의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 이소프렌의 생산 방법은 이소프렌 생산능을 가지며, recA(recombinase A) 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 대장균을 탄소원을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다.
DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 등의 대장균 균주들이 생물전환반응에 의한 효소 생산에 산업적으로 많이 사용되고 있는데, 그 중, 생산성 측면에서 DH5α가 많이 사용된다. 한편, DH5α 균주는 티아민 생합성 유전자 결손 균주이므로 자체적으로 티아민 생산을 할 수 없는 문제가 있다. 이에, DH5α 이용시에는 배지에 티아민을 첨가해야 하는 비용적 부담이 있다.
한편, MG1655의 경우 생장 속도는 빠른 반면, 이소프렌 물질 생산 속도가 느린 단점이 있다. 본 발명자들은 상기 대장균 간 이소프렌 물질 생산 속도 차이가 어떠한 요인에 기인한 것인지 연구하여, recA 단백질이 이소프렌 생산 속도에 영향을 미치는 요인임을 발견하였다.
recA 단백질은 DNA 손상 복구 및 유지에 필요한 약 38kDa의 단백질로서, ATP가 존재하는 가운데 외가닥 DNA와 결합하는 것으로 활성화하여 ATPase의 작용을 나타내며, 2중가닥 DNA를 부분적으로 되감아서 외가닥의 상보적인 사슬과 수소결합을 형성시킴으로써 DNA 조합을 유발시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 recA 단백질이 결실된 대장균이 보다 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것에 착안하여 본 발명을 고안하였다.
본 명세서에 있어서, 용어 "감쇄(attenuation)"는 대상 유전자의 발현이 모균주에 비하여 감소한 것을 나타낸다. 용어 "결실(deletion)"은 대상 유전자의 발현이 상실된 것을 나타낸다.
상기 감쇄 또는 결실은 유전자 서열의 변이, 예를 들면, 치환, 결실, 삽입 또는 그들의 조합에 의하여 발생할 수 있다. 상기 감쇄 또는 결실은 유전자 조절 부의 서열의 변이, 예를 들면, 치환, 결실, 삽입 또는 그들의 조합에 의하여 발생할 수 있다.
상기 대장균은 예를 들면 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합일 수 있으며, 균체 생장 속도 및 이소프렌 생산성의 측면에서 바람직하게는 MG1655일 수 있다.
recA 단백질을 코딩하는 유전자는 해당 대장균 균주의 recA 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 이는 NCBI genbank 등을 통해 공지되어 있다. 예를 들어, MG1655 균주의 recA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 76의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 대장균은 이소프렌 생산능을 갖는다. 본 명세서에서 이소프렌 생산능을 가지는 대장균은 이소프렌 생산에 필요한 효소를 내재적으로 발현하거나, 이들 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이들 효소를 발현하는 미생물을 의미한다.
전술한 바와 같이 recA 단백질은 DNA 상동성 재조합에 관여하는 것인데, 본원에서 이소프렌 생산에 필요한 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 경우에, 이들은 대장균 고유 유전자와 상동성이 없어 상동성 재조합이 일어날 수 없음에도 이소프렌 생산량이 증가되었다. 즉, 이소프렌 생산량 증가는 DNA 상동성 재조합 억제에 의한 것이 아닌 별개의 경로에 의한 것으로 판단된다. 이는 이소프렌 외에 다른 이소프레노이드에서는 관찰되지 않았다.
이소프렌 생산에 필요한 효소는 예를 들면 이소프렌 신타제 및 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 들 수 있다.
구체적으로, 상기 대장균은 이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자로 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제(isoprene synthase)를 코딩하는 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 갖는 것일 수 있다.
이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자의 도입은 예를 들면 해당 리보솜 결합 부위가 강화된 플라스미드를 대장균에 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다.
리보솜 결합 부위는 단백질 생합성 개시시에 mRNA가 리보솜과 결합하는 부위로서, 리보솜 결합 부위가 강화되면 이소프렌 신타제의 발현량이 증가할 수 있다.
리보솜 결합 부위의 강화는 예를 들면, 리보솜 결합 부위 서열의 전사시작비율(TIR: Translation Initiation rate) 값을 향상시키는 것으로 수행될 수 있다. 보다 구체적인 예를 들자면, 상기 이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자는 그에 대응되는 리보솜 결합 부위 서열의 전사시작비율 값이 3,000 au 이상인 플라스미드에 도입된 것일 수 있다. 바람직하게는 5,000au, 보다 바람직하게는 10,000au, 더욱 바람직하게는 30,000au일 수 있다. 그러한 경우에, 이소프렌 신타제의 발현량이 현저히 증가될 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않으나 예를 들자면 100,000au일 수 있다.
전사시작비율 값은 리보솜 결합 부위와 전사시작 시점 사이의 서열을 변경함으로써 조절될 수 있다. 구체적인 예를 들자면 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자의 경우, 리보솜 결합 부위와 전사시작 지점인 ATG까지의 서열을 기존 AGGAAACAGACC (전사시작비율 값 217 au)를 AGGAGGTAATAAACC (전사시작비율 값 39,327 au)로 변경함으로써 조절할 수 있다.
본 발명자들은 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제(isoprene synthase)의 발현을 증가시키기 위해 pTrc99A 벡터에서 리보솜 결합 부위 서열을 AGGAGGTAATAAACC로 변경하여 강화시킨 pTrc99SN 벡터를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 특정 유전자에 대하여 특정 전사시작비율 값을 갖는 서열은 https://www.denovodna.com의 Reverse Engineer RBSs 프로그램을 사용하여 생성할 수도 있다.
도 1은 메발로네이트(MVA) 경로 및 맵(MEP) 경로를 포함한 이소프렌 생합성 경로를 나타낸 것으로, 이를 참조하면 메발로네이트 경로에 관여하는 효소는 acetoacetyl-CoA 신타제/HMG-CoA 리덕타제, HMG-CoA 신타제, 메발로네이트 카인아제, 메발로네이트 다이포스페이트 카복실아제, 포스포메발로네이트 카인아제 및 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제이다.
상기 대장균은 예를 들면 엔테로코커스 속 (Enterococcus) 또는 스트렙토코커스 속 (Streptococcus) 또는 이들 조합의 메발로네이트계 경로에 관여하는 효소를 발현하는 것일 수 있다.
구체적으로, 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 서열번호 2의 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 acetoacetyl-CoA 신타제와 HMG-CoA 리덕타제의 기능을 동시에 갖는 효소를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 다이포스페이트 카복실아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 포스포메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 7의 대장균 MG1655 (Escherichia coli MG1655) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 갖는 것일 수 있다.
또한, 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 증폭되거나, 증폭된 상태로 벡터를 통해 도입된 것일 수 있다. 그러한 경우에, 메발로네이트 경로에 관여하는 효소 발현이 증가되어, 균체 생장에 필요한 DMAPP를 충분히 공급할 수 있다. 이에, 균체 생장 저하를 막을 수 있다.
용어 "증폭(amplification)"은 유전자 카피의 증가 및/또는 유전자의 발현량 증가를 나타낸다. 상기 증폭은 일 양상으로 외래 유전자의 도입 또는 내재적 유전자의 카피 수의 증가에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 증폭을 위해 유전자의 발현량을 늘릴 수 있도록 프로모터 또는 RBS(ribosomal binding site)를 대체할 수 있다.
또한, 상기 대장균은 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 서열번호 8의 사이네코 시스티스 (Synechocystis sp. PCC6803) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자, 서열번호 9의 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 10의 헤마토코쿠스 플라비아리스 (Haematococcus plavialis) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 중 선택된 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 더 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 8의 사이네코 시스티스 (Synechocystis sp. PCC6803) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자를 더 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자 대신에 이소프렌 신타제와 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가질 수 있다. 그러한 경우에 이소프렌 생산능이 더욱 향상될 수 있다. 해당 유전자는 벡터에 2개의 유전자를 클로닝하여 1개의 단백질로 발현되게 설계함으로써 얻어질 수 있다. 그 순서는 특별히 한정되지 않으며, 이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자가 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 앞 또는 뒤에 오도록 설계할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 대장균은 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제(isoprene synthase)를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자 대신에 서열번호 11의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제(서열번호 1)와 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제(서열번호 7)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자(이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자가 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자보다 앞에 위치), 서열번호 12의 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제(서열번호 7)와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제(서열번호 1)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자(이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자가 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자보다 뒤에 위치), 서열번호 13의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제(서열번호 1)와 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제(서열번호 8)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자(이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자가 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자보다 앞에 위치) 또는 서열번호 14의 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제 (서열번호 8)와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제 (서열번호 1)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자(이소프렌 신타제를 코딩하는 유전자가 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자보다 뒤에 위치)를 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 12의 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제(서열번호 7)와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제(서열번호 1)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 것일 수 있다.
상기 이소프렌 신타제 및 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 각각 또는 하나의 플라스미드를 통해 대장균에 도입될 수 있다.
이소프렌 신타제 및 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 하나의 통합 플라스미드를 통해 미생물에 도입하는 경우, 상기 통합 플라스미드는 앰피실린 저항성 유전자(bla)(서열번호 18)를 카나마이신 저항성 유전자(nptII)(서열번호 19)로 치환한 것일 수 있다. 그러한 경우에, 플라스미드의 안정성 향상에 의해 이소프렌 생산량이 증가될 수 있다.
이소프렌 생산량 개선을 위해, 필요에 따라, 상기 통합 플라스미드의 도입시에 추가로 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 더 도입할 수도 있다.
또한, 상기 대장균은 발효 부산물 생성 효소를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
이소프렌 생산 반응 중에 발효에 의한 부산물로 아세테이트, 알코올, 락테이트, 아세토아세테이트, 포스포에놀파루베이트 등이 생성될 수 있는데, 이에 의해 메발로네이트 경로의 전구 물질인 아세틸-CoA가 소모된다. 결국, 이소프렌 생산 효율이 감소하게 된다. 발효는 예를 들면 이소프렌 생산과 더불어 혼합 유기산이 생성되는 발효일 수 있다.
그러나, 발효 부산물 생성 효소를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실되는 경우에는 전구 물질인 아세틸-CoA의 불필요한 소모를 막고, 이소프렌 생산성을 극대화 할 수 있다.
발효 부산물 생성 효소를 코딩하는 유전자는 예를 들면 락테이트 생성에 관여하는 dld, 아세토아세테이트 생성에 관여하는 atoD, atoA, 포스포에놀파루베이트 생성에 관여하는 pps 등을 들 수 있다. 상기 대장균은 이들 유전자 중 1개 이상의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 유전자가 모두 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
상기 유전자는 해당 대장균 균주 유래 서열일 수 있고, MG1655인 경우의 구체적인 예를 들면, dld는 서열번호 52의 뉴클레오티드 서열, atoAD는 서열번호 53의 뉴클레오티드 서열, pps는 서열번호 54의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 발효 부산물 생성 효소를 코딩하는 유전자로 아세테이트 생성에 관여하는 ackA -pta, poxB, 알콜 생성에 관여하는 adhE, 락테이트 생성에 관여하는 ldhA 등을 더 예로 들 수 있다. 상기 대장균은 이들 유전자 중 1개 이상의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 유전자가 모두 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
상기 유전자는 해당 대장균 균주 유래 서열일 수 있고, MG1655인 경우의 구체적인 예를 들면, ackA-pta는 서열번호 48의 뉴클레오티드 서열, poxB는 서열번호 49의 뉴클레오티드 서열, adhE는 서열번호 50의 뉴클레오티드 서열, ldhA는 서열번호 51의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 NudB 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
NudB 단백질은 대장균의 내재(or 고유) 효소로서, 이소프렌의 전구물질인 IPP와 DMAPP를 각각 3-methyl-3-buten-1-ol과 3-methyl-2-buten-1-ol로의 전환을 촉매한다.
즉, NudB의 작용에 의해 이소프렌의 전구 물질이 감소됨으로써, 이소프렌 생성량이 저하되게 되는 바, 본 발명은 NudB 단백질을 코딩하는 유전자를 감소 또는 결실시킴으로써 이소프렌 생산량을 더욱 증가시킬 수 있다.
NudB 단백질을 코딩하는 유전자는 대장균의 공지된 NudB 서열일 수 있고, 구체적인 예를 들자면 MG1655 균주인 경우 서열번호 77의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 대장균은 편모(flagellar)가 불활성화 또는 제거된 것일 수 있다.
편모는 대장균의 운동 기관으로, 대장균은 이를 통해 유영 운동을 하게 된다. 본 발명자는 편모를 불활성화 또는 제거시킴으로써 이소프렌 생산량을 더욱 증가시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 고안하였다.
편모를 불활성화시키거나 제거할 수 있는 것이라면 그 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들자면 편모의 형성에 필수적인, 편모의 형성을 촉진하는 유전자를 감쇄 또는 결실시킴으로써 수행할 수 있다.
구체적으로는 fliF, fliG, fliH, fliI, fliJ 및 fliK로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자를 결실 또는 불활성화시킬 수 있다.
예를 들면, fliF은 서열번호 87, fliG은 서열번호 88, fliH은 서열번호 89, fliI은 서열번호 90, fliJ은 서열번호 91, fliK은 서열번호 92의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 각각의 서열 외에도 상기 서열들을 포함하는 오페론이 결손 또는 불활성화된 것일 수도 있다.
상기 서열들을 포함하는 오페론은 예를 들면 서열번호 93의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
배양은 합성, 반합성, 또는 복합 배양 배지 상에서 수행될 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, TB (Terrific medium) 액체 배지 및 단백질 발현 물질이 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다.
탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글리세롤이다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 트립톤이다.
배양은 통상의 대장균 배양 조건으로 수행될 수 있다. 배양은 예를 들어 약 15-45℃, 예를 들면, 15-44℃, 15-43℃, 15-42℃, 15-41℃, 15-40℃, 15-39℃, 15-38℃, 15-37℃, 15-36℃, 15-35℃, 15-34℃, 15-33℃, 15-32℃, 15-31℃, 15-30℃, 20-45℃, 20-44℃, 20-43℃, 20-42℃, 20-41℃, 20-40℃, 20-39℃, 20-38℃, 20-37℃, 20-36℃, 20-35℃, 20-34℃, 20-33℃, 20-32℃, 20-31℃, 20-30℃, 25-45℃, 25-44℃, 25-43℃, 25-42℃, 25-41℃, 25-40℃, 25-39℃, 25-38℃, 25-37℃, 25-36℃, 25-35℃, 25-34℃, 25-33℃, 25-32℃, 25-31℃, 25-30℃, 27-45℃, 27-44℃, 27-43℃, 27-42℃, 27-41℃, 27-40℃, 27-39℃, 27-38℃, 27-37℃, 27-36℃, 27-35℃, 27-34℃, 27-33℃, 27-32℃, 27-31℃ 또는 27-30℃에서 수행될 수 있다.
배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체 만을 회수하거나 제거하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
배양의 일 예에 있어서, 배양은 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 글리세롤은 배지 중의 유일한 탄소원일 수 있다. 0.5-5.0%(w/v), 예를 들면, 0.5-4.5%(w/v), 0.5-4.0%(w/v), 0.5-3.5%(w/v), 0.5-3.0%(w/v), 0.5-2.5%(w/v), 0.5-2.0%(w/v), 1-5.0%(w/v), 1-4.5%(w/v), 1-4.0%(w/v), 1-3.5%(w/v), 1-3.0%(w/v) 또는 1-2.5%(w/v)의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배지는 글리세롤이 첨가된 TB 배지일 수 있다. TB 배지는 리터당 24g yeast extract, 12g 트립톤, 9.4g K2HPO4, 2.2g KH2PO4 (pH 7.0)이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 대장균의 경우 상기 배양하는 단계에서 상기 배지는 1 내지 3.0부피% 농도의 글리세롤을 포함하고, 상기 에세리키아 속 미생물은 대장균 MG1655이고, 상기 배양하는 단계는 TB 배지 50 ml, 25 내지 35℃에서 24 내지 48시간 동안 배양시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 배지는 대장균의 이소프렌 생산에 필요한 단백질의 발현량을 증가시키는 발현유도제를 더 포함할 수 있다.
이에 의해 이소프렌 생산량이 더욱 개선될 수 있다.
발현 유도제는 당 분야에 공지된 것이 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), 락토스(lactose)일 수 있고, 바람직하게는 락토스일 수 있다.
발현 유도제는 예를 들면 1g/l 내지 20g/l, 구체적으로는 1g/l 내지 10g/l의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 Mg2 +를 더 포함할 수 있다.
이에 의해 이소프렌 생산량이 더욱 개선될 수 있다.
Mg2 +는 예를 들면 5mM 이상, 구체적으로 10mM 이상, 보다 구체적으로 20mM 이상 포함될 수 있으며, 그 상한은 특별히 제한되지 않고 예를 들면 30mM일 수 있다. Mg2 +가 상기 범위로 포함되는 경우 이소프렌 생산성이 극대화 될 수 있다.
필요에 따라, 배양은 친유성 물질 존재 하의 배양 배지에서, 예를 들면 배지 표면에 친유성 물질인 도데칸 상(dodecane phase)을 위치시킨 상태로 수행될 수 있다.
친유성 물질은 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 파이토스쿠알란, 미네랄 오일, 이소프로필 미리스테이트, 세틸 에틸헥사노에이트, 디옥타노일 데카노일 글리세롤, 스쿠알란, 또는 이들의 조합일 수 있다.
친유성 물질은 생산되는 이소프렌을 안정화시키는 것뿐만 아니라, 대장균에 의한 이소프렌의 생산성을 증가시킬 수 있다. 친유성 물질은 대장균의 생장에 영향을 미치지 않거나 적게 영향을 미치는 것일 수 있다.
배양은 교반되는 상태에서 수행될 수 있다. 교반되는 경우, 100 내지 300rpm, 예를 들면, 100 내지 280rpm, 100 내지 260rpm, 100 내지 240rpm, 100 내지 220rpm, 100 내지 200rpm, 100 내지 180rpm, 100 내지 160rpm, 100 내지 140rpm, 100 내지 120rpm, 120 내지 300rpm, 120 내지 280rpm, 120 내지 260rpm, 120 내지 240rpm, 120 내지 220rpm, 120 내지 200rpm, 120 내지 180rpm, 120 내지 160rpm, 120 내지 140rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 280rpm, 150 내지 260rpm, 150 내지 240rpm, 150 내지 220rpm, 150 내지 200rpm, 150 내지 180rpm, 140 내지 160rpm, 200 내지 300rpm, 200 내지 280rpm, 200 내지 260rpm, 200 내지 240rpm, 200 내지 220rpm, 또는 150 rpm으로 교반될 수 있다.
교반되는 경우, 상기 친유성 물질, 예컨대 도데칸은 배지 중에서 분산되어 세포와 접촉된다. 친유성 물질은 배지 중에 분산됨으로써 미생물과 접촉하는 면적이 넓어져 배양 중 이소프렌을 효율적으로 세포로부터 분리되게 하여 안정화 및/또는 용해시킬 수 있다.
친유성 물질, 예컨대 도데칸 상의 존재 하에 배양 배지에서 상기 미생물을 배양시키게 되면 생산된 이소프렌이 세포 내에서 분해되기 전에 친유성 물질, 예컨대 도데칸 상에 흡수되게 되어 이소프렌 생산량을 향상시킬 수 있다.
상기 친유성 물질, 예컨대 도데칸 상은 대장균의 세포 성장에 영향을 미치지 않고, 소수성 이소프렌의 추출을 위해 소수성이고, 낮은 휘발성을 갖는 것일 수 있다.
배지 대 친유성 물질의 부피비는 특정 범위의 비로 한정되지 않고, 예컨대, 배지 대 친유성 물질의 부피비가 1:0.1-3.0, 1:0.2-3.0, 1:0.5-3.0, 1:1.0-3.0, 1:1.5-3.0, 1:2.0-3.0, 1:2.5-3.0, 1:0.2-2.5, 1:0.2-2.0, 1:0.2-1.5, 1:0.2-1.0, 1:0.2-0.5, 1:0.5-2.5, 1:0.5-2.0, 1:0.5-1.5, 1:0.5-1.0, 1:0.8-2.5, 1:0.8-2.0, 1:0.8-1.5, 1:0.8-1.2, 1:0.8-1.0 등이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따른 이소프렌 생산용 대장균은 이소프렌 생산능을 가지며, recA(recombinase A) 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 대장균이다.
상기 대장균은 예를 들면 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합일 수 있으며, 균체 생장 속도 및 이소프렌 생산성의 측면에서 바람직하게는 MG1655일 수 있다.
recA 단백질을 코딩하는 유전자는 해당 대장균 균주의 recA 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 이는 NCBI genbank 등을 통해 공지되어 있다. 예를 들어, MG1655 균주의 recA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 73의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 대장균은 전술한 이소프렌 생산에 필요한 효소를 내재적으로 발현하거나, 이들 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이들 효소를 발현시킬 수 있다. 상기 유전자들은 전술한 플라스미드로 도입된 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 전술한 발효 부산물 생성 효소를 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 전술한 NudB 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것일 수 있다.
또한, 상기 대장균은 전술한 편모가 불활성화 또는 제거된 것일 수 있다.
본 발명의 이소프렌의 생산 방법은 이소프렌 생산성이 매우 우수하다. 이에 따라, 짧은 시간 내에 많은 양의 이소프렌을 생산할 수 있어, 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.
본 발명의 이소프렌 생산용 대장균은 이소프렌 생산성이 우수하여, 고순도의 이소프렌을 다량으로 생산할 수 있다.
도 1은 메발로네이트 경로와 맵 경로를 포함한 이소프렌 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 인공합성한 포플러 트리코카파 이소프렌 신타제를 포함하는 플라스미드와 메발로네이트 경로를 포함하는 플라스미드가 동시에 도입된 대장균 균주의 세포생장과 이소프렌 생산량을 나타낸 것이다.
도 3은 이소프렌 신타제와 메발로네이트 경로를 동시에 가지는 통합 플라스미드에 의한 이소프렌 생산성을 나타낸 것이다.
도 4는 이소프렌 신타제와 메발로네이트 경로를 동시에 가지는 통합 플라스미드의 대장균 내 플라스미드 안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 통합 플라스미드의 안정성을 향상시킨 플라스미드를 도입한 대장균 형질전환체의 세포생장과 이소프렌 생산성 그리고 플라스미드 안정성을 나타낸 것이다.
도 6은 대장균 DH5α와 MG1655 간의 이소프렌 생산능 차이를 나타낸 것이다.
도 7은 MG1655의 recA와 relA 결손균주의 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MG1655와 MG1655의 nudB 결손 균주의 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 MG1655의 nudB 결손주, recA 결손주, nudB와 recA의 동시 결손균주의 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 MG1655와 MG1655의 fli operon 결손 균주의 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 AceCo 균주 제작과정을 도식화로 나타내었고, acetyl-CoA와 pyruvate를 대사경로와 AceCo 균주 제작을 위해 제거해야 할 유전자를 나타낸 것이다.
도 12는 탄소원 이용효율이 향상된 AceCo 균주와 대조군인 야생형 균주와 아세트산 생합성 경로인 ackA-pta 유전자가 결손된 균주의 세포생장과 이소프렌 생산성 그리고 유기산 생산성을 비교한 것이다.
도 13은 이소프렌 생산 플라스미드에 추가적인 idi 유전자를 도입하여 이소프렌 생산성 향상을 확인한 결과이다.
도 14는 IspS와 IDI 융합단백질을 이용한 이소프렌 생산성 향상 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 이소프렌 생합성경로 발현을 위한 발현 유도제로 IPTG와 lactose를 사용해서 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 이소프렌 생산용 배양 배지에서 Mg2 + 첨가 유무에 따른 이소프렌 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 대장균 숙주에 도입한 유전자 배열에 따른 이소프렌 생산성 향상 변화
(1) 이소프렌 생산을 위한 플라스미드 제작
이소프렌 생합성에 관여하는 유전자들의 정보는 하기 표 1에 나타내었고, 해당 유전자를 증폭하기 위한 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 이소프렌 생합성을 위한 전구체 생산에 관여하는 유전자들의 정보는 하기 표 1에 나타내었고 전구체 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 Yoon et al. (2007) 문헌의 pS-NA 플라스미드를 이용하였다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000001
이소프렌 생합성을 위해 상기 증폭한 유전자 또는 유전자 조합을 pTrc99A 벡터(Bacterial expression vector with inducible lacI promoter; amp resistance; restriction enzyme cloning)에 도입하여 이소프렌 생산용 벡터 4종을 제작하였다. 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa)의 이소프렌 신타제를 (ispS) 대장균의 코돈에 맞게 인공 합성하였다(서열번호 1). 인공합성을 위한 염기서열은 DNA2.0 프로그램을 이용하여 제작하였고, 유전자의 인공합성은 Genescript (USA)에 의뢰하였다. 인공합성한 포플러 트리코카파 이소프렌 신타제를 표 2의 프라이머 sPtispS-F와 sPtispS-R을 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후 제한효소 NcoI과 XbaI으로 절단한 후 pTrc99A 벡터의 동일 부위에 삽입하여 pT-sPtispS를 제작하였다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000002
다음으로 pTrc99A 벡터에 리보솜 결합 부위가 강화된 pTrc99SN을 제작하였으며(서열번호 15), 표 2의 프라이머 sPtispS-F와 sPtispS-R을 이용하여 PCR로 증폭하여 인공합성한 포플러 트리코카파 이소프렌 신타제를 삽입하여 pTSN-sPtispS를 제작하였다. 다음으로 상기 메발로네이트 경로가 도입된 플라스미드인 pS-NA로부터 전체 메발로네이트 경로를 증폭하여 (서열번호 2~7) 상기 제작한 pTSN-sPtispS 플라스미드의 XbaI 사이트에 도입하여 pTSN-sPtispS-MVA를 제작하였다. 다음으로 상기 제작한 pTSN-sPtispS-MVA의 앰피실린 저항성 유전자(서열번호 18)를 제한효소 BglII와 BspHI을 이용하여 제거하고, 동일 위치에 카나마이신 저항성 유전자(서열번호 19)를 삽입하여 pTSNK-sPtispS-MVA를 제작하였다.
상기 제작한 이소프렌 생산용 재조합 플라스미드 pT-sPtispS, pTSN-sPtispS, pTSN-sPtispS-MVA 그리고 pTSNK-sPtispS-MVA와 음성대조구인 pTrc99A 벡터를 대장균 DH5에 단독 또는 pS-NA 플라스미드와 동시에 도입하여 형질전환 하였으며, 사용된 형질전환방법은 Sambrook and Russell(2001)에 명시된 통상적인 방법을 따랐다.
(2) 대장균 DH5α 형질전환체를 이용한 이소프렌 생산
본 실시예에서는 상기 제작한 재조합 플라스미드인 pT-sPtispS, pTSN-sPtispS와 메발로네이트 경로 플라스미드인 pS-NA(서열번호 2~7의 유전자 도입)가 동시에 도입된 대장균 DH5α 형질전환체를 글리세롤을 포함하는 배지 중에서 배양하여 이소프렌을 생산한 내용을 포함한다.
대장균 DH5α에 pT-sPtispS와 pTSN-sPtispS를 메발로네이트 경로 플라스미드인 pS-NA와 각각 동시에 도입하여 리보솜 결합강도에 따른 이소프렌 생산성의 차이를 알아보았다.
이소프렌 생산능을 가진 형질전환체를 100 ㎍/ml의 앰피실린과 50 ㎍/ml의 크로람페니콜을 포함하는 5 ml의 TB 배지 (1리터 당 24g yeast extract, 12g tryptone, 9.4g K2HPO4, 2.2g KH2PO4)에 접종하여 30℃, 250rpm 조건으로 종배양한 후, 20g/L 글리세롤 및 100㎍/ml의 앰피실린과 50 ㎍/ml의 크로람페니콜을 포함하는 50 ml의 TB 배지에 접종하여 본배양하였다. 단백질 발현량을 높이기 위하여 발현유도제인 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 최종 농도 0.1 mM로 첨가하였다. 본배양은 홈이 파인 250 ml 삼각플라스크를 사용하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건에서 36 시간 배양하였다.
이소프렌의 정량 분석을 위한 샘플링은 배양 6시간 후부터 배양 36시간까지 2시간 간격으로 실시하였다. 배양액 700㎕와 동량의 도데칸 (CH3(CH2)10CH3)을 혼합하여 30℃에서 10분간 반응하였다. 형질전환체로부터 10분간 생산된 이소프렌은 도데칸으로 포집되고, 도데칸 층을 배지와 분리하여 정량분석을 실시하였다. 이소프렌 정량분석은 가스크로마토그래피를 이용하였다. 에질런트 (Agilent, 미국) 사의 7890A 모델 가스크로마토그래피를 사용하였으며, 시료분리를 위한 칼럼은 19091N-133 HP-INNOWAX 칼럼 (길이, 30 m; 내부구경, 0.25 mm; 필름두께, 250 um) 사용하였다. 오븐의 온도는 최초 50 ℃에서 시작하여 2분간 정치 후 분당 30℃ 비율로 최고 250 ℃까지 상승시켰다. 질소를 운반가스로 사용하였고, 가스유입 압력은 15.345 psi로 설정하였다. FID (flame ionization detector) 탐지기를 이용하였으며 온도는 280 ℃로 설정하였다. 이소프렌의 분리 시간은 1.53분 이고, 정량을 위한 이소프렌 표준물질은 시그마(Sigma, 미국)에서 구매하였다.
배양 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하면 IPTG 미첨가 배양에서 강한 리보솜 결합 부위를 가진 플라스미드인 pTSN-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체에서 약 450 mg/L 이소프렌을 생산량을 보였으며, 이는 약 280 mg/L 이소프렌을 생산한 pT-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체에 비해 약 1.6배 높은 수치이다. 두 균주 간의 시간당 최고 이소프렌 생산량의 차이는 약 10 mg/L/hr 이었으며, 균체 생장속도의 차이는 거의 나타나지 않았으며 최종 OD(optical density)는 약 25를 나타내었다.
IPTG를 첨가한 배양에서는 두 균주 모두 초기 균체 생장에 저해를 보였지만 최종 균체 생장은 IPTG 미첨가 배양과 차이를 보이지 않았다. 이소프렌 생산량 역시 초기 균체 생장의 저해로 인하여 IPTG 미첨가 배양에 비해 초기 이소프렌 생산량은 낮지만 배양 18시간 이후부터 균체 생장과 함께 높아지는 양상을 보였고, pTSN-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체에서 420 mg/L 이소프렌을 생산하여 pT-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체에 (260 mg/L) 비해 1.6배 높은 생산성을 나타내었다.
최종적으로 강한 리보솜 결합 부위를 가진 플라스미드인 pTSN-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체의 이소프렌 생산성이 pT-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체에 비해 우수하였다. 이는 강한 리보솜 결합 부위로 인한 이소프렌 신타제의 발현량이 높아진 결과라고 볼 수 있다.
단백질 발현량 증가를 위한 IPTG 첨가 배양에서 초기 균체 생장의 저해를 보이는 원인은 다음과 같다. 강한 프로모터와 플라스미드 복제수가 높은 벡터에 클로닝된 이소프렌 신타제의 발현량이 상대적으로 약한 프로모터와 플라스미드 복제수가 낮은 벡터에 클로닝된 메발로네이트 경로에 비해 월등히 높다. 이로 인해 전구체인 DMAPP를 과소비하여 균체 생장에 필요한 DMAPP 부족현상에 따른 결과라고 판단된다.
(3) 전구체 생산 경로 발현량 증가에 따른 이소프렌 생산성 향상
본 실시예에서는 상기 실시예 1-(2)의 DMAPP 부족으로 인한 균체 생장 저해의 문제점을 해결하기 위하여 메발로네이트 경로의 발현량을 높인 플라스미드를 활용한 이소프렌 생산성 향상에 대한 내용을 포함한다. 메발로네이트 경로의 발현량을 높인 플라스미드인 pTSN-sPtispS-MVA 통합 플라스미드를 제작하고, 이 플라스미드의 안정성 향상을 위하여 앰피실린 저항성 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 대체한 pTSNK-sPtispS-MVA를 제작하였다.
이 두 가지 플라스미드의 제작 방법은 상기 실시예 1-(1)에 언급하였다.
먼저, 메발로네이트 경로의 발현량을 높인 pTSN-sPtispS-MVA를 도입한 대장균 DH5α 형질전환체를 만들고 pTSN-sPtispS와 pS-NA가 동시 도입된 형질전환체를 대조군으로 하여 이소프렌 생산성 향상 여부를 확인하기 위한 배양을 실시하였다.
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3을 참조하면 메발로네이트 경로의 발현량을 높인 통합 플라스미드를 도입한 균주에서 대조군에 비해 약 3배 높은 1.25 g/L 이소프렌 생산량을 나타내었다. 시간당 이소프렌 생산량(최고 약 90 mg/L/hr)과 단위 세포당 이소프렌 생산량(최고 약 5.5 mg/L/hr/OD600nm) 역시 통합 플라스미드를 도입한 균에서 대조군에 비해 월등히 높게 나타났다. 하지만 균체 성장 저해는 나타나지 않았다.
상기 이소프렌 생산성 향상은 상기 실시예 1-(2)의 DMAPP 부족 문제점을 전구체 생산경로인 메발로네이트 경로의 발현 증가를 통하여 극복한 결과라고 할 수 있으며, IspS와 MVA 경로의 균형적인 발현으로 인한 이소프렌 생산성 향상 결과라고 할 수 있다.
(4) 플라스미드 안정성 향상을 통한 이소프렌 생산성 향상
본 실시예에서는 상기 실시예 1-(3)에서 사용된 통합 플라스미드가 배양중 손실되는 문제점을 해결하기 위하여 통합 플라스미드 상의 앰피실린 저항성 유전자를 코딩하는 bla(서열번호 18)를 카나마이신 저항성 유전자를 코딩하는 nptII(서열번호 19)로 교체한 플라스미드를 활용한 이소프렌 생산성 향상에 대한 내용을 포함한다.
통합 플라스미드를 포함하는 대장균 배양 중 플라스미드의 손실 여부를 확인하였다. 플라스미드의 안정성 확인은 배양과정에서 6시간 단위로 배양중인 배양액을 배지와 희석하여 항생제가 없는 고체 배지와 항생제가 포함된 고체배지에 동량을 각각 도말하고 측정하였다. 플라스미드의 안정성 계산은 항생제가 없는 배지의 콜로니 수를 100%로 하여 항생제가 포함된 배지의 콜로니 수를 %로 나타내었다.
플라스미드 안정성 확인 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하면 플라스미드 안정성 확인 결과, IPTG를 첨가하지 않은 배양에서는 배양 종료 시점인 36시간에 플라스미드를 포함하는 대장균의 수가 50% 이하인 것을 확인하였고, IPTG를 첨가한 배양에서는 월등히 더 높은 비율로 플라스미드가 손실되는 것을 확인하였다.
상기 플라스미드 안정성이 낮은 문제를 해결하기 위하여 통합 플라스미드 상의 앰피실린 저항성 유전자를 코딩하는 bla를 카나마이신 저항성 유전자를 코딩하는 nptII로 교체하여 새로운 pTSNK-sPtispS-MVA 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드 안정성 향상에 따른 이소프렌 생산성 변화를 확인하기 위하여 배양을 실시하였다
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5를 참조하면 안전성이 향상된 플라스미드를 도입한 균주에서 대조군에 비해 약 1.3 배 높은 약 1.6 g/L 이소프렌을 생산하였다. 플라스미드 안정성 또한 대조군에 비해 월등히 높게 나타났으며 배양 종료시점인 36시간에 90% 이상의 플라스미드를 유지하고 있는 것으로 나타났다. 배양 14시간 이후부터 카나마이신 저항성 유전자를 가진 플라스미드를 도입한 균주에서 시간당 이소프렌 생산량과 단위 세포당 이소프렌 생산량이 높아지는 것으로 확인되었다. 이는 플라스미드의 안정성 향상으로 인한 결과라고 할 수 있다.
2. 대장균 숙주 균주의 개량을 통한 이소프렌 생산성 향상
(1) 대장균 균주에 따른 이소프렌 생산성 변화
실시예 1에서 사용한 대장균 균주인 DH5α는 티아민 (thiamine) 생합성 유전자 결손 균주이므로 자체적으로 티아민 생산을 할 수 없다. 이러한 이유로 배지 내 티아민을 첨가해야 하는 비용적 부담이 있다. 또한 산업적으로 많이 사용되고 있는 대장균 MG1655 균주에 비해 생장 속도가 느린 단점이 있다.
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 언급한 숙주 대장균인 DH5α와 MG1655 균주간의 이소프렌 생산 능력을 비교하고, 두 숙주 대장균 간의 이소프렌 생산성에 영향을 미치는 유전 인자를 파악하여 산업적으로 더 유용한 균주인 MG1655를 이소프렌 생산을 위한 숙주 균주로 활용하는 내용을 포함한다.
먼저 대장균 DH5α와 MG1655 균주에 각각 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 이소프렌 생산성을 비교하였다.
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6을 참조하면 대장균 DH5α 형질전환체가 MG1655 형질전환체에 비해 이소프렌 생산량이 약 3.2배 높게 나타났다. 균체의 생장은 MG1655 형질전환체가 더 빠른 양상을 보였지만 pH의 빠른 하락과 더불어 최종 균체 생장량은 약간 낮은 것을 확인하였다.
이러한 이소프렌 생산성 차이는 대장균 균주 간의 유전적 특징에 의한 결과라고 판단되며, 아울러 MG1655 균주의 경우 탄소원을 과도하게 빠르게 소모하면서 유기산 등의 발효 부산물이 생성 및 축적되고, 그 결과 빠른 pH 하락이 발생하여 이소프렌 생산성 저하를 유발하였다고 판단된다.
(2) 대장균 균주 간 이소프렌 생산성 차이를 나타내는 인자 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 2-(1)의 결과를 바탕으로 숙주 대장균인 DH5α와 MG1655 균주의 이소프렌 생산성 차이를 나타내는 유전인자를 파악하여 대장균 MG1655 균주의 유전형질을 변화시킴으로써 이소프렌 생산성이 대장균 DH5α 균주와 유사 또는 향상된 결과를 나타내도록 하는 내용을 포함하고 있다.
대장균 DH5α 균주에 결손되어 있는 유전자인 recA(서열번호 76)와 relA를 야생형 MG1655 균주에서 각각 결손을 시킨 MG1655 ΔrecA, MG1655 ΔrelA 균주를 각각 제작하였다. 유전자의 결손은 유전자 결손 키트 (Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit By Red®/ET® Recombination, Gene Bridges, Germany)를 사용하였으며, 키트의 사용방법을 따라 유전자를 결손하였다.
각각의 유전자 결손 대장균 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA와 pS-NA를 동시 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 대조군으로 야생형 대장균 MG1655와 DH5α의 형질전환체들을 이용하여 이소프렌 생산성을 비교하였다.
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7을 참조하면 MG1655 recA 균주가 야생형 MG1655와 DH5α 균주들에 비해 각각 약 4.6배와 약 1.3배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 하지만 relA 결손균주는 야생형 MG1655와 이소프렌 생산성 차이를 보이지 않았다.
이러한 연구결과를 바탕으로 DH5α와 MG1655(DE3) 간에 이소프렌 생산성의 차이를 나타내는 유전인자가 recA 임을 확인하였다.
(3) nudB 결손을 통한 이소프렌 생산성 증가
본 실시예에서는 이소프렌의 전구물질인 IPP와 DMAPP를 각각 3-methyl-3-buten-1-ol과 3-methyl-2-buten-1-ol로 전환시켜주는 유전자인 nudB를 결손시킴으로써 이소프렌 생산성을 향상시킨 내용과 결과를 포함하고 있다.
이소프렌 신타아제의 전구체인 DMAPP의 불필요한 소모를 차단해서 이소프렌 생산성을 향상시키고자 야생형 MG1655 균주의 NudB 유전자(서열번호 77)가 결손 된 균주를 제작하였다.
유전자 결손을 위한 PCR 프라이머는 표 3에 나타내었다. 결손 균주의 제작은 실시예 2-(2)와 동일한 방법으로 진행하였고, 제작된 균주를 MG1655△nudB 라고 명명하였다.
MG1655△nudB 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 대조군으로 야생형 대장균 MG1655 형질전환체를 이용하여 이소프렌 생산성을 비교하였다.
이소프렌 생산능을 가진 형질전환체를 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 5 ml의 TB 배지 (1리터 당 24g yeast extract, 12g tryptone, 9.4g K2HPO4, 2.2g KH2PO4)에 접종하여 37 ℃, 250 rpm 조건으로 종배양한 후, 20 g/L 글리세롤 및 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 50 ml의 TB 배지에 접종하여 본배양하였다. 단백질 발현량을 높이기 위하여 발현유도제인 락토스(lactose)를 최종 농도 5 g/l로 첨가하였다. 본배양은 홈이 파인 250 ml 삼각플라스크를 사용하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건에서 36 시간 배양하였다. 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8을 참조하면 MG1655 nudB 균주가 야생형 MG1655 균주에 비해 약 1.35배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통하여 nudB의 결손이 이소프렌 생산성 향상에 도움이 된다는 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000003
(4) nudB와 recA 동시 결손을 통한 이소프렌 생산성 증가
본 실시예 에서는 실시예 2-(2)와 2-(3)의 결과를 바탕으로 nudB와 recA를 함께 결손 시킴으로써 이소프렌 생산성을 향상시킨 내용과 결과를 포함하고 있다.
MG1655△nudB 균주에 MG1655△recA 균주를 P1 transduction을 통하여 통합하여 MG1655△nudB,recA 균주를 제작하였고, MG1655△nudB,recA 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 대조군으로 MG1655△recA와 MG1655△nudB 균주 형질전환체들을 이용하여 이소프렌 생산성을 비교하였다.
배양을 위한 배지와 배양조건은 상기 실시예 2-(3)과 동일하며, 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하다.
배양 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9를 참조하면 MG1655 nudB,recA 균주가 MG1655△recA와 MG1655△nudB 균주들에 비해 각각 약 1.4배와 약 2.15배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통하여 nudB와 recA의 동시 결손이 이소프렌 생산성 향상에 도움이 된다는 것으로 확인되었다.
(5) 편모의 제거를 통한 이소프렌 생산성 확인
본 실시예에서는 편모(flagellar) 형성에 관여하는 유전자들 (fliF(서열번호 87), fliG(서열번호 88), fliH(서열번호 89), fliI(서열번호 90), fliJ(서열번호 91), fliK(서열번호 92))을 포함하는 오페론(서열번호 93)을 결손시킴으로써 이소프렌 생산성을 향상시킨 내용과 결과를 포함하고 있다.
편모를 작동시키기 위해서는 많은 양의 ATP가 소모된다. 하지만 야생이 아닌 인위적으로 조절 되는 미생물 생육에 적합한 배양 환경에서는 편모의 작동이 필수적이지 않다. ATP의 불필요한 소모를 차단해서 이소프렌 생산성을 향상시키고자 야생형 MG1655 균주의 편모 형성에 관여하는 유전자들의 오페론을 결손하여 편모가 제거된 MG1655 균주를 제작하였다.
유전자 결손을 위한 PCR 프라이머는 표 3에 나타내었다. 결손 균주의 제작은 실시예 2-(2)와 동일한 방법으로 진행하였고, 제작된 균주를 MG1655△fli operon 라고 명명하였다.
MG1655△fli operon 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 대조군으로 야생형 대장균 MG1655 형질전환체를 이용하여 이소프렌 생산성을 비교하였다.
이소프렌 생산능을 가진 형질전환체를 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 5 ml의 2YT 배지 (1리터 당 10g yeast extract, 16g tryptone, 5g NaCl)에 접종하여 37 ℃, 250 rpm 조건으로 종배양한 후, 20 g/L 글리세롤 및 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 50 ml의 MR 배지(1리터 당 KH2PO4 22g, (NH4)2HPO4 3g, MgSO4·7H2O 0.7g, Citrate 0.8g, Trace metal solution(1리터 당 ZnSO4·7H2O 0.55g, MnSO4·H2O 1.25g, Na2B4O7·10H2O 0.05g, FeSO4·7H2O 50g, CuSO4·5H2O 2.5g, CaCl2 5g, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.25g) 2ml)에 접종하여 본배양하였다. 단백질 발현량을 높이기 위하여 발현유도제인 lactose를 최종 농도 5 g/l로 첨가하였다. 본배양은 홈이 파인 250 ml 삼각플라스크를 사용하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건에서 48 시간 배양하였다. 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10을 참조하면 MG1655fli operon 균주가 야생형 MG1655 균주에 비해 약 1.3배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통하여 편모의 제거가 이소프렌 생산성 향상에 도움이 된다는 것으로 확인되었다.
3. 탄소원 이용 효율 향상에 따른 이소프렌 생산성 증가
(1) 탄소원 이용 효율이 향상된 균주의 제작
본 실시예에서는 탄소원 이용 효율이 향상된 대장균 MG1655 균주 제작과 관련된 내용을 포함하고 있다.
메발로네이트 경로의 전구체인 acetyl-CoA의 불필요한 소모를 차단해서 이소프렌의 생산성과 탄소원의 이용효율을 향상시키고자 야생형 MG1655 균주의 유기산 및 알코올 생합성에 관여하는 9개의 유전자가 결손된 균주를 제작하였다.
유전자 결손을 위한 PCR 프라이머와 결손 균주의 목록과 결손과정은 표 4과 도 11에 나타내었다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000004
야생형 MG1655 균주의 acetate 생성에 관여하는 ackA-pta(서열번호 48)와 poxB(서열번호 49), 알콜 생성에 관여하는 adhE(서열번호 50), lactate 생성에 관여하는 ldhA(서열번호 51)와 dld(서열번호 52), acetoacetate 생성에 관여하는 atoDA(서열번호 53), phosphoenolpyruvate 생성에 관여하는 pps(서열번호 54)를 제거하였다. 결손 균주의 제작은 λ-Red recombinase를 이용한 homologous recombination 방법을 통하여 각각의 유전자가 결손된 균주를 제작하고, 제작된 유전자 결손 균주를 바탕으로 추가적인 유전자 결손 균주를 제작할 경우, 동일한 프로모터, 터미네이터, FRT site 등이 이미 균주 내에 존재하여 recombination을 이용한 방법을 사용할 수가 없기 때문에 각각의 유전자 결손들을 P1 transduction을 통하여 서로 합치는 방법을 사용하였다. 최종적으로 발효 부산물 생성에 관련된 9가지 유전자가 결손된 균주를 제작하였고, 이 균주를 MG1655 AceCo로 명명하였다.
AceCo 균주 제작과정에 사용된 PCR 프라이머와 최종 AceCo 제작 과정은 표 4과 도 11에 나타내었다. 실 예로 IS1 균주의 제작과정을 상세히 기술하면, 대장균의 ackA-pta 유전자(서열번호 48)의 가장자리 50 bp를 각각 포함하는 프라이머인 ΔackA-pta-F와 ΔackA-pta-R을 이용하여 프로모터, 마커유전자, FRT site, 터미네이터를 포함하는 유전자군(서열번호 55)을 PCR을 통해 증폭하고, 증폭된 DNA 조각을 대장균에 도입하여 λ-Red recombinase를 통한 homologous recombination을 유도하여 제작하였다. 유전자 결손 균주의 선별은 1차적으로 도입된 항생제 저항성 유전자에 상응하는 고체 항생제 배지를 통해 이루어졌고, 최종 결손 균주의 확인은 ackA-ptaCF-F와 ackA-ptaCF-R 프라이머를 이용한 PCR을 통해 유전자 결손을 확인하였다.
표 4와과 도 11을 참조하면, 먼저 IS1~IS7과 같이 하나의 유전자 혹은 오페론이 결손된 균주를 homologous recombination 방법을 통하여 각각의 유전자가 결손된 균주를 제작하고, IS1과 IS2를 P1 transduction을 통하여 서로 합친 IS8 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 IS8 균주에 IS3~IS6 균주를 P1 transduction을 통하여 순차적으로 통합하여 IS9~IS12 균주를 제작하였고 최종 IS12와 IS7 균주를 통합하여 AceCo 균주를 제작하였다.
(2) 탄소원 이용 효율이 향상된 균주를 이용한 이소프렌 생산성 향상 과 발효부산물 차단 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 3-(1)에서 제작된 MG1655 AceCo 균주에 상기 실시예 1-(4)의 pTSNK-sPtispS-MVA 플라스미드를 도입하여 이소프렌 생산성 향상과 발효부산물 생성 차단을 확인한 결과를 포함하고 있다.
대조군으로는 야생형 대장균 MG1655와 MG1655에서 아세트산 생합성 경로 유전자인 ackA-pta 유전자를 제거한 결손주를 이용하였다. 대장균 MG1655에 ackA-pta 유전자가 결손된 균주는 상기 실시예 3-(1)에서 언급한 λ-Red recombinase를 이용한 homologous recombination 방법을 통하여 제작되었다. 제작에 사용된 프라이머는 표 4에 나타내었다.
배양을 위한 배지와 배양조건, 그리고 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다. 발효 부산물 분석은 시마즈(Shimadzu) 사의 액체크로마토그래피 (HPLC, LC-20A)를 사용하였다. 물질 분리를 위한 칼럼은 바이오라드(BIO-RAD) 사의 이온교환 칼럼 (AminexR, HPX-87H, 7.8 x 300 ㎜)을 사용하였다. 이동상으로 5 mM 황산을 사용하였으며 분당 0.6ml 속도로 이동 시켰다. 오븐의 온도는 40℃를 유지하였다. 배지 내 잔여 글리세롤의 분석은 RID 탐지기를 사용하였으며, 물질 분리를 위한 칼럼은 크로마실(Chromacyl) 사의 소수성 (100-5NH2, 250 x 4.6 ㎜) 칼럼을 사용하였다. 이동상으로 75% acetonitrile을 분당 1.5 ml 속도로 이동 시켰다. 정량 분석을 위한 표준물질은 시그마 사의 제품을 이용하였다.
배양 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12를 참조하면 이소프렌 생산량에서 AceCo 균주가 대조군인 야생형 MG1655에 비해 약 3.5배, ackA-pta 결손 균주에 비해 약 2.6배 높은 생산량을 나타내었다. 반면 발효부산물인 아세트산 생산량은 AceCo 균주가 대조군인 야생형 MG1655에 비해 약 5.6배, ackA-pta 결손 균주에 비해 약 5.0배 낮은 1.3 g/L을 생산하였다. 세포내 acetyl-CoA 농도의 척도가 되는 전구체인 pyruvate의 농도는 AceCo 균주에서 3.1 g/L 농도로 확인되어 대조군인 야생형 MG1655와 ackA-pta 결손 균주에 비해 월등히 높은 농도를 나타내었다.
따라서 발효부산물 생합성경로를 차단하여 MVA 경로의 전구물질인 acetyl-CoA의 불필요한 소모를 막고, 탄소원 이용효율을 향상시켰을 경우 이소프렌 생산성을 월등히 향상시킬 수 있다는 연구결과를 확인하였다. 또한 아세트산 생합성에 관여하는 ackA와 pta의 유전자만을 결손 했을 경우, 아세트산 생산을 억제하는 효과가 없으며, 이소프렌 생산성 향상에도 도움을 주지 못하는 것으로 나타났다.
4. 이소프렌 전구체에서 이소프렌으로 효율적 전환을 통한 이소프렌 생산성 향상
(1) 다양한 미생물 유래 idi 유전자 추가도입에 의한 이소프렌 생산성 향상 확인
본 실시예 에서는 상기 실시예 1에서 제작된 플라스미드에 다양한 미생물 유래 idi 유전자를 추가 도입하여 새로운 플라스미드를 제작하고, 이를 이용한 이소프렌 생산성 향상 확인을 위한 배양 결과를 포함하고 있다.
상기 실시예 1-(1)에서 제작된 pTSN-sPtispS 플라스미드의 XbaI 제한효소 사이트를 이용하여 에세리키아 속(서열번호 7), 헤마토코커스 속(서열번호 10), 사이네코시스티스 속(서열번호 8), 스트렙토코커스 속(서열번호 9) idi 유전자를 삽입하였다. 실 예로 pTSN-sPtispS-Ecidi 플라스미드의 제작을 상세히 기술하면, 프라이머 Ecidi-F와 Ecidi-R을 이용하여 대장균의 지놈으로부터 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자를 pTSN-sPtispS의 XbaI 사이트에 도입하여 최종 완성하였다. 상기 네가지 idi 유전자를 동일한 방법으로 제작한 결과 pTSN-sPtispS-Ecidi, pTSN-sPtispS-HPidi, pTSN-sPtispS-Syidi 그리고 pTSN-sPtispS-Snidi 플라스미드를 제작하였다. 유전자 idi 추가 도입을 위해 사용된 PCR 프라이머는 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000005
상기 플라스미드들을 대장균 MG1655 AceCo ΔrecA 균주에 pS-NA와 같이 도입하여 형질전환체를 만들고 이소프렌 생산성 향상 여부를 확인하였다.
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 0.5 mM IPTG를 첨가하여 배양하였다.
배양 결과는 도 13에 나타내었다. 도 13을 참조하면 사이네코시스티스 속의 idi 유전자가 추가 도입된 균주가 가장 높은 이소프렌 생산량을 나타내었고, 나머지 idi 들이 추가된 균주 또한 대조군에 비해 높은 이소프렌 생산량을 나타내었다.
이 결과를 통하여 추가적인 idi의 도입이 이소프렌 생산성 향상에 도움이 되며 사이네코시스티스 속의 idi가 가장 효율이 좋은 것으로 확인되었다.
(2) 융합단백질 제작과 활용에 따른 이소프렌 생산성 향상 확인
본 실시예 에서는 상기 실시예 4-(1)의 결과를 바탕으로 이소프렌 생산성 향상 결과를 보인 사이네코시스티스 속 idi와 대장균 고유의 에세리키아 속 idi를 이소프렌 신타제와 융합한 형태의 융합단백질을 제작하고, 이를 이용한 이소프렌 생산성 향상 결과를 포함하고 있다.
이소프렌 신타제의 종결코돈을 제거(프라이머 FispS-F와 FispS-R을 이용하여 PCR로 증폭)하여 pTrc99SN 벡터의 NcoI과 XbaI 사이트에 클로닝을 한 후 세린-글리신 링커를 포함한 idi 유전자(프라이머 REcidi-F와 REcidi-R 또는 RSyidi-F와 RSyidi-R을 이용하여 PCR로 증폭)를 XbaI 사이트를 이용하여 이소프렌 신타제의 뒤쪽에 삽입하여 두 개의 유전자가 하나의 단백질로 발현되도록 설계하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pTSN-sPtispS-L-Sydid와 pTSN-sPtispS-L-Ecidi로 각각 명명하였다. 또한 idi (프라이머 FEcidi-F와 FEcidi-R 또는 FSyidi-F와 FSyidi-R을 이용하여 PCR로 증폭)를 pTrc99SN 벡터의 NcoI과 XbaI 사이트에 클로닝 후 세린-글리신 링커를 포함한 이소프렌 신타제(프라이머 RispS-F와 RispS-R을 이용하여 PCR로 증폭)를 XbaI 사이트를 이용하여 idi 유전자의 뒤쪽에 삽입한 형태의 pTSN-Syidi-L-sPtispS와 pTSN-Ecidi-L-sPtispS를 각각 제작하였다. 융합단백질을 코딩하는 유전자 제작에 사용된 PCR 프라이머는 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2017000990-appb-T000006
상기 제작된 네가지 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 플라스미드들을 pS-NA와 대장균 DH5α에 동시 도입하여 이소프렌 생산성 향상 여부를 확인하기 위한 배양을 실시하였다
배양을 위한 배지와 배양조건 그리고 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 14에 나타내었다. 도 14를 참조하면 배양결과 IspS와 에세리키아 속 IDI 융합단백질이 사이네코시스티스 속 IDI 융합 단백질에 비해 높은 이소프렌 생산량을 나타내었으며, 특히 에세리키아 속 IDI가 IspS의 앞쪽에 융합된 형태에서 가장 높은 이소프렌 생산성을 나타내었고, 대조군에 비해 약 2.4배 높은 이소프렌 생산량을 보였다.
이러한 결과를 바탕으로 IspS와 IDI 융합단백질이 보다 효율적으로 IPP를 이소프렌으로 전환한다는 것을 확인하였다.
5. 배양 조건에 따른 이소프렌 생산성 확인
(1) 유도물질의 종류에 따른 이소프렌 생산성 확인
본 실시예에서는 단백질 발현량을 높이기 위한 발현유도제의 종류에 따른 이소프렌 생산성 확인을 위한 결과를 포함하고 있다.
Lactose는 β-galactosidase에 의해 glucose와 galactose로 분해된다. 그리고 glucose와 galactose는 β-galactosidase의 역반응에 의해 lactose로 합성되기도 하는데 이때 일정 확률로 allolactose가 생성되며 이 allolactose가 발현유도제로 작용한다. 이러한 사실을 바탕으로 균체량이 증가함에 비례하여 β-galactosidase의 발현량이 증가하고 그에 비례하여 allolactose의 양이 증가할 것이라고 예상한다. 균체량에 비례하여 이소프렌 생합성 관련 유전자들의 발현을 적절히 조절하기 위해 lactose를 첨가하여 이소프렌 생산성을 확인하였다.
MG1655△recA 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 이소프렌 생산능을 가진 형질전환체를 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 5 ml의 TB 배지 (1리터 당 24g yeast extract, 12g tryptone, 9.4g K2HPO4, 2.2g KH2PO4)에 접종하여 37 ℃, 250 rpm 조건으로 종배양한 후, 20 g/L 글리세롤 및 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 50 ml의 TB 배지에 접종하여 본배양하였다. 단백질 발현량을 높이기 위하여 발현유도제를 각각 IPTG를 최종 농도 0.03 mM, Lactose를 최종 농도 5 g/l, 10 g/l, 20g/l 로 첨가하였다. Lactose를 20 g/l 첨가한 조건에서는 글리세롤을 첨가하지 않았다. 본배양은 홈이 파인 250 ml 삼각플라스크를 사용하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건에서 36 시간 배양하였다. 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 15에 나타내었다. 도 15를 참조하면 글리세롤과 함께 lactose를 첨가한 조건에서 IPTG를 첨가한 조건에 비해 약 2.3배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통하여 발현유도제로써 락토스의 첨가는 이소프렌 생산성 향상에 도움이 된다는 것으로 확인되었다.
(2) 보조인자 Mg2 +의 첨가에 따른 이소프렌 생산성 확인
본 실시예에서는 이소프렌 신타아제의 보조인자인 Mg2 +을 추가로 첨가하여 이소프렌 생산성 확인을 위한 결과를 포함하고 있다.
이소프렌 신타아제는 20 mM의 Mg2 +이 보조인자로 존재하는 조건에서 최적 활성을 나타낸다고 보고된다. 따라서 과량의 Mg2 +을 첨가하여 이소프렌 생산성을 확인하였다.
MG1655△recA 균주에 pTSNK-sPtispS-MVA를 도입하여 대장균 형질전환체를 만든 후 이소프렌 생산능을 가진 형질전환체를 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 5 ml의 2YT 배지 (1리터 당 10g yeast extract, 16g tryptone, 5g NaCl)에 접종하여 37 ℃, 250 rpm 조건으로 종배양한 후, 20 g/L 글리세롤 및 50 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 50 ml의 MR 배지(1리터 당 KH2PO4 0.6g, MgSO4·7H2O 0.492g, Na2HPO4O7·2H2O 2.56g, NaCl2 0.1g, NH4Cl 0.2g)에 접종하여 본배양하였다. 단백질 발현량을 높이기 위하여 발현유도제인 lactose를 최종 농도 5 g/l로 첨가하였고 보조인자 Mg2 +을 30 mM 첨가하였다. 본배양은 홈이 파인 250 ml 삼각플라스크를 사용하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건에서 60 시간 배양하였다. 이소프렌 정량 방법은 상기 실시예 1-(2)의 방법과 동일하며 IPTG는 첨가하지 않았다.
배양 결과는 도 16에 나타내었다. 도 16을 참조하면 MR 배지가 포함하고 있는 Mg2 +의 양에 추가로 30mM Mg2 +을 첨가한 조건에서 Mg2 +을 추가로 첨가하지 않은 조건에 비해 약 1.65배 높은 이소프렌 생산량을 나타내는 것으로 확인되었다. 이 결과를 통하여 보조인자로써 Mg2 +의 첨가는 이소프렌 생산성 향상에 도움이 된다는 것으로 확인되었다.

Claims (29)

  1. 이소프렌 생산능을 가지며 recA 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 대장균을 탄소원을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 이소프렌의 생산 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합인 이소프렌의 생산 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 MG1655인 이소프렌의 생산 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 recA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 76의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이소프렌의 생산 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 이소프렌 신타제, 및 엔테로코커스 속 (Enterococcus) 또는 스트렙토코커스 속 (Streptococcus) 메발로네이트 경로의 효소를 발현하는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제(isoprene synthase)를 코딩하는 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 갖는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 유전자는 그에 대응되는 리보솜 결합 부위 서열의 전사시작비율 값이 3,000au 이상인 플라스미드에 도입된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 2의 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 acetoacetyl-CoA 신타제와 HMG-CoA 리덕타제의 기능을 동시에 갖는 효소를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 다이포스페이트 카복실아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 포스포메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 7의 대장균 MG1655 (Escherichia coli MG1655) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 갖는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 8의 사이네코 시스티스 (Synechocystis sp. PCC6803) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자, 서열번호 9의 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 10의 헤마토코쿠스 플라비아리스 (Haematococcus plavialis) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 중 선택된 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 더 갖는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 11의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제와 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 12의 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제 와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 13의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제 와 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 14의 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 dld, atoD, atoA 및 pps로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 대장균은 ackA -pta, poxB, adhE 및 ldhA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 NudB 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 77의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 대장균은 편모가 불활성화 또는 제거된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 대장균은 fliF, fliG, fliH, fliI, fliJ 및 fliK로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화된 것인 이소프렌의 생산 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 락토스를 포함하는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 Mg2 +를 포함하는 것인 이소프렌의 생산 방법.
  19. 이소프렌 생산능을 가지며 recA 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 이소프렌 생산용 대장균.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합인 이소프렌 생산용 대장균.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 MG1655인 이소프렌 생산용 대장균.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 recA 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 76의 뉴클레오티드 서열을 갖는 이소프렌 생산용 대장균.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 1의 포플러 트리코카파 (Populus trichocarpa) 유래의 이소프렌 신타제(isoprene synthase)를 코딩하는 유전자, 서열번호 2의 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 acetoacetyl-CoA 신타제와 HMG-CoA 리덕타제의 기능을 동시에 갖는 효소를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 다이포스페이트 카복실아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 6의 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 포스포메발로네이트 카인아제를 코딩하는 유전자, 및 서열번호 7의 대장균 MG1655 (Escherichia coli MG1655) 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자를 내재적으로 또는 도입에 의해 갖는 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 서열번호 11의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제와 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 12의 대장균 MG1655 유래의 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제 와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 서열번호 13의 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제 와 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 14의 사이네코 시스티스 이소프레닐 파이로포스페이트 이소머라제와 포플러 트리코카파 유래의 이소프렌 신타제의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  25. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 dld, atoD, atoA 및 pps로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  26. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 NudB 단백질을 코딩하는 유전자가 감쇄 또는 결실된 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  27. 청구항 19에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 77의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  28. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 편모가 불활성화 또는 제거된 것인 이소프렌 생산용 대장균.
  29. 청구항 19에 있어서, 상기 대장균은 fliF, fliG, fliH, fliI, fliJ 및 fliK로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화된 것인 이소프렌 생산용 대장균.
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