WO2015060649A1 - O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 - Google Patents

O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 Download PDF

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seq
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microorganism
succinyl
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김소영
신용욱
나광호
엄혜원
허인경
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01046—Homoserine O-succinyltransferase (2.3.1.46)

Definitions

  • the present invention provides an isolated polypeptide having resistance to feedback inhibition by methionine and homoserine O-succinyltransferase activity, an O-succinyl homoserine producing microorganism expressing the polypeptide and O-succinyl homo using the same. It is about how to produce serine.
  • O-succinyl homoserine or O-acetyl homoserine are known to use as an intermediate to biosynthesize methionine.
  • O-succinyl homoserine is bound to homoserine (homoserine O-succinyltransferase (MetA) which binds the succinyl group of Succinyl-coA to Homoserine.
  • MetA homoserine O-acetyltransferase
  • METX homoserine O-acetyltransferase
  • metA is one of the very important genes for the production of production strains.
  • MetX unlike MetA does not receive feedback inhibition and is known to have high enzyme stability.
  • O-succinylhomoserine can be produced using metB gene deletion strains encoding cystathionine gamma synthase in the methionine biosynthetic pathway.
  • O-succinylhomoserine producing strains exhibit L-methionine requirement.
  • homoserine O-succinyltransferase is inhibited by feedback inhibition by methionine added to the medium, and finally, high concentration of O-succinyl homoserine cannot be obtained.
  • the present invention also aims to provide a method for producing O-succinyl homoserine using the microorganism.
  • O-succinylhomoserine producing microorganisms that are resistant to feedback inhibition to the novel isolated methionine of the present invention and that have a polypeptide having homoserine O-succinyltransferase activity are resistant to feedback inhibition to methionine. Since O-succinyl homoserine can be produced in high yield, it can be usefully used to produce L-methionine having a high yield as a precursor thereof.
  • the present invention provides a novel isolated polypeptide that is resistant to feedback inhibition by methionine and has homoserine O-Succinyltransferase activity. do.
  • the term "activity of homoserine O-succinyltransferase" used in the present invention refers to homoserine in the process of methionine biosynthesis (Homoserine) O-succinyl homoserine (O-succinyl homoserine) Means the activity of converting.
  • feedback inhibition refers to the inhibition of the enzymatic activity of homoserine O-succinyltransferase by methionine in methionine biosynthesis.
  • the polypeptide of the present invention is characterized by having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 having homoserine O-succinyltransferase activity and being resistant to methionine feedback inhibition.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95
  • Polypeptides having a homology of at least%, in particular at least 97% are also included in the present invention. Homology to the amino acid sequence is described, for example, in the algorithm BLAST by Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci.
  • Another aspect of the invention provides an isolated polynucleotide encoding said polypeptide.
  • the polypeptide may preferably be encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 36, which is at least 80%, in particular at least 90%, more specifically at least 95%, in particular 97, due to the degeneracy of the codon Polynucleotides having at least% homology are also included in the present invention.
  • the present invention is not limited thereto.
  • Still another aspect of the present invention provides a vector operably comprising the polynucleotide.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to allow expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and any vector known in the art may be used.
  • Another aspect of the invention provides an O-succinyl homoserine, which expresses a polypeptide that is resistant to feedback inhibition to methionine and has a homoserine O-succinyltransferase activity.
  • -succinyl L-homoserine to provide a microorganism.
  • microorganism that produces O-succinyl L-homoserine may be a microorganism that can accumulate inside and outside cells by producing O-succinyl homoserine.
  • Microorganisms producing the O-succinyl homoserine include prokaryotic and eukaryotic microbial strains.
  • Microorganism strains belonging to the genus and Brevibacterium genus may be included, but are not limited thereto.
  • microbial strains belonging to the genus Escherichia for example Escherichia coli may be used.
  • the microorganism producing the O-succinyl homoserine may be prepared using L-lysine, L-threonine or L-isoleucine producing strain. Specifically, it can be prepared using L-threonine producing strain. Since L-threonine producing strains are already well-synthesized to homoserine, precursors of L-threonine and O-succinyl homoserine, a large amount of methionine precursor, that is, O-succinyl Homoserine can be synthesized.
  • expression of the polypeptide may be achieved by transforming with a recombinant vector operably comprising a gene encoding the polypeptide, or by inserting a polynucleotide encoding the polypeptide into a chromosome, but is not particularly limited thereto. .
  • the term "transformation" means to introduce a vector comprising a polynucleotide encoding the target protein into the host cell to be able to express the protein encoded by the polynucleotide in the host cell.
  • the introduced polynucleotide can be located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to an open reading frame of the gene (abbreviated as "ORF").
  • ORF open reading frame of the gene
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it initiates a high frequency of transcription of a polynucleotide encoding a protein of interest in a host cell, and any promoter known in the art may be used. Specifically, a T7 promoter, trc promoter, tac promoter, CJ1 promoter (Korean Patent No. 0620092) and the like can be used.
  • the microorganism may be further deleted or attenuated the metB gene encoding cystathionine gamma synthase.
  • the microorganism further comprises a thrB gene encoding a homoserine kinase and a metA gene encoding a homoserine O-succinyltransferase. May weaken.
  • phosphoenolpyruvate carboxylase aspartate aminotransferase and aspartate semialdehyde dehydrogenase It may be a microorganism of the genus Escherichia.
  • sequence of the genes can be obtained from a database such as the American Biotechnology Information Center (NCBI).
  • NCBI American Biotechnology Information Center
  • deletion used in the present invention means a form in which the nucleotide sequence from the nucleotide sequence corresponding to the start codon of the target gene to the stop codon or a part or all of the regulatory region nucleotide sequences is removed from the chromosome. do.
  • the term “weakening” refers to the removal or reduction of intracellular activity of one or more enzymes encoded by corresponding polynucleotides in a microbial strain, eg, expression control sequences of genes. And by altering the nucleotide sequence of the 5'-UTR region, the expression of the protein may be attenuated, or the activity of the protein may be weakened by replacing the start codon or introducing a mutation into the ORF region of the gene.
  • enhancing refers to an increase in the intracellular activity of the enzyme encoded by the corresponding polynucleotide. Enhancement of the enzyme's intracellular activity can be achieved by overexpression of the gene or by introducing mutations in the polynucleotide sequence itself.
  • Overexpression of the polynucleotide may be caused by alteration or substitution of expression control sequences, replacement of initiation codons, increased copy number by additional insertion of the polynucleotide into a chromosome or introduction via a vector, or a combination thereof. It may be.
  • the expression control sequence is a sequence that controls the expression of a polynucleotide operably linked thereto, and may include, for example, a promoter, terminator, enhancer, silencer, Shine-Dalgarno sequence, and the like.
  • the start codon can be weakened by replacing the start codon consisting of TTG or GTG with ATG, thereby increasing the enzyme activity of the gene or vice versa.
  • the polynucleotide may be an increase in the number of copies by insertion at a specific position in the chromosome. The specific position may include, for example, a transposon or an intergenic site.
  • the polynucleotide may be inserted into an expression vector, and the copy number may be increased by introducing the expression vector into a host cell.
  • Another aspect of the present invention comprises culturing the microorganism in a medium to produce O-succinyl homoserine and obtaining O-succinyl homoserine from the microorganism or medium, O-succinyl homoserine It provides a production method of
  • Cultivation process of the prepared O-succinyl homoserine production strain may be made according to suitable media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultures. Such various culture methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.
  • the medium used for culturing must adequately meet the requirements of the particular strain.
  • Media of various microorganisms are disclosed, for example, in "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., United States, 1981.
  • the medium contains various carbon sources, nitrogen sources and trace element components.
  • carbon sources that can be used include glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, fats such as coconut oil, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid Fatty acids such as, alcohols such as glycelol and ethanol, and organic acids such as acetic acid.
  • nitrogen sources examples include organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), and soybean wheat, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate Inorganic nitrogen sources are included. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a person. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate.
  • amino acids, vitamins, and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • anti-foaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used during the culture to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, specifically 25 ° C to 40 ° C. The incubation period may continue until the desired amount of O-succinylhomoserine is obtained, specifically 10 to 160 hours.
  • O-succinylhomoserine produced by the method of the present invention can be converted to methionine by cystathionine gamma synthase or O-succinylhomoserine sulfhydrylase.
  • succinic acid can be obtained as a by-product without a separate production process.
  • Another embodiment of the present invention is an O-succinyl of a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 and having feedback resistance and homoserine O-succinyltransferase activity by methionine It relates to the use of homoserine production.
  • the newly isolated polypeptide is resistant to feedback inhibition to methionine and can produce O-succinyl homoserine in high yield, and the polypeptide can be used for O-succinyl homoserine production. Can be.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, followed by purification of DNA from a 1.2 kbp sized band.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to the FTR2533 strain previously transformed with the pKD46 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645).
  • FTR2533 strain transformed with pKD46 for the electroporation was 30 ° C. until the OD600 reached 0.6 using LB medium containing 100 ⁇ g / L ampicillin and 5 mM arabinose. Incubated at. Sterile distilled water was used twice, and washed once with 10% glycerol (glycerol). Electroporation was applied at 2500V.
  • the recovered strains were plated in LB plate medium containing 25 ⁇ g / L chloramphenicol and incubated overnight at 37 ° C. to select strains showing resistance.
  • Selected strains were PCR strains under the same conditions using the same primers as the strain as a template, and confirmed the deficiency of the metB gene by confirming that the gene size was observed at 1.2 Kb on 1.0% agarose gel.
  • the identified strain was transformed with pCP20 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) and cultured in LB medium, and the final size of the gene was reduced to 150bp on 1.0% agarose gel through PCR under the same conditions.
  • metB gene-deficient strains were constructed and confirmed that chloramphenicol markers were removed.
  • the produced strain was named CJMA1.
  • pKD4 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) as a template to prepare a thrB deletion cassette, denatured using primers of SEQ ID NOs: 3, 4, 94 ° C., 30 seconds; Annealing 55 ° C., 30 seconds; The PCR reaction was performed 30 times at 72 ° C. for 1 minute.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and then DNA was purified from a 1.6 kbp sized band.
  • the recovered DNA fragments were electroporated into CJMA1 strain previously transformed with pKD46 vector.
  • the recovered strains were plated in LB plate medium containing 50 ⁇ g / L kanamycin and incubated overnight at 37 ° C., and strains showing resistance were selected.
  • Selected strains were PCR strains under the same conditions using the primers of SEQ ID NOs: 3, 4 using the strains as templates, and then the strains of the thrB gene were identified by selecting strains having a size of 1.6 Kb on a 1.0% agarose gel. It was confirmed.
  • the identified strains were transformed with pCP20 vector and cultured in LB medium, and again, the final thrB gene deletion strain was reduced to 150 bp on 1.0% agarose gel by PCR under the same conditions, and the kanamycin marker was added. It was confirmed that it was removed.
  • the produced strain was named CJMA2 strain.
  • the FM2533 (KCCM 10541) strain was deleted from the original metA gene on the chromosome based on the CJMA2 strain which lacked the metB and thrB genes.
  • pKD3 vector PNAS (2000) vol97: P6640-6645
  • PCR was performed 30 times with extension 72 ° C. for 1 minute.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, followed by purification of DNA from a 1.2 kbp sized band.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to a CJMA2 strain previously transformed with the pKD46 vector.
  • the recovered strains were plated in LB plate medium containing chloramphenicol and incubated overnight at 37 ° C, and strains showing resistance were selected.
  • Selected strains were PCR as a template by using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 under the same conditions, and confirmed the deficiency of the metA gene by confirming that the gene size was changed to 1.1 Kb on a 1.0% agarose gel. It was.
  • the identified strain was transformed with pCP20 vector and cultured in LB medium, and the final metA gene deletion strain having a gene size reduced to 100 bp on 1.0% agarose gel was prepared by PCR under the same conditions, and a chloramphenicol marker was added. It was confirmed that it was removed.
  • the produced strain was named CJM2.
  • CJM2 is a strain capable of producing O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine depending on the metX substrate specificity of the introduced plasmid with excessive accumulation of homoserine in the strain.
  • CJM2 is a strain in which homoserine accumulates, and when the gene introduced into pCL1920 is homoserine succinyltransferase, O-succinyl homoserine is obtained as a final product, and when homoserine acetyltransferase is introduced, final product O-acetylhomoserine is obtained. Yet metX gene from among the 10 kinds of evaluation using the characteristics of homoserine was obtained a gene encoding a kinase-succinyl transferase.
  • Chromobacterium Violaceum- derived metX gene (Amino Acid SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 36), which has been characterized as being capable of producing O-succinyl homoserine in high yield. We have confirmed that there is no new activity.
  • Primers used for PCR were prepared on the basis of the NC_000913 Escherichia coli chromosomal sequence registered in the National Institutes of Health Gene Bank (NIH Gene Bank), the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively, the restriction enzyme EcoRV site and HindIII site Have.
  • PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 68 ° C. for 30 minutes, followed by polymerization at 68 ° C. for 10 minutes. It was.
  • the pCL1920 plasmid containing the PCR product and the CJ1 promoter (Korean Patent No. 0620092) thus obtained was cloned by treating EcoRV and HindIII restriction enzymes, respectively. After transforming E. coli DH5 ⁇ using the cloned plasmid, transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 50 ⁇ g / ml of specinomycin to obtain a plasmid. The obtained plasmid was named pCL_Pcj1_metA (wt).
  • the metA gene feedback resistance to methionine using a site directed mutagenesis kit (Stratagene, USA) as a template using the pCL_Pcj1_metA (wt) plasmid prepared in Example 3-1 # 11) was made.
  • Amino acid No. 114 was replaced with glutine at glutamic acid (E114G), and amino acid No. 140 was substituted at phenylalanine with serine (F140S) using SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • the primer sequence used at this time is as follows.
  • PCR was carried out using primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 using the chromosomes of Deinococcus radiodurans (Accession No. ATCC BAA-816D) purchased from the American Type Culture Collection. Thereby, the metX gene encoding homoserine O-acetyl transferase was amplified.
  • the primers used for PCR were prepared based on the chromosomal sequences of AE000513 registered in the National Institutes of Health, NIH Gene Bank.
  • the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 each had restriction enzyme EcoRV sites and HindIII sites, respectively. have.
  • PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 68 ° C. for 30 minutes, followed by polymerization at 68 ° C. for 7 minutes. It was.
  • the pCL1920 plasmid containing the PCR product and the CJ1 promoter (Korean Patent No. 0620092) thus obtained was cloned by treating EcoRV and HindIII restriction enzymes, respectively. After transforming E. coli DH5 ⁇ using the cloned plasmid, transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 50 ⁇ g / ml of specinomycin to obtain a plasmid. The obtained plasmid was named pCL_Pcj1_dra metX.
  • PCR was performed using chromosomes of Chromobacterium Violaceum strain (Accession No. ATCC12472) purchased from the American Type Culture Collection using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18.
  • the chromobacterium bioolase derived metX gene was amplified.
  • the primers used for PCR were prepared based on the NC_005085 chromobacterium biuranium chromosome sequence registered in the National Institutes of Health, NIH Gene Bank, and primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were restriction enzymes, respectively. It has an EcoRV site and a HindIII site.
  • PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 68 ° C. for 30 minutes, followed by polymerization at 68 ° C. for 10 minutes. It was.
  • the pCL1920 plasmid containing the PCR product and the CJ1 promoter (Korean Patent No. 0620092) thus obtained was cloned by treating EcoRV and HindIII restriction enzymes, respectively. After transforming E. coli DH5 ⁇ using the cloned plasmid, transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 50 ⁇ g / ml of specinomycin to obtain a plasmid. The obtained plasmid was named pCL_Pcj1_cvi metX.
  • pSG76c-2ppc a vector for chromosomal DNA insertion of E. coli containing a ppc gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase, was prepared.
  • the nucleotide sequence information of the ppc gene (NCBI accession number gi: 89110074) was obtained, based on which the ppc ORF was contained from -200 part of the ppc gene and the restriction enzyme EcoRI A primer containing a site and a SacI site (SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20) and a primer containing a restriction enzyme SacI site and a KpnI site (SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22) were synthesized.
  • PCR was performed using the primers SEQ ID NO: 19, 20 and SEQ ID NO: 21, 22.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealed at 56 ° C. for 30 seconds, and 5 minutes at 68 ° C. After the polymerization was repeated 30 times, polymerization was performed at 68 ° C. for 7 minutes. As a result, approximately 3.1 kb of amplified ppc gene containing EcoRI and SacI and SacI and KpnI restriction enzyme recognition sites were obtained.
  • PSG76c J Bacteriol. 1997 Jul; 179 (13): 4426-8.
  • pSG76c-2ppc recombinant vector was constructed in which two copies of the ppc gene were cloned through ligation.
  • pSG76c-2aspC a vector for chromosomal DNA insertion of E. coli containing an aspC gene encoding aspartate aminotransferase, was prepared.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 23, 24 as primers.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and 68 minutes at 68 ° C. After the polymerization was repeated 30 times, polymerization was performed at 68 ° C. for 7 minutes. As a result, an amplified aspC gene of about 1.5 kb containing a BamHI restriction enzyme recognition site was obtained.
  • the pSG76c-2aspC recombinant vector was prepared by treating restriction enzyme BamHI at the end of the aspC gene obtained through PCR, and finally cloning 2copy of aspC gene by ligation to the pSG76c vector treated with restriction enzyme BamHI.
  • pSG76c-2asd a vector for chromosomal DNA insertion of E. coli containing an asd gene encoding aspartate-semialdehyde dehydrogenase, was prepared.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 25, 26 and 27, 28 as primers.
  • the polymerase was PfuUltraTM high-trust DNA polymerase (Stratagene), PCR conditions were denaturation 96 °C, 30 seconds; Annealing 50 ° C., 30 seconds; And polymerization reaction 68 degreeC, 2 minutes was repeated 30 times.
  • amplified asd genes of about 1.5 kb containing EcoRI, XbaI and XbaI, EcoRI restriction enzyme recognition sites were obtained.
  • PSG76c-2asd in which the asd gene obtained through the PCR was treated with restriction enzymes EcoRI and XbaI contained in the terminal and finally cloned into two copies of the asd gene through ligation to the pSG76c vector treated with the restriction enzyme EcoRI. Recombinant vectors were constructed.
  • PSG76c-2ppc, pSG76c-2aspC, and pSG76c-2asd vectors prepared in Example 3-5 were transformed into E. coli W3110 strain (Accession No. ATCC9637) purchased from the American Biotechnology Center (American Biotechnology Center). , LB-Cm (Yeast extract 10g / L, NaCl 5g / L, Tryptone 10g / L, chloramphenicol 25 ⁇ g / L, agar 15g / L) After plating on the medium was selected chloramphenicol-resistant colonies. Selected transformants are strains in which the pSG76c-2ppc vector is inserted primarily into the ppc portion of the genome.
  • the obtained 2 copies of the ppc gene were inserted into the strain BB-Ap (Yeast extract 10 g / A) by transforming pST76-AsceP, a vector expressing the restriction enzyme I-SceI, which cuts the I-SceI portion present in the pSG76c vector.
  • L, NaCl 5g / L, Tryptone 10g / L, Ampicillin 100 ⁇ g / L, agar 15 g / L) plated on the medium to grow strains were selected at 30 °C.
  • the ppc gene was amplified by 2 copies or returned to the first copy.
  • the PCR was performed using primers SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 and the gene size was increased to 6.5 kb on 1% agarose gel. 2 copy ppc strains were selected. After this process, the ppc gene is inserted and the pSG76c vector is removed.
  • pSG76c-2aspC pSG76c-2asd vectors were prepared strains amplified by 2 copies of the ppc, asd, aspC in the w3110 strain.
  • aspC 2copy production is to perform PCR with SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and the size of the gene on agarose gel 1% larger by 3.2kb, making copy asd 2 is the PCR with SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 It was confirmed that the gene size was increased to 3.2kb on 1% agarose gel.
  • the strain thus produced was named CJW2.
  • CJW2H is a strain capable of producing O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine depending on the metX substrate specificity of the introduced plasmid with excessive accumulation of homoserine in the strain.
  • E. coli CJM2 and CJW2H strains prepared in Examples 1- (3) and 4- (2) were prepared as competent cells, and the cell was subjected to electroporation in Example 3-1.
  • Four plasmids, pCL_Pcj1_metA (wt), pCL_Pcj1_metA # 11, pCL_Pcj1_dra metX, and pCL_Pcj1_cvi metX prepared in, 3-2,3-3,3-4 were introduced, respectively.
  • CJW2H pCL_Pcj1_metA # 11 produced O-succinyl homoserine, and O-acetyl homoserine by CJM2 pCL_Pcj1_dra metX and CJW2H pCL_Pcj1_dra metX, strains containing metX genes derived from Deinococcus radiodurans, respectively. It was found that it was produced.
  • Chromotherapy bacterium unlike Solarium non come syum derived for metX gene has the other metX homologous gene (orthologues) of the high homology (homology) compared with the metA gene in substrate specificity surface generally reported metX gene, succinyl It can be seen that it is homoserine succinyltransferase producing homoserine.
  • O-succinyl homoserine is produced by about 1 g / L due to feedback inhibition by 0.3 g / L of methionine added to the medium. It can be seen that O-succinyl homoserine is produced when the chromobacterium biouranium- derived metX gene is introduced without introducing a mutation and without feedback inhibition by methionine added to the medium. .
  • CJM2 strain CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX
  • pCL_Pcj1_cvi metX CJM2 strain introduced with pCL_Pcj1_cvi metX was entrusted to the Korea Microbial Conservation Center, an international depository organization under the Budapest Treaty, 361-221, Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, dated June 20, 2013. Deposited with the number KCCM11433P.
  • 5L fermenter culture was performed to mass-produce the methionine precursor O-succinyl homoserine using CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX and CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX strains.
  • CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX and CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX strains were inoculated on plate LB medium containing spectinomycin antibiotics and incubated overnight at 31 ° C. Thereafter, single colonies were inoculated in 10 ml LB medium containing spectinomycin and then incubated at 31 ° C. for 5 hours, and 2 ml of this culture was inoculated again in a 1000 ml Erlenmeyer flask containing 200 ml Seed medium. After incubation for 3 to 10 hours at 31 ° C. and 200 rpm, 255 ml of the seed culture solution was inoculated into 1.7 L of 5 L fermentation tank main medium, and 1.3 L of seed medium was consumed by fed batch fermentation to incubate for 50 to 100 hours. .
  • CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX a strain into which the chromobacterium biouranium-derived metX gene was introduced using a threonine producing strain as a parent strain, accumulates O-succinyl homoserine at a high level.

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Abstract

본 발명은 메치오닌에 의한 피드백 저해에 대한 내성 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 O-숙시닐호모세린의 생산방법
본 발명은 메치오닌에 의한 피드백 저해에 대한 내성 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 대부분의 미생물은 메치오닌을 생합성하기 위해서 O-숙시닐호모세린(O-succinyl homoserine) 또는 O-아세틸호모세린(O-acetyl homoserine)을 중간체로 이용하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 O-숙시닐호모세린은 호모세린(Homoserine)에 숙시닐코에이(Succinyl-coA)의 숙시닐 부위(Succinyl group)를 결합시키는 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase, MetA)에 의해 생산되고, O-아세틸호모세린은 호모세린(Homoserine)에 아세틸코에이(acetyl-coA)의 아세틸 부위(Succinyl group)를 결합시키는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제(homoserine O-acetyltransferase, MetX)에 의해 생산된다. 즉, 중간체중 O-숙시닐호모세린을 생산하는 데에 있어서, metA는 생산균주 개발에 아주 중요한 유전자중 하나이다. 한편, MetX는 MetA와는 달리 피드백 저해를 받지 않으며 효소 안정성도 높은 것으로 알려져 있다.
O-숙시닐호모세린은 메치오닌 생합성 경로에서 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자 결손 균주를 이용하여 생산할 수 있다. 하지만, O-숙시닐호모세린 생산 균주는 L-메치오닌 요구성을 나타낸다. 이런 이유로 배지에 첨가된 메치오닌에 의해서 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제가 피드백저해(feedback inhibition)를 받아 활성이 억제되고 최종적으로는 고농도의 O-숙시닐호모세린을 얻을 수 없게 된다.
따라서, 종래의 많은 특허들은 피드백 조절 체계로부터 metA의 피드백 저해를 해제하는 연구에 집중되었다. 하지만 metA에 의해서 코딩되는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 야생형 단백질 자체로도 안정성이 낮고, 피드백해제를 위해서 변이가 도입되면 불안정성이 더 커지는 문제점을 안고 있다. 높은 생산능을 가지는 O-숙시닐호모세린 생산 균주의 개발을 위해서는 metA 유전자의 피드백 저해가 제거되고 효소 안정성이 확보될 필요가 있다.
앞에서 언급된 metA의 피드백 저해현상과 불안정성 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 메치오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않으며 효소 안정성이 확보된 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제를 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 이의 활성을 갖는 신규한 효소를 탐색하였다. 이렇게 탐색된 후보 유전자를 선별하고, 이를 에스케리키아 속 미생물에 도입하여 플라스크 배양한 결과, O-숙시닐호모세린이 생성됨을 확인하였다. 이렇게 선별된 유전자는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지며 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 메치오닌에 의한 피드백 저해에 내성 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 신규 분리한 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 신규 분리한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 신규 분리한 폴리펩티드를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 미생물을 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 신규 분리한 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물은 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며 고수율로 O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있으므로, 이를 전구체로 하는 L-메치오닌을 고수율로 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 메치오닌에 의한 피드백 저해에 내성을 가지며(feedback resistant) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-Succinyltransferase) 활성을 갖는 신규 분리한 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 상기 용어 “호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(activity of homoserine O-succinyltransferase)”은 메치오닌 생합성 과정에서 호모세린(Homoserine)을 O-숙시닐호모세린(O-succinyl homoserine)으로 전환하는 활성을 의미한다.
본 발명에서 사용된 상기 용어 “피드백 저해(feedback inhibition)”는 메치오닌 생합성에서 메치오닌에 의한 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제의 효소 활성의 억제를 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, 메치오닌 피드백 저해에 내성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 제시한 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성 및 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지는 한, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드 또한 본 발명에 포함된다. 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: www.ncbi.nlm.nih.gov].
본 발명의 또 다른 양태는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리펩티드는 바람직하게 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있으며, 코돈의 축퇴성으로 인하여 이와 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명에 포함된다. 그러나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 또 다른 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 작동 가능하게 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 메치오닌에 대한 피드백 저해에 대한 내성을 가지며(feedback resistant) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는, O-숙시닐호모세린(O-succinyl L-homoserine)을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 상기 용어 “O-숙시닐호모세린(O-succinyl L-homoserine)을 생산하는 미생물”이란 O-숙시닐호모세린을 생산하여 세포내외에서 축적할 수 있는 미생물일 수 있다.
상기 O-숙시닐호모세린을 생산하는 미생물은, 원핵 및 진핵 미생물 균주를 포함한다. 예를 들어, O-숙시닐호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물 균주, 그 예로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 가 사용될 수 있다.
상기 O-숙시닐호모세린을 생산하는 미생물은 L-라이신, L-쓰레오닌 또는 L-이소류신 생산 균주를 이용하여 제조할 수도 있다. 구체적으로는, L-쓰레오닌 생산 균주를 이용하여 제조할 수 있다. L-쓰레오닌 생산 균주는 L-쓰레오닌 및 O-숙시닐호모세린의 전구체인 호모세린까지의 합성이 이미 원활하게 이루어지는 균주이므로, 이를 활용하여 많은 양의 메치오닌 전구체, 즉 O-숙시닐호모세린을 합성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 폴리펩티드의 발현은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 삽입되어 달성될 수 있으나, 이로 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질을 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 프로모터는 숙주세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 높은 빈도로 개시하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 프로모터를 이용할 수 있다. 구체적으로는, T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, CJ1 프로모터(대한민국 등록특허번호 제0620092호) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에서, 상기 미생물은 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자가 추가로 결손 또는 약화될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에서, 상기 미생물은 호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 thrB 유전자 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase)를 코딩하는 metA 유전자를 추가로 더 결손 또는 약화시킬 수 있다.
또한 본 발명의 구체적 실시양태로서, 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase)를 추가로 강화시키는 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
본 발명에서, 상기 유전자들의 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 용어 “결손(deletion)”은 목적 유전자의 개시코돈에 해당하는 염기서열로부터 종결코돈까지의 염기서열 영역 혹은 그 조절부위 염기서열 중 일부 혹은 전부를 염색체 내부에서 제거한 형태를 의미한다.
본원에서 사용되는 상기 용어“약화(weakening)”는 미생물 균주에서 상응하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소에 대한 세포 내 활성을 제거하거나 감소시키는 것을 의미하는데, 예를 들어, 유전자의 발현조절 서열 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나, 개시 코돈의 교체, 해당 유전자의 ORF 부위에 돌연변이를 도입함으로써 단백질의 활성을 약화시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 상기 용어 “강화(enhancing)”는 상응하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소의 세포 내 활성의 증가를 말한다. 효소의 세포 내 활성 증진은 유전자의 과발현에 의해 또는 폴리뉴클레오티드 서열 자체의 변이 도입에 의해 이루어질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 과발현은 발현 조절 서열의 치환 또는 돌연변이에 의한 변형, 개시 코돈의 교체, 상기 폴리뉴클레오티드를 추가로 염색체에 삽입하는 것 또는 벡터를 통해 도입하는 것에 의한 카피수 증가, 또는 이의 조합에 의한 것일 수 있다.
상기 발현 조절 서열은 그와 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열로, 예를 들면, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일렌서, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 등이 포함될 수 있다. 상기 개시 코돈은 TTG 혹은 GTG로 이루어진 개시 코돈을 ATG로 치환함으로써, 해당 유전자의 효소 활성을 증가시키거나, 그 반대로 교체하여 약화시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 염색체 내 특정 위치에 삽입됨으로써 카피수가 증가된 것일 수 있다. 상기 특정 위치는 예를 들면, 트랜스포존 또는 인터제닉(intergenic) 부위 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 삽입되고, 그 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입함으로써 카피수가 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계 및 상기 미생물 또는 배지로부터 O-숙시닐호모세린을 수득하는 단계를 포함하는, O-숙시닐호모세린의 생산방법을 제공한다.
상기 제조된 O-숙시닐호모세린 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 O-숙시닐호모세린의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 160 시간이다.
본 발명의 방법으로 생산한 O-숙시닐호모세린은 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)에 의하여 메치오닌으로 전환될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 생산한 O-숙시닐-L-호모세린과 CH3SH와의 반응을 통하여 L-메치오닌 이외에도 숙신산을 별도의 생산공정 없이 부산물로 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 메치오닌에 의한 피드백 내성(feedback resistant) 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드의 O-숙시닐호모세린 생산 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 신규하게 분리한 상기 폴리펩티드가 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며 고수율로 O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있음을 규명하였는바, 상기 폴리펩티드는 O-숙시닐호모세린 생산 용도로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : 쓰레오닌 생산균주 기반 모균주의 제작
(1) metB 유전자 결손
metX 유전자의 기질특이성과 활성을 파악하기 위하여 호모세린을 축적하고, 생산된 아실 호모세린(acyl homoserine)의 이용성이 결손된 균주를 제작하였다. 상기 균주 제작은 국제특허 WO05/075625에 명기된 쓰레오닌 생산균주인 FTR2533(KCCM 10541) 균주를 기반으로 하였다.
상기 쓰레오닌 생산균주인 FTR2533(KCCM 10541) 균주에서 시스타치오닌 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 결손시키기 위해서, FRT-one-step PCR deletion 방법을 수행하였다(PNAS (2000) vol97: P6640-6645). 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형(template)으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트(cassette)를 구성하였다. PCR 조건은 변성 94℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초 동안 어닐링(annealing) 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다.
<서열번호 1>
5’ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg gagctgcttc 3’
<서열번호 2>
5’ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata tcctccttag 3’
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 미리 형질전환시킨 FTR2533 균주에 일렉트로포레이션하였다.
상기 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 FTR2533 균주는 100 μg/L 암피실린(ampicillin)과 5 mM 아라비노스(L-arabinose)가 포함된 LB 배지를 이용하여 OD600이 0.6에 도달할 때까지 30℃에서 배양하였다. 멸균 증류수로 2회, 10% 글리세롤(glycerol)로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다.
회수된 균주를 25μg/L 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2 Kb로 관찰되는 것을 확인함으로서 metB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150bp로 작아진 최종 metB 유전자 결손균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 CJMA1로 명명하였다.
(2) thrB 유전자 결손
상기 제작된 CJMA1균주에서 호모세린 키나아제를 코딩하는 thrB 유전자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.
thrB 결손 카세트를 제작하기 위하여 pKD4 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645) 를 주형으로, 서열번호 3, 4의 프라이머를 이용하여 변성 94℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 연장72℃, 1분을 30회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
<서열번호 3>
aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg gtgtaggctg gagctgcttc
<서열번호 4>
agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg ggaaggcaaa catatgaata tcctccttag
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.6 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 CJMA1균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 50μg/L 카나마이신(kanamycin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 3, 4의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 확인되는 균주를 선별함으로써 thrB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150bp로 작아진 최종 thrB 유전자 결손 균주를 제작하고, 카나마이신 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주는 CJMA2 균주로 명명하였다.
(3) metA 유전자 결손
상기 CJMA2 균주에서 크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자의 기질 특이성 및 활성 확인을 위해 FTR2533(KCCM 10541) 균주에 metB 및 thrB 유전자를 결손시킨 CJMA2균주를 기반으로 염색체 상의 본래 metA 유전자를 결손시켰다.
metA 유전자를 결손시키기 위하여, FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다. metA 유전자 결손 카세트를 제작하기 위하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형으로, 서열번호 5, 6의 프라이머를 이용하여 변성 94℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 연장 72℃, 1분으로 30회 PCR을 수행하였다.
<서열번호 5>
caatttcttg cgtgaagaaa acgtctttgt gatgacaact tctcgtgcgt gtgtaggctg gagctgcttc
<서열번호 6>
aatccagcgt tggattcatg tgccgtagat cgtatggcgt gatctggtag catatgaata tcctccttag
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 CJMA2 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 클로람페니콜을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 5, 6의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.1Kb로 변화되는 것을 확인함으로써 metA 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주를 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 100bp로 작아진 최종 metA 유전자 결손 균주를 제작하고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 CJM2로 명명하였다.
CJM2는 균주 내에 호모세린이 과량 축적되며, 도입되는 플라스미드의 metX 기질특이성에 따라 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 생산할 수 있는 균주이다.
실시예 2 : 신규한 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 선별
metA 유전자의 피드백 조절의 해제 및 안정성 확보를 위하여, KEGG website(//www.genome.jp/kegg/)에서 metX로 명명된 10종의 상동체(Orthologue)들을 선별하여 pCL1920_PCJ1 벡터에 클로닝하였다. 상기 10종의 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1에서 제조된 CJM2에 형질 전환하였다.
이렇게 획득된 10종의 균주를 하기 실시예 5-(2)에서 언급된 플라스크 배양 방법으로 플라스크 평가를 수행하였다. CJM2는 호모세린이 축적되는 균주로 pCL1920에 도입된 유전자가 호모세린 숙시닐트랜스퍼라아제인 경우 최종산물로 O-숙시닐호모세린이 획득되고, 호모세린 아세틸트랜스퍼라아제가 도입된 경우는 최종산물로 O-아세틸호모세린이 획득된다. 상기의 특성을 이용하여 평가된 10종 중에서 metX 유전자이면서 호모세린 숙시닐트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 확보하였다. 이는 O-숙시닐호모세린을 고수율로 생산 가능하게 하는 특성을 가진 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum) 유래 metX 유전자이나 (아미노산 서열번호 29, 염기서열 서열번호 36), 기 보고된 바 없는 새로운 활성임을 본 발명자들이 확인하였다.
실시예 3 : 플라스미드의 제작
3-1. 야생형 E.coli 유래 metA 유전자를 발현하는 플라스미드 제작
미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 구매한 대장균 W3110 균주(기탁번호 ATCC9637)의 염색체를 주형으로 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 유전자를 증폭하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH Gene Bank)에 등록되어 있는 NC_000913의 대장균 염색체 염기서열을 바탕으로 제작하였으며, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다.
<서열번호 7>
5’ AATTGATATCATGCCGATTCGTGTGCCGG 3’
<서열번호 8>
5’ AATTAAGCTTTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTG 3’
PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 68℃에서 2분간 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
이렇게 획득된 PCR 산물 및 CJ1 프로모터(대한민국 등록특허번호 제0620092호)를 포함하는 pCL1920 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 스펙티노마이신(spectinomycin) 50μg/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(wt)로 명명하였다.
3-2. 피드백 내성(Feedback-resistance)을 갖는 metA 유전자를 발현하는 플라스미드 제작
상기 실시예 3-1에서 제작된 pCL_Pcj1_metA(wt) 플라스미드를 주형으로 부위 특이적 돌연변이 키트(site directed mutagenesis kit; Stratagene, 미국)를 이용하여 메치오닌에 대한 피드백 내성(feedback resistance)을 가진 metA 유전자(metA #11)를 제작하였다.
구체적으로, 국제공개특허 WO2008127240에 개시된 내용에 따라, 서열번호 9와 서열번호 10을 이용하여 O-숙시닐호모세린의 29번 아미노산을 세린에서 프롤린으로(S29P), 서열번호 11과 서열번호 12를 이용하여 114번 아미노산을 글루탐산에서 글리신으로(E114G), 서열번호 13과 서열번호 14를 이용하여 140번 아미노산을 페닐알라닌에서 세린으로 치환(F140S)하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기와 같다.
<서열번호 9>
5’ ATGACAACTTCTCGTGCGCCTGGTCAGGAAATTCG 3’
<서열번호 10>
5’ CGAATTTCCTGACCAGGCGCACGAGAAGTTGTCAT 3’
<서열번호 11>
5’ CGCCGCTGGGCCTGGTGGGGTTTAATGATGTCGCT 3’
<서열번호 12>
5’ AGCGACATCATTAAACCCCACCAGGCCCAGCGGCG 3’
<서열번호 13>
5’ CACGTCACCTCGACGCTGAGTGTCTGCTGGGCGGT 3’
<서열번호 14>
5’ ACCGCCCAGCAGACACTCAGCGTCGAGGTGACGTG 3’
각각의 상기 변이를 순차적으로 도입하여, 3종 변이를 모두 도입한 metA(#11) 유전자를 함유한 플라스미드를 제조한 후, pCL_Pcj1_metA#11로 명명하였다.
3-3. 데이노코쿠스 라디오두란스 유래 metX 유전자를 발현하는 플라스미드 제작
미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 구매한 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans; 기탁번호 ATCC BAA-816D)의 염색체를 주형으로 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 metX 유전자를 증폭하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH Gene Bank)에 등록되어 있는 AE000513의 염색체 염기서열을 바탕으로 제작하였으며, 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다.
<서열번호 15>
5’ AATTGATATCATGACCGCCGTGCTCGC 3’
<서열번호 16>
5’ AATTAAGCTTTCAACTCCTGAGAAACGCCCC 3’
PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 68℃에서 5분간 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
이렇게 획득된 PCR 산물 및 CJ1 프로모터(대한민국 등록특허번호 제0620092호)를 포함하는 pCL1920 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 스펙티노마이신(spectinomycin) 50μg/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 pCL_Pcj1_dra metX로 명명하였다.
3-4. 크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자를 발현하는 플라스미드 제작
미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 구매한 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum) 균주(기탁번호 ATCC12472)의 염색체를 주형으로 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자를 증폭하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH Gene Bank)에 등록되어 있는 NC_005085의 크로모박테리움 비오라슘 염색체 염기서열을 바탕으로 제작하였으며, 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다.
<서열번호 17>
5’ aatt gatatc ATGACCGACACCAACTGTTCGG 3’
<서열번호 18>
5’ aatt aagctt TCATGCGTTCACCTCCTTGGC 3’
PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 68℃에서 2분간 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
이렇게 획득된 PCR 산물 및 CJ1 프로모터(대한민국 등록특허번호 제0620092호)를 포함하는 pCL1920 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 스펙티노마이신(spectinomycin) 50μg/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 pCL_Pcj1_cvi metX로 명명하였다.
3-5. 생합성 유전자 강화용 2 copy 균주 제작을 위한 플라스미드
(1) ppc 유전자 삽입용 pSG76c 벡터 제작
본 실시예에서는 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자를 포함하는 E.coli의 염색체 DNA 삽입용 벡터인 pSG76c-2ppc를 제작하였다.
미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 ppc 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 89110074)를 확보하고, 이에 근거하여 ppc 유전자의 -200 부분부터 ppc ORF를 함유하며 제한효소 EcoRI 부위와 SacI 부위를 함유하고 있는 프라이머(서열번호 19, 서열번호 20)와 제한효소 SacI 부위와 KpnI 부위를 함유하고 있는 프라이머(서열번호 21, 서열번호 22)을 합성하였다.
<서열번호 19>
5’ gccggaattc tgtcggatgc gatacttgcg c 3’
<서열번호 20>
5’ gaaggagctc agaaaaccct cgcgcaaaag 3’
<서열번호 21>
5’ gccggagctc tgtcggatgc gatacttgcg c 3’
<서열번호 22>
5’ gaagggtacc agaaaaccct cgcgcaaaag 3’
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 19, 20과 서열번호 21, 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 68℃에서 5분간 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, EcoRI과 SacI 그리고 SacI과 KpnI 제한효소 인식부위를 함유한 약 3.1kb의 증폭된 ppc 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 ppc 유전자 말단에 제한효소 EcoRI와 SacI 그리고 SacI과 KpnI을 처리하고, 제한효소 EcoRI, KpnI가 처리된 pSG76c(J Bacteriol. 1997 Jul;179(13):4426-8.) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 최종적으로 2 카피(copy)의 ppc 유전자가 클로닝된 pSG76c-2ppc 재조합 벡터를 제작하였다.
(2) aspC 삽입용 pSG76c 벡터 제작
본 실시예에서는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase)를 코딩하는 aspC 유전자를 포함하는 E.coli의 염색체 DNA 삽입용 벡터인 pSG76c-2aspC를 제작하였다.
미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 aspC 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 85674274)를 확보하고, 이에 근거하여 aspC 유전자의 -200 부분부터 aspC ORF를 함유하고 제한효소 SacI를 함유하고 있는 프라이머(서열번호 23, 서열번호 24)을 합성하였다.
<서열번호 23>
5’ tccgagctca taagcgtagc gcatcaggca 3’
<서열번호 24>
5’ tccgagctcg tccacctatg ttgactacat 3’
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 23, 24의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing), 68℃에서 2분간 중합을 30회 반복한 후, 68℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, BamHI 제한효소의 인식부위를 함유한 약 1.5kb의 증폭된 aspC 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 aspC 유전자 말단에 제한효소 BamHI을 처리하고, 제한효소 BamHI가 처리된 pSG76c 벡터에 접합(ligation)을 통하여 최종적으로 2copy의 aspC 유전자가 클로닝된 pSG76c-2aspC 재조합 벡터를 제작하였다.
(3) asd 삽입용 pSG76c vector 제작
본 실시예에서는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 asd 유전자를 포함하는 E.coli 의 염색체 DNA 삽입용 벡터인 pSG76c-2asd를 제작하였다.
미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 asd 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 89110578)를 확보하고, 이에 근거하여 asd 유전자의 -200 부분부터 asd ORF를 함유하고 제한효소 EcoRI, XbaI을 함유하고 있는 프라이머(서열번호 25, 서열번호 26)와 XbaI과 EcoRI을 함유하고 있는 프라이머(서열번호 27, 서열번호 28)를 합성하였다.
<서열번호 25>
5’ ccggaattcc caggagagca ataagca 3’
<서열번호 26>
5’ ctagtctaga tgctctattt aactcccg 3’
<서열번호 27>
5’ ctagtctaga ccaggagagc aataagca 3’
<서열번호 28>
5’ ccggaattct gctctattta actcccg 3’
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 25, 26과 서열번호 27, 28의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 2분을 30회 반복하였다. 그 결과, EcoRI, XbaI 그리고 XbaI, EcoRI 제한효소 인식부위를 함유한 약 1.5 kb의 증폭된 asd 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 asd 유전자에 말단에 포함된 제한효소 EcoRI 그리고 XbaI을 처리하고, 제한효소 EcoRI가 처리된 pSG76c 벡터에 접합(ligation)을 통하여 최종적으로 2 copy의 asd 유전자가 클로닝된 pSG76c-2asd 재조합 벡터를 제작하였다.
실시예 4: 야생형 기반 모균주의 제작
(1) ppc, aspC, asd 유전자 강화
상기의 실시예 3-5 에서 제작된 pSG76c-2ppc, pSG76c-2aspC, pSG76c-2asd 벡터를 이용하여 미국생물자원센터(American Type Culture Collection)로부터 구매한 대장균 W3110 균주(기탁번호 ATCC9637)에 형질전환하여, LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, chloramphenicol 25μg/L, agar 15g/L) 플레이트 배지에서 도말한 후 클로람페니콜 내성을 가지는 콜로니를 선발하였다. 선별된 형질전환체는 pSG76c-2ppc 벡터가 유전체 내의 ppc 부분에 1차로 삽입된 균주이다.
확보된 2 copy의 ppc 유전자가 삽입된 균주는 pSG76c 벡터 내에 존재하는 I-SceI 부분을 절단하는 제한 효소 I-SceI를 발현하는 벡터인 pST76-AsceP를 형질전환하여 LB-Ap(Yeast extract 10 g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100 μg/L, agar 15 g/L)플레이트 배지에 도말하여 30℃에서 생장하는 균주를 선별하였다.
이렇게 성장한 균주는 ppc 유전자가 2 copy로 증폭됐거나 처음 1 copy로 되돌아갈 수 있는데, 서열번호 30, 서열번호 31 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고 1% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 6.5kb로 커진 2 copy ppc 균주를 선별하였다. 상기의 과정을 거치게 되면, ppc 유전자가 추가 삽입되고 pSG76c 백터는 제거되게 된다.
상기와 같은 방법으로 pSG76c-2aspC, pSG76c-2asd 벡터를 이용하여 차례대로 w3110 균주에 ppc, asd, aspC가 2 copy로 증폭된 균주를 제작하였다. 이 과정에서 aspC 2copy 제작은 서열번호 32, 서열번호 33으로 PCR을 수행하고 1% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 3.2kb로 커진 것으로, asd 2 copy 제작은 서열번호 34, 서열번호 35로 PCR을 수행하고 1% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 3.2kb로 커진 것을 통해 확인할 수 있었다. 이렇게 제작된 균주를 CJW2로 명명하였다.
<서열번호 30>
CTGGCTCAATTAATCAGGCTC
<서열번호 31>
CGAGGGTGTTAGAACAGAAGT
<서열번호 32>
TGGTGAACTACTTTGAAGTGG
<서열번호 33>
TGCGGCACGAGCGCCTTATCC
<서열번호 34>
GCTCGTAGGCTAAGAAATGCC
<서열번호 35>
CAGGTAAGGCTGTGAATACTC
(2) metB, thrB 및 metA 유전자 결손
상기의 방법으로 제작된 CJW2 균주를 이용하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 metB, thrB 및 metA 유전자가 결손된 균주를 제작하였고, CJW2H로 명명하였다. CJW2H는 균주 내에 호모세린이 과량 축적되며, 도입되는 플라스미드의 metX 기질특이성에 따라 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 생산할 수 있는 균주이다.
실시예 5: 실험균주 제작
(1) 균주의 제작
상기 실시예 1-(3) 및 4-(2)에서 제조된 대장균 CJM2와 CJW2H 균주를 컴피턴트 세포(competent cell)로 제작하고, 컴피턴트 세포에 전기천공 방법(electroporation)으로 실시예 3-1,3-2,3-3,3-4에서 제조된 pCL_Pcj1_metA(wt), pCL_Pcj1_metA#11, pCL_Pcj1_dra metX, pCL_Pcj1_cvi metX의 4종의 플라스미드를 각각 도입하였다.
(2) 플라스크 배양실험
이후, 4종의 플라스미드가 도입된 각각의 균주가 생산하는 메치오닌 전구체 종류와 생산량을 비교하기 위해서 플라스크 테스트를 수행하였다. 플라스크 테스트는 각각의 균주를 LB 플레이트에서 스트리킹(streaking)하고, 31℃ 배양기에 16시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니(colony)를 LB 배지 3ml에 접종한 후 200rpm/31℃ 배양기에서 16시간 동안 배양함으로써 수행하였다.
250 ml 플라스크에 하기 표 1의 메치오닌 전구체 생산배지 25ml를 넣고, 앞서 배양한 배양액을 500μl씩 투입하였다. 이후, 플라스크를 200rpm/31℃ 배양기에서 40시간 동안 배양한 후, HPLC를 이용해서 각각의 플라스미드가 도입된 균주에서 얻어지는 메치오닌 전구체의 종류 및 양을 비교하고, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2014009970-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2014009970-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2014009970-appb-T000003
그 결과, 상기 표 2 및 표 3에 의하면, E.coli 야생형 metA 유전자 및 피드백 저해에 내성을 가지는 metA#11 유전자를 각각 포함하는 균주인 CJM2 pCL_Pcj1_metA(wt), CJM2 pCL_Pcj1_metA#11, CJW2H pCL_Pcj1_metA(wt) 및 CJW2H pCL_Pcj1_metA#11에 의해서는 O-숙시닐 호모세린이 생산되었고, 각각 데이노코쿠스 라디오두란스 유래의 metX 유전자를 포함하는 균주인 CJM2 pCL_Pcj1_dra metX 및 CJW2H pCL_Pcj1_dra metX에 의해서는 O-아세틸 호모세린이 생산되었음을 알 수 있었다.
크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자의 경우는 metA 유전자에 비해 다른 metX 상동 유전자(orthologues)들과 높은 상동성(homology)을 갖지만 기질특이성 면에서는 일반적으로 보고된 metX 유전자와는 달리, 숙시닐 호모세린을 생산하는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라아제임을 알 수 있다.
또한, E.coli 야생형 metA(wt) 유전자가 도입된 경우는 배지에 첨가되는 0.3g/L의 메치오닌에 의한 피드백저해 현상으로 인해서 O-숙시닐 호모세린이 약 1 g/L정도 생성되는 현상을 보이지만, 크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자가 도입된 경우는 유전자 변이의 도입 없이 야생형 그 자체로도 배지에 첨가된 메치오닌에 의한 피드백 저해 현상 없이 O-숙시닐 호모세린이 생산됨을 알 수 있었다.
pCL_Pcj1_cvi metX이 도입된 CJM2 균주(CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX)를 2013년 06월 20일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 수탁번호 KCCM11433P로 기탁하였다.
(3) 대형발효조 배양실험
CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX 및 CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX 균주를 이용하여 메치오닌 전구체인 O-숙시닐호모세린을 대량 생산하기 위해서 5L 발효조 배양을 실시하였다.
스펙티노마이신 항생제가 함유된 평판 LB 배지에 CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX 및 CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX 균주를 접종하여 31℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 단일 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된10 ml LB 배지에 접종한 후 31℃ 에서 5 시간 배양하고, 이 배양액 2ml을 다시 200 ml 시드(Seed) 배지를 포함한 1000ml 삼각플라스크에 접종하였다. 그리고 다시 31℃ 200 rpm에서 3~10시간 배양한 후, 시드 배양액 255ml을 5L 발효조 주배지 1.7L에 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 시드 배지를 1.3L 소모시켜 50~100시간 배양하였다.
배양과정에 사용한 상세 배지 성분을 하기 표 4에 나타내었다. 이렇게 배양한 발효액에서 O-숙시닐호모세린 농도를 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2014009970-appb-T000004
표 5
Figure PCTKR2014009970-appb-T000005
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 쓰레오닌 생산균주를 모균주로 하여 크로모박테리움 비오라슘 유래 metX 유전자가 도입된 균주인 CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX는 높은 수준으로 O-숙시닐호모세린을 축적한다는 것을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2014009970-appb-I000001

Claims (8)

  1. 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 메치오닌에 의한 피드백 저해에 대한 내성(feedback resistant) 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드.
  2. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 36의 염기서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 메치오닌에 의한 피드백 저해에 대한 내성(feedback resistant) 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는, O-숙시닐호모세린을 생산하는 에스케리키아속 미생물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 에스케리키아속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 에스케리키아속 미생물.
  5. 제3항에 있어서,
    시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자가 추가로 결손 또는 약화된, 에스케리키아속 미생물.
  6. 제3항에 있어서,
    호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 thrB 유전자 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase)를 코딩하는 metA 유전자가 추가로 결손 또는 약화된, 에스케리키아속 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase)가 추가로 강화된 에스케리키아속 미생물.
  8. (a) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 또는 배지로부터 O-숙시닐호모세린을 수득하는 단계를 포함하는, O-숙시닐호모세린의 생산방법.
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