WO2022098163A1 - 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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성민경
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present application relates to a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose and a method for producing 3-hydroxypropionic acid from glucose using the same.
  • 3-hydroxypropionic acid (3-HP) is an important synthetic intermediate used in various chemical processes.
  • Key compounds synthesized using 3-HP as a precursor include 1,3-propanediol, acrylic acid ( acrlici acid, methyl acrylate, acrylamide, ethyl 3-HP, malonic acid, propiolactone, and acrylonitrile.
  • 3-HP has excellent economic value to the extent that it was selected as an important high value-added compound that can be converted from biomass by the US Department of Energy (DOE) in 2004.
  • DOE US Department of Energy
  • 3-HP can be produced through a chemical process using ethylene cyanohydrin, beta-idopropionic acid, beta-bromopropionic acid, beta-chloropropionic acid, beta-propiolactone, acrylic acid, etc. as an intermediate, and from glycerol It can also be produced through biological processes. However, most of these chemicals are toxic and carcinogenic, consume a large amount of energy under conditions of high temperature and pressure, and discharge large amounts of pollutants.
  • 3-HP can also be produced through microbial fermentation.
  • the 3-HP production process using E. coli or Krebsiella pneumoniae has been studied so far, it has not yet reached a commercial level in terms of productivity, yield, economic feasibility, etc. of the medium.
  • Most of the ones studied so far have synthesized 3-HP using glycerol as a substrate, and studies on the biosynthesis of 3-HP from glucose other than glycerol have not been conducted, and glucose is also used for cell growth. As a result, there is a problem in that the yield of 3-HP production is lowered. Therefore, there is a need for research on a microorganism capable of producing 3-HP from glucose and a method for producing 3-HP using the same.
  • One example provides a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose.
  • GPD glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • GPP glycerol-3-phosphate phosphatase
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Escherichia.
  • the microorganism has an increased ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose and/or a by-product (eg, glycerol, etc.) compared to a homogeneous microorganism that does not have one or more characteristics selected from the above characteristics (1) to (5). may be to reduce
  • Another example provides a composition for producing 3-hydroxypropionic acid, including the microorganism.
  • Another example provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising culturing the microorganism in a glucose-containing medium.
  • Another example provides a culture obtained by culturing the microorganism in a glucose-containing medium.
  • the culture may contain 3-hydroxypropionic acid in an amount of 60 g or more per 1 L, and do not include glycerol or include it in an amount of 20 g or less.
  • the present application relates to a microorganism having an increased ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose (eg, 3-HP production amount and 3-HP production yield) and a method for producing 3-hydroxypropionic acid from glucose using the same provide technology.
  • An example of the present application provides a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose.
  • GPD glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • GPP glycerol-3-phosphate phosphatase
  • the microorganism may include all of the characteristics of (1) to (5).
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Escherichia.
  • the microorganism has an increased production capacity of 3-hydroxypropionic acid from glucose and/or a by-product (eg, glycerol, acetate, PDO etc.) may be reduced.
  • a by-product eg, glycerol, acetate, PDO etc.
  • 'activity is enhanced, weakened, and/or inactivated' may mean that the activity is enhanced, weakened, and/or inactivated compared to the parent strain (host microorganism).
  • the parent strain as a strain homologous to the microorganism, may refer to a microorganism before or without a mutation to have one or more characteristics selected from (1) to (5).
  • adenosyltransferase (adenosyltransferase, corrinoid adenosyltransferase)
  • the adenosyltransferase may be an enzyme belonging to EC 2.5.1.17, Escherichia coli , Pseudomonas denitrificans , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium ( Salmonella typhimurium ), Shewanella oneidensis ), Ralstonia solanacearum ), Pseudomonas denitrificans ( Pseudomonas denitrificans ), or Mycobacterium bovis and the gene encoding it may be exemplified by btuR (GenBank Accession Nos. M21528.1), cobA (GenBank Accession Nos. L08890.1), or cobO (GenBank Accession Nos. M62866.1).
  • Glycerol-3-phosphate dehydrogenase is an enzyme that catalyzes the conversion of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) to glycerol-3-phosphate (G3P). It may mean a polypeptide having an activity. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase may be NADH-, NADPH-, or FAD-dependent.
  • Glycerol-3-phosphate dehydrogenase regardless of its origin, may be included in the scope of the present application as long as it is an enzyme having an enzymatic activity that catalyzes the conversion of DHAP to G3P, for example, the gene encoding it is GPD1 and / Or it may be GPD2, and may be derived from Saccharomyces cerevisiae , GPD1 (Genbank Accession no. CAA98582.1), GPD2 (Genbank Accession no. NM_001183314.1), or a combination thereof. .
  • GPP glycerol-3-phosphate phosphatase
  • Glycerol-3-phosphate phosphatase refers to a polypeptide having an enzymatic activity that catalyzes the conversion of glycerol-3-phosphate (G3P) to glycerol.
  • Glycerol-3-phosphate phosphatase regardless of its origin, may be included in the scope of the present application as long as it is an enzyme having an enzymatic activity that catalyzes the conversion of G3P to glycerol, for example, the gene encoding it is GPP1 and/or GPP2 It may be, and may be from Saccharomyces cerevisiae , GPP1 (Genbank Accession no.
  • KZV10562.1 coding gene: Genbank Accession no. NM_001179403.1), GPP2 (Genbank Accession no. NP_010984.3) ; encoding gene: Genbank Accession no. NM_001178953.3).
  • glycerol dehydratase or “diol dehydratase” refers to the enzyme activity that catalyzes the conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA). It may mean a polypeptide having Glycerol dehydratase or diol dehydratase may be coenzyme B12 dependent or independent.
  • the enzymes are, Klebsiella pneumoniae , Citrobacter freundii , Clostridium pasteurianum , Salmonella typhimurium , Klebsiella oxy Toka ( Klebsiella oxytoca ), and / or Clostridium butyricum ( Clostridium butyricum ) It may be derived from, but is not limited thereto.
  • the enzyme regardless of its origin, may be included in the scope of the present application as long as it has an enzyme activity that catalyzes the conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA), for example, a gene encoding it may be dhaB .
  • the dhaB may be derived from Krebsiella pneumoniae (EMBL Accession Nos. U30903.1( dhaB1 ), Genbank Accession no. CDO12380.1 ( dhaB ), etc.).
  • glycerol dehydratase reactivase refers to an enzyme that functions to maintain catalytic activity by reactivating what is irreversibly inactivated during the action of glycerol dehydratase can do.
  • Any commonly known glycerol dehydratase reactivase may be used, for example, Klebsiella sp. (eg, Klebsiella pneumoniae), Citrobacter genus ( Citrobacter sp.), the genus Lactobacillus ( Lactobacillus sp.), the genus Salmonella ( Salmonella sp.) may be derived from strains, but is not limited thereto.
  • Glycerol dehydratase reactivase may be DhaFG, GdrAB, DdrAB, or the like, for example, the gene encoding it may be dhaFG , gdrAB , and/or ddrAB .
  • aldehyde dehydrogenase is an enzyme that converts an aldehyde to a carboxylic acid, from 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) to 3-hydroxypropionic acid (3-HP) It may refer to a polypeptide having an enzymatic activity that catalyzes the conversion of Aldehyde dehydrogenase can be any generally known, for example, may be derived from the genus Escherichia (eg, the genus Escherichia (eg, Escherichia coli), etc., but is limited thereto No.
  • Any enzyme having an enzymatic activity that catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) to 3-hydroxypropionic acid (3-HP) may be included in the scope of the present application, for example, encoding it
  • the gene may be aldH and/or puuC .
  • galactose permease refers to a protein that transports several types of sugars including galactose and/or glucose into cells (Venter, Henrietta et al., Biochemical Journal (2002) )363:243-252).
  • the galactose permease (GalP) can act as a glucose permease, and as a symporter having 12 trans-membrane loops, the ability to transport glucose through the cell membrane can have
  • the galactose permease (GalP) is capable of transporting glucose within the pts -strain, and may act to compensate for the loss of glucose uptake mediated by the phosphotransferase system (PTS).
  • the galactose permease may be a galactose permease derived from Escherichia coli (eg, strain W3110), and may be encoded by a galP gene.
  • glucokinase may refer to an enzyme that promotes phosphorylation of glucose into glucose-6-phosphate.
  • the glucokinase may be a glucokinase derived from Escherichia coli (eg, strain W3110), and may be encoded by a glk gene.
  • the phosphotransferase system (PTS) consuming PEP phosphoenol pyruvate
  • PTS phosphoenol pyruvate
  • glucose-specific transporter of the phosphotransferase system may mean a protein capable of transporting glucose in the phosphotransferase system, for example, EIICB Glc (Enzyme IICB Glc ).
  • the glucose transporter of the phosphotransferase system may be derived from Escherichia coli (eg, strain W3110), and may be encoded by ptsG .
  • PTS phosphotransferase system
  • the activity of the glucose transporter of the phosphotransferase system is weakened and/or inactivated, and the activity of galactose permease and glucokinase is enhanced, so that the PEP-free glucose uptake route is used.
  • glucose can be ingested and used.
  • the activities of galactose permease and glucokinase are enhanced to transport glucose into cells and transport the transported glucose into cells. may be converted to the glucose-6-phosphate form, a process that may not require and/or may not depend on PEP.
  • the microorganism is capable of uptake and/or use of glucose by a glucose introduction system that is not dependent on PEP.
  • microorganisms provided in the present application are:
  • the activity of the glucose-specific transporter of the phosphotransferase system may be weakened or inactivated.
  • the microorganism may have enhanced activity of adenosyltransferase.
  • the enhancement of the activity of the adenosyltransferase may be due to an increase in the expression of the btuR gene.
  • the increase in expression may be due to introduction of a homologous or heterologous btuR gene.
  • the microorganism may have enhanced activity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD) and/or glycerol-3-phosphate phosphatase (GPP), and a glycerol-3-phosphate dehydrogenase encoding gene and / or overexpression of a glycerol-3-phosphate phosphatase coding gene.
  • the microorganism may further include a gene encoding GPD and a gene encoding GPP derived from allogeneic or heterologous origin, for example, an inducible promoter and a gene encoding GPD operably linked thereto, and / or may additionally include a gene encoding GPP.
  • the inducible promoter may be linked to the promoter by addition (treatment) of an inducing substance to induce expression of a gene, and the inducible promoter is used to control the transcriptional timing of the GPD-encoding gene and GPP-encoding gene, which are foreign genes.
  • the inducible promoter may be BAD, LTTR, BAD, Trc, and/or Tac, when the inducible promoter is BAD, the inducer is L-arabinose, and when the inducible promoter is LTTR, the inducer is the inducer This could be 3-HP.
  • the microorganism may further include a GPD gene and a GPP gene operably linked to the LTTR promoter.
  • the BAD, LTTR, and/or TAC promoters may include the nucleic acid sequences shown in Table 1 or consist of the nucleic acid sequences shown in Table 1.
  • the gene encoding the glycerol-3-phosphate dehydrogenase into which the inducible promoter is introduced and the gene encoding the glycerol-3-phosphate phosphatase into which the inducible promoter is introduced are cloned into the cells, respectively. can be introduced.
  • the two genes may be cloned into one vector and introduced into a cell.
  • the vector refers to a genetic construct including essential regulatory elements operably linked so that a gene insert encoding a target protein is expressed in cells of an individual, and has various forms such as plasmids, viral vectors, bacteriophage vectors, and cozmid vectors. You can use a vector of
  • the microorganism may be one in which one or more activities selected from the group consisting of glycerol dehydratase, glycerol dehydratase reactivase, and aldehyde dehydrogenase are enhanced.
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of a dhaB gene encoding glycerol dehydratase, a gdrAB gene encoding glycerol dehydratase reactivase, and aldH gene encoding aldehyde dehydrogenase , for example, may further include all three, whereby the microorganism according to an example is dhaB , gdrAB , and/or aldH genes overexpressed to glycerol dihydratase, glycerol dihydratase reactivase, and/or The activity of the arabinose transport protein may be enhanced.
  • the microorganism according to an embodiment may additionally include a constitutive expression promoter and dhaB , gdrAB , and/or aldH operably linked thereto.
  • the constitutive expression promoter can induce expression of an operably linked gene without a separate inducer.
  • the constitutive expression promoter may be J23100, J23101, J23102, J23103, J23104, J23105, J23106, J23107, and/or J23109, but is not limited thereto. can be used
  • the microorganism may further include a dhaB gene operably linked to the J23101 promoter and aldH gene operably linked to the gdrAB gene and J23100 .
  • a gene encoding glycerol dehydratase into which a constitutive expression promoter is introduced a gene encoding glycerol dehydratase reactivase into which a constitutive expression promoter is introduced, and an arabinose transport protein into which a constitutive expression promoter is introduced
  • a gene encoding glycerol dehydratase into which a constitutive expression promoter is introduced a gene encoding glycerol dehydratase reactivase into which a constitutive expression promoter is introduced
  • an arabinose transport protein into which a constitutive expression promoter is introduced
  • the microorganism may have enhanced activity of galactose permease and/or glucokinase.
  • the enhancement of the activity of the galactose permease may be due to an increase in expression of the galP gene
  • the enhancement of the activity of the glucokinase may be due to an increase in the expression of the glk gene.
  • the increase in expression may be due to introduction of a homologous or heterologous galP gene and/or a glk gene.
  • the microorganism may have weakened or inactivated activity of the glucose transporter of the phosphotransferase system.
  • the weakening and/or inactivation of the glucose transporter activity of the phosphotransferase system in the microorganism may be due to deletion of all and/or part of the ptsG gene inherent in the microorganism.
  • protein or polypeptide
  • the term "protein (or polypeptide)” has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity to the amino acid sequence of the described protein, the amino acid sequence It may refer to a protein having substantially equivalent enzymatic activity and/or effect (ie, the effect of imparting or enhancing 3-hydroxypropionic acid production ability from glucose to microorganisms) as that of the protein.
  • the term “gene (or polynucleotide)” refers to at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity to a nucleic acid sequence of a described gene, wherein the nucleic acid sequence is It may refer to a nucleic acid molecule encoding a protein having substantially equivalent enzymatic activity and/or effect (ie, the effect of imparting or enhancing 3-hydroxypropionic acid production ability from glucose to a microorganism) as that of the encoding protein.
  • % identity of sequences refers to the degree to which two or more polynucleotide sequences are the same when comparing the sequences after aligning them so that they match as much as possible. Percent sequence identity can be determined, for example, by comparing two optimally aligned sequences throughout the comparison region and determining the number of positions in which the same amino acid or nucleic acid appears in both sequences to obtain the number of matched positions and , dividing the number of matched positions by the total number of positions within the comparison range (ie, range size), and multiplying the result by 100 to obtain the percent sequence identity. The percent sequence identity may be determined using a known sequence comparison program, and examples of the program include BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), and the like.
  • activity enhancement means that the activity of a protein itself is newly introduced or increased to derive an effect beyond its original function, as well as increase in intrinsic gene activity, internal or external factors Intrinsic gene amplification from, deletion of inhibitory regulatory factors for gene expression, gene copy number increase, gene introduction from outside, modification of expression control sequences, and/or increase in enzyme activity due to promoter replacement or modification and intragene mutation, etc. It may mean a state in which the activity of the microorganism after the operation is increased compared to the activity of the microorganism before the same operation is performed.
  • enhancing the activity of a protein can be achieved by applying various methods well known in the art.
  • the method for enhancing or increasing the activity of the enzyme can be applied to various methods well known in the art.
  • a method of additionally inserting a gene (polynucleotide) including a nucleotide sequence encoding the enzyme (or protein) into a chromosome, introducing the gene (polynucleotide) into a vector system Methods for increasing the copy number of the nucleotide sequence encoding enzymes (or proteins) by methods, etc., replacing a promoter capable of expressing a gene (polynucleotide) with a strong promoter, and introducing mutations into the promoter may be included.
  • RNA-guided endonuclease system RNA-guided endonuclease system
  • an RNA-guided endonuclease eg, Cas9 protein, etc.
  • a coding gene thereof e.g.
  • a vector comprising the gene e.g., a guide RNA (eg, single guide RNA (sgRNA)) etc.), a mixture (eg, a mixture of an RNA-guided endonuclease protein and a guide RNA, etc.), a complex (eg, a ribonucleic acid fusion protein ( RNP), a recombinant vector (e.g., one or more selected from the group consisting of a vector including a RNA-guided endonuclease-encoding gene and a guide RNA-encoding DNA, etc.)
  • a guide RNA eg, single guide RNA (sgRNA)
  • a mixture eg, a mixture of an RNA-guided endonuclease protein and a guide RNA, etc.
  • a complex
  • the microorganism according to an embodiment may further include a constitutive expression promoter and a gene operably linked thereto, and the activity of the protein (or enzyme) encoded by the gene may be enhanced.
  • the constitutive expression promoter can induce expression of an operably linked gene without a separate inducer.
  • the constitutive expression promoter may be of the J23 family (eg, J23100, J23101, J23102, J23103, J23104, J23105, J23106, J23107, and/or J23109), but is not limited thereto. You can select and use it without any restrictions according to your needs.
  • enhancing the activity of a protein (or enzyme) may change the promoter to a stronger promoter than that of the native promoter through mutation or substitution.
  • an improved promoter having a base substitution mutation or a heterologous promoter may be linked.
  • promoter is an untranslated nucleic acid sequence upstream of the coding region that includes a binding site for polymerase and has transcription initiation activity to mRNA of a gene below the promoter, that is, polymerase binds to Refers to a DNA region that initiates transcription of a gene, and may be located at the 5' site of the mRNA transcription initiation site.
  • vector refers to any medium for cloning and/or transfer of a base into a host cell.
  • the vector may be a replicator capable of binding other DNA fragments to bring about replication of the bound fragment.
  • Replication unit refers to any genetic unit (eg, plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, i.e. capable of replicating by its own regulation.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in a host, and any vector known in the art may be used.
  • the vector used for the construction of the recombinant vector may be a plasmid, a cosmid, a virus, or a bacteriophage in a natural state or a recombinant state.
  • pWE15, M13, ⁇ EMBL3, ⁇ EMBL4, ⁇ FIXII, ⁇ DASHII, ⁇ ZAPII, ⁇ gt10, ⁇ gt11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors
  • pDZ vectors, pBR systems, and pUC systems may be used as plasmid vectors.
  • the usable vector is not particularly limited and a known expression vector may be used, but is not limited thereto.
  • the vector may be such that the gene transferred into the vector is irreversibly fused into the genome of the host cell so that the gene expression in the cell is stably maintained for a long period of time.
  • Such vectors contain transcriptional and translational expression control sequences that allow the gene of interest to be expressed in the host of choice.
  • Expression control sequences may include any operator sequence for regulating transcription, and/or sequences regulating the termination of transcription and translation.
  • the start codon and stop codon are generally considered part of the nucleic acid sequence encoding the protein of interest, and must be functional in the subject when the genetic construct is administered and must be in frame with the coding sequence.
  • the origin of replication may be included.
  • an enhancer, an untranslated region at the 3' end of a gene of interest, a selection marker (eg, an antibiotic resistance marker), or a replication-competent unit may be included as appropriate.
  • Vectors can be self-replicating or integrated into host genomic DNA.
  • each element in the vector must be operably linked to each other, and ligation of these element sequences can be performed by ligation (ligation) at a convenient restriction enzyme site, where such a site does not exist , can be performed using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method.
  • transformation refers to introducing a gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell, and if the transformed gene can be expressed in the host cell, it is inserted into the chromosome of the host cell or located extrachromosomally. Anything may be included without limitation.
  • the gene includes DNA and/or RNA encoding a target protein.
  • the form in which it is introduced is not limited.
  • the gene may be introduced into a host microorganism in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include expression control elements such as a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site and/or a translation termination signal, which are operably linked to the gene in general.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the gene may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the transformation method is included without limitation as long as it is a method of introducing a gene into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art according to the host cell.
  • electroporation calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, retroviral infection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method , cationic liposome method, and/or lithium acetate-DMSO method may be used, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a desired gene to be expressed and the gene sequence are functionally linked.
  • the microorganism according to an embodiment may have a weakened or inactivated activity of a glucose-specific transporter of the phosphotransferase system.
  • the weakening and/or inactivation of the glucose transporter activity of the phosphotransferase system may be due to deletion of all and/or part of the ptsG gene.
  • weakened activity may mean a case in which the activity level of the glucose transporter of the phosphotransferase system in the cell is reduced compared to the parent strain, such as a wild-type strain or a strain before modification.
  • the weakening is a case in which the activity of the enzyme itself is reduced compared to the activity of the enzyme possessed by the original microorganism due to mutation of the gene encoding the enzyme, transcription inhibition and/or translation inhibition of the gene encoding it, etc.
  • activation means that the expression of a gene (eg, ptsG ) encoding a glucose transporter of the phosphotransferase system is not expressed at all compared to the wild-type strain or the strain before modification, or the expression is Even if it is, it may mean a state in which there is no activity.
  • a gene eg, ptsG
  • Attenuation or inactivation of the activity of a protein or enzyme can be achieved by application of various methods well known in the art.
  • a method of replacing a gene encoding the enzyme on a chromosome with a mutated gene such that the activity of the enzyme (or protein) is reduced, including when the activity of the enzyme (or protein) is completely removed a method of introducing a mutation into an expression control sequence (eg, a promoter) of a gene on a chromosome encoding the enzyme (or protein); a method of replacing the expression control sequence of the gene encoding the enzyme (or protein) with a sequence having weak activity or no activity; a method of deleting all or part of a gene on a chromosome encoding the enzyme (or protein); a method of introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to
  • a decrease in gene expression may mean that the expression level of a gene is reduced than that of the host cell (parent strain) and/or wild-type before mutation, and includes cases where expression is not achieved due to complete inhibition of expression. can do.
  • the expression may be reduced by substituting a start codon for gene translation, or genetic engineering may be performed to reduce the expression level of an existing gene.
  • the method of modifying the sequence for expression control is performed by inducing mutations in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof in the nucleic acid sequence of the expression control sequence, or by changing the promoter to a weaker promoter.
  • the expression control sequence includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • microorganism may include unicellular bacteria, for example, E. coli (eg, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B, and/or E. coli XL1-Blue).
  • E. coli eg, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B, and/or E. coli XL1-Blue).
  • the microorganism may additionally have weakened or inactivated activity of one or more enzymes selected from the group consisting of the following (a) to (f):
  • the microorganism may be one in which one or more genes selected from the group consisting of the following (i) to (v) are additionally deleted:
  • the microorganism may be one in which the yqhD , glpK , ldhA , ack-pta , and gldA genes are additionally deleted.
  • the microorganism according to an example may be one in which cell growth is inhibited (rather than the parent strain).
  • the microorganism according to an embodiment can introduce glucose without requiring PEP, and thus can be easily utilized to produce 3HP without using the glucose introduced from the host cell for cell growth.
  • the microorganism according to an example may have enhanced adenosyltransferase activity (rather than the parent strain) to increase the conversion of glucose to 3-HP.
  • the microorganism according to an example may have the ability to synthesize an organic acid, for example, it may have the ability (or 3-HP production ability) to synthesize 3-hydroxypropionic acid (3-Hydroxypropionic Acid).
  • the microorganism according to an example may itself be a strain genetically engineered to produce an organic acid including a gene involved in organic acid production, to have an organic acid production ability, or to enhance an organic acid production ability.
  • the production of the organic acid includes those produced within the strain, those produced within the cell and secreted outside the cell, or a combination thereof.
  • the 3-hydroxypropionic acid (3-HP) is an isomer of lactic acid (2-hydroxypropionic acid) and is used as a crosslinking agent for polymer coatings, metal lubricants, antistatic agents for fibers, etc., acrylic acid, 1,3-propanediol, methyl acrylic acid It is a platform compound that can be converted into several commercially important chemicals such as lactate, ethyl 3-hydroxypropionic acid, malonic acid, propionlactone, acronitrile, or acrylamide. 3-HP can be produced from glycerol through a biological process.
  • “having 3-hydroxypropionic acid (3-HP) producing ability” refers to cells and/or microorganisms naturally having 3-HP producing ability, or 3-HP in the parent strain without 3-HP producing ability. It refers to microorganisms endowed with productive capacity.
  • microorganism has 3-HP production ability by introducing the mutation according to one example and/or the microorganism has 3-HP production ability by introducing the mutation according to the embodiment to a microorganism having no 3-HP production ability
  • a microorganism of the genus Escherichia having 3-HP production ability is a native microorganism itself or an external gene related to 3-HP production mechanism is inserted, or enhanced 3-HP production ability by enhancing or inactivating the activity of an intrinsic gene It may mean a microorganism of the genus Escherichia that has
  • the microorganism may have 3-HP-producing ability or may be a strain genetically engineered to have 3-HP-producing ability.
  • the production of 3-HP is produced in the strain
  • the microorganism has a 3-HP yield (3-HP production (g)/input glucose amount (g)) of 0.4 or more, 0.42 or more, 0.45 or more, 0.47 when cultured for 24 hours in a medium containing glucose or more, 0.5 or more, 0.52 or more, 0.54 or more, 0.57 or more, 0.6 or more, 0.65 or more, 0.7 or more, or 0.75 or more (the upper limit may be 1, 0.9, 0.85, or 0.8).
  • the microorganism has a 3-HP production amount of 60 g/L or more, 65 g when cultured in a medium containing glucose for 24 hours to 48 hours, for example, 24 hours, 30 hours, 36 hours, 42 hours or 48 hours.
  • /L or more, 70 g/L or more, or 75 g/L or more such as 60 g/L to 200 g/L, 60 g/L to 150 g/L, 60 g/L to 100 g/L, 65 g/L to 200 g/L, 65 g /L to 150 g/L, 65 g/L to 100 g/L, 70 g/L to 200 g/L, 70 g/L to 150 g/L, 70 g/L to 100 g/L, 75 g/L to 200 g/L, 75 g/L to 150 g/L, or 75 g/L to 100 g/L.
  • the microorganism is a by-product (eg, glycerol, acetate, PDO (1, 3-propanediol) of 20g/L or less, 15g/L or less, 10g/L or less, 5g/L or less, 4g/L or less, 3g/L or less, 2g/L or less, or 1.5 g/L or less (the lower limit may be 0 (no by-products are produced), 0.001 g/L, 0.01 g/L, or 0.1 g/L).
  • glycerol, acetate, PDO (1, 3-propanediol) 20g/L or less, 15g/L or less, 10g/L or less, 5g/L or less, 4g/L or less, 3g/L or less, 2g/L or less, or 1.5 g/L or less (the lower limit may be 0 (no by-products are produced), 0.001 g/L, 0.01 g/L, or
  • the microorganism (or recombinant cell) may have increased (improved) 3-HP production capacity than the cells before recombination, the parent strain, and/or the wild-type strain.
  • the microorganism into which the mutation is introduced according to an example may have increased 3-HP production compared to the same type of unmodified microorganism.
  • the unmodified microorganism may refer to a microorganism of the same species to which a mutation is not introduced according to an example or a microorganism before introduction.
  • the production capacity (production amount or yield) of 3-HP is about 0.1% or more, about 1% or more, about 5% or more than that of a microorganism (parent strain, and/or host microorganism) into which the mutation of the present invention is not introduced. or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% It may be increased by more than, 200% or more, or 300% or more.
  • the microorganism may additionally include a mutation to increase 3-HP production, and the location of the mutation and/or the type of gene and/or protein to be mutated may increase 3-HP production. It can be included without limitation.
  • the microorganism may be used without limitation as long as it is a transformable cell.
  • the mutation according to the embodiment in order to distinguish the microorganism before the mutation according to the embodiment is introduced from the microorganism to which the mutation according to the embodiment is introduced and the 3-HP production capacity is increased or the microorganism to which the 3-HP production ability is imparted, the mutation according to the embodiment is introduced.
  • the microorganism before becoming a host microorganism (or parent strain) can be expressed.
  • Another example provides a method of increasing 3-HP production capacity of the microorganism or a method of imparting 3-HP production capacity to the microorganism, comprising introducing (eg, transformation) the above-described mutation into a microorganism do.
  • Another example provides a composition for producing 3-hydroxypropionic acid from glucose, including the microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose.
  • Another example provides a use for the production of 3-hydroxypropionic acid from glucose of the microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from glucose.
  • Another example provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid, comprising culturing a microorganism having the ability to produce 3-hydroxypropionic acid from the glucose in a medium containing glucose.
  • the culturing may be performed by adjusting the pH to 6.5 to 7.0 using a basic solution.
  • the culturing step may include adding an inducer for promoting glycerol production (eg, an inducer for an inducible promoter) to promote glycerol production.
  • the culturing may include adding an inducer for an inducible promoter, and in one example, glycerol production may be promoted by the addition of the inducer, for example, induction GPD and/or GPP expression may be induced by the addition of the substance to promote glycerol production.
  • the inducible promoter may be BAD, LTTR, and/or TAC, when the inducible promoter is BAD, the inducer is L-arabinose, and when the inducible promoter is LTTR, the inducer is 3-HP (3-hyd hydroxypropionic acid), and when the inducible promoter is TAC, the inducer may be IPTG, and the inducible promoter is the same as described above.
  • the microorganism to which the production method according to an example can be applied is an inducible promoter and a gene encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD) operably linked thereto, and glycerol-3- It may include a gene encoding phosphate phosphatase (glycerol-3-phosphate phosphatase: GPP), and specifically may include the microorganisms described above.
  • GPP glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • the basic solution may be a magnesium hydroxide (Mg(OH)2) solution.
  • the culturing step uses a magnesium hydroxide (Mg(OH) 2 ) solution to adjust the pH to 6.5 to 7.0, 6.75 to 7.0, 6.9 to 7.0, 6.5 to 6.95, 6.75 to 6.95, or 6.9 to 6.95. It may be cultured under conditions controlled by In an example, the concentration of the magnesium hydroxide solution may be 10 to 500, 50 to 300, 100 to 200, or 150 g/L.
  • 3-HP when the pH is adjusted to the above range using magnesium hydroxide, 3-HP than when the pH is adjusted in the above range using another basic aqueous solution (eg, ammonium hydroxide (NH 4 OH) solution) About 5% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more of 3HP production yield compared to production and/or input glucose , about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more, 200% or more, or 300% or more, but is not limited thereto.
  • NH 4 OH ammonium hydroxide
  • the medium containing glucose may contain glucose at a concentration of 5 to 50 gL, 10 to 30 g/L, 15 to 25 g/L, 10 to 20 g/L, 20 to 30 g/L, or 20 g/L. there is.
  • the addition of the inducer may be added to the culture medium before the microorganisms consume all of the glucose.
  • the production method according to an example may be cultured by adding the inducer to the culture medium from the beginning of the culture.
  • the culturing step may further include adding 3-hydroxypropionic acid to the culture medium before the microorganisms consume all of the glucose. More specifically, in the culturing step, before the microorganisms consume all of the glucose, 3-HP is added to the culture medium to induce transcription of GPD and GPP genes, rather than using the glucose contained in the culture medium for cell growth. It can be used in 3-HP production. According to the method according to an example, the 3-HP production amount relative to the input (added) glucose may be increased compared to the existing method.
  • the timing of adding 3-HP in the culturing step can be confirmed by measuring whether the microorganisms consume glucose in the culturing step, for example, the amount of glucose consumption by the microorganisms can be measured using oxygen demand.
  • the initial culture period (0 hours) to 12 hours, 0 hours to 11 hours 30 minutes, 0 hours to 11 hours, 0 hours to 10 hours 30 minutes, or 0 hours to 10 hours It could mean time.
  • the concentration of glucose in the culture medium is 5% (w/w) or more, 10% (w/w) or more, 15% ( w/w) or more, or 20% (w/w) or more .
  • 3-HP as the inducer may be added at a concentration of 0.1 to 10 g/L, 0.1 to 5 g/L, 0.1 to 3 g/L, 0.5 to 3 g/L, or 0.5 or 1 g/L.
  • coenzyme B12 may be added in the culturing step, and the B12 is the glucose added to the medium in which the microorganism according to an example is initially added to the medium. It may be added after all consumption.
  • the B12 is the cell growth of the microorganism is OD 550 to 650, or OD 600 value is 5 to 30, 5 to 25, 5 to 20, 5 to 15, 10 to 30, 10 to 25, 10 to 20, It may be added when 10 to 15, 15 to 30, 15 to 25, or 15 to 20.
  • the B12 is after 5 hours to 30 hours, 10 hours to 30 hours, 10 hours 30 minutes to 30 hours, 11 hours to 30 hours, 12 hours to 30 hours, 14 hours to 30 hours after the start of the culture.
  • the coenzyme B12 may be added at a concentration of 0.1 to 10 uM, 0.1 to 5 uM, 0.1 to 3 uM, 0.5 to 3 uM, or 0.5 or 1 uM.
  • the culture may be made according to an appropriate medium and culture conditions known in the art, and it should meet the requirements of a specific strain in an appropriate manner, and may be appropriately modified by a person skilled in the art.
  • the culture method may include, for example, batch culture, continuous culture, fed-batch culture, or a combination culture thereof, but is not limited thereto.
  • the medium may include various carbon sources, nitrogen sources and trace element components, and the recombinant cells are subjected to temperature and/or pH control in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, etc. It can be cultivated while Carbon sources that may be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and/or cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and/or coconut oil; fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, and/or linoleic acid; alcohols such as glycerol, and/or ethanol; organic acids such as acetic acid.
  • sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and/or cellulose
  • oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and/or coconut oil
  • fatty acids such as palmitic acid, stearic acid
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen source may also be used individually or as a mixture, but is not limited thereto.
  • Sources of phosphorus that may be used include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • the medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth, but is not limited thereto.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be included.
  • precursors suitable for the medium may be used.
  • the medium or individual components may be added batchwise or continuously by an appropriate method to the culture medium during the culturing process, but is not limited thereto.
  • the pH of the culture medium may be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid to the microorganism culture medium in an appropriate manner during culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester during culture.
  • oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture medium may be 20 °C to 45 °C, 25 °C to 40 °C, or 30 °C to 37 °C.
  • the incubation period may be continued until a useful substance (eg, 3-HP) is obtained in a desired yield, and may be, for example, 10 to 160 hours.
  • the production method may further include isolating, recovering and/or purifying 3-hydroxypropionic acid from the cultured microorganism and the culture medium.
  • the step of isolating and/or recovering 3-HP from the cultured microorganism (or recombinant cell) and/or culture medium is performed using a suitable method known in the art according to the culture method. It may be collecting material (eg 3-HP). For example, centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), and/or chromatography (eg ion exchange, affinity, hydrophobicity, liquid, and size exclusion), but are not limited thereto.
  • the culture medium may refer to a medium in which microorganisms (or recombinant cells) are cultured.
  • the method for producing 3-HP may further include the step of purifying 3-HP before, simultaneously with, or after the step of separating and/or recovering the 3-HP.
  • Another example provides a culture in which the microorganisms described above are cultured in a medium containing glucose.
  • the culture may be one containing 3-HP at a high concentration.
  • the culture may be one containing a low level of by-products.
  • the culture may or may not contain the microorganism (cell-free).
  • the culture contains 3-HP at least 60 g/L, at least 65 g/L, at least 70 g/L, or at least 75 g/L, such as 60 g/L to 200 g/L, 60 g/L to 150 g/L.
  • the culture is at least one selected from the group consisting of glycerol, acetate, and PDO (1,3-propanediol), for example, glycerol 20 g / L or less, 15 g / L or less, 10 g / L or less, 5 g / L or less, 4 g/L or less, 3 g/L or less, 2 g/L or less, or 1.5 g/L or less (lower limit is 0 (not including by-products), 0.001 g/L, 0.01 g/L, or 0.1 g/L It may be included in a concentration of ).
  • PDO 1,3-propanediol
  • the microorganism according to an example may have an increased 3HP production capacity (3HP production) including a mutation that allows the glucose introduced into the cell to be used for 3HP production rather than cell growth, and the method according to an example includes the timing of addition of the inducer By controlling and / or adjusting the type of aqueous base solution, it is possible to increase the 3HP production yield.
  • 3HP production 3HP production capacity
  • FIG. 1a to 1c show the growth (OD) and mutant strains of Experimental Group 1 (FIG. 1b) and Experimental Group 2 (FIG. 1c) of Table 8, which are mutant strains according to Comparative Example (FIG. 1A) of Table 8, and The results of measuring the amount of material produced over time are shown respectively.
  • Figures 2a and 2b are results of measuring the growth (OD) of the mutant strain and the amount of material produced by the mutant strain according to an embodiment over time, specifically, Figure 2a is cultured using NH 4 (OH) The results of the case of adjusting the pH in the step (Experimental group 3 in Table 9) are shown, and FIG. 2b shows the results of the case of adjusting the pH in the culture step using Mg(OH) 2 (Experimental group 4 in Table 9).
  • Saccharomyces cerevisiae-derived GPD1 and GPP2 genes were subjected to PCR (2 minutes predenaturation at 95°C; 1 minute at 95°C) using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 or SEQ ID NOs: 3 and 4 in Table 2, respectively.
  • pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector a vector containing pRSF-pLTTR-GPD-GPP (hereinafter, “pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector”; vector names described in Examples of the present application) represents the gene/promoter contained in the vector and their position (sequence) from the 5' end) was constructed.
  • the sequences of the LTTR promoters used are shown in Table 3 below.
  • Example 1-2 Produced by pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR
  • the gene encoding glycerol dehydratase ( dhaB ), the gene encoding aldehyde dehydrogenase ( aldH ) and the gene encoding glycerol dehydratase reactivase ( gdrAB) were cloned into the plasmid pCDF to 'pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH' , and 'pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR' was prepared by cloning the gene ( btuR ) encoding adenosyltransferase here.
  • the promoter portion of the pCDFDuet-1 vector (Novagen, USA) was substituted with the J23101 and J23100 promoters.
  • dhaB U30903.1; about 2.7 kb; dhaB1 , dhaB2 , dhaB3
  • gdrAB genes about 2.2 kb; gdrA, gdrB
  • SEQ ID NO: 6 in Table 4 below 7 or the primer pair of SEQ ID NOs: 8 and 9 and NEB Q5 DNA polymerase was used to amplify using the conditions provided by NEB:
  • dhaB123 and gdrA genes are located side by side on the chromosome of Krebsiella pneumoniae, they were amplified together. Since gdrB is located in the opposite direction to dhaB123 and gdrA , only gdrB was amplified separately. At this time, NEB Q5 DNA polymerase was used. , the conditions provided by NEB were used. Thereafter, the dhaB123 and gdrA genes were cloned under the J23101 promoter (3' end) in the vector using restriction enzymes EcoRI and HindIII, and the gdrB gene using restriction enzymes HindIII and AflII.
  • aldH was cloned under the J23100 promoter (3' end), and amplified from the E. coli K12 MG1655 chromosome using the primers below, and the primers in Table 5 and NEB Q5 DNA polymerase were used, and the conditions were from NEB. The conditions provided were used.
  • aldH was cloned under the J23100 promoter using restriction enzymes KpnI and NdeI.
  • btuR was cloned under aldH and amplified from E. coli K12 MG1655 Chromosome using the following promoter, at this time, the primers in Table 5 and NEB Q5 DNA polymerase were used, and the conditions provided by NEB were used. .
  • a gene encoding glycerol dehydratase ( dhaB ), a gene encoding aldehyde dehydrogenase ( aldH ), and a gene encoding glycerol dehydratase reactivase ( gdrAB ) ), but a plasmid pCDF into which the btuR gene is not cloned was used.
  • the prepared vector was introduced into E. coli W3110 (KCCM 40219) by electroporation using an electroporation device (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell), and 3-HP production strain and control strain according to an embodiment of the present application were produced respectively.
  • the above strains were inoculated with a single colony of the strain in 5 mL of LB medium (containing 5 g/L yeast extract, 10 g/L tryptone, and 10 g/L NaCl) containing 25 mg/L streptomycin and then at 37°C and Incubated overnight in a shaking incubator under 250 rpm conditions.
  • Examples 1-3 Deletion of ptsG gene and overexpression of galP and glk genes
  • the ptsG gene was deleted using the Cas9 system.
  • the DKAPG strain (the strain in which the yqhD, glpK, ldhA, ack-pta and gldA genes were deleted from the W3110 strain) was transformed with an expression vector containing the Cas9 gene (Quick & easy E. coli gene deletion kit (K006) from Gene bridges).
  • DKALGP::PK was obtained by simultaneously transforming a guide RNA vector targeting the ptsG gene and repair DNA (Quick&easy E. coli gene deletion kit (K006) from Gene bridges).
  • the front part (1000 bp at the 5' end) and the back part (1000 bp at the 3' end) of ptsG are amplified from the E. coli K12 MG1655 chromosome using the primers of SEQ ID NOs: 14 and 15 and SEQ ID NOs: 18 and 19.
  • galP and glk genes were amplified from pRSF-J23106-galP-glk- LTTR -GPD-GPP vector using primers of SEQ ID NOs: 16 and 17.
  • the three amplified fragments (the front part of ptsG , the rear part of ptsG , and the galP and glk genes) were subjected to overlap-PCR using SEQ ID NOs: 14 and 19 and used as Repair-DNA.
  • the sequences of the primers used in this Example are shown in Table 6 below.
  • the galP and glk genes were amplified by PCR using the genomic DNA of the W3110 strain, the primers of SEQ ID NOs: 20 and 21, and the primer pairs of 22 and 23, respectively.
  • strain W3110 ( ⁇ yqhD, ⁇ glpK, ⁇ ldhA, ⁇ ack-pta ) in which the yqhD, glpK, ldhA, ack-pta and gldA genes were deleted from the W3110 (purchased from KCTC) strain according to the manufacturer's manual And ⁇ gldA ) (referred to as DKALG strain) was prepared, and, as in Example 1-3, the ptsG gene was deleted in the DKALG strain using the Cas9 system, and the galP and glk genes were added to the ptsG gene position.
  • a strain (referred to as a DKALGP::PK strain) in which the galP and glk genes were overexpressed by insertion was prepared.
  • the DKALGP::PK strain was electroporated with the pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector and pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR vector prepared in Examples 1-1 and 1-2 using an electroporation device (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell).
  • dhaB glycerol dehydratase gene
  • aldH aldehyde dehydrogenase encoding gene
  • gdrAB glycerol dehydratase reactivase-encoding gene
  • btuR adeno A strain containing a gene encoding a siltransferase
  • the pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector and pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH vector prepared in Examples 1-1 and 1-2 were introduced into the DKALGP::PK strain in the same manner as above, and glycerol dehydratase was introduced Plasmid pCDF containing a gene encoding ( dhaB ), a gene encoding an aldehyde dehydrogenase (aldH), and a gene encoding a glycerol dehydratase reactivase (gdrAB), into which the btuR gene is not cloned was introduced microorganisms were used.
  • dhaB a gene encoding
  • aldH aldehyde dehydrogenase
  • gdrAB glycerol dehydratase reactivase
  • each of the DKALGP::PK strains was plated on an LB plate (including 10 g tryptone per 1 liter, 5 g yeast extract, 10 g NaCl, 15 g agar) and cultured at 37° C. overnight.
  • the cultured single colonies were inoculated into 3 to 5 mL LB liquid medium (the medium composition is the same as above, but not including agar) and cultured overnight at 37°C with stirring.
  • the culture medium was diluted 1:100 in 0.05 liter of LB broth and incubated for 3-6 hours until the OD was ⁇ 0.5. After cooling on ice for 10 to 15 minutes, cells were collected by centrifugation at 4° C. at 4000 rpm for 10 minutes.
  • the cells were resuspended in 1 volume of sterile DI water cooled with ice, washed, and again centrifuged at 4°C at 4000rpm for 10 minutes to collect the cells.
  • the collected cells were again resuspended in 0.5 volume of DI water, washed, and again centrifuged at 4° C. at 4000 rpm for 10 minutes to collect the cells.
  • Collected cells were resuspended in 1 mL of ice-cold sterile 10% glycerol, and aliquots of cells were placed in individual pre-chilled microfuge tubes (90 ul per transformation in 0.1 cm gap electroporation cuvettes).
  • salt-free DNA (vector) After adding 1-5 ⁇ l by pipetting, the mixture was transferred to a pre-chilled electroporation cuvette. After electroporation at 1.8 kV, 1 mL of room temperature LB broth was added to the cells immediately after the pulse, and incubated at 37° C. for 1 hour. Cultures were plated onto LB plates containing kanamycin and streptomycin and excess liquid was allowed to dry/absorb into the plate. The plate was inverted and incubated at 37°C.
  • the DKALGP::PK strain introduced with the pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector (GG) and the pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH vector (DGA) (hereinafter referred to as DKALGP::PK + GG-DGA strain) and the DKALGP::PK strain
  • DKALGP::PK + GG-DGAB strain A strain in which the pRSF-pLTTR-GPD-GPP vector (GG) and pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR vector (DGAB) were introduced into the strain.
  • Example 2-1 Measurement of 3-HP production according to the time of introduction of mutation and addition of inducer
  • a single colony of the strain prepared in Example 1 was inoculated in LB medium and pre-cultured at 37° C. for 18 hours (seed culture).
  • modified MR medium MgSO 4 .7H 2 O 0.8 g/L, (NH 4 ) 2 HPO 4 4 containing 20 g/L glucose and 25 mg/L streptomycin and 50 mg/L kanamycin g/L, containing KH 2 PO 4 6.67 g/L and citrate 0.8 g/L
  • the growth of the strain in each culture condition was measured by measuring the OD600 (absorbance (OD) of the strain culture solution at 600 nm) using a UV Spectrometer, and the results are shown in Table 8 and FIG. 1a (comparative example of Table 8), FIG. 1b (experimental group 1 in Table 8) and FIG. 1c (experimental group 2 in Table 8) are shown.
  • mutant strain btuR gene overexpression
  • 3HP production method using the same significantly increased the 3HP production yield from glucose, and utilized glucose for 3HP production rather than cell growth.
  • Example 2-2 3HP production measurement according to the type of basic aqueous solution
  • Example 2-1 Similar to the method of Example 2-1, the btuR gene-overexpressed strain prepared in Example 1 (DKALGP::PK + GG-DGAB) was subjected to condition 1, NH 4 (OH) or Mg(OH) 2 was cultured for 42 hours under conditions of maintaining the pH at 6.95 using (Experimental group 3 of Table 9) and FIG. 2b (Experimental group 4 of Table 9) are shown.

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Abstract

본 출원은 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 일 예에 따른 미생물은 세포 내로 유입된 포도당을 세포 생장보다 3HP 생산에 이용하게 하는 변이를 포함하여 3HP 생산능(3HP 생산량)이 증가된 것일 수 있고, 일 예에 따른 방법은 유도물질의 첨가시기를 조절 및/또는 염기 수용액의 종류를 조절하여, 3HP 생산 수율을 증가시킬 수 있다.

Description

포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2020년 11월 05일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0147145호 및 2020년 11월 09일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0148912호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)은 여러 화학공정에 사용되는 중요한 합성 중간체로, 3-HP를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 1,3-프로판디올, 아크릴릭 에시드(acrlici acid), 메틸 아크릴레이트(methyl acrylate), 아크릴아미드(acrylamide), 에틸 3-HP, 말로닉 에시드(malonic acid), 프로피로락톤(propiolactone) 및 아크릴로니트릴(acrylonitrile) 등이 있다. 또한, 3-HP는 2004년 US DOE(Department of Energy)에 의하여 바이오매스로부터 전환이 가능한 중요 고부가가치 화합물로 선정된 바 있을 정도로 경제적 가치가 우수하다.
3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여화학적 공정을 통해 생산될 수 있고, 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수도 있다. 그러나 이러한 화학물질 대부분이 유독하며 발암성을 띠고, 높은 온도와 압력의 조건으로 대량의 에너지를 소모하며 다량으로 공해 물질을 배출하는 문제가 있다.
3-HP는 또한 미생물 발효를 통해 생산될 수 있다. 현재까지 대장균이나 크렙시엘라 뉴모니아 등을 이용한 3-HP 생산 공정이 연구되었으나, 생산성, 수율, 배지의 경제성 등의 측면에서 아직 상업적 수준에 이르지 못하고 있다. 현재까지 연구된 것들 중 대부분의 것들은 글리세롤을 기질로 하여 3-HP를 합성한 것들이고, 글리세롤 외에 포도당으로부터 3-HP를 생합성하는 기술에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며, 포도당은 세포 생장에도 사용되어 3-HP 생산 수율이 저하되는 문제가 있다. 따라서, 포도당으로부터 3-HP를 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 3-HP 생산 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
[선행기술문헌]
대한민국 등록특허 제10-1689451호
일 예는 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 다음의 특징을 가지는 것일 수 있다:
(1) 아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase)의 활성 강화; 및
(2) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), 또는 이들 모두의 활성 강화.
상기 미생물은, 다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는 것일 수 있다:
(3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성 강화;
(4) 갈락토스 퍼미아제 (galactose permease), 글루코키나제 (glucokinase), 또는 이들 모두의 활성 강화; 및
(5) 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성 약화 또는 불활성화.
상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
상기 미생물은 상기 특징 (1) 내지 (5) 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 가지지 않는 동종 미생물과 비교하여, 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능이 증가되거나 및/또는 부산물 (예컨대, 글리세롤 등)의 생성을 감소시키는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 미생물을 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 미생물을 포도당 함유 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산의 생산 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 미생물을 포도당 함유 배지에서 배양하여 얻어진 배양물을 제공한다. 상기 배양물은 1L당 3-히드록시프로피온산을 60g 이상의 양으로 포함하고, 글리세롤을 포함하지 않거나 20g 이하의 양으로 포함하는 것일 수 있다.
본 출원은 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능 (예를 들면, 3-HP생산량 및 3-HP 생산 수율)이 증가된 미생물 및 이를 이용하여 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산을 생산하는 방법과 관련된 기술을 제공한다.
이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.
포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 (3-Hydroxypropionic Acid; 3-HP)의 생산능을 가지는 미생물
본 출원의 일 예는 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 다음의 특징을 가지는 것일 수 있다:
(1) 아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase)의 활성 강화; 및
(2) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), 또는 이들 모두의 활성 강화.
상기 미생물은, 다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는 것일 수 있다:
(3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성 강화;
(4) 갈락토스 퍼미아제 (galactose permease), 글루코키나제 (glucokinase), 또는 이들 모두의 활성 강화; 및
(5) 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성 약화 또는 불활성화.
일 예에서, 상기 미생물은 (1) 내지 (5)의 특성을 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
상기 미생물은 상기 특징 (1) 내지 (5) 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 가지지 않는 동종 미생물과 비교하여, 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능이 증가되거나 및/또는 부산물 (예컨대, 글리세롤, 아세테이트, PDO 등)의 생성을 감소시키는 것일 수 있다.
본 출원에서 ‘활성이 강화, 약화, 및/또는 불활성화’된 것은 모균주 (숙주 미생물) 대비 활성이 강화, 약화, 및/또는 불활성화된 것을 의미할 수 있다. 상기 모균주는, 상기 미생물과 동종 균주로서, 상기 (1) 내지 (5) 중 선택된 하나 이상의 특징을 가지도록 하는 변이가 도입되지 않거나 도입되기 전의 미생물을 의미할 수 있다.
본 출원에서 “아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase, corrinoid adenosyltransferase)”는 ATP에서 환원된 코리노이드로의 데옥시아데노실 잔기의 전달을 초래하는 효소를 의미할 수 있고, 상기 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 각종 원핵세포 또는 진핵세포 유래일 수 있다. 예를 들면, 상기 아데노실트랜스퍼라제는 EC 2.5.1.17에 속하는 효소일 수 있고, 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 데니프리피칸스 (Pseudomonas denitrificans), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 쉬와넬라 오네이덴시스 (Shewanella oneidensis), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 슈도모나스 데니트리피칸스 (Pseudomonas denitrificans), 또는 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) 등의 유래일 수 있고, 이를 코딩하는 유전자로는 btuR (GenBank Accession Nos. M21528.1), cobA (GenBank Accession Nos. L08890.1), 또는 cobO (GenBank Accession Nos. M62866.1)등을 예시할 수 있다.
본 출원에서, "글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD)"는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제는 NADH-, NADPH-, 또는 FAD-의존성일 수 있다. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제는 그 유래에 관계없이, DHAP에서 G3P 로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 GPD1 및/또는 GPD2일 수 있으며, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있고, GPD1 (Genbank Accession no. CAA98582.1), GPD2 (Genbank Accession no. NM_001183314.1), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 출원에서, "글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase: GPP)"는 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)에서 글리세롤로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제는 그 유래에 관계없이, G3P 에서 글리세롤로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 GPP1 및/또는 GPP2일 수 있으며, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있고, GPP1 (Genbank Accession no. KZV10562.1; 암호화 유전자: Genbank Accession no. NM_001179403.1), GPP2 (Genbank Accession no. NP_010984.3; 암호화 유전자: Genbank Accession no. NM_001178953.3)를 갖는 것일 수 있다.
본 출원에서, "글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)" 또는 "디올 디하이드라타제 (diol dehydratase)"는 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 글리세롤 디하이드라타제 또는 디올 디하이드라타제는 코엔자임 B12 의존성이거나 비의존성일수 있다. 상기 효소는, 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄 (Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움 (Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 및/또는 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum) 등의 유래일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 효소는, 그 유래에 관계없이, 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 dhaB 일 수 있다. 일 예에서, 상기 dhaB 은 크렙시엘라 뉴모니아 유래의 것 (EMBL Accession Nos. U30903.1(dhaB1), Genbank Accession no. CDO12380.1 (dhaB) 등)일 수 있다.
본 출원에서, "글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)"는 글리세롤 디하이드라타제가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화하여 촉매 활성을 유지시키는 작용을 하는 효소를 의미할 수 있다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제로는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 클랩시엘라 속 (Klebsiella sp.) (예를 들면, 크렙시엘라 뉴모니아), 시트로박터 속 (Citrobacter sp.), 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 균주 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 dhaFG, gdrAB, 및/또는 ddrAB 일 수 있다.
본 출원에서, "알데히드 디하이드로게나제 (aldehyde dehydrogenase)"는 알데히드를 카르복실산으로 전환시키는 효소로서, 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 알데히드 디하이드로게나제는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들면, 에스케리키아 속 (예를 들면, 에스케리키아 속 (예를 들면, 대장균) 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함될 수 있고, 예를 들면, 이를 암호화하는 유전자는 aldH 및/또는 puuC 등일 수 있다.
본 출원에서, “갈락토스 퍼미아제 (galactose permease; GalP)”는 갈락토스 및/또는 포도당을 포함한 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 작용을 하는 단백질(Venter, Henrietta et al., Biochemical Journal (2002)363:243-252)을 의미할 수 있다. 상기 갈락토스 퍼미아제 (GalP)는 글루코스 퍼미아제(glucose permease)로 작용할 수 있고, 12개의 트랜스-멤브레인 루프들을 갖는 심포터(symporter)로서, 세포 멤브레인을 통과하여 포도당을 이송시킬 수 있는 능력을 가질 수 있다. 상기 갈락토스 퍼미아제 (GalP)는 pts- 균주 내에서 포도당을 이동시킬 수 있는 것으로서, 포스포트랜스퍼라제 시스템 (phosphotransferase system; PTS) 매개된 포도당 섭취의 손실을 보충하는 작용을 할 수 있다. 일 예에서 상기 갈락토스 퍼미아제는 대장균 (예를 들면, W3110 균주) 유래의 갈락토스 퍼미아제일 수 있으며, galP 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 출원에서 “글루코키나제 (glucokinase)”는 포도당 (glucose)을 포도당-6-인산 (glucose 6-phosphate)으로 인산화를 촉진하는 효소를 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 글루코키나제는 대장균 (예를 들면, W3110 균주) 유래의 글루코키나제일 수 있으며, glk 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 일 예에서, PEP (phosphoenol pyruvate)를 소모하는 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)이 활성화되지 않는 환경에서, 수송된 포도당을 인산화시키는 것일 수 있고, 예를 들면 PTS 결여된 환경에서 상기 갈락토스 퍼미아제에 의해 수송된 포도당을 인산화시키는 것일 수 있다.
본 출원에서, “포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)”는 포스포트렌스퍼라제 시스템에서, 포도당을 수송할 수 있는 단백질을 의미할 수 있고, 예를 들면 EIICBGlc (Enzyme IICBGlc)일 수 있다. 일 예에서, 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체는 대장균 (예를 들면, W3110 균주) 유래의 것일 수 있으며, ptsG에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 상기“포스포트랜스퍼라제 시스템 (phosphotransferase system; PTS)”은 박테리아에서 세포 내부로 포도당과 기타 당을 수송하기 위한 시스템으로, 당을 수송하고 동시에 인산화하기 위해 포스페이트 및 에너지 원으로서, PEP (phosphoenol pyruvate)를 사용할 수 있다.
일 예에 따른 미생물은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성이 약화 및/또는 불활성화되고, 갈락토스 퍼미아제 및 글루코키나제의 활성이 강화되어, PEP를 사용하지 않는 포도당 섭취의 경로를 이용하여 포도당을 섭취 및 이용할 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 상기 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성이 약화 및/또는 불활성화되어도, 갈락토스 퍼미아제 및 글루코키나제의 활성이 강화되어, 포도당을 세포 내로 수송하고 수송된 포도당을 포도당-6-인산 형태로 전환시킬 수 있으며, 이러한 과정은 PEP를 요구하지 않을 수 있고/있거나 PEP에 의존하지 않을 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 PEP에 의존하지 않는 당 도입 시스템에 의해 포도당을 섭취 및/또는 이용할 수 있다.
본 출원에서 제공되는 미생물은
(1) 아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase)의 활성이 강화되고,
(2) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), 또는 이들 모두의 활성이 강화되고,
(3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)로 이루어진 하나 이상의 활성이 강화되고,
(4) 갈락토스 퍼미아제 (galactose permease), 글루코키나제 (glucokinase), 또는 이들 모두의 활성 강화되고,
(5) 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 미생물은 아데노실트랜스퍼라제의 활성이 강화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 아데노실트랜스퍼라제의 활성 강화는 btuR 유전자의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 동종 또는 이종 유래의 btuR 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 이와 같은 아데노실트랜스퍼라제의 활성이 강화에 의하여 포도당의 대사로 얻어진 글리세롤의 세포내 축적을 감소시키고 글리세롤로부터 3-HP로의 변환이 촉진하여, 포도당으로부터 3-HP의 생산 수율을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 미생물은 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GPD) 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 (GPP)의 활성이 강화된 것일 수 있으며, 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 암호화 유전자 및/또는 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 암호화 유전자의 과발현에 의한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 동종 또는 이종 유래의 GPD를 암호화하는 유전자 및 GPP를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, 유도성 프로모터와 이에 작동 가능하게 각각 연결된 GPD를 암호화하는 유전자 및/또는 GPP를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 유도 물질의 첨가(처리)에 의하여 프로모터에 연결되 유전자의 발현을 유도하는 것일 수 있고, 유도성 프로모터를 이용하여 외래 유전자인 GPD 암호화 유전자 및 GPP를 암호화 유전자의 전사 시기를 조절할 수 있다. 일 예에 따르면 상기 유도성 프로모터는 BAD, LTTR, BAD, Trc, 및/또는 Tac일 수 있고, 유도성 프로모터가 BAD인 경우 유도물질이 L-아라비노스이고, 유도성 프로모터가 LTTR 인 경우 유도물질이 3-HP일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 LTTR 프로모터와 작동적으로 연결된 GPD 유전자 및 GPP 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 BAD, LTTR, 및/또는 TAC 프로모터는 하기 표 1에 기재된 핵산 서열을 포함하거나 표 1에 기재된 핵산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
명칭 서열 (5’->3’) 서열번호
TAC ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgt 서열번호 24
BAD AAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCAT 서열번호 25
LTTR GTCAGCCTCAGCGCACCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACA 서열번호 5
일 예에서 상기 유도성 프로모터가 도입된 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자와, 유도성 프로모터가 도입된 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제를 암호화하는 유전자는, 각각 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 또는, 상기 두 유전자가 하나의 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 여기에서, 벡터는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 미생물은 글리세롤 디하이드라타제, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제, 및 알데히드 디하이드로게나아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성이 강화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 글리세롤 디하이드라타제를 암호화하는 dhaB 유전자, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 암호화하는 gdrAB 유전자, 및 알데히드 디하이드로게나아제를 암호화하는 aldH 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대 3개 모두를 더 포함할 수 있으며, 이에 의해 일 예에 따른 미생물은 dhaB, gdrAB, 및/또는 aldH 유전자가 과발현되어 글리세롤 디하이드라타제, 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제, 및/또는 아라비노스 수송 단백질의 활성이 강화된 것일 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 항시 발현 프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 dhaB, gdrAB, 및/또는 aldH를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)는 별도의 유도제 없이도 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터는 J23100, J23101, J23102, J23103, J23104, J23105, J23106, J23107, 및/또는 J23109 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 3-HP 생산 목적 범위에서 필요에 따라 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 J23101 프로모터와 작동적으로 연결된 dhaB 유전자 및 gdrAB 유전자와 J23100 와 작동적으로 연결된 aldH 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 항시 발현 프로모터가 도입된 글리세롤 디하이드라타제를 암호화하는 유전자, 항시 발현 프로모터가 도입된 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 암호화하는 유전자, 및 항시 발현 프로모터가 도입된 아라비노스 수송 단백질를 암호화하는 유전자는 각각 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 또는, 상기 세 유전자가 하나의 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다.
또한, 상기 미생물은 갈락토스 퍼미아제 및/또는 글루코키나제의 활성이 강화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 갈락토스 퍼미아제의 활성 강화는 galP 유전자의 발현 증가에 의한 것일 수 있고, 상기 글루코키나제의 활성 강화는 glk 유전자의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 동종 또는 이종 유래의 galP 유전자 및/또는 glk 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성이 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성이 약화 및/또는 불활성화는 상기 미생물에 내재하는 ptsG 유전자의 전부 및/또는 일부의 결실에 의한 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “단백질 (또는 폴리펩티드)”는 기재된 단백질의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 가지고, 상기 아미노산 서열의 단백질과 실질적으로 동등한 효소 활성 및/또는 효과 (즉, 미생물에 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 부여하거나 증진시키는 효과)를 가지는 단백질을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 용어 “유전자 (또는 폴리뉴클레오티드)”는 기재된 유전자의 핵산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 가지고, 상기 핵산 서열이 암호화하는 단백질과 실질적으로 동등한 효소 활성 및/또는 효과 (즉, 미생물에 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 부여하거나 증진시키는 효과)를 가지는 단백질을 암호화 하는 핵산 분자를 의미하는 것일 수 있다.
본 출원에서, 서열의 "% 동일성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 최대한 일치되도록을 정렬한 후 서열을 비교하였을 때 염기가 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된(matched) 위치의 갯수를 수득하고, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누고, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 출원에서, “활성 강화" 또는 “활성이 강화된” 것이란, 단백질 자체의 활성이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절 서열의 변형, 및/또는 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자내 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성이 증가된 상태를 의미할 수 있다.
일 예에서, 단백질(효소)의 활성이 강화되는 것은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 효소의 활성을 강화 또는 증가시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 예를 들면, 이로 제한되는 것은 아니지만, 해당 효소(또는 단백질)들을 암호화하는 염기서열을 포함하는 유전자(폴리뉴클레오타이드)를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 상기 유전자(폴리뉴클레오타이드)를 벡터 시스템에 도입하는 방법 등에 의하여 효소(또는 단백질)들을 암호화하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 유전자(폴리뉴클레오타이드)를 발현시킬 수 있는 프로모터를 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법이 포함될 수 있으며 유전자 변이에 의해 활성이 강한 효소(또는 단백질)로 변이시키는 방법 등이 있다. 상기 유전자(폴리뉴클레오타이드)의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입하는 방법은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease ystem; 예를 들면, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예를 들면, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예를 들면, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에 따른 미생물은 항시 발현 프로모터와 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 추가적으로 포함하여 상기 유전자가 암호화하는 단백질(또는 효소)의 활성이 강화된 것일 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터(constitutive expression promoter)는 별도의 유도제 없이도 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 항시 발현 프로모터는 J23 계열 (예를 들면, J23100, J23101, J23102, J23103, J23104, J23105, J23106, J23107, 및/또는 J23109)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 3-HP 생산 목적 범위에서 필요에 따라 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 일 예에서, 단백질(또는 효소)의 활성을 강화시키는 것은 프로모터를 변이 또는 치환을 통해 네이티브 프로모터(native promoter)에 비하여 강한 프로모터로 변이시킬 수 있다. 상기 내재적 효소의 프로모터 대신 염기치환 변이를 갖는 개량형 프로모터 또는 이종 프로모터가 연결될 수 있다.
본 출원에서, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
본 출원에서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 예에서 상기 벡터는 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것일 수 있다. 이러한 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 3'말단의 비번역영역, 선별 마커(예를 들면, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될수 있다.
일 예에 따르면, 벡터 내의 각 구성요소는 서로 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들 구성요소 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서, "형질전환"은 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주 세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다. 또한, 상기 유전자는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원에서, 형질전환시키는 방법은 유전자를 세포 내로 도입하는 방법이면 제한 없이 포함되며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및/또는 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, "작동 가능하게 연결"된 것은 발현시키고자 목적하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
일 예에 따른 미생물은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성이 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 미생물은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성이 약화 및/또는 불활성화는 ptsG 유전자의 전부 및/또는 일부의 결실에 의한 것일 수 있다.
본 출원에서, "활성이 약화"되었다는 것은 세포 내에서 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체의 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주 등 모균주에 비하여 감소된 경우를 의미할 수 있다. 상기 약화는 효소를 암호화하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 전사(transcription) 저해 및/또는 번역(translation) 저해 등으로 상기 효소의 발현 수준이 저하되어 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 또한, 본 출원에서, “불활성화”란, 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체를 암호화하는 유전자 (예를 들면, ptsG)의 발현이 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현되지 않거나, 발현이 되더라도 그 활성이 없는 상태를 의미할 수 있다.
일 예에서, 단백질 또는 효소 (예를 들면, 포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체)의 활성 약화 또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소 (또는 단백질)의 활성이 완전히 제거된 경우를 포함하여 상기 효소 (또는 단백질)의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열 (예를 들면, 프로모터)에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나, 활성이 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소 (또는 단백질)로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소 (또는 단백질)를 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜 (ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법; 및/또는 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 유전자 발현의 감소는 유전자의 발현량이 변이 전의 숙주세포 (모균주) 및/또는 야생형의 발현량 보다 감소된 것을 의미할 수 있고, 발현이 완전히 저해되어 발현이 이루어지지 않은 경우를 포함할 수 있다. 미생물에서 유전자의 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 프로모터를 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발현을 감소시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 약한 프로모터(weak promoter)로 치환하거나 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 나아가, 기존 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 출원에서, “미생물”은 단세포 박테리아를 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 대장균 (예를 들면, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B, 및/또는 E. coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
일 예에서 상기 미생물은 추가적으로 하기 (a) 내지 (f)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 약화되거나 불활성화된 것일 수 있다:
(a) 1,3-프로판다이올 데하이드로지나아제(1,3-propanediol dehydrogenase);
(2b) 글리세롤 키나아제(glycerol kinase);
(c) 아세테이트 키나아제(acetate kinase);
(d) 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase);
(e) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase); 및
(f) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase).
일 구체예에서, 상기 미생물은 하기 (i) 내지 (v)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자가 추가적으로 결실된 것일 수 있다:
(i) 1,3-프로판다이올 데하이드로지나아제(1,3-propanediol dehydrogenase)를 암호화하는 yqhD, (ii) 글리세롤 키나아제(glycerol kinase)를 암호화하는 glpK, (iii) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase)를 암호화하는 ldhA, (iv) 아세테이트 키나아제(acetate kinase)-포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase)를 암호화하는 ackA-pta, 및/또는 (v) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase)를 암호화하는 gldA 유전자.
일 구체 예에서, 상기 미생물은 yqhD, glpK, ldhA, ack-pta, 및 gldA 유전자가 추가적으로 결실된 것일 수 있다.
일 예에 따른 미생물은 세포 생장이 (모균주 보다) 억제된 것일 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 PEP를 요구하지 않고 포도당을 유입할 수 있어, 숙주 세포보다 유입된 포도당을 세포 생장에 사용하지 않고, 3HP 생산하는데 용이하게 활용할 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 (모균주 보다) 아데노실트랜스퍼라제 활성이 강화되어 글루코스로부터 3-HP로의 전환이 증가된 것일 수 있다.
일 예에 따른 미생물은 유기산을 합성하는 능력을 가질 수 있으며, 예를 들면, 예를 들면, 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)을 합성하는 능력(또는 3-HP 생산능)을 가질 수 있다. 일 예에 따른 미생물은 그 자체가 유기산 생산에 관여하는 유전자를 포함하여 유기산을 생산하거나, 유기산 생산능을 가지도록 또는 유기산 생산능이 강화되도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 유기산의 생산은 균주 내에서 생산되는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다.
상기 3-히드록시프로피온산(3-HP)은 젖산(2-히드록시프로피온산)의 이성질체로서 고분자 코팅제의 가교제, 금속 윤활제, 섬유의 정전기 방지제 등으로 사용되고, 아크릴산, 1,3-프로판디올, 메틸아크릴레이트, 에틸 3-히드록시프로피온산, 말로닉산, 프로피온락톤, 아크로니트릴, 또는 아크릴아마이드 등 상업적으로 중요한 여러 화학물질로 전환될 수 있는 플랫폼 화합물이다. 3-HP는 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수 있다.
본 출원에서, “3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산능을 갖는다”는 것은 자연적으로 3-HP 생산능을 갖는 세포 및/또는 미생물, 또는 3-HP 생산능이 없는 모균주에 3-HP 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 일 예에 따른 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 3-HP 생산능을 갖는 경우 및/또는 3-HP 생산능을 갖지 않는 미생물에 일 예에 따른 변이가 도입됨으로써 상기 미생물이 3-HP 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 3-HP 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물이란 천연형 미생물 자체 또는 3-HP 생산 기작과 관련된 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 3-HP 생산능을 가지게 된 에스케리키아 속 미생물을 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 미생물은 3-HP 생산능을 가지고 있거나 3-HP 생산능을 가지도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 3-HP의 생산은 균주 내에서 생산되
는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다.
일 예에서, 상기 미생물은 포도당을 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양시의 3-HP 수율 (3-HP 생산량(g)/투입된 포도당 양(g))이 0.4 이상, 0.42 이상, 0.45 이상, 0.47 이상, 0.5 이상, 0.52 이상, 0.54 이상, 0.57 이상, 0.6 이상, 0.65 이상, 0.7 이상 또는 0.75 이상 (상한 값은 1, 0.9, 0.85 또는 0.8일 수 있음)인 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 포도당을 포함하는 배지에서 24시간 내지 48시간 동안, 예컨대, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 동안 배양시의 3-HP 생산량이, 60g/L 이상, 65g/L 이상, 70g/L 이상, 또는 75g/L 이상, 예컨대, 60g/L 내지 200g/L, 60g/L 내지 150g/L, 60g/L 내지 100g/L, 65g/L 내지 200g/L, 65g/L 내지 150g/L, 65g/L 내지 100g/L, 70g/L 내지 200g/L, 70g/L 내지 150g/L, 70g/L 내지 100g/L, 75g/L 내지 200g/L, 75g/L 내지 150g/L, 또는 75g/L 내지 100g/L인 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 포도당을 포함하는 배지에서 24시간 내지 48시간 동안, 예컨대, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간 또는 48시간 동안 배양시의 부산물 (예, 글리세롤, 아세테이트, PDO (1,3-propanediol) 중 선택된 1종 이상)의 생산량이 20g/L 이하, 15g/L 이하, 10g/L 이하, 5g/L 이하, 4g/L 이하, 3g/L 이하, 2g/L 이하, 또는 1.5g/L 이하 (하한값은 0 (부산물을 생산하지 않음), 0.001g/L, 0.01g/L, 또는 0.1 g/L일 수 있음)인 것일 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)은 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주 보다 3-HP생산능이 증가(향상)된 것일 수 있다. 일 예에 따른 변이가 도입된 미생물은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, 3-HP 생산이 증가된 것일 수 있다. 상기 비변형 미생물은 일 예에 따른 변이가 도입되지 않은 동종의 미생물 또는 도입되기 전의 미생물을 의미할 수 있다. 일 예에서, 3-HP의 생산능 (생산량 또는 생산수율)은 본 발명의 변이가 도입되지 않은 미생물(모균주, 및/또는 숙주 미생물)보다 약 0.1% 이상, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상 증가된 것일 수 있다.
상기 미생물(또는 재조합 세포)는 추가적으로 3-HP 생산이 증가되도록 하는 변이를 포함할 수 있고, 상기 변이의 위치 및/또는 변이 대상이 되는 유전자 및/또는 단백질의 종류는 3-HP 생산이 증가되도록 하는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 미생물은 형질전환이 가능한 세포라면 제한 없이 사용 가능할 수 있다.
본 출원에서, 일 예에 따른 변이가 도입되기 전의 미생물을 일 예에 따른 변이가 도입되어 3-HP 생산능이 증가되거나 3-HP 생산능이 부여된 미생물과 구별하기 위하여, 일 예에 따른 변이가 도입되기 전의 미생물을 숙주 미생물(또는 모균주)로 표현할 수 있다.
다른 예는, 앞서 설명한 변이를 미생물에 도입(예를 들면, 형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 3-HP 생산능 증가 방법 또는 상기 미생물에 3-HP 생산능을 부여하는 방법을 제공한다.
3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid; 3-HP)의 생산
또 다른 예는 상기한 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 갖는 미생물을 포함하는, 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기한 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 갖는 미생물의 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산을 위한 용도를 제공한다.
또 다른 예는 상기한 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산 생산능을 갖는 미생물을 포도당을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산의 생산 방법을 제공한다. 상기 상기 배양하는 단계는 염기성 용액을 사용하여 pH를 6.5 내지 7.0으로 조절하여 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양하는 단계는 글리세롤 생산을 촉진하는 유도물질 (예컨대, 유도성 프로모터에 대한 유도물질)을 첨가하여 글리세롤 생산을 촉진하는 것을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 배양하는 단계는 유도성 프로모터에 대한 유도물질을 첨가하는 단계를 포함할 수 있으며, 일 예에서, 상기 유도물질의 첨가에 의해 글리세롤 생산이 촉진될 수 있고, 예를 들면, 유도물질의 첨가에 의해 GPD 및/또는 GPP 발현이 유도되어 글리세롤 생산이 촉진되는 것일 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 BAD, LTTR, 및/또는 TAC 일 수 있고, 유도성 프로모터가 BAD인 경우 유도물질이 L-아라비노스이고, 유도성 프로모터가 LTTR 인 경우 유도물질이 3-HP (3-히드록시프로피온산)일 수 있고, 유도성 프로모터가 TAC일 경우 유도물질이 IPTG일 수 있으며, 유도성 프로모터에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예에 따른 생산 방법이 적용될 수 있는 상기 미생물은 유도성 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD)를 코딩하는 유전자 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase: GPP)를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 전술한 미생물을 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 염기성 용액은 수산화 마그네슘(Magnesium hydroxide; Mg(OH)2) 용액일 수 있다. 일 예에서 상기 배양하는 단계는 수산화 마그네슘(Magnesium hydroxide; Mg(OH)2) 용액을 이용하여 pH를 6.5 내지 7.0, 6.75 내지 7.0, 6.9 내지 7.0, 6.5 내지 6.95, 6.75 내지 6.95, 또는 6.9 내지 6.95로 조절한 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 수산화 마그네슘 용액의 농도는 10 내지 500, 50 내지 300, 100 내지 200, 또는 150 g/L 일 수 있다.
일 예에 따라 수산화 마그네슘을 이용하여 pH를 상기 범위로 조절한 경우, 다른 염기성 수용액 (예를 들면, 수산화 암모늄(NH4OH) 용액)을 이용하여 pH를 상기 범위로 조절한 경우 보다 3-HP 생산량 및/또는 투입된 포도당 대비 3HP 생산 수율을 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서 상기 포도당을 함유하는 배지는 포도당을 5 내지 50gL, 10 내지 30 g/L, 15 내지 25g/L, 10 내지 20g/L, 20 내지 30g/L, 또는 20g/L 농도로 포함할 수 있다.
상기 유도물질을 첨가하는 것은 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전에 배양 배지에 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들면, 일 예에 따른 생산 방법은 상기 유도물질을 배양 초기부터 배양 배지에 첨가하여 배양할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 배양 단계는 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전에 3-히드록시프로피온산을 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 배양하는 단계에서 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전에 3-HP를 배양 배지에 첨가하여 GPD 및 GPP 유전자의 전사를 유도하여, 배양 배지에 포함된 포도당을 세포 생장에 사용하기 보다는 3-HP 생산에 사용되도록 할 수 있다. 일 예에 따른 방법에 의하면, 기존 방법 보다 투입된(첨가된) 포도당 대비 3-HP 생산량은 증가된 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계에서 3-HP 첨가 시기는 미생물이 배양 단계에서 포도당을 소비하는지 여부를 측정하여 확인될 수 있으며, 예를 들면 산소요구량를 이용하여 미생물이 포도당 소비양을 측정할 수 있다. 일 예에서 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전은 배양 초기 (O시간) 내지 12시간, 0시간 내지 11시간 30분, 0시간 내지 11시간, 0시간 내지 10시간 30분, 또는 0시간 내지 10시간을 의미하는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전은 배양 배지 내의 포도당의 농도가 배양 초기에 첨가한 포도당을 기준으로 5%(w/w) 이상, 10%(w/w) 이상, 15%(w/w) 이상, 또는 20%(w/w) 이상 존재하는 것을 의미할 수 있다 .
일 예에서, 상기 유도물질로서 3-HP를 0.1 내지 10g/L, 0.1 내지 5 g/L, 0.1 내지 3 g/L, 0.5 내지 3 g/L, 또는 0.5 또는 1 g/L 농도로 첨가할 수 있다.
일 예에 따른 생산 방법은 대장균과 같이 코엔자임 B12를 생산하지 않는 균주를 사용할 경우, 상기 배양 단계에서 코엔자임 B12를 첨가할 수 있고, 상기 B12는 일 예에 따른 미생물이 초기에 배지에 첨가된 포도당을 모두 소비한 뒤 첨가하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 B12는 미생물의 세포 생장이 OD 550 내지 650, 또는 OD 600 값이 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 또는 15 내지 20 일 때 첨가하는 것일 수 있다. 또 다른 예에서 상기 B12는 배양 시작 후 5시간 내지 30시간 후, 10시간 내지 30시간 후, 10시간 30분 내지 30시간 후, 11시간 내지 30시간 후, 12시간 내지 30시간 후, 14시간 내지 30시간 후, 15 내지 30시간 후, 5시간 내지 25시간 후, 10시간 내지 25시간 후, 10시간 30분 내지 25시간 후, 11시간 내지 25시간 후, 12시간 내지 25시간 후, 14시간 내지 25시간 후, 15 내지 25시간 후, 5시간 내지 20시간 후, 10시간 내지 20시간 후, 10시간 30분 내지 20시간 후, 11시간 내지 20시간 후, 12시간 내지 20시간 후, 14시간 내지 20시간 후, 15 내지 20시간 후, 5시간 내지 15시간 후, 10시간 내지 15시간 후, 10시간 30분 내지 15시간 후, 11시간 내지 15시간 후, 12시간 내지 15시간 후, 14시간 내지 15시간 후, 5시간 내지 12시간 후, 10시간 내지 12시간 후, 10시간 30분 내지 12시간 후, 또는 11시간 내지 12시간 후에 첨가하는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 코엔자임 B12를 0.1 내지 10uM, 0.1 내지 5 uM, 0.1 내지 3 uM, 0.5 내지 3 uM, 또는 0.5 또는 1uM 농도로 첨가할 수 있다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있고 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다.
상기 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture), 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있고, 상기 재조합 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도 및/또는 pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 및/또는 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 및/또는 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 및/또는 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 및/또는 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 20℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 37℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질(예를 들면, 3-HP)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면, 10 내지 160 시간일 수 있다.
일 예에서, 상기 생산 방법은 상기 배양된 미생물 및 배양 배지에서 3-히드록시프로피온산을 분리, 회수 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 배양된 미생물(또는 재조합 세포) 및/또는 배양 배지에서 3-HP을 분리 및/또는 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 물질 (예를 들면, 3-HP)을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 및/또는 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성, 액체, 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 배양 배지는 미생물(또는 재조합 세포)를 배양한 배지를 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 3-HP 생산 방법은 3-HP를 정제하는 단계를 상기 분리 및/또는 회수하는 단계 이전, 동시, 또는 그 이후에 추가적으로 포함할 수 있다.
3-히드록시프로피온산 (3-Hydroxypropionic Acid; 3-HP)를 포함하는 배양물
다른 예는 앞서 설명한 미생물을 포도당을 포함한 배지에서 배양한 배양물을 제공한다. 상기 배양물은 3-HP를 고농도로 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 부산물을 낮은 수준으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 상기 미생물을 포함하거나 포함하지 않는(cell-free) 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 배양물은 3-HP를 60g/L 이상, 65g/L 이상, 70g/L 이상, 또는 75g/L 이상, 예컨대, 60g/L 내지 200g/L, 60g/L 내지 150g/L, 60g/L 내지 100g/L, 65g/L 내지 200g/L, 65g/L 내지 150g/L, 65g/L 내지 100g/L, 70g/L 내지 200g/L, 70g/L 내지 150g/L, 70g/L 내지 100g/L, 75g/L 내지 200g/L, 75g/L 내지 150g/L, 또는 75g/L 내지 100g/L의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 배양물은 글리세롤, 아세테이트, 및 PDO (1,3-propanediol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 글리세롤을 20g/L 이하, 15g/L 이하, 10g/L 이하, 5g/L 이하, 4g/L 이하, 3g/L 이하, 2g/L 이하, 또는 1.5g/L 이하 (하한값은 0 (부산물을 포함하지 않음), 0.001g/L, 0.01g/L, 또는 0.1g/L일 수 있음)의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
일 예에 따른 미생물은 세포 내로 유입된 포도당을 세포 생장 보다 3HP 생산에 이용하게 하는 변이를 포함하여 3HP 생산능(3HP 생산량)이 증가된 것일 수 있고, 일 예에 따른 방법은 유도물질의 첨가시기를 조절 및/또는 염기 수용액의 종류를 조절하여, 3HP 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 표 8의 비교예 (도 1a), 및 일 실시예에 따른 변이 균주인 표 8의 실험군 1 (도 1b) 및 실험군 2 (도 1c)의 생장(OD) 및 변이균주가 생산하는 물질의 양을 시간에 따라 측정한 결과를 각각 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 일 실시예에 따른 변이 균주의 생장(OD) 및 변이 균주가 생산하는 물질의 양을 시간에 따라 측정한 결과로서, 구체적으로 도 2a는 NH4(OH)를 사용하여 배양 단계에서 pH를 조절한 경우 (표 9의 실험군 3)의 결과를 나타내고, 도 2b는 Mg(OH)2를 사용하여 배양 단계에서 pH를 조절한 경우 (표 9의 실험군 4)의 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 변이 균주 제작
실시예 1-1. pRSF-pLTTR-GPD-GPP
사카로미세스 세레비지에 유래의 GPD1 및 GPP2 유전자를 하기 표 2의 서열번호 1과 2 또는 서열번호 3과 4의 프라이머 쌍을 각각 이용하여 PCR (95℃에서 2분 예비변성; 95℃에서 1분 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃에서 2분 신장을 28회 반복; 72℃에서 5분 최종신장; 4도로 유지하여 보관) 하고, 각각 BamHI/SacI 과 KpnI/XhoI 제한효소 처리하여, LTTR 프로모터를 포함하는 pRSFDuet-1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여, pRSF-pLTTR-GPD-GPP을 포함하는 벡터 (이하, “pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터”; 본 출원의 실시예에 기재된 벡터 명칭은 벡터 내 포함된 유전자/프로모터 및 이들의 5’ 말단으로부터의 위치(순서)를 나타냄)를 제작하였다. 사용한 LTTR 프로모터의 서열은 하기 표 3에 기재하였다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
GPD1-F CATCATCATGGATCCA TAGCAGTAAGAAAGGAGCATCCATCatgagcgctgcggctg 서열번호 1
GPD1-R CATCATCATGAGCTCtcaatcttcatgaaggtctaattcttcaatcatg 서열번호 2
GPP2-F CATCATCATGGTACCACAGTTTTAGTAAAGGAGCATCAAAA atgggactcactacgaaaccg 서열번호 3
GPP2-R catcatcatCTCGAGttaccatttcagcagatcgtctttgg 서열번호 4
명칭 서열(5'->3') 서열번호
LTTR GTCAGCCTCAGCGCACCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACA 서열번호 5
실시예 1-2. pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 제작
글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 (dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자 (aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자 (gdrAB)를 플라스미드 pCDF에 클로닝하여 ‘pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH’ 를 제작하고, 여기에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 (btuR)을 클로닝하여 ‘pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR ’를 제작하였다.
구체적으로, pCDFDuet-1 벡터(Novagen, USA)의 프로모터 부분을 J23101과 J23100 프로모터로 치환하였다. dhaB (U30903.1; 약 2.7 kb; dhaB1, dhaB2, dhaB3) 및 gdrAB 유전자 (약 2.2 kb; gdrA, gdrB)는 크렙시엘라 뉴모니아(ATCC 25955)의 염색체에서 하기 표 4의 서열번호 6과 7 또는 서열번호 8과 9의 프라이머 쌍 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용해 NEB에서 제공하는 조건을 사용하여 증폭하였다:
명칭 서열(5'->3') 서열번호
dhaB-gdrA-F GAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTCCT 서열번호 6
dhaB-gdrA-R AAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG 서열번호 7
gdrB-F AAGCTTAGAGGGGGCCGTCATGTCGCTTTCACCGCCAG 서열번호 8
gdrB-R CTTAAGTCAGTTTCTCTCACTTAACGGC 서열번호 9
크렙시엘라 뉴모니아의 염색체 상에 dhaB123와 gdrA 유전자가 나란히 위치해 있어 같이 증폭하였고, gdrB는 dhaB123, gdrA와 반대 방향으로 위치해 있기 때문에 gdrB만 따로 증폭하였으며, 이 때 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. 그 후 dhaB123, gdrA 유전자는 제한 효소 EcoRI과 HindIII을, gdrB 유전자는 제한 효소 HindIII과 AflII을 이용하여 상기 벡터 내에서 J23101 프로모터 아래(3’ 말단)에 클로닝하였다.
aldH는 J23100 프로모터 아래(3’ 말단)에 클로닝하였으며, 아래의 프라이머를 이용하여 E. coli K12 MG1655 chromosome으로부터 증폭하였고, 이 때 표 5의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. aldH는 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ을 이용하여 J23100 프로모터 아래에 클로닝하였다. btuR은 aldH 아래에 클로닝하였으며, E. coli K12 MG1655 Chromosome으로부터 아래의 프로모터를 이용하여 증폭하였고, 이 때 표 5의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. btuR의 클로닝은 Takara사의 In-Fusion Kit을 이용하여 aldH 아래에 수행하였다. 이상의 클로닝을 통해 ‘pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR ’벡터를 제작하였다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
aldH-F ggtaccatgaattttc atcatctggc 서열번호 10
aldH-R catatgtcaggcctccaggcttat 서열번호 11
btuR-F tggaggcctgacataatgagtgatgaacgctaccaacag 서열번호 12
btuR-R ttgagatctgccatattaataatcgatccctatctgcgc 서열번호 13
대조군으로는, 상기와 동일한 방법으로 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH), 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하되, btuR 유전자가 클로닝되지 않은 플라스미드 pCDF 가 도입된 미생물을 사용하였다.
상기 준비된 벡터를 E. coli W3110 (KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여, 본 출원의 일 실시예에 따른 3-HP 생산 균주와 대조군 균주를 각각 제작하였다. 상기 균주들을 25mg/L 스트렙토마이신이 포함된 5 mL의 LB 배지(효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10g/L, 및 NaCl 10g/L 함유)에 해당 균주의 Single colony를 접종한 뒤 37℃ 및 250 rpm 조건으로 진탕 배양기에서 밤새 배양하였다.
실시예 1-3. ptsG 유전자의 결실 및 galP 및 glk 유전자의 과발현
ptsG 유전자는 Cas9 시스템을 이용하여 결실시켰다. 구체적으로 DKAPG 균주 (W3110 균주에서 yqhD, glpK, ldhA, ack-pta 및 gldA 유전자를 결실시킨 균주)에 Cas9 유전자를 포함하는 발현벡터(Gene bridges 사의 Quick&easy E. coli gene deletion kit(K006))를 형질전환시켰고, 여기에 ptsG 유전자 부분을 타켓팅하는 guide RNA 벡터와 repair DNA(Gene bridges 사의 Quick&easy E. coli gene deletion kit(K006))을 동시에 형질전환하여 DKALGP::PK를 얻었다. ptsG 앞부분(5’ 말단쪽 1000 bp)과 뒷부분(3’ 말단쪽 1000 bp)을 E. coli K12 MG1655 chromosome으로부터 서열번호 14와 15 및 서열번호 18과 19의 프라이머를 이용하여 증폭하다.
galP 및 glk 유전자의 과발현을 위하여, pRSF-J23106-galP-glk-LTTR-GPD-GPP 벡터로부터 서열번호 16와 17의 프라이머를 이용하여 galP 및 glk 유전자를 증폭하였다. 증폭된 세가지 단편 (ptsG 앞부분, ptsG 뒷부분, 및 galP 및 glk 유전자)을 서열번호 14, 19를 이용하여 Overlap-PCR 하여 Repair-DNA로 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 6에 기재하였다. pRSF-J23106-galP-glk-LTTR-GPD-GPP 벡터의 경우, galP 및 glk 유전자를 W3110 균주의 genomic DNA와 서열번호 20과 21의 프라이머 및 22와 23의 프라이머쌍을 각각 사용하여 PCR로 증폭하고, 상기 증폭한 두 PCR product를 섞은 template와 서열번호 20과 23의 프라이머쌍을 이용하여 Overlap-PCR로 증폭하고, Overlap-PCR로 증폭하여 제작한 최종 galP-glk fusion 유전자를 KpnI/NdeI 제한 효소로 linearized된 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터와 In-fusion 반응 (50℃ 30분)을 통해 제작하였다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
ptsG-1000-F ACGCGATGTGAAATTTTGTC 서열번호 14
ptsG-1000-R CACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTAAAAATTGAGAGTGCTCCTGAGTATG 서열번호 15
J23-over-F TTTACGGCTAGCTCAGTCC 서열번호 16
glk-over-R ttacagaatgtgacctaaggtctg 서열번호 17
ptsG+1000-F catttacgccagaccttaggtcacattctgtaaTCCGTAAGACGTTGGGGAG 서열번호 18
ptsG+1000-R CCAACATCTTCCCGGATG 서열번호 19
galP_infu_F tagtgctagcGGTACatgcctgacgctaaaaaacaggggc 서열번호 20
galP_infu_R GTCAAAATAATTAATCGTGAGCGCCTATTTC 서열번호 21
glk_infu_F TCACGATTAATTATTTTGACTTTAGCGGAGCAG 서열번호 22
glk_infu_R TCCAATTGAGATCTGCCATATTACAGAATGTGACCTAAGGTCTGG 서열번호 23
실시예 1-4. 변이주 제작
Gene bridges 사의 Quick&easy e. coli gene deletion kit 사용하여, 제조사의 매뉴얼대로 W3110 (KCTC에서 구입) 균주에서 yqhD, glpK, ldhA, ack-pta 및 gldA 유전자를 결실시킨 균주 W3110 (△yqhD, △glpK, △ldhA, △ack-pta 및 △gldA) (DKALG 균주라 명명함)를 제작하고, 상기 실시예 1-3의 방법과 같이, 상기 DKALG 균주에서 Cas9 시스템을 이용하여 ptsG 유전자를 결실시키고, ptsG 유전자 위치에 galP 및 glk 유전자를 삽입하여 galP 및 glk 유전자를 과발현시킨 균주 (DKALGP::PK 균주라 명명함)를 제작하였다.
상기 DKALGP::PK 균주에 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제작한 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 및 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터를 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여 형질전환하여, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB) 및 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(btuR)를 포함하는 균주를 제작하였다.
대조군으로는, 상기와 동일한 방법으로 DKALGP::PK 균주에 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제작한 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 및 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 벡터를 도입하여, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH), 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하되, btuR 유전자가 클로닝되지 않은 플라스미드 pCDF 가 도입된 미생물을 사용하였다.
구체적으로, 상기 DKALGP::PK 균주를 각각 LB 플레이트 (1 리터당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 10g NaCl, 15g agar 포함) 상에 평판도말하고 37℃ 에서 밤새 배양하였다. 배양한 단일 콜로니를 3 내지 5mL LB 액체배지 (배지 조성은 위와 동일하되 agar 를 포함하지 않음)에 접종하고 교반하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침 배양액을 LB 액체배지 0.05 리터에 1:100 으로 희석하고 OD ~0.5 가 될 때까지 3-6시간 배양하였다. 10 내지 15분간 얼음 위에서 식힌 후 4℃에서 4000rpm 으로 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포를 얼음으로 식힌 멸균 DI water 1 부피에 재현탁하여 세척하고 다시 4℃에서 4000rpm 으로 10분 간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포는 다시 DI water 0.5 부피에 재현탁하여 세척하고 다시 4℃에서 4000rpm 으로 10분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포는 얼음으로 식힌 멸균 10% 글리세롤 1mL에 재현탁하고, 개별 pre-chilled microfuge tube에 세포 분취량(aliquots)을 넣었다(0.1㎝의 갭 전기천공용 큐벳에서 형질전환 당 90 ul). salt-free DNA (벡터) 1-5㎕를 피펫팅하여 첨가한 후 혼합물을 전처리된 전기천공용 큐벳(pre-chilled electroporation cuvette)에 옮겼다. 1.8kV에서 전기천공하고 펄스 직후 상온의 LB 액체배지 1mL를 세포에 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양액은 카나마이신 및 스트렙토마이신이 포함된 LB 플레이트 상에 도말하고 과량의 액체가 건조/플레이트 내로 흡수되게 하였다. 플레이트를 거꾸로 하여 37℃에서 배양하였다.
상기 DKALGP::PK 균주에 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 (GG)와 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH 벡터 (DGA)가 도입된 균주 (이하, DKALGP::PK + GG-DGA 균주라 명명함)와 상기 DKALGP::PK 균주에 pRSF-pLTTR-GPD-GPP 벡터 (GG)와 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 벡터 (DGAB)가 도입된 균주 (이하, DKALGP::PK + GG-DGAB 균주라 명명함)를 제작하였다.
실시예 2. 3-HP 생산량 측정
실시예 2-1. 변이 도입 및 유도물질 첨가 시기에 따른 3-HP 생산량 측정
상기 실시예 1에서 제조한 균주의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하여 37℃의 조건에서 18시간 동안 전배양(Seed culture) 하였다.
그 후 5L 발효기에서, 20 g/L의 글루코스와 25mg/L 스트렙토마이신 및 50mg/L 카나마이신이 포함된 변형된 MR 배지(MgSO4ㆍ7H2O 0.8 g/L, (NH4)2HPO4 4 g/L, KH2PO4 6.67 g/L 및 Citrate 0.8 g/L 함유) 2L에 전배양액 (Seed culture) 150mL을 플라스크에 접종하고, 35℃, 500 rpm 발효기에서, NH4(OH) 또는 Mg(OH)2를 이용하여 pH를 6.95로 유지한 조건으로 배양하였다.
하기 조건 1 또는 조건 2의 시기에, 100 g/L 3HP 10mL, 5mM B12 10 mL 첨가하여, 3HP 생산을 유도하였고, 배지에 포함된 글루코스 소진 후에 40.5 mL/hr의 속도로 Feeding Solution (글루코스 700g/L, MgSO4 15g/L, Trace metal 10mL/1L, 10x MR salt 100mL/1L, 25mg/L 스트렙토마이신, 및 50mg/L 카나마이신 포함)을 첨가하였다. 조건 1 및 조건 2에서 글루코스가 모두 소비된 시점은 각각 배양 시작 후 10.5 H (hour) 및 11.5H (hour)였다.
- 조건 1: 글루코스 모두 소비된 10.5H에 100 g/L 3HP 10mL, 5mM B12 10mL 첨가
- 조건 2: 배양 초기 (0 hour)에 100 g/L 3HP 10mL 첨가하고, 글루코스가 모두 소비된 11.5 H에 5mM B12 10mL 첨가
각 조건에서 24시간 배양한 배양액 1mL을 원심분리 (13,200rpm, 1분) 후, 상등액을 0.45㎛ 크기의 필터를 사용하여 준비하였다. 그 후 HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 배양액 내 3-HP, 글리세롤 (glycerol) 생산량과 부산물 (acetate 및 PDO) 생산량을 분석하고, 그 결과를 표 8과 도 1a (표 8의 비교예) 및 도 1b (표 8의 실시예 1)에 나타내었다. 구체적으로, HPLC는 하기 표 7의 조건으로 수행하였다.
또한, 각 배양 조건에서 균주의 생장은 UV Spectrometer 를 이용하여 OD600(600nm에서의 상기 균주 배양액의 흡광도(O.D.))를 측정하여, 그 결과를 표 8과 도 1a (표 8의 비교예), 도 1b (표 8의 실험군 1) 및 도 1c (표 8의 실험군 2)에 나타내었다.
HPLC Model Agilent Technologies 1200 Series
Column Bio-Rad Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column300 mmX7.8 mm
Detector Refractive Index (RI) / Ultraviolet (UV) Detector
Mobile Phase 0.5 mM H2SO4
Flow rate 0.4 mL/min
Run time 35 min
Column temperature 35℃
Detector temperature 35℃
Injection volume 10㎕
균주 배양 조건 O.D. 글리세롤 (g/L) 3HP yield
(g-3HP/g-포도당)		 3HP (g/L)
pH 조절 3HP 첨가
시기
비교예 DKALGP::PK + GG-DGA NH4(OH) 조건 1 64.0 13.4 0.399 51.4
실험군 1 DKALGP::PK + GG-DGAB NH4(OH) 조건 1 49.6 1.01 0.545 75.2
실험군 2 DKALGP::PK + GG-DGAB Mg(OH)2 조건 2 25.6 0 0.761 59.5
표 8, 및 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, btuR 유전자가 과발현된 균주 (DKALGP::PK + GG-DGAB; 실험군 1 및 실험군 2)의 경우 비교예 (DKALGP::PK + GG-DGA) 대비 글리세롤 축적량 및 세포 생장이 감소되었고, 3HP 생산량 및 3HP 수율 (투입한 포도당 대비 3HP 생산량의 비율; g/g)이 현저히 증가하였다. 또한 실험군 1 (도 1b) 및 실험군 2 (도 1c)에서 부산물 생성은 거의 관찰되지 않았다. 또한 표 8에 나타난 바와 같이, 실험군 2의 경우, 비교예 및 실험군 1 보다 글리세롤 축적량 및 세포 생장이 감소되었고 3HP 수율 (투입한 포도당 대비 3HP 생산량의 비율; g/g)은 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 예에 따른 변이 균주 (btuR 유전자 과발현) 및/또는 이를 이용한3HP 생산 방법은 포도당으로부터 3HP 생산 수율이 현저히 증가시키고, 포도당을 세포 생장보다 3HP 생산에 활용한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2. 염기성 수용액 종류에 따른 3HP 생산량 측정
상기 실시예 2-1의 방법과 유사하게, 실시예 1에서 제작한 btuR 유전자가 과발현된 균주 (DKALGP::PK + GG-DGAB)를 조건 1에서, NH4(OH) 또는 Mg(OH)2를 이용하여 pH를 6.95로 유지한 조건으로 42시간 배양하고, 배양액 내 3-HP, 글리세롤 (glycerol), 부산물 (acetate 및 PDO) 생산량과 균주의 생장을 측정하여 그 결과를 하기 표 9과 도 2a (표 9의 실험군 3) 및 도 2b (표 9의 실험군 4)에 나타내었다.
- 조건 1: 글루코스 모두 소비된 10.5H에 100 g/L 3HP 10mL, 5mM B12 10mL 첨가
균주 배양 조건 3HP (g/L)
pH 조절 3HP 첨가
시기
실험군 3 DKALGP::PK + GG-DGAB NH4(OH) 조건 1 75.6
실험군 4 Mg(OH)2 98.7
상기 표 9, 도 2a, 및 도 2b에 나타난 바와 같이, NH4(OH))를 사용하여 배양 단계에서 pH를 조절한 실험군 3 보다 Mg(OH)2를 사용한 실험군 4에서 3HP 생산량이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (18)

  1. (1) 아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase)의 활성이 강화되고,
    (2) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD), 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP), 또는 이들 모두의 활성이 강화된
    에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물
  2. 제1항에 있어서, 다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는, 미생물:
    (3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 활성 강화;
    (4) 갈락토스 퍼미아제 (galactose permease), 글루코키나제 (glucokinase), 또는 이들 모두의 활성 강화; 및
    (5)포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성 약화 또는 불활성화.
  3. 제1항에 있어서, 추가적으로 하기 (1) 내지 (6)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 약화되거나 불활성화된, 미생물:
    (1) 1,3-프로판다이올 디하이드로게나제 (1,3-propanediol dehydrogenase);
    (2) 글리세롤 키나아제 (glycerol kinase);
    (3) 아세테이트 키나아제 (acetate kinase);
    (4) 포스포트랜스아세틸라제 (phosphotransacetylase);
    (5) 락테이트 디하이드로게나제 (lactate dehydrogenase); 및
    (6) 글리세롤 디하이드로게나제 (glycerol dehydrogenase).
  4. 제2항에 있어서, 다음의 특징을 모두 가지는 미생물:
    (1) 아데노실트랜스퍼라제 (adenosyltransferase)의 활성 강화;
    (2) 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase; GPD) 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제(glycerol-3-phosphate phosphatase; GPP)의 활성 강화;
    (3) 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase), 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase), 및 알데히드 디하이드로게나아제 (aldehyde dehydrogenase)의 활성 강화;
    (4) 갈락토스 퍼미아제 (galactose permease) 및 글루코키나제 (glucokinase) 활성 강화; 및
    (5)포스포트랜스퍼라제 시스템의 포도당 수송체 (glucose-specific transporter of the phosphotransferase system)의 활성 약화 또는 불활성화.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 아데노실트랜스퍼라제의 활성 강화는 btuR 유전자의 발현 증가에 의한 것인, 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제의 활성 강화는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 암호화 유전자 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 암호화 유전자의 발현 증가에 의한 것인, 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 세포 생장이 억제된, 미생물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산능을 가지는, 미생물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포함하는, 포도당으로부터3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid) 생산용 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 포도당을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
    포도당으로부터 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic Acid)의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 염기성 용액을 사용하여 pH를 6.5 내지 7.0으로 조절하여 수행하는 것인, 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 염기성 용액은 수산화 마그네슘(Magnesium hydroxide) 용액인, 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 상기 미생물이 포도당을 모두 소비하기 전에 배양 배지에 글리세롤 생산을 촉진을 위한 유도물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유도물질을 배양 초기부터 배양 배지에 첨가하는 것인, 생산 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 유도물질은 3-히드록시프로피온산인, 생산 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 포도당을 포함한 배지에서 배양한 배양물.
  18. 제17 항에 있어서, 3-히드록시프로피온산을 60g/L 내지 200g/L의 농도로 포함하고 글리세롤을 10g/L 이하의 농도로 포함하는, 배양물.
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