JP2014528705A - アセトアセチルCoAシンターゼを用いるイソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願特許第61/515,300号(2011年8月4日出願)の利益を請求するものであり、該開示は、参照によりその全体が本案件に組み込まれる。
本発明は全体として、培養細胞及びこれらの培養細胞を含む組成物からの、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及び/又はイソプレノイドの生産方法に関する。
本発明の実施においては、特に断りのない限り、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。このような技術は、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、第3版(Sambrook et al.、2001年);「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M.J.Gait,ed.、1984年);「動物細胞培養法:実践的アプローチ(Animal Cell Culture: A practical approach)、第3版(J.R.Masters,ed.,2000年);「酵素学的手法(Methods in Enzymology)」(Academic Press,Inc.);「分子生物学最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(F.M.Ausubel et al.,編、1987年、周期的に改訂);「PCR:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR: The Polymerase Chain Reaction)」(Mullis et al.,編、1994年)、Singleton et al.、「微生物学及び分子生物学辞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第3版」J.Wiley&Sons(New York,N.Y.2006年)、並びに「マーチ最新有機化学反応、機序及び構造(March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure)第6版」、John Wiley & Sons(New York,N.Y.2007年)といった文献中に十分に説明されており、これらの文献は、当業者に対し、本開示に使用される多くの用語について一般的な指針を提供する。
用語「イソプレン」は、2−メチル−1,3−ブタジエン(CAS# 78−79−5)を指す。3,3−ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)からピロリン酸を除去することで、揮発性のC5炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。IPP分子をDMAPP分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
メバロン酸依存性生合成経路(MVA経路)は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びN−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の生産に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のDMAPP及びIPPの主要な供給源を提供する。
アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子(nphT7としても知られる)は、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有し、かつ2分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性は最小限である(例えば、非活性である)酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Okamura et al.,PNAS Vol 107,No.25,pp.11265〜11270(2010)を参照されたい。この文献中のnphT7に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。日本国特許公開第2008−61506(A)号及び米国特許出願公開第2010/0285549号には、放線菌(actinomycete)のストレプトミセス(Streptomyces)属CL190株のアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子が記載されている。アセトアセチルCoAシンターゼも、アセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチルCoAシンターゼ(又はアセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素)としては、Genbank AB540131.1が挙げられる。
アセトアセチルCoAシンターゼと合わせて使用することのできるMVA経路のポリペプチド例としては、限定するものではないが、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ(HMG−CoAシンターゼ)ポリペプチド(例えば、mvaSによりコードされる酵素)、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ(HMG−CoAレダクターゼ)ポリペプチド(例えば、mvaRによりコードされる酵素又はチオラーゼは欠損しているものの還元酵素活性は保持するよう改変を受けたmvaEによりコードされる酵素)、メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ(IPK)ポリペプチド、IPPイソメラーゼポリペプチド、IDIポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドに関係する2つ又はそれ以上の活性を有するポリペプチド(例えば、融合ポリペプチド)、が挙げられる。特に、MVA経路ポリペプチドとしては、MVA経路のポリペプチドの活性を少なくとも1つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。MVA経路の核酸例としては、MVA経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも1つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。MVA経路のポリペプチド及び核酸例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産を増大させるような、MVA経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
HMG−CoAのメバロン酸ポリぺプチドへの変換を触媒する酵素、例えば、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ(HMG−CoAレダクターゼ)を使用することができる。チオラーゼを欠損しつつ還元酵素活性は保持するよう改変したmvaEによりコードされる酵素も別の例として挙げられる。mvaE遺伝子は、チオラーゼ活性及びHMG−CoAレダクターゼ活性を両方保有しているポリペプチドをコードするものと報告されている。mvaE遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換するのに対し、HMG−CoAレダクターゼポリペプチドの酵素活性は、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAをメバロン酸に変換する。本発明に使用することのできるmvaEポリぺプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の微生物資源から天然に又は改変により得られ、チオラーゼ活性は有さないもののHMG−CoAレダクターゼ活性は有するポリぺプチド及び核酸が挙げられる。
アセトアセチルCoAのHMG−CoA(例えば、HMG−CoAシンターゼ又はHMGS)への変換を触媒する酵素を使用することができる。一実施形態では、mvaS遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用することができる。mvaS遺伝子は、HMG−CoAシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルCoAを、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoA(HMG−CoA)に変換させることができる。mvaSポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにmvaSポリペプチドの活性を少なくとも1つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、下流メバロン酸(MVA)経路のポリペプチドをコードしている核酸を1つ以上更に含む。一部の態様では、下流MVA経路のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、下流MVA経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように構成型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流MVA経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモーターに連結される。一部の態様では、下流MVA経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモーターに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性下流MVA経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、下流MVA経路のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターに連結される。
本発明の一部の態様では、本開示の組成物又は方法のいずれかに記載の組み換え細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、又はイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドを更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸を1つ以上使用する(例えば、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸の2、3、又は4つ以上のコピーを使用する)。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモーターに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属(Pueraria)又はハコヤナギ属(Populus)由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ(Populus alba)xヤマナラシ(Populus tremula)などの交雑種由来のポリペプチドである。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組み換え細胞は、DXSポリペプチド又はDXP経路の他のポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、DXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている内在性核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌(E. coli)細胞は更に、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を含む。一部の態様では、核酸は、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、1つのプラスミドは、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミド(multiple plasmids)は、イソプレンシンターゼポリペプチド、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチド又は他のDXP経路ポリペプチドをコードしている。
イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路、及び/又はMVA経路核酸(分子のアセトアセチルCoAをアセチルCoAに縮合する、アセトアセチルCoAチオラーゼ、すなわちAACTなどの酵素は除く)、MVA経路ポリぺプチド(2分子のアセトアセチルCoAをアセチルCoAに縮合する、AACTなどの酵素は除く)は、イソプレンシンターゼ、IDI、DXP経路、及び/又はMVA経路核酸を天然に含有する任意の微生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するMVA経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。したがってMVA経路の核酸は、例えば、MVA経路を含有する任意の生物から得ることができる。IDI及びDXP経路の核酸は、例えば、IDI及びDXP経路を含有する任意の生物から得ることができる。
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
当業界で知られる任意の技術により、アセトアセチルCoAシンターゼをコードしている核酸、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAシンターゼを生産する酵素、チオラーゼ以外のMVA経路ポリペプチド、DXP経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、IDI、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及びイソプレン、イソプレノイド前駆体、及び/又はイソプレノイドの生産に必要とされる任意の酵素を宿主細胞(例えば、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はバクテリア細胞)に導入することができる。
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、適切なベクターを使用して、HMG−CoAレダクターゼ、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及び/又はチオラーゼ以外の1つ以上のMVA経路ポリぺプチドをコードしている遺伝子の1つ以上のコピーの発現を最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸(例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール)、及び/又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝に関係する利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは使用せずに、HMG−CoAレダクターゼ、イソプレンシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ並びに/又はチオラーゼ以外のMVA経路ポリペプチドの核酸の1つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込む。本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の1つのベクターを使用することができる。
本発明は、更に、経路を開始させるマロニルCoAの細胞内含量を増加させる変異を有する宿主微生物の使用を目的とする。これらの改変を行った宿主細胞では、アセトアセチルCoAシンターゼによる基質(例えば、マロニルCoA)利用能が向上していることから、アセトアセチルCoAの生産が増大することになり、イソプレン及び/又はイソプレノイドなどの下流の生成物の生産も増大する。特定の実施形態では、宿主微生物には、クエン酸サイクルの遺伝子のsdhCDAB及びcitE、アミノ酸輸送体brnQ、並びにピルビン酸を消費するadhEの活性を、減弱させるか又は欠失させる遺伝子操作を行うことができる。他の実施形態では、宿主微生物には、限定するものではないが、アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPD)及び/又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDH)などの1つ以上の遺伝子を過剰発現させることにより、細胞内マロニルCoA濃度を上昇させる遺伝子操作を行うことができる。例えば、Fowler,et al.,Applied and Environmental Microbiology,Vol.75,No.18,pp.5831〜5839(2009)、Zha et al.,Metabolic Engineering,11:192〜198(2009)、Xu et al.,Metabolic Engineering,(2011)doi:10.1016/j.ymben.2011.06.008、Okamura et al.,PNAS 107:11265〜11270(2010)、並びに米国特許出願公開第2010/0285549号を参照されたい。これらの非特許文献及び特許文献の内容は、参照によりその全体が本開示に明示的に組み込まれる。
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルCoAを縮合させることによるクエン酸(トリカルボン酸(TCA)回路の代謝生成物)の生成を触媒する(Ner,S.et al.1983.Biochemistry 22:5243〜5249;Bhayana,V.and Duckworth,H.1984.Biochemistry 23:2900〜2905)(図5)。大腸菌(E. coli)では、gltAによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はNADHによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている(Wiegand,G.,and Remington,S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.15:97〜117;Duckworth et al.1987.Biochem Soc Symp.54:83〜92;Stockell,D.et al.2003.J.Biol.Chem.278:35435〜43;Maurus,R.et al.2003.Biochemistry.42:5555〜5565)。NADHによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、枯草菌(Bacillus subtilis)NADH感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071〜1081;Sanchez et al.2005.Met.Eng.7:229〜239)。
ホスホトランスアセチラーゼ(pta)(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Acta 191:550〜558)は、アセチルCoAとアセチルリン酸(アセチル−P)の可逆性の変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ(ackA)(Kakuda,H.et al.1994.J.Biochem.11:916〜922)は、アセチル−Pと酢酸の可逆性の変換を触媒する。これらの遺伝子は、大腸菌(E. coli)においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ATPの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子(例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子)及び/又は酢酸キナーゼ遺伝子(例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子)の活性を減弱させて、利用可能なアセチルCoAを増加させることができる。減弱させる手法の1つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)及び/又は酢酸キナーゼ(ackA)の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌(E. coli)により生成される(Wolfe,A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69:12〜50)。理論に束縛されるものではないが、ackA−ptaはアセチルCoAを消費することから、これらの遺伝子を欠失させると、炭素は酢酸に変換されなくなり、メバロン酸、イソプレン又はイソプレノイドの収率が増加することになる。
大腸菌(E. coli)では、D−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA−図5)により、ピルビン酸から生成される(Bunch,P.et al.1997.Microbiol.143:187〜195)。乳酸の生成はNADHの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸生産(並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの生産)への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
リンゴ酸酵素(大腸菌(E. coli)ではsfcA及びmaeB)は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する(NAD+又はNADP+を用いる)アナプレロティックな酵素である:
ピルビン酸のアセチルCoAへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子aceE、aceF、及びlpdAによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチルCoAを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び/又は発現(例えば、常時発現)を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg−ラムダプロモーター、GenBank NC_001416(配列番号2))などの強力な常時発現型プロモーターをオペロンの前に配置することにより、あるいは常時発現型合成プロモーターを1種以上用いることにより行うことができる。
本開示の酵素及び/又は酵素経路のいずれかに関し、本開示の酵素及び/又は酵素経路の任意の組み合わせ(これらのうち2、3、4、5、又は6の組み合わせ)を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ(gltA)はAと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ(ptaB)はBと表記し、酢酸キナーゼ(ackA)はCと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)はDと表記し、リンゴ酸酵素(sfcA又はmaeB)はEと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(aceE、aceF及び/又はlpdA)はFと表記する。上記のとおり、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のaceE、aceF、及び/又はlpdA酵素を単独で使用して、又は3つの酵素のうち2つを、又は3つ酵素のうち3つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。
他の分子的操作を使用して、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量を増加させることができる。このような方法のうちの1つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子aceEF−lpdAはオペロンであり、pdhRの上流に遺伝子を4つ有する。pdhRは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。pdhRは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモーターに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でndh及びcyoABCDも制御する(Ogasawara,H.et al.2007.J.Bact.189:5534〜5541)。一態様では、pdhR制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの生産を向上させることができる。
イソプレン(2−メチル−1,3−ブタジエン)は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
本明細書で使用するとき、用語「最少培地(minimal medium又はminimal media))」は、概して細胞の生育に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に1種以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10種以上のアミノ酸)が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には、(1)宿主細胞生育用の炭素源、(2)宿主細胞種及び生育条件間で変更させ得る各種塩類、及び(3)水、を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
本発明の組み換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。細胞培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第2009/076676号、米国特許出願第12/335,071号(同第2009/0203102号)、国際公開第2010/003007号、米国特許出願公開第2010/0048964号、国際公開第2009/132220号、米国特許出願公開第2010/0003716号、Gerhardt et al.,編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル)、American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)又はBrock in Biotechnology:テキスト「工業微生物学(Industrial Microbiology)」第2版(1989)Sinauer Associates,Inc.(Sunderland,MA)が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、HMG−CoAレダクターゼ、HMG−CoAシンターゼ、イソプレンシンターゼ、DXP経路(例えば、DXS)、IDI、下流MVA経路ポリペプチド又はPGL、のポリペプチドのうちの、1種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
本開示では、本開示に記載の任意の組み換え微生物を培養する工程を含む、イソプレンの生産方法も提供される。一態様では、イソプレンは、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成(例えば、アセトアセチルCoAシンターゼ)することのできるポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸:並びに(a)イソプレンシンターゼポリペプチド;及び(b)メバロン酸(MVA)経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を含む組み換え宿主細胞(例えば、バクテリア細胞)を培養することにより生産することができ、イソプレンシンターゼポリペプチドは、異種核酸によりコードされる。一態様では、HMG−CoAレダクターゼ、下流MVA経路のポリペプチド、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を使用することができる。別の態様では、HMG−CoAレダクターゼ及びHMG−CoAシンターゼ、下流MVA経路のポリペプチド、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の異種核酸を含む組み換え宿主細胞(例えば、バクテリア細胞)を培養することによりイソプレンを生産することができる。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。六炭糖(グルコースなど)などの炭水化物からイソプレンを生産する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。
イソプレノイドは、多くの生物において、MVA経路の最終産物であるイソプレノイド前駆体分子の合成をもとに生産させることができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
本発明の組み換え微生物は、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子DMAPP及びIPPの生産量を増加させる能力がある。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール(すなわち、3−メチル−2−ブテン−1−オール)、イソプレノール(すなわち、3−メチル−3−ブテン−1−オール)、2−メチル−3−ブテン−2−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、ファルネセン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン(Terpindene)、及びバレンセンからなる群から選択することができる。
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、アセトアセチルCoAシンターゼを含む組み換え細胞は、更に、上記のとおりにチオラーゼ以外のMVA経路のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモーターに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモーターに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモーターと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモーターと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
本開示では、イソプレノイド前駆体分子及び/又はイソプレノイドの生産方法であって、アセトアセチルCoAシンターゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、並びにMVA経路のポリペプチド、例えば限定するものではないが、HMG−CoAレダクターゼ、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ(HMG−CoAシンターゼ)ポリペプチド、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ(HMG−CoAレダクターゼ)ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ(MVK)ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MVD)ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMDC)ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ(IPK)ポリペプチド、IPPイソメラーゼポリペプチド、IDIポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドのうち2つ又はそれ以上の活性を有するポリペプチド(例えば、融合ポリペプチド)などをコードしている1つ以上の核酸を含む組み換え微生物(例えば、組み換えバクテリア細胞)を培養する工程を含む方法も提供する。
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、生産された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは吸着ストリッピングにより回収される(例えば、米国特許第12/969,440号を参照されたい)。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
それぞれアセトアセチルCoAシンターゼ、HMG−CoAシンターゼ、及びHMG−CoAレダクターゼを発現するnphT7遺伝子、mvaS遺伝子、及びmvaR遺伝子をコードする発現プラスミドを生成した。簡潔に述べると、順行プライマー及び逆行プライマーを合成して、ストレプトミセスタンパク質をコードしている合成遺伝子から、mvaS遺伝子(MCM489及びMCM490)、mvaR遺伝子(MCM491及びMCM492)、及びnphT7遺伝子(MCM495及びMCM496)を増幅させた(表1)。MCM485順行プライマー及びMCM486逆行プライマーを使用して、発現ベクターを増幅させた。ベクターを増幅させるためのDNAテンプレートはpMCM1225である(表2)。ストレプトミセス(Streptomyces)のmvaS及びmvaRを増幅させるためのDNAテンプレートは、mvaS及びmvaRをコードしている合成オペロンを含有し、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ(atoB)もコードしているStrepCL190(DNA2.0)である。Hisタグを付加したNphT7をコードしている合成遺伝子を含むpMCM1187テンプレートを使用して、NphT7をコードしている遺伝子を増幅する(Genbank BAJ10048)。
β−ラクタマーゼをコードしているbla遺伝子を用い、イソプレンシンターゼ及びメバロン酸キナーゼ(MVK)発現プラスミドを生成した。簡潔に述べると、pUC19 DNA(Invitrogen)から、プライマーMCM694及びMCM695によりbla遺伝子を増幅させた(表5)。cmRマーカー遺伝子を含まない発現プラスミドpDu65を、プライマーMCM696及びMCM697により増幅させた。GENEART(登録商標)Seamless Cloning and Assemblyキット(#A13288)を使用し、製造元のプロトコルに従い増幅産物を融合させ、続いて生成物によりケミカルコンピテントなMD09−314細胞を形質転換させた。融合させたプラスミドを、LB/carb50プレートで37℃で一晩選別した。単一のコロニーを採取し、5mL LB/carb50で37℃で生育させた後、−80℃で保管した。
アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ(atoB)欠損株を作成した。簡潔に述べると、カナマイシンマーカーにより破壊されたatoB遺伝子を含有しているDNA断片を、Keio collection(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)の株JW2218をテンプレートとして用い、プライマーatoBrecF(5’−GCAATTCCCCTTCTACGCTGGG−3’(配列番号15))及びatoBrecR(5’−CTCGACCTTCACGTTGTTACGCC−3’(配列番号16))を使用して、PCRにより増幅させた。製造元からの取扱説明書に従ってポリメラーゼHerculase II Fusion(Agilent,Santa Clara,CA)を使用した。得られたPCR産物を、製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)の推奨するとおりに組み換え反応に使用し、CMP451株のlatoB座に組み入れた。CMP451は、CMP258(米国特許出願第12/978,324号を参照されたい)に2つ改変を加えたものである。簡潔に述べると、CMP258においてクエン酸シンターゼ遺伝子(gltA)の前にあるプロモーターをGI1.2と置き換えた(米国特許第7,371,558号)。gltA(Wilde,R,and J.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239〜3251)に関しては2つの野生型プロモーターが報告されており、遠位プロモーターの−35領域の直後に合成プロモーターを挿入した。プライマーUpgltACm−F(5’−TATTTAATTTTTAATCATCTAATTTGACAATCATTCAACAAAGTTGTTACAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG−3’(配列番号17))及びDngltA1.xgiCm−R(5’−TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATHGTCAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCG−3’(配列番号18))、並びにテンプレートとしてGene Bridges(Heidelberg,Germany)のFRT−gb2−Cm−FRTテンプレートを使用し、PCR産物を得た。PCR産物を精製し、λ redを用いる組み換えに製造元(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)による記載のとおりに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選別した。プロモーター領域は、プライマーgltAPromSeqF:5’−GGCAGTATAGGCTGTTCACAAAATC−3’(配列番号19)及びgltApromSeqR(5’−CTTGACCCAGCGTGCCTTTCAGC−3’(配列番号20))と、テンプレートとしてコロニーから抽出したDNA(コロニーを30μLのH2Oに再懸濁し、95℃で4分加熱し、スピンダウンしたもの。50μLのPCR反応には、この溶液のうち2μLをテンプレートとして使用する)とを使用しPCR増幅させた。得られたPCR産物の配列決定結果を観察した後、プロモーターGI1.2(米国特許第7,371,558号)を保有しているコロニーを、更なる使用のため保存し、CMP141と名づけた。CMP258(米国特許出願第12/978,324号を参照されたい)にMCM521株(米国特許出願第12/978,324号を参照されたい)のP1可溶化液を形質導入し、MD09−313株を構築し、20μg/mLのカナマイシンを含有させたルリア・ベルターニ培地のプレートにてコロニーを選択した。Ausubel,et al.の「Current Protocols」(Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc)に記載の方法に従ってP1可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)カナマイシンマーカーを除去し、MD09−314株を作製した。株CMP141からP1可溶化液を作製し、株MD09−314に形質導入してCMP440を作成するのに使用した。製造元により推奨されるプロトコルを用い(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)クロラムフェニコールマーカーを除去して株CMP451を作製した。
記載のプラスミドを記載の親株に電気穿孔により導入し株MCM1331、MCM1681、MCM1684、MCM1685、及びMCM1686を作成した(表6)。凍結バイアルから掻きとった抗生物質を添加した5mL LBで、37℃で、250rpmで振とうしながら親細胞を生育させた。細胞密度がOD 0.5〜0.8に達した時点で、培養物を氷上に置いて冷却し、3mLの培養物サンプルを氷冷再蒸留水で3回洗浄した後、氷冷再蒸留水200μLに再懸濁した。エッペンドルフチューブ中で、100μL細胞懸濁液サンプルを1〜3μL DNAと混合した後、電気穿孔用2mmキュベットに移し、25uFD、200ohm、2.5kVで電気穿孔し、直ちに500μL LBでクエンチした。37℃で1時間振とうさせて細胞を回復させ、記載の抗生物質を添加したLBプレートで37℃で形質転換体を選別した。単一のコロニーを5mL LB+抗生物質に採取し、37℃で生育させ、16.5%グリセロールにより−80℃で保管した。MCM1686株にはpCL1920の空のプラスミドを含有させたため、上流MVA経路は発現されず、DXP経路によるイソプレン生産に指向した。
株MCM1684、MCM1685、及びMCM1686のイソプレンの比生産性を測定した。Carb50及びSpec 50を含有させたLB培地でOD 1.0付近で生育させた10uLの細胞培養サンプルを、1%グルコース、0.02%酵母エキス、並びにcarb50及びspec50を含有させたTM3細胞培養培地に播種し、34℃で一晩培養した。これらの培養物を用い、同様のTM3培地5mLにOD 0.2で播種し、続いて250rpmで浸透しながら34℃で2時間45分生育させた。400uM IPTGにより培養物に発現誘導を行い、更に2時間15分生育させた。ブロスを1:10希釈して細胞密度を測定した。2mLヘッドスペースバイアルでブロス100μLを34℃で30分インキュベートした後、70℃で12分熱殺菌した。ヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフ(Model G1562A,Agilent Technologies)(Mergen et al.,LC GC North America,28(7):540〜543,2010)を連結した水素炎イオン化検出器により測定した。イソプレン生産のデータ解析により、DXP経路に加えてNphT7によりイソプレンを生産する経路を含有しているMCM1684及びMCM1685が、それぞれ、DXP経路のみを含有させたMCM1686の生産速度と比較して、2.4倍及び2.5倍でイソプレンを生産することが実証される(表7及び図1)。
Strep CL190 Upper MVA pTrcHis2A
(i)材料
TM3培地の組成(発酵培地1L当たり):
K2HPO4を13.6g、KH2PO4を13.6g、MgSO4 *7H2Oを2g、クエン酸一水和物を2g、クエン酸鉄アンモニウムを0.3g、(NH4)2SO4を3.2g、酵母エキスを0.2g、1000X微量金属溶液を1mL。すべての成分を共に加え、diH2Oに溶解させる。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整する。次に、0.22μmのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加する。
クエン酸*H2Oを40g、MnSO4 *H2Oを30g、NaClを10g、FeSO4 *7H2Oを1g、CoCl2 *6H2Oを1g、ZnSO4 *7H2Oを1g、CuSO4 *5H2Oを100mg、H3BO3を100mg、NaMoO4 *2H2Oを100mg。各成分を1成分ずつdiH2Oに溶解する。pHをHCl/NaOHで3.0に調整した後、溶液を用量に調整し、0.22μmフィルタでフィルタ滅菌する。
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、OD600が0.05になるよう細胞を20mLのTM3培地(50ug/mLのスペクチノマイシン及び50ug/mLのカルベニシリンを含有(250mLのバッフル付き三角フラスコ))により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。接種前に、培養フラスコには20%(v/v)ドデカン(Sigma−Aldrich)を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する(Newman et.al.,Biotechnol.Bioeng.95:684〜691,2006)。
s.c.EasyComp形質転換キット(Invitrogen)に記載のプロトコルを用い、上記のプラスミドにより親株を形質転換させ酵母株を作成する。プラスミドを含有している酵母株を、2%グルコースと指定の選択マーカーを添加したSC最少培地で選択及び維持する。プラスミドを含有している単離コロニーを以降の実験に備え選別する。
プラスミドpMCM1221の作成
以降の設計を用い、上流MVA経路をコードしているプラスミドをGeneOracle(Mountain View,CA)により作成した。アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ−RBS−3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAシンターゼ−RBS−ヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼをコードしている合成DNAを作成し、次に、NcoI及びPstI部位間に存在するオペロンと置き換えてpMCM82(米国特許出願公開第2011/0159557号を参照されたい)にクローン化した。ベクターによりmvaE用のRBSを提供した。プラスミドマップについては図5を参照されたい。
ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)に由来する上流MVA経路の3つの要素をプラスミドコンストラクトpMCM1221(pCL−Ptrc−Upper_GcMM_159)に含有させ、使用した。ストレプトミセス属(Streptomyces sp.)株CL190に由来し、プラスミドコンストラクトMCM1187内でnphT7によりコードされるアセトアセチルCoAシンターゼについてはこれまでに記載している(表2を参照されたい)。5’BglII rbs nphT7プライマー及び3’PstI nphT7プライマーを使用し、製造元の推奨するプロトコルに従い、PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)により、MCM1187テンプレートからnphT7遺伝子をPCR増幅させた。一般的な分子生物学的手法を用い、nphT7を含有しているPCR産物をアガロースゲル電気泳動(E−gel 0.8%(GP),Invitrogen)により確認し、次にPCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen,Germantown,MD)により洗浄し、PCR産物及びpMCM1221の精製アリコートをBgl II及びPst I(Roche,Indianapolis,IN)により切断し、制限消化産物をQIAquickゲル抽出キット(Qiagen,Germantown,MD)により洗浄し、得られた、清浄なBgl II−Pst I断片をNew England BiolabsのT4 DNAリガーゼにより連結した。次に、Bio−Radの0.1cm電極間隔キュベット及びBio−Radジーンパルサー・システム(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を利用し、ライゲーション産物を電気穿孔コンピテントセルTop10(Invitrogen,Carlsbad,CA)に形質移入させた。形質移入させた細胞を、50ug/mLスペクチノマイシン(Teknova,Hollister,CA)を含有させたLB培地で選別した。推奨されるプロトコルに従い、QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen,Germantown,MD)を使用し、スペクチノマイシン耐性コロニーにより得られた培養物からプラスミドを調製した。続いて、nphT7(現在、株REM B5_25と命名されている)を含有するプラスミドコンストラクトを保有している陽性のTop10クローンを、nphT7 top seqプライマー、nphT7 bot seqプライマー、pSE3803(Sequetech in−houseプライマー)、5’BglII rbs nphT7プライマー、及び3’PstI nphT7プライマーを使用し、DNA配列を解析(Sequetech,Mountain View,CA)することにより確認した。nphT7を含有しているプラスミドコンストラクトを「nphT7 with S suis HMGRS/pCL」と名づけ、図6に例示する。
5’BglII rbs nphT7プライマー:5’−GGGCagatctcgcactaggaggatataccaatgaccgacgtgcgctttcgg(配列番号26)
3’PstI nphT7プライマー:5’−TATCCTGCAG tcaccattcaatcaacgcgaaggaagc(配列番号27)
nphT7 top seqプライマー:5’−CGGCACTGAAGGCTGCGG(配列番号28)
nphT7 bottom seqプライマー:5’−CCGCAGCCTTCAGTGCCG(配列番号29)
(ハウスプライマーにおける配列)pSE3803:5’−GGCATGGGGTCAGGTGGG(配列番号30)
MVAの生産量が高レベルで維持されていることが示された、atoBを欠失(内在性チオラーゼ活性を欠損)し、かつこれまでに記載した一連の変異を含有している宿主株CMP865を使用して、本開示位に記載の試験及び対照株を作成した。CMP865を作成するため、CMP646(BL21 pgl+PL.2 mKKDyI GI 1.2 gltA ML ackA−pta ldhA attB::Cmを含有)のP1可溶化液を作製し、これを使用して株CMP856に形質導入を行うことにより、株の染色体から下流メバロン酸経路(例えば、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ)を除去した。形質導入反応物をLB+クロラムフェニコール5ug/mLに播種し、1つのコロニーを選択しCMP859と名づけた。CMP859にpCP20(Datsenko及びWanner.2000年.PNAS 97:6640〜5)を電気穿孔することによりカナマイシン(atoB座)及びクロラムフェニコールマーカー(attB座)を同時に除去し、30℃にてカルベニシリン50mg/L耐性コロニーを選別し、次に42℃にて2つの形質転換体を画線した。カナマイシン感受性、クロラムフェニコール感受性を選別し、CMP865(BL21 PL.2mKKDyI GI 1.2 gltA ML atoB attB)と名づけた。
IPTGにより介在される上流MVA経路遺伝子の導入後、22時間の生産期間中に、MVAに限定した試験株REM C8_25、REM C9_25、及びREM D1_25、並びに対照株REM D2_25、REM D3_25、D4_25により生産されるMVA力価。簡潔に述べると、対照及び試験株を、34℃にて1%グルコース/0.025%酵母エキス/TM3培地4mLで生育させ、200μM IPTGにより発現を誘導させ、誘導した時点を0時とした。細胞を含まない上清のMVAを測定した。MVA力価を顕著に示す、pMCM1221由来のMVA経路成分を発現している対照株を、試験株と比較した。3つの試験株中2つの試験株ではMVAの検出濃度は低かった。これらのatoB(チオラーゼ)欠失株で顕著にMVAが検出されたことから、大腸菌(E. coli)BL21宿主により、nphT7の機能性を確認した。
大腸菌(E. coli)BL21株CMP861(実施例3を参照されたい)を宿主株として使用した。宿主株CMP861は、大腸菌(E. coli)の内在性DXP経路により得られるものと比べて多量にイソプレンを生産させるために、ストレプトミセス(Streptomyces sp.)株CL190に由来する遺伝子nphT5、nphT6、及びnphT7によりコードされる上流MVA経路の酵素を利用する上記のMCM1684及びMCM1685株を作製するために使用したものと同様のバックグラウンドをもつ。IPTG誘導性ispS(イソプレンシンターゼ)変異体及びカルベニシリン耐性遺伝子を保有しているプラスミドコンストラクトpDW240(pTrc P.alba IspS MEA−mMVK(Carb50))は、IPTG誘導性のispS(イソプレンシンターゼ)対立遺伝子と、カルベニシリン耐性遺伝子とをコードするものである。簡潔に述べると、標準的な電気穿孔プロトコルと、上記Bio−Radジーンパルサーキュベット及び電気穿孔システムとを使用し、プラスミドコンストラクトnphT7 with S suis HMGRS/pCLと、プラスミドコンストラクトpDW240を、株CMP861に導入し、50ug/mLスペクチノマイシン及び50ug/mLカルベニシリン(Teknova,Hollister,CA)を含有させたLB培地で選別することで、完全なMVA経路をもつ、イソプレン生産試験株REM F7_25、REM F8_25、及びREM F9_25を作成した。更なる解析に備え、得られたスペクチノマイシン及びカルベニシリン耐性コロニーのうち3つを選択し、株REM F7_25、REM F8_25、及びREM F9_25と名づけた。同様にして、電気穿孔法により、pDW240プラスミドコンストラクトのみを株CMP861に導入し、50ug/mLカルベニシリン(Teknova,Hollister,CA)のみを含有させたLB培地で選別することで、IspSのみの対照株を作成した。以降の実験の対照株としてカルベニシリン耐性コロニーを選別し、REM F3_25と名づけた。IspSのみの対照株REM F3_25によるイソプレン産生量は、評価する生育条件下において、大腸菌(E. coli)が維持するDXP経路のIspS基質(DMAPP)の内在濃度を反映する。
図7には、IPTGにより、関連する遺伝子発現を誘導した3.5時間後に、完全なMVA経路のみの試験株REM F7_25、REM F8_25、及びREM F9_25(それぞれ図8において株NphT7 a〜cとして記載する)、これまでに記載のMCM1684及びMCM1685 NphT7利用株、並びにIspSのみの対照株について測定された吸光度(OD)及びイソプレン濃度をもとに算出したイソプレンの比生産性(ug/L OD Hr)を示す。簡潔に述べると、対照及び試験株を、1%グルコース/0.05%酵母エキス/TM3培地20mL中で34℃にて生育させ、200uM IPTGにより発現誘導を行い、誘導を行った時点を0時とした。ほぼ上記のとおりにイソプレン及びOD測定を行い、イソプレンの比生産性を算出した。結果を図7に示す。IPTGによる発現誘導の5.5時間後に前述の各18mLの培養物から細胞ペレットを回収し、続いて、上流MVA経路及びIspS活性(下記を参照されたい)について解析した。これまでに観察されたとおり、ストレプトミセス種(Streptomyces sp.)株CL190由来の上流MVA経路の3つの成分のすべてを発現しているMCM1684及びMCM1685 NphT7利用株では、IspSのみの対照株と比較して、イソプレンの比生産性がわずかに高いことが裏付けられる。興味深いことに、本開示において新規に作製した試験株REM F7_25、REM F8_25、及びREM F9_25は、これまでに特性の評価されているMCM1684及びMCM1685株と比較しておおよそ3倍も多量にイソプレンを生産した。このデータにより、NphT7が大腸菌(E. coli)BL21宿主内で機能することが裏付られる。このデータにより、NphT7アセトアセチルCoAシンターゼとストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)HMG−CoAシンターゼ及びHMG−CoAレダクターゼとをコードしているプラスミドコンストラクトS suis HMGRS/pCLは、株MCM1684及びMCM1685が発現するストレプトミセス種(Streptomyces sp.)株CL190の遺伝子から、もっぱら経路の(previously described)3つの成分のみを有する株と比較して、より活性な上流MVA経路をもたらすことも示唆される。
材料:
アセチルCoA、マロニルCoA、NADPH、TRIS塩類、AEBSF、DNAase、リゾチーム、塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムはシグマから購入した。DMAPPは化学合成した。
1%グルコース、0.05%酵母エキス及び200μM IPTGを含有させたTM3培地で、細胞を5.5時間34℃にて生育させた。次に、Eppendorf 5804R遠心機により、細胞を4℃にて5000RPMで15分遠心分離した。100mM Tris、100mM NaCl、0.5mM AEBSF、1mg/mLリゾチーム、0.1mg/mL DNAaseを含有している溶液(pH 7.6)に、細胞ペレットを再懸濁した。フレンチプレスセルにより、細胞懸濁液を96.5MPa(14,000psi)で可溶化した。次に、Eppendorf 5804R遠心機により、可溶化液を4℃にて15,000RPMで10分遠心分離した。酵素活性アッセイに備え、上清を回収した。
1mMアセチルCoA、1mMマロニルCoA、又はこれら両方、0.4mM NADPH、100mM Tris、100mM NaCl、及び20μL清澄化細胞可溶化液を用い、pH 7.6で、細胞可溶化液のアセチルCoA及びマロニルCoA活性アッセイを実施した。アセチルCoA、マロニルCoA又はこれら両方を加えて反応を開始した。SpectraMax Plus190(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を使用し、96ウェルプレートで、340nmにてNADPHの酸化をモニターした。すべての反応は、最終用量100μLで25℃にて実施した。アセチルCoA、マロニルCoA、又はこれら両方を存在させた場合の反応速度から、アセチルCoA又はマロニルCoAの非存在下でNADPHの酸化速度を減算した。
2mLガスタイトバイアル中で、25μL大腸菌(E. coli)可溶化液に、5mM DMAPP、50mM MgCl2、及び100mM Tris/NaCl、(pH 7.6)を加え、最終用量100μLで、34℃にて15分間インキュベートした。250mM EDTA 100μLを加え、反応を停止させた。GC−MSによりガラスバイアルを解析し、反応により生成されたイソプレン濃度を測定した。
これらの試験により、細胞可溶化液と、アセチルCoA、マロニルCoA、又はアセチルCoA及びマロニルCoAの両方の存在下で、NADPHの酸化を測定した。この結果により、アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)含有株におけるNADPHの酸化速度は、アセチルCoA及びマロニルCoAの存在下で最も大きくなることが示される(図8を参照されたい)。アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)を欠損している対照株におけるNADPH酸化速度は、アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)含有株と比較して減少し、対照株の酸化速度は、アセチルCoA又はマロニルCoAの存在に依存するものではなかった(図8)。これらの結果は、アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)、HMG−CoAシンターゼ、及びHMG−CoAレダクターゼ活性を複合させるには、マロニルCoA及びアセチルCoAを存在させる必要があることと一致する。HMG−CoAシンターゼ触媒活性は、アセチルCoAの存在に依存することから、アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)活性にはマロニルCoAを存在させる必要があるものと結論付けることができる。これらの結果により、アセトアセチルCoAシンターゼ(nphT7)は、アセトアセチルCoA生産時の基質として両方のマロニルCoAを利用することが明瞭に裏付けされる。イソプレンシンターゼ活性を解析して、イソプレン比生産性(図7を参照されたい)における違いを確認したところ、イソプレンシンターゼ活性の差によるものではなかった(図9)。
MCM521可溶化液を使用し、下流メバロン酸経路をMCM1684に形質導入させた。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する(Gene Bridges、Heidelberg、Germany)。MCM521の下流経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するrbsを改変し、オペロン上流のプロモーターを変更することで改変することができる。染色体上のプロモーター及び/又はrbsを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸合成酵素(ispA)を過剰発現させる。多様なプラスミドpDW34(米国特許第2010/0196977号;図2を参照されたい)を用い、プラスミドpMCM1321を同時電気穿孔した。pDW34変異体のプラスミドは、大腸菌(E. coli)用にコドンを最適化させたファルネセンシンターゼ又は大腸菌(E. coli)用にコドンを最適化させたアモルファジエンシンターゼを、イソプレンシンターゼの代わりに含有する。LB+スペクチノマイシン50ug/mL+カルベニシリン50ug/mLでコロニーを選択する。
(i)材料
TM3培地組成(発酵培地1L当たり):K2HPO4(13.6g)、KH2PO4(13.6g)、MgSO4*7H2O(2g)、クエン酸一水和物(2g)、クエン酸鉄アンモニウム(0.3g)、(NH4)2SO4(3.2g)、酵母エキス(0.2g)、1000X微量金属溶液(1mL)。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム(30%)によりpHを6.8に調整し、及び容量を調整する。次に、0.22μmのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びpH調整後にグルコース10.0g及び抗菌剤を添加する。
ルリア・ベルターニブロス+抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、OD600が0.05になるよう細胞を20mLのTM3培地(50ug/mLのスペクチノマイシン及び50ug/mLのカルベニシリンを含有(250mLのバッフル付き三角フラスコ))により希釈し、34℃かつ200rpmでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには20%(v/v)ドデカン(Sigma−Aldrich)を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する(Newman et.al.,2006)。
pMCM1321を含有している株を、同様のバックグラウンドを持つもののアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子は含まない株と比較したところ、アモルファジエン又はファルネセンの比生産性、収率、CPI及び/又は力価の上昇が観察された。
Newman,J.D.,Marshal,J.L.,Chang,M.C.Y.,Nowroozi,F.,Paradise,E.M.,Pitera,D.J.,Newman,K.L.,Keasling,J.D.,2006.High−level production of amorpha−4,11−diene in a two−phase partitioning bioreactor of metabolically engineered E.coli.Biotechnol.Bioeng.95:684〜691。
Claims (78)
- イソプレンを生産することのできる組み換え微生物であって、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、並びに
a.イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、及び
b.メバロン酸(MVA)経路の1つ以上のポリぺプチド
をコードしている1つ以上の核酸を含み、
前記組み換え微生物を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及びイソプレンの合成が提供される、組み換え微生物。 - マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が、アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子である、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 前記アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子が放線菌由来の遺伝子である、請求項2に記載の組み換え微生物。
- 前記アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子がストレプトミセス(Streptomyces)属由来である、請求項3に記載の組み換え微生物。
- 前記アセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子が、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている、又は配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつマロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードしている、請求項4に記載の組み換え微生物。
- 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドであるか、又はその変異体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属(Pueraria)又はハコヤナギ属(Populus)由来のポリペプチド、又はウラジロハコヤナギ(Populus alba)とヤマナラシ(Populus tremula)の交雑種由来のポリペプチド、又はそれらの変異体由来のポリペプチドである、請求項6に記載の組み換え微生物。
- 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、プエラリア・モンタナ(Pueraria montana)又はクズ(Pueraria lobata)、アメリカヤマナラシ(Populus tremuloides)、ウラジロハコヤナギ(Populus alba)、セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)、及びコットンウッド(Populus trichocarpa)、又はそれらの変異体からなる群から選択される、請求項7に記載の組み換え微生物。
- (b)のMVA経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が異種核酸である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- (b)のMVA経路の1つ以上のポリぺプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が、内在性核酸のコピーである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- MVA経路の前記1つ以上のポリぺプチドが、(a)アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG−CoAを生成する酵素;(b)HMG−CoAをメバロン酸に変換する酵素;(c)メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素;(d)5−ホスホメバロン酸を5−ジホスホメバロン酸に変換する酵素;及び(e)5−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、M.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼ、M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス(Lactobacillus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス(Streptococcus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス(Streptomyces)メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトミセス(Streptomyces)CL190メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、M.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼである、請求項12に記載の組み換え微生物。
- イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ(IDI)のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸(DXP)経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- DXP経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が異種核酸である、請求項15に記載の組み換え微生物。
- DXP経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が内在性核酸のコピーである、請求項15に記載の組み換え微生物。
- DXP経路の前記1つ以上のポリペプチドポリペプチドが、(a)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)、(b)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸リダクトイソメラーゼ(DXR)、(c)4−ジホスホシチジル−2C−メチル−D−エリスリトールシンターゼ(MCT)、(d)4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトールキナーゼ(CMK)、(e)2C−メチル−D−エリスリトール−2,4−シクロ二リン酸シンターゼ(MCS)、(f)1−ヒドロキシ−2−メチル−2−(E)−ブテニル−4−二リン酸シンターゼ(HDS)、及び(g)1−ヒドロキシ−2−メチル−2−(E)−ブテニル−4−二リン酸レダクターゼ(HDR)から選択される、請求項15に記載の組み換え微生物。
- 前記DXP経路のポリペプチドがDXSである、請求項18に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が、1つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が、細胞の染色体に組み込まれる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物がバクテリア細胞である、請求項23に記載の組み換え微生物。
- 前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項24に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が、大腸菌(E. coli)、L.アシドフィルス(L. acidophilus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、P.シトレア(P. citrea)、枯草菌(B. subtilis)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.レンタス(B. lentus)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.クラウシイ(B. clausii)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.コアギュランス(B. coagulans)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.ロータス(B. lautus)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、S.アルバス(S. albus)、S.リビダンス(S. lividans)、S.セリカラー(S. coelicolor)、S.グリセウス(S. griseus)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、及びP.アルカリゲネス(P. alcaligenes)細胞からなる群から選択される、請求項25に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が大腸菌(E. coli)細胞である、請求項26に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞がL.アシドフィルス(L. acidophilus)細胞である、請求項26に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞がコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)細胞である、請求項26に記載のバクテリア細胞。
- 前記微生物が藻類細胞である、請求項23に記載の組み換え微生物。
- 前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類(chlorarachniophytes)、ミドリムシ類(euglenids)、クロミスタ類(chromista)、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項30に記載の藻類細胞。
- 前記微生物が真菌細胞である、請求項23に記載の組み換え微生物。
- 前記真菌細胞が糸状菌である、請求項32に記載の真菌細胞。
- 前記微生物が酵母細胞である、請求項23に記載の組み換え微生物。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、又はカンジダ属(Candida sp.)からなる群から選択される、請求項34に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項35に記載の酵母細胞。
- イソプレノイドを生産することのできる組み換え微生物であって、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、並びに
a.ポリプレニルピロリン酸シンターゼ、及び
b.メバロン酸(MVA)経路の1つ以上のポリぺプチド
をコードしている1つ以上核酸を含み、
前記組み換え微生物を適切な培地で培養することで、前記ポリぺプチドの生産及び回収可能な量のイソプレノイドの合成が提供される、組み換え微生物。 - (b)のMVA経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸が異種核酸である。請求項37に記載の組み換え微生物。
- MVA経路の前記1つ以上のポリぺプチドが、(a)アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG−CoAを生成する酵素;(b)HMG−CoAをメバロン酸に変換する酵素;(c)メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素;(d)5−ホスホメバロン酸を5−ジホスホメバロン酸に変換する酵素;及び(e)5−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素からなる群から選択される、請求項37又は38のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、M.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼ、M.バートニイ(M. burtonii)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス(Lactobacillus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス(Streptococcus)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス(Streptomyces)メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス(Streptomyces)CL190メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される、請求項37〜39のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素が、M.マゼイ(M. mazei)メバロン酸キナーゼである、請求項40に記載の組み換え微生物。
- イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ(IDI)のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む、請求項37〜41のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が、誘導型プロモーター又は構成型プロモーター下に配置される、請求項37〜42のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が1つ以上のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項37〜43のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記1つ以上の異種核酸が、細胞の染色体に組み込まれる、請求項37〜43のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記微生物がバクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項37〜45のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物がバクテリア細胞である、請求項46に記載の組み換え微生物。
- 前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項47に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が、大腸菌(E. coli)、L.アシドフィルス(L. acidophilus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、P.シトレア(P. citrea)、枯草菌(B. subtilis)、B.リケニフォルミス(B. licheniformis)、B.レンタス(B. lentus)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、B.アルカロフィルス(B. alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.クラウシイ(B. clausii)、B.ハロデュランス(B. halodurans)、B.メガテリウム(B. megaterium)、B.コアギュランス(B. coagulans)、B.サーキュランス(B. circulans)、B.ロータス(B. lautus)、B.チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、S.アルバス(S. albus)、S.リビダンス(S. lividans)、S.セリカラー(S. coelicolor)、S.グリセウス(S. griseus)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、及びP.アルカリゲネス(P. alcaligenes)細胞からなる群から選択される、請求項47に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が大腸菌(E. coli)細胞である、請求項49に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞がL.アシドフィルス(L. acidophilus)細胞である、請求項49に記載のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)細胞である、請求項49に記載のバクテリア細胞。
- 前記微生物が藻類細胞である、請求項46に記載の組み換え微生物。
- 前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類(chlorarachniophytes)、ミドリムシ類(euglenids)、クロミスタ類(chromista)、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項53に記載の藻類細胞。
- 前記微生物が真菌細胞である、請求項46に記載の組み換え微生物。
- 前記真菌細胞が糸状菌である、請求項55に記載の真菌細胞。
- 前記微生物が酵母細胞である、請求項46に記載の組み換え微生物。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、又はカンジダ属(Candida sp.)からなる群から選択される、請求項57に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項58に記載の酵母細胞。
- 前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項37〜59のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記イソプレノイドがセスキテルペンである、請求項60に記載の組み換え微生物。
- 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、ファルネセン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン(terpindene)、及びバレンセンからなる群から選択される、請求項37〜61のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- イソプレンの生産方法であって、
a.
(i)マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、並びに
(ii)イソプレンシンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、及び(iii)メバロン酸(MVA)経路の1つ以上のポリぺプチド、をコードしている1つ以上の核酸
を含む組み換え微生物を培養する工程と、
b.イソプレンを生産させる工程と
を含む方法。 - 前記組み換え微生物により生産された前記イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項63に記載の方法。
- マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている前記1つ以上の核酸がアセトアセチルCoAシンターゼ遺伝子である、請求項63に記載の方法。
- 前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項63に記載の方法。
- MVA経路の前記1つ以上のポリぺプチドが、(a)アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG−CoAを生成する酵素;(b)HMG−CoAをメバロン酸に変換する酵素;(c)メバロン酸を5−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素;(d)5−ホスホメバロン酸を5−ジホスホメバロン酸に変換する酵素;及び(e)5−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素からなる群から選択される、請求項63に記載の方法。
- イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ(IDI)のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む、請求項63に記載の方法。
- 前記組み換え微生物が、1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸(DXP)経路の1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸を更に含む、請求項63に記載の方法。
- 前記微生物がバクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞又は酵母細胞である、請求項63に記載の方法。
- 前記微生物がバクテリア細胞である、請求項70に記載の方法。
- 前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項71に記載の方法。
- 前記バクテリア細胞が大腸菌(E. coli)細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記バクテリア細胞がL.アシドフィルス(L. acidophilus)細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記バクテリア細胞がコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)細胞である、請求項72に記載のバクテリア細胞。
- 前記微生物が酵母細胞である、請求項70に記載の方法。
- 前記酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項76に記載の方法。
- イソプレノイドの生産方法であって、
a.
(i)マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成することのできるポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸、並びに
(ii)ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドであって、異種核酸によりコードされるポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、及び(iii)メバロン酸(MVA)経路の1つ以上のポリぺプチド、をコードしている1つ以上の核酸
を含む組み換え微生物を培養する工程と、
b.前記イソプレノイドを生産させる工程と
を含む方法。
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