WO2016194685A1 - アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物 - Google Patents

アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物 Download PDF

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奈央樹 坂口
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Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant composition containing aluminum and a vaccine composition containing the same.
  • the immune system is a defense mechanism that protects the living body from diseases and the like by eliminating foreign substances and abnormal cells that have entered the living body.
  • An adjuvant is a substance used for enhancing the effect of a vaccine.
  • the function of the immune system is generally expressed through two mechanisms, humoral immunity and cellular immunity.
  • Humoral immunity is a mechanism centered on components that are dissolved in serum such as antibodies and complement.
  • Antibody induction is important from a vaccine perspective and is usually expressed as follows. That is, exogenous antigens such as bacteria that have entered the living body are taken into antigen-presenting cells by endocytosis, digested by proteolytic enzymes in endosomes in the antigen-presenting cells, and decomposed into peptide fragments. The peptide fragment binds to a major histocompatibility complex (MHC) class II molecule, and the resulting complex is presented to CD4-positive T cells on the surface of antigen-presenting cells, which activates CD4-positive T cells.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the activated CD4 positive T cells release cytokines and the like, so that antibodies are finally produced from the B cells.
  • the MHC class II molecule is expressed on macrophages, dendritic cells, activated T cells, B cells and the like.
  • materials containing aluminum have an old history and are widely used throughout the world. Examples thereof include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate (alum), aluminum chloride, and the like, and these are sometimes simply referred to as alum.
  • cellular immunity is a mechanism centered on cells responsible for foreign body exclusion such as macrophages, cytotoxic T cells (CTL), natural killer cells, and the like.
  • CTL cytotoxic T cells
  • Induction of cell-mediated immunity can attract virus-infected cells, cancer cells, and the like, and thus has attracted much attention from the viewpoint of treatment by immunity.
  • CTL induction is expected to be realized from application to cancer immunotherapy. Induction of CTL is usually expressed as follows. That is, endogenous antigens such as proteins produced in virus-infected cells and cancer cells are ubiquitinated and then decomposed into peptides by the proteasome.
  • the decomposed peptide binds to MHC class I molecules, and the resulting complex is presented to CD8 positive T cells on the surface of antigen presenting cells, thereby activating CD8 positive T cells. Then, activated CD8-positive T cells are differentiated into cytotoxic T cells (CTL).
  • CTL cytotoxic T cells
  • the MHC class I molecule is present on the surface of almost all nucleated cells and platelets.
  • an object of the present invention is to provide an adjuvant that is highly safe and that effectively induces cellular immunity through cross-presentation.
  • the present inventor conducted extensive research. As a result, a substance that contains aluminum is used in combination with a carrier that is sensitive to pH as a substance having a stimulus that activates innate immunity (hereinafter also referred to simply as “a substance that activates innate immunity”). Thus, the present inventors have found that the above problems can be solved, and have completed the present invention.
  • an adjuvant composition comprising a pH-sensitive carrier and a substance containing aluminum; (2) The adjuvant composition according to (1), wherein the substance containing aluminum is at least one selected from the group consisting of aluminum hydroxide and aluminum phosphate; (3)
  • the pH sensitive carrier is a group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof
  • At least one pH sensitive compound selected from: Phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms, sorbitan fatty acid ester having only an acyl group having 16 to 18 carbon atoms, glycerol monooleate
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an adjuvant composition according to one embodiment of the present invention and a vaccine composition containing the same.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of evaluating the induction of cellular immunity (CTL) by the ELIspot method of a vaccine composition and a comparative sample (composition). Cells that produced IFN ⁇ in response to SIINFEKL, an MHC class I-restricted peptide, were detected by spot formation.
  • CTL cellular immunity
  • A is antigen only
  • B is a mixture of antigen and tocopherol
  • C is a mixture of antigen and tocopherol acetate
  • D is a mixture of antigen and alum
  • E is an antigen, tocopherol and pH.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of comparison with CpG-ODN and evaluation of antigen specificity of induced cellular immunity by ELIspot method.
  • A) is a mixture of antigen and alum
  • B) is a mixture of antigen, alum and pH sensitive carrier
  • C) is a mixture of antigen and CpG-ODN, and immunized with the composition obtained It is a result.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of examining the amount of alum required to induce cellular immunity by the ELIspot method.
  • the pH-sensitive carrier was a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid, and alum was aluminum hydroxide.
  • (A) is antigen only
  • (B) is a mixture of antigen and 10 ⁇ g alum
  • (C) is a mixture of antigen, 100 ⁇ g alum and pH sensitive carrier
  • (D) is an antigen, 10 ⁇ g alum and pH sensitive carrier.
  • E) is a mixture of an antigen and 1 ⁇ g of alum and a pH-sensitive carrier
  • (F) is a mixture of the antigen, 0.1 ⁇ g of alum and a pH-sensitive carrier
  • Is the result of FIG. 5 is a graph showing the results of examining the amount of pH-sensitive carrier necessary for inducing cellular immunity by the ELIspot method.
  • the pH-sensitive carrier was based on a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid, and the complex was diluted to a predetermined concentration and used for each evaluation.
  • (A) is antigen only
  • (B) is a mixture of antigen and alum
  • (C) is a mixture of antigen, alum and pH sensitive carrier
  • (D) is an antigen and alum, a pH sensitive carrier diluted 10-fold.
  • E) is a composition obtained by mixing an antigen and alum with a pH-sensitive carrier diluted 100-fold
  • (F) is a composition obtained by mixing an antigen, alum and a pH-sensitive carrier diluted 1000-fold. It is the result when immunized.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of verifying induction of humoral immunity by the combined use of alum and a pH-sensitive carrier. Induction of humoral immunity was evaluated by IgG antibody titer.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of examining the types of alum suitable as components of a vaccine composition for inducing cellular immunity by the ELIspot method.
  • the pH-sensitive carrier was a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid, and alum was aluminum hydroxide.
  • (A) is a mixture of antigen and 10 ⁇ g of aluminum phosphate
  • (B) is a mixture of antigen, 1 ⁇ g of aluminum phosphate and pH sensitive carrier
  • (C) is a pH sensitive of antigen, 0.1 ⁇ g of aluminum phosphate and pH.
  • (D) is a mixture of antigen and 10 ⁇ g of potassium aluminum sulfate
  • (E) is a mixture of antigen, 1 ⁇ g of potassium aluminum sulfate and pH sensitive carrier
  • (F) is a mixture of antigen and 0.1 ⁇ g of sulfate. It is a result at the time of immunizing with the composition obtained by mixing potassium aluminum and a pH sensitive carrier.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of evaluating the influence of alum on the membrane destruction function promoting effect of alum when alum and a pH-sensitive carrier are mixed.
  • (A) is the type of alum
  • (B) is the result of evaluation regarding the amount of alum.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of examining the influence of alum on the membrane fusion function promoting effect of the pH-sensitive carrier.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluating the influence of alum on the membrane destruction function promoting effect of alum when the composition of the pH-sensitive carrier, in particular, the amount of deoxycholic acid is changed.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of evaluating the induction of cellular immunity by the vaccine composition by the ELIspot method in the intradermal administration route.
  • the pH-sensitive carrier was a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid, and alum was aluminum hydroxide.
  • (A) is a result of subcutaneous administration of a composition in which an antigen and alum are mixed
  • (B) is a result of subcutaneous administration of a composition in which an antigen, alum and a pH-sensitive carrier are mixed.
  • D) is the result of intradermal administration of a composition in which an antigen, alum and a pH-sensitive carrier are mixed.
  • (E) to (H) are evaluations of antigen specificity, and are attempts to form a spot without adding SIINFEKL peptide.
  • (E) is a result of subcutaneous administration of a composition in which an antigen and alum are mixed
  • (F) is a result of subcutaneous administration of a composition in which an antigen, alum and a pH-sensitive carrier are mixed.
  • H is the result of intradermal administration of a composition in which an antigen, alum and a pH-sensitive carrier are mixed.
  • an adjuvant composition comprising a pH sensitive carrier and a substance containing aluminum.
  • the adjuvant composition provides an adjuvant capable of effectively inducing cellular immunity through cross presentation.
  • the adjuvant composition provides a highly safe adjuvant.
  • the adjuvant composition according to this embodiment includes a pH-sensitive carrier (hereinafter sometimes simply referred to as “carrier”, “aggregate”, or “complex”) and a substance containing aluminum. That is, the adjuvant composition of this embodiment includes a substance containing aluminum as a substance having a stimulus that activates innate immunity (a substance that activates innate immunity).
  • the adjuvant composition according to this embodiment includes a pH sensitive carrier, a substance containing aluminum, and an aqueous solvent. Therefore, the adjuvant composition according to this embodiment is preferably in a form in which a pH-sensitive carrier and a substance containing aluminum are dispersed in an aqueous solvent.
  • the adjuvant composition according to the present embodiment is such that the pH-sensitive carrier is deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acid, glycodeoxychol.
  • At least one pH-sensitive compound selected from the group consisting of acids, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof, phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, and having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms
  • at least one amphiphile is selected from the group consisting of ⁇ - tocopherol, include, expressing membrane disruption function promoting effect.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an adjuvant composition according to one embodiment of the present invention and a vaccine composition containing the same.
  • the adjuvant composition 4 includes an amphiphilic substance 1, a pH sensitive compound 2, and a substance 3 containing aluminum which is a substance having a stimulus for activating innate immunity.
  • the substance 3 containing aluminum is associated with the pH-sensitive compound 2 in the hydrophobic part constituting the amphiphilic substance 1.
  • the adjuvant composition 4 can also be referred to as an adjuvant complex.
  • the substance 3 containing aluminum is present independently of the pH sensitive carrier comprising the amphiphilic substance 1 and the pH sensitive compound 2.
  • the vaccine composition 6 includes an adjuvant composition 4 and an antigen 5.
  • the antigen 5 may be included in the adjuvant composition 4 according to the above two forms, or may exist independently.
  • the vaccine composition 6 in which the antigen 5 is included in the adjuvant complex 4 can also be referred to as a vaccine complex.
  • the “adjuvant composition” means a substance containing a pH-sensitive carrier and a substance containing aluminum, and the form thereof is not particularly limited. That is, the “adjuvant composition” may be a mixture of a pH-sensitive carrier and a substance containing aluminum, or a substance containing or containing a substance containing aluminum in a pH-sensitive carrier (adjuvant complex). In the present specification, both are collectively referred to as an “adjuvant composition”.
  • the “vaccine composition” means a composition containing an adjuvant composition and an antigen, and the form thereof is not particularly limited. That is, the “vaccine composition” may be a mixture of two or more selected from the group consisting of the components of the adjuvant composition and the antigen, or the adjuvant complex carries or includes the antigen. In the present specification, both are collectively referred to as a “vaccine composition”.
  • the pH-sensitive carrier is sensitive to pH, and has a function of transporting intracellular antigens to the cytoplasmic substrate when the pH becomes acidic.
  • the pH-sensitive carrier is not particularly limited, but deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof
  • At least one pH-sensitive compound selected from the group consisting of phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms, and 16 to 16 carbon atoms From the group consisting of sorbitan fatty acid esters having only 18 acyl groups, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil and ⁇ -tocopherol Comprising at least one amphiphile
  • pH sensitive carrier As the pH sensitive carrier according to the present embodiment, “pH sensitive carrier” described in International Publication No. 2013/180253 filed on May 24, 2013 can be used in the same manner.
  • the pH-sensitive carrier is considered to be formed by association of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance at a physiological pH or higher. More specifically, the pH-sensitive carrier is considered to be formed by associating a pH-sensitive compound with a hydrophobic portion constituting an amphiphilic substance.
  • the association format of the pH-sensitive carrier is speculation, and the pH-sensitive carrier is not limited to the association format.
  • “Membrane destruction function promotion effect” means a function of causing dissolution in a dissolution test.
  • the dissolution test in this specification refers to adding a liposome (dispersion) containing an aqueous solution containing a quenching substance and a fluorescent substance, and an evaluation sample dispersion to an aqueous solution adjusted to a predetermined pH, This is a test for measuring the fluorescence intensity of the aqueous solution after incubating the aqueous solution at 37 ° C. for 90 minutes or 30 minutes. By this method, the amount of the fluorescent substance eluted from the liposome can be measured, and the membrane breaking function of the pH sensitive carrier can be confirmed. In addition, about a dissolution test, it demonstrates in detail in the Example mentioned later.
  • “expressing a membrane destruction function promoting effect” means (1) in the dissolution test, the dissolution rate at a predetermined pH lower than physiological pH is higher than the dissolution rate at physiological pH, and the increase width Is larger than the increase in the case of experimenting with the pH sensitive compound alone, and (2) in the dissolution test at a predetermined pH lower than the physiological pH, the pH sensitive compound and the amphiphile are complexed ( It means that the elution rate when the pH-sensitive carrier is formed is greater than the sum of the elution rate of the pH-sensitive compound alone and the elution rate of the amphiphile alone.
  • a membrane destruction function promoting effect means that a pH-sensitive carrier (a complex of a pH-sensitive compound and an amphiphile) in an elution test between pH 7.4 and pH 5.0 or pH 4.5.
  • Elution rate Lc satisfies the following relationship with the elution rate La of the pH-sensitive compound alone and the elution rate Lb of the amphiphilic substance alone. That is, said (1) is represented by following formula (1), and said (2) is represented by following formula (2).
  • the elution rate at pH 7.4 is expressed as Lc 7.4 , La 7.4 , and Lb 7.4 , respectively, and the elution rate at pH 5.0 or 4.5 is expressed as Lc x , It is expressed as La x and Lb x .
  • ⁇ only needs to exceed 0, but is preferably 2 or more, more preferably 2.5 or more, further preferably 5 or more, and 10 or more. It is particularly preferable that it is 30 or more.
  • ⁇ ′ only needs to exceed 0, but is preferably 2 or more, more preferably 2.5 or more, and further preferably 3 or more. It is even more preferably 5 or more, particularly preferably 10 or more, and most preferably 15 or more.
  • a pH sensitive carrier in which ⁇ and ⁇ ′ in the above formula (1) and the above formula (2) are each 2 or more (preferably 5 or more), and containing bile acid and lipid. preferable.
  • ⁇ and ⁇ ′ in the above formula (1) and the above formula (2) are each 2 or more (preferably 5 or more), and glycyrrhizic acid or glycyrrhetinic acid, And a pH sensitive carrier comprising lipid.
  • physiological pH in this specification means pH in normal tissue or normal body fluid.
  • the physiological pH is usually 7.4, but varies slightly ( ⁇ 0.1) depending on normal tissues and normal body fluids.
  • the “predetermined pH less than physiological pH” may be less than pH 7.4, preferably pH 3.0 or more, less than pH 7.4, more preferably pH 4.0 or more, less than pH 7.3,
  • the pH is preferably 4.5 or more and less than 7.0.
  • the mechanism by which the pH-sensitive carrier exerts the effect of promoting the membrane destruction function is not clear, but is presumed as follows.
  • the present invention is not limited by the following estimation.
  • the pH-sensitive carrier is considered to have an effect of promoting the membrane destruction function as a result of a change in the form of association between the pH-sensitive compound and the amphiphile when the surrounding environment is below physiological pH.
  • a pH-sensitive carrier and a biological membrane for example, a cell membrane, a vesicle membrane, etc.
  • the association form of the pH-sensitive carrier changes, After contact with the membrane, it is presumed that the membrane structure change of the biological membrane is also induced by the change. That is, the pH sensitive carrier induces a membrane structure change of the biological membrane.
  • a pH-sensitive compound in the pH-sensitive carrier is destabilized in the structure of the carrier by changing the pH to weakly acidic, so that the pH-sensitive carrier is rearranged from the biological membrane present in the system.
  • a pH-sensitive compound is considered to be a molecule that changes the state of hydrophobic association by protonation when the pH changes to weak acidity. That is, it can be said that a hydrophobic association containing a pH-sensitive compound can exhibit a membrane breaking function by responding to a weakly acidic environment.
  • Membrane breakdown refers to such a change in the membrane structure, and it is not necessary that all membrane constituent components are separated or decomposed. When such “membrane destruction” occurs, components that can be contained inside the membrane of the biological membrane (eg, endosome) are eluted out of the biological membrane (eg, cytoplasmic substrate).
  • the pH-sensitive carrier has a dissolution rate in a dissolution test of less than 20% at pH 7.4 and greater than 20% at pH 4.0.
  • the dissolution rate in the dissolution test is more preferably less than 20% at pH 6.5 and more than 20% at pH 4.0.
  • the elution rate at pH 7.4 or pH 6.5 is more preferably 15% or less, and further preferably 10% or less.
  • the elution rate at pH 4.0 is more preferably 40% or more, and further preferably 50% or more.
  • the dissolution rate in the dissolution test is preferably less than 20% at pH 7.4 and greater than 20% at pH 5.0.
  • the adjuvant composition of this embodiment may use a pH-sensitive carrier having the effect of promoting the membrane destruction function as described above.
  • the pH-sensitive carrier can express a membrane fusion function promoting effect as well as a membrane disrupting function promoting effect.
  • membrane fusion function means a function of causing membrane fusion in a membrane fusion test.
  • the membrane fusion test in the present specification is performed by adding a liposome (dispersion) in which two kinds of fluorescent substances are incorporated into a bilayer membrane and an evaluation sample dispersion to an aqueous solution adjusted to a predetermined pH, This is a test for measuring the fluorescence intensity of the aqueous solution after incubating the aqueous solution at 37 ° C. for 60 minutes. By this method, changes in energy resonance transfer of two types of fluorescent substances incorporated in the liposome can be measured, and the membrane fusion function of the pH-sensitive carrier can be confirmed.
  • the membrane fusion test will be described in detail in the examples described later.
  • expressing a membrane fusion function promoting effect means that in a membrane fusion test, the fusion rate at a predetermined pH lower than physiological pH is higher than the fusion rate at physiological pH, and the range of the increase is pH sensitive. It means satisfying that it is larger than the increase in the case of experimenting with the compound alone. More specifically, expression of a membrane fusion function promoting effect means that the fusion rate of a pH sensitive carrier (a complex of a pH sensitive compound and an amphiphile) in a membrane fusion test at pH 7.4 and pH 5.0.
  • Rc (%) means the one satisfying the relationship of the fusion rate Ra (%) of the pH sensitive compound alone and the following formula (3). In the following formulae, the fusion rate at pH 7.4 is expressed as Rc 7.4 and Ra 7.4 , respectively, and the fusion rate at pH 5.0 is expressed as Rc x and Ra x , respectively.
  • ⁇ R only needs to exceed 0, but is preferably 2 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 or more.
  • the pH-sensitive carrier exhibits a membrane fusion function promoting effect at a weakly acidic pH (a predetermined pH lower than physiological pH). These mechanisms are not clear, but are considered to be the same mechanism as the above-described effect of promoting the film destruction function.
  • the present invention is not limited by the estimation.
  • the pH-sensitive carrier of the present invention changes the association form of the pH-sensitive compound and the amphiphile and rearranges it with the biological membrane present in the system. Therefore, it is estimated that membrane fusion occurs.
  • a component eg, antigen
  • an antigen is surrounded by an endosome, which is a type of biological membrane, and taken up by a cell (antigen-presenting cell or the like). Thereafter, the pH inside the endosome is lowered by the action of the proton pump. In addition, endosomes fuse with lysosomes containing hydrolases and the antigen is degraded (which can then be complexed with MHC class II molecules and presented to CD4 positive T cells). For this reason, most antigens are not delivered into the cytoplasmic matrix.
  • an antigen for example, exogenous antigen
  • an antigen can be delivered to the cytoplasmic substrate. More specifically, when an antigen is surrounded by an endosome together with a pH-sensitive carrier and taken up by a cell, it is similarly led to a reduced pH environment. As the pH decreases (acidification), the pH-sensitive compound destabilizes the pH-sensitive carrier, and membrane rearrangement occurs between the endosome and the pH-sensitive carrier. As a result, a membrane disrupting function (a membrane disrupting function that is expressed together with the membrane fusion function) by the pH-sensitive carrier occurs.
  • antigens can be delivered from the endosome to the cytoplasmic substrate.
  • the antigen can be transported to the cytoplasmic substrate as long as it is incorporated into the endosome together with the pH-sensitive carrier, so it is used in the form of a composition in which the antigen and the pH-sensitive carrier are mixed.
  • the antigen may be used in a form supported or included in a pH sensitive carrier.
  • the pH-sensitive compound is composed of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof as described above. It is preferably at least one selected from the group.
  • the “salts” are not particularly limited, and examples thereof include alkali metal salts such as lithium, sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as magnesium, calcium and barium; ammonium salts and the like. These pH sensitive compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the pH-sensitive compound is a group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, and salts thereof. More preferably, it is at least one selected from.
  • the pH-sensitive compound is a group consisting of deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid or a salt thereof. More preferably, it is at least one selected from the group consisting of deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, or a salt thereof, and particularly preferably.
  • Bile acids Deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids and glycodeoxycholic acids preferably used as pH-sensitive compounds are collectively referred to as bile acids.
  • Bile acid has been known as a typical steroid derivative since the 1920s and is used in the field of bacteriology. Bile acids form a complex with cholesterol, lipids, and fat-soluble vitamins in the human body, and have a function of assisting in their absorption.
  • the pH sensitive compound is preferably contained in a proportion of 10 mol or more, more preferably in a proportion of 10 to 640 mol, and more preferably in a proportion of 20 to 320 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. Is more preferable, and it is particularly preferable to be contained in a proportion of 20 to 160 mol.
  • the content of the pH sensitive compound with respect to 100 mol of the amphiphilic substance is also referred to as “complexed amount of pH sensitive compound”.
  • the amphiphilic substance includes phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms, and an acyl group having 16 to 18 carbon atoms. It is preferably at least one selected from the group consisting of sorbitan fatty acid esters having only glycerol, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil, and ⁇ -tocopherol. These amphiphiles may be used alone or in combination of two or more.
  • the “carbon number” in the amphiphilic substance means the carbon number of the fatty acid component (acyl group) constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
  • the phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms is preferably a diacylphosphatidylcholine having a saturated acyl group.
  • a diacylphosphatidylcholine having a saturated acyl group for example, didecanoylphosphatidylcholine (DDPC; 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3- Phosphatidylcholine) and dilauroylphosphatidylcholine (DLPC; 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine).
  • DDPC didecanoylphosphatidylcholine
  • DLPC 1,2-dilauroylphosphatidylcholine
  • phosphatidylcholine may be naturally derived or synthesized by a known method, or a commercially available product can be used.
  • polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms examples include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), polyoxyethylene sorbitan myristate (polyoxyethylene sorbitan monoester). Myristate), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (polyoxyethylene sorbitan palmitate), polyoxyethylene sorbitan monostearate (polyoxyethylene sorbitan monostearate), polyoxyethylene sorbitan monooleate (polyoxy) Ethylene sorbitan monooleate).
  • the polymerization degree of polyoxyethylene is not particularly limited, but the total polymerization degree of each polyoxyethylene chain added to sorbitan is preferably 10 to 200, more preferably 15 to 100, and 20 More preferably, it is ⁇ 50.
  • the polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used. Examples of commercially available products of polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester include Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate), Tween 60 (polyoxyethylene sorbitan monostearate), What is marketed as Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) can be preferably used. Among these, it is preferable to use polyoxyethylene sorbitan monofatty acid esters having 16 to 18 carbon atoms (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80).
  • sorbitan fatty acid esters having only an acyl group having 16 to 18 carbon atoms include sorbitan monopalmitate (sorbitan monopalmitate), sorbitan monostearate (sorbitan monostearate), sorbitan monooleate (sorbitan monooleate). Sorbitan monofatty acid esters such as sorbitan tripalmitate (sorbitan tripalmitate), sorbitan tristearate (sorbitan tristearate), sorbitan trioleate such as sorbitan trioleate (sorbitan trioleate), etc. Can be mentioned.
  • sorbitan fatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used.
  • sorbitan fatty acid esters examples include SPAN40 (sorbitan palmitate), SPAN60 (sorbitan stearate), SPAN80 (sorbitan oleate), SPAN65 (sorbitan tristearate), and SPAN85 (sorbitan trioleate). What is marketed as ester is preferably used. Of these, SPAN80, SPAN65, and SPAN85 are preferably used.
  • Glycerol monooleate (glyceryl monooleate), glycerol dilaurate (glyceryl dilaurate), glycerol distearate (glyceryl distearate), and glycerol dioleate (glyceryl dioleate) are ester-bonded to one or two molecules of fatty acid.
  • the site to which the fatty acid binds is not particularly limited.
  • a fatty acid may be ester-bonded to the C1 position or C2 position of glycerol.
  • glycerol dilaurate, glycerol distearate, and glycerol dioleate which are diacylglycerols
  • fatty acids may be ester-bonded at the C1 and C2 positions, or the C1 and C3 positions of glycerol.
  • glycerol dilaurate is preferably ⁇ , ⁇ '-dilaurin in which the C1 and C3 positions are substituted.
  • diacylglycerol substituted at the C1 position and the C2 position is preferable.
  • synthetic products or commercially available products may be used.
  • Polyoxyethylene castor oil is obtained by adding polyoxyethylene to castor oil.
  • the degree of polymerization of polyoxyethylene is not particularly limited, but is preferably 3 to 200, more preferably 5 to 100, and still more preferably 10 to 50.
  • As the polyoxyethylene castor oil a synthetic product or a commercially available product may be used.
  • PEG (10) castor oil having a polyoxyethylene polymerization degree of 10 is preferably used.
  • ⁇ -tocopherol a naturally-derived or synthesized method may be used, or a commercially available product may be used.
  • phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan monooleate, polyoxyethylene castor oil and ⁇ -More preferably selected from the group consisting of tocopherols, dilauroyl phosphatidylcholine, didecanoyl phosphatidylcholine, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan monooleate, polyoxyethylene castor oil and More preferably, it is selected from the group consisting of ⁇ -tocopherol.
  • the pH-sensitive carrier can express a membrane destruction function promoting effect at a desired pH by a combination of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance.
  • the pH at which the effect of promoting the membrane destruction function of the pH-sensitive carrier begins to appear varies depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. This is considered to originate from the fact that the pKa differs depending on the pH-sensitive compound, and further, the mode of association formation with the amphiphilic substance differs depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. Therefore, by appropriately changing the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance, it is possible to select a pH at which the function is expressed, and it is possible to set the delivery in detail.
  • combinations of pH-sensitive compounds and amphiphiles include cholic acid and DLPC, deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic Acid and Tween 60, Deoxycholic acid and Tween 80, Deoxycholic acid and SPAN40, Deoxycholic acid and SPAN60, Deoxycholic acid and SPAN80, Deoxycholic acid and SPAN65, Deoxycholic acid and SPAN85, Deoxycholic acid and SPAN85, Deoxycholic acid, Deoxycholic Acid and glycerol monooleate, deoxycholic acid and glycerol distearate, deoxycholic acid and di Glycerolate, deoxycholic acid and glycerol dilaurate ( ⁇ , ⁇ '-dilaurin), deoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil, chenodeoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil,
  • cholic acid and DLPC deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic acid and Tween 60, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and SPAN 40 , Deoxycholic acid and SPAN 60, deoxycholic acid and SPAN 80, deoxycholic acid and SPAN 65, deoxycholic acid and SPAN 80, deoxycholic acid and SPAN 85, deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol, deoxycholic acid and glycerol monooleate, deoxychol Acid and polyoxyethylene castor oil, chenodeoxycholic acid and DLPC, hyodeoxyco Luric acid and DLPC, Glyodeoxycholic acid and DLPC, Ursodeoxycholic acid and DDPC, Ursodeoxycholic acid and DLPC
  • cholic acid and DLPC deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic acid and Tween 60, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and SPAN 40 , Deoxycholic acid and SPAN 60, deoxycholic acid and SPAN 80, deoxycholic acid and SPAN 65, deoxycholic acid and SPAN 80, deoxycholic acid and SPAN 85, deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol, deoxycholic acid and glycerol monooleate, deoxychol Acid and polyoxyethylene castor oil, chenodeoxycholic acid and DLPC, hyodeoxy Lumpur acid and DLPC, glycodeoxycholic acid and DLPC, ursodeoxycholic acid and DDPC, ursodeoxycholic acid and DLPC,
  • the adjuvant composition of the present invention comprises a pH-sensitive carrier composed of the above-mentioned amphiphile and a pH-sensitive compound, and a substance having a stimulus that activates innate immunity (hereinafter, “substance that activates innate immunity”). And a substance containing aluminum.
  • a substance containing aluminum is one type of substance that activates innate immunity.
  • a substance that activates innate immunity means a substance that is recognized by a structural pattern recognition receptor or that stimulates immunocompetent cells to bring the immunocompetent cells into an active state.
  • alum is used as a general term for adjuvants containing aluminum. Therefore, “alum” also means “a substance containing aluminum”.
  • the aluminum-containing substance used in the present invention is not particularly limited as long as cellular immunity can be induced by use in combination with a pH-sensitive carrier, but is preferably an aluminum salt, such as aluminum hydroxide ( Al (OH) 3 ), aluminum phosphate (AlPO 4 ), aluminum sulfate (Al 2 (SO 4 ) 3 ), potassium aluminum sulfate (alum, AlK (SO 4 ) 2 ⁇ 12H 2 O), aluminum chloride (AlCl 3) ) And the like.
  • AlPO 4 aluminum phosphate
  • Al 2 (SO 4 ) 3 aluminum sulfate
  • potassium aluminum sulfate alum, AlK (SO 4 ) 2 ⁇ 12H 2 O
  • AlCl 3 aluminum chloride
  • the substance containing aluminum is aluminum hydroxide.
  • Aluminum hydroxide and aluminum phosphate are insoluble in water. Therefore, when used in an adjuvant composition, it is preferably dispersed in a dispersion medium. By using such aluminum hydroxide and / or aluminum phosphate, It can be a gel type adjuvant.
  • a commercially available aluminum compound can be used as the substance containing aluminum.
  • aluminum hydroxide examples include “aluminum hydroxide” manufactured by Sigma-Aldrich, “AlumVax Hydroxide 2%” manufactured by OZ BIOSCIENCES, “Alhydrogel adjuvant 2%” manufactured by InvivoGen, and the like.
  • Alhydrogel adjuvant 2% examples include “AlumVax Hydroxide 2%” and “Alhydrogel adjuvant 2%” are forms in which aluminum is dispersed in an aqueous solution at a concentration of about 10 mg / mL in terms of metal.
  • aluminum phosphate examples include “aluminum phosphate” manufactured by Sigma-Aldrich, “AlumVax Phosphate 2%” manufactured by OZ BIOSCIENCES, “Adju-Phos” manufactured by Alpha Diagnostic International, Inc, and the like.
  • Al phosphates examples include “aluminum phosphate” manufactured by Sigma-Aldrich, “AlumVax Phosphate 2%” manufactured by OZ BIOSCIENCES, “Adju-Phos” manufactured by Alpha Diagnostic International, Inc, and the like.
  • Al phosphates examples include “aluminum phosphate” manufactured by Sigma-Aldrich, “AlumVax Phosphate 2%” manufactured by OZ BIOSCIENCES, “Adju-Phos” manufactured by Alpha Diagnostic International, Inc, and the like.
  • Adju-Phos is a form in which aluminum is dispersed in an aqueous solution at a concentration of about 5 mg / mL in terms of metal.
  • aluminum sulfate “aluminum sulfate” manufactured by Sigma-Aldrich can be used.
  • potassium aluminum sulfate examples include “alum crystals” manufactured by InvivoGen.
  • aluminum chloride “aluminum chloride” manufactured by Sigma-Aldrich can be used.
  • the “aluminum-containing substance” in the form of a dispersion can be used as a dispersion.
  • a “aluminum-containing substance” in the form of a dispersion is designated as a pH-sensitive carrier (dispersion of pH-sensitive carrier). (Solution)).
  • the aluminum compound when a solid aluminum compound is used as aluminum hydroxide or aluminum phosphate, the aluminum compound is dispersed in a dispersion medium in advance before mixing with a pH sensitive carrier (dispersion of pH sensitive carrier). It is preferable to use in the form.
  • aluminum sulfate, potassium aluminum sulfate or aluminum chloride When aluminum sulfate, potassium aluminum sulfate or aluminum chloride is used as a substance containing aluminum, it may be mixed with a pH sensitive carrier (dispersion of pH sensitive carrier) in a solid state, or these aluminum compounds may be mixed with an aqueous solvent in advance. It may be dissolved in and then mixed with a pH sensitive carrier (dispersion of pH sensitive carrier).
  • the substance containing aluminum may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the substance containing aluminum varies depending on the type of the substance containing aluminum, but the substance containing aluminum is 1 to 1000 ⁇ g in terms of aluminum metal with respect to 100 nmol of the amphiphilic substance. Preferably, it is contained in an amount of 1 to 500 ⁇ g, more preferably 1 to 100 ⁇ g. It is preferable that the content of the substance containing aluminum with respect to 100 nmol of the amphiphilic substance is 1 ⁇ g or more because an immune response can be suitably induced. On the other hand, the content of the substance containing aluminum with respect to 100 nmol of the amphiphilic substance is preferably 1000 ⁇ g or less because side reactions can be reduced. In particular, when the amphiphilic substance contained in 100 ⁇ L of the adjuvant composition is less than 10 nmol, the ratio of the substance containing aluminum per nmol of the amphiphilic substance is preferably 10 to 100 ⁇ g.
  • the content (concentration) of the substance containing aluminum in the adjuvant composition is preferably 1 ⁇ g / 100 ⁇ L or more in terms of aluminum metal when the adjuvant composition is dispersed in an aqueous solvent. / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L is more preferable, and 10 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L is even more preferable. It is preferable that the content of the substance containing aluminum is 1 ⁇ g / 100 ⁇ L or more because an immune response can be suitably induced. On the other hand, the content of the substance containing aluminum is preferably 100 ⁇ g / 100 ⁇ L or less because side reactions can be reduced.
  • the adjuvant composition may contain an aqueous solvent (hereinafter sometimes referred to as “aqueous medium”).
  • the pH-sensitive carrier and the substance containing aluminum can be a dispersion liquid (hereinafter also referred to as “aqueous solution”) dispersed in the aqueous solvent.
  • the pH-sensitive carrier preferably forms a complex containing the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance in an aqueous medium.
  • the form of these complexes is not particularly limited, and the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance may form a film, or a part or the whole of the pH-sensitive compound is associated with the structure formed by the amphiphilic substance. May be embedded.
  • a pH-sensitive compound and an amphiphile are micelle-like particles (particles in which a pH-sensitive compound and an amphiphile are associated in a granular form by hydrophobic interaction, and typically have a monomolecular film structure. Is preferably formed.
  • the micelle particles preferably have a particle size of 10 to 200 nm. More preferably, it is 100 nm.
  • the micelle-like particles do not include those that form a lipid bilayer structure (for example, liposome).
  • the particle diameter of the pH-sensitive carrier can be measured by a dynamic light scattering method (NanoZS90, manufactured by MALVERN Instruments).
  • the adjuvant composition preferably forms a complex (adjuvant complex) containing a pH-sensitive carrier in which the complex is formed and a substance containing aluminum in an aqueous medium.
  • a complex adjuvant complex
  • the form of the complex is not particularly limited, but it is preferable that the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance constituting the pH-sensitive carrier and the substance containing aluminum form micelle-like particles.
  • the particle size of the micellar particles is preferably 10 to 200 nm, and more preferably 10 to 100 nm.
  • aqueous solution containing the adjuvant composition at least one of a pH-sensitive compound, an amphiphilic substance, and a substance having an activity to stimulate innate immunity does not form an aggregate and exists in a free state. Good.
  • the solvent of the aqueous solution containing the adjuvant composition of the present invention is preferably an aqueous solution containing a buffer, saccharides such as NaCl, glucose and sucrose.
  • any known buffer can be used as appropriate as long as the pH of the adjuvant composition is maintained at a physiological pH or higher, and is not particularly limited.
  • the buffer include phosphate buffer, citrate buffer, citrate-phosphate buffer, trishydroxymethylaminomethane-HCl buffer (Tris-HCl buffer), MES buffer (2-morpholinoethanesulfone).
  • Acid buffer TES buffer (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid buffer), acetate buffer, MOPS buffer (3-morpholinopropanesulfonic acid buffer), MOPS-NaOH buffer Agent, HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid buffer), GOOD buffer such as HEPES-NaOH buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, glycine-NaOH buffer, glycyl Amino acid buffers such as glycine-NaOH buffer and glycylglycine-KOH buffer; C acid buffer, borate -NaOH buffer, borate buffers such as boric acid buffer; or imidazole buffer are used.
  • a phosphate buffer a citrate buffer, a citrate-phosphate buffer, a Tris-HCl buffer, a MES buffer, an acetate buffer, and a HEPES-NaOH buffer.
  • concentration of the buffer is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 100 mM.
  • buffer concentration refers to the concentration (mM) of the buffer contained in the aqueous solution.
  • the concentration of saccharides such as NaCl, glucose and sucrose is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 150 mM.
  • the concentration of the pH-sensitive carrier in the aqueous solution is not particularly limited, but the total molar concentration of the pH-sensitive compound and the amphiphile is preferably 7.3 ⁇ mol / L or more, and 8.0 ⁇ mol / L or more. Is more preferably 50 ⁇ mol / L or more, particularly preferably 100 ⁇ mol / L or more, and most preferably 1 mmol / L or more.
  • the total molar concentration of the pH sensitive compound and the amphiphilic substance is preferably 500 mmol / L or less, more preferably 300 mmol / L or less, further preferably 280 mmol / L or less, It is particularly preferably 0.5 mmol / L or less, and most preferably 4.2 mmol / L or less.
  • the total molar concentration of the pH-sensitive compound and the amphiphile is preferably 100 ⁇ mol / L to 300 mmol / L, and 1 mmol / L to 280 mmol / L. More preferably, it is L.
  • the substance containing aluminum in the aqueous solution is preferably a substance containing aluminum so that the concentration of aluminum is preferably 1 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L, more preferably 10 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L. Is preferably used.
  • the adjuvant composition may contain other components. Although it does not restrict
  • the stabilizer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the pH-sensitive carrier and the substance containing aluminum.
  • a polyoxyethylene sorbitan tri-palmitate, a polyoxyethylene sorbitan trioleate, a polyoxyethylene sorbitan tri-fatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms for example, Tween 65, Tween 85
  • a polyoxyethylene laurate Polyoxyethylene myristic acid ester, polyoxyethylene palmitic acid ester, polyoxyethylene stearic acid ester C12-18 polyoxyethylene alkyl esters such as PEG20 stearyl ether, PEG23 lauryl ether
  • polyoxyalkylene hydrogenated castor oil eg, PEG10 hydrogenated castor oil, PEG40 hydrogenated castor oil, PEG60 hydrogenated castor oil
  • Saturated and unsaturated monofatty acids having 8 to 18 carbon atoms such as caprylin (glycerol octanoate), glycerol monocaprate, glycerol monolaurate, glycerol monomyristate, glycerol monopalmitate,
  • C8-16 difatty acid glycerol C8-16 difatty acid glycerol; ⁇ -tocopherol acetate, castor oil, soybean oil, cholesterol, squalene, squalane, lactose, ascorbyl palmitate, benzyl benzoate, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoate
  • Known stabilizers such as propyl acid and butyl paraoxybenzoate can be used.
  • the “carbon number” in the stabilizer means the carbon number of the fatty acid component (acyl group) constituting the hydrophobic part.
  • the content of these other components is not particularly limited as long as it does not adversely affect the pH-sensitive carrier and the aluminum-containing substance, but it is preferably 150 mol or less and more than 0 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. And more preferably 66.4 mol or less.
  • the adjuvant composition according to this embodiment can induce CTLs effectively when administered together with an antigen.
  • the function of the pH-sensitive carrier for example, the membrane destruction function promoting effect (and the membrane fusion function promoting effect) is obtained. It can exhibit suitably.
  • the function of the substance containing aluminum can be suitably exhibited.
  • the pH-sensitive carrier contains a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance, and has a membrane destruction function promoting effect (in some cases, a membrane destruction function promoting effect and a membrane fusion function promoting effect).
  • the membrane destruction function promoting effect (and the membrane fusion function promoting effect) is, as described above, inducing the change in the association state of the pH sensitive carrier by the pH sensitive compound in an acidic environment, and in this case the amphipathic property It is based on rearrangement with a cell membrane such as an endosome by a substance.
  • the pH sensitivity of the pH-sensitive compound does not fluctuate, so that the pH-sensitive compound can cause a change in the association state of the pH-sensitive carrier.
  • an aluminum-containing substance is incorporated into an amphiphilic substance or exists independently of a pH-sensitive carrier, it does not affect the rearrangement of the cell membrane by the amphiphilic substance. . If it does so, even if the substance containing aluminum is used together with a pH sensitive support
  • the material containing aluminum is, for example, only incorporated into the amphiphile of the pH sensitive carrier by hydrophobic interaction, or simply present independently of the pH sensitive carrier. Yes, its function is not impaired.
  • the adjuvant composition according to the present embodiment when administered together with an antigen, can introduce the antigen into the cytoplasmic substrate by the function of the pH-sensitive carrier, and the substance containing aluminum acts on the cytoplasmic substrate.
  • Cross presentation based on the introduced antigen can be preferably induced, and cellular immunity (CTL) can be effectively induced.
  • CTL cellular immunity
  • humoral immunity can also be suitably induced.
  • exogenous antigens are usually decomposed into peptide fragments by endosomes in antigen-presenting cells, form complexes with MHC class II molecules, and presented to CD4-positive T cells.
  • the pH-sensitive carrier contains the antigen and aluminum when rearranging the endosomal cell membrane. Substances can be introduced into the cytoplasmic matrix. However, in one embodiment, even if rearrangement occurs, some or all of the antigen and aluminum containing material may remain in the endosome. In one embodiment, when the antigen and the adjuvant composition are present independently, only a part of the endosome may take up only the antigen. Then, the antigen is decomposed into peptide fragments in the endosome, forms a complex with the MHC class II molecule, and is presented to CD4 positive T cells to induce humoral immunity.
  • dendritic cells that are preferably inducing cross-presentation are in an immunologically activated state, the induction of humoral immunity is suitably expressed.
  • dendritic cells that are preferably inducing cross-presentation actively produce cytokines that activate immunity (eg, IFN ⁇ ), and lead the surrounding environment to an environment suitable for immunity induction.
  • humoral immunity can be induced together with or instead of the cross presentation.
  • the vaccine composition includes an adjuvant composition and an antigen.
  • adjuvant composition Since the above-mentioned adjuvant composition can be used, the description thereof is omitted here.
  • the antigen is not particularly limited as long as it causes an immune response, but is preferably a peptide or protein.
  • Examples of the peptide or protein include viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, protozoal or parasitic antigens, cancer antigens, allergy related antigens, disease related antigens, graft rejection related antigens, and the like.
  • the viral antigen is not particularly limited, but human immunodeficiency virus (HIV) antigens such as gag, pol, and env gene product, Nef protein, reverse transcriptase, and other HIV components; Hepatitis virus antigens such as S, M, and L proteins, hepatitis B virus pre-S antigen, hepatitis C virus RNA, and viral components of hepatitis A, B, and C; hemagglutinin and neuraminidase, and others Influenza virus components such as influenza virus components; measles virus antigen; rubella virus antigen; rotavirus antigen; cytomegalovirus antigen; respiratory syncytial virus antigen; herpes simplex virus antigen; varicella zoster virus antigen; It includes the rabies virus antigen.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • adenovirus retrovirus, picornavirus, herpes virus, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rhabdovirus, paramyxovirus, orthomyxovirus, bunyavirus, arenavirus, leo Peptides derived from viruses, papillomaviruses, parvoviruses, poxviruses, hepadnaviruses or spongy viruses.
  • bacterial antigens such as pertussis toxin, fibrillary hemagglutinin, pertactin, FIM2, FIM3, adenylate cyclase, and other pertussis bacterial antigen components; diphtheria toxin or toxoid, etc.
  • Diphtheria bacterial antigens such as diphtheria bacterial antigen components of tetanus toxin or toxoid, tetanus bacterial antigens such as other tetanus bacterial antigen components, streptococcal bacterial antigens; lipopolysaccharide, other gram-negative bacterial antigen components, etc.
  • Gram-negative gonococcal bacterial antigens Mycolic acid, heat shock protein 65 (HSP65), 30 kDa major secreted protein, antigen 85A, other mycobacterial antigen components and other Mycobacterial bacterial antigens; Helicobacter pylori bacterial antigen component; Fungal bacterial antigens; Haemophilus influenzae bacterial antigens; anthrax bacterial antigens; rickettsial bacterial antigens, and the like.
  • the fungal antigen is not particularly limited, and examples thereof include a Candida fungal antigen component; a histoplasma fungal antigen; a cryptococcal fungal antigen; a coccidioidofungal antigen;
  • the protozoan or parasitic antigen is not particularly limited, and examples thereof include Plasmodium falciparum antigen; Toxoplasma antigen; Schistosomiasis antigen; Leishmania antigen; Trypanosoma cruzi antigen and the like.
  • the cancer antigen is not particularly limited, and includes cancer antigens derived from the cell surface, cytoplasm, nucleus, organelle, etc. of the cells of the tumor tissue.
  • cancers include leukemia, lymphoma, neural tumor, melanoma, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, testicular cancer, prostate cancer.
  • cancer antigens include HER2 / neu (Human EGFR related 2), CEA (Carcinogenic Embryonic Antigen), MAGE (Melanoma-associated Antigen), and XAGE (Xantigen E).
  • gp100 Melan / mart-1, Tyrosinase, PSA (Prostate Specific Antigen), PAP (Prostate Acid Phosphatase), p53, K-ras, N-ras, Bcr-Abl, MUC-1 (Mucin-1) Specific (Membrane Antigen), survi in, WT-1 (Wilms tumor suppressor gene 1), AFP (Alpha Fetoprotein), GPC (Glypican), EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), and the like.
  • the allergy-related antigen is not particularly limited, but includes cedar pollen antigen, ragweed pollen antigen; pollen antigen such as ryegrass pollen antigen; animal-derived antigen such as house dust mite antigen and feline antigen; therapeutic agent such as histocompatibility antigen and penicillin. Is mentioned.
  • the disease-related antigen (autoimmune disease, allergy, etc.) is not particularly limited, but diabetes, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, Sjogren's syndrome, alopecia areata, Crohn's disease, Ulcerative colitis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, asthma, allergic asthma, proctitis, drug eruption, allergic encephalomyelitis, acute necrotizing hemorrhagic encephalopathy, aplastic anemia, erythroblastic anemia, idiopathic thrombocytopenia Disease, Wegener's granulomatosis, Stevens-Johnson syndrome, interstitial pulmonary fibrosis and the like.
  • G9D65 glutamate decarboxylase 65
  • natural DNA myelin basic protein
  • myelin proteolipid protein acetylcholine receptor component
  • thyroglobulin thyroid stimulation as examples of antigens involved in autoimmune diseases
  • TSH thyroid stimulation
  • the graft rejection-related antigen is not particularly limited, and examples include an antigenic component of a graft transplanted into a graft recipient such as a heart, lung, liver, pancreas, kidney, and nerve graft component.
  • antigens may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the antigen is preferably 3.2 to 400 ⁇ g, more preferably 16 ⁇ g to 80 ⁇ g, based on 100 nmol of the amphiphilic substance constituting the pH sensitive carrier.
  • the incorporation rate of the antigen is not particularly limited, and the antigen and the adjuvant composition may exist independently, but is preferably 3% or more, more preferably 5 to 80%, and more preferably 10 to More preferably, it is 60%.
  • the integration rate is 3% or more, for example, when the vaccine composition is endocytosed into cells, the possibility that the antigen is introduced into the same endosome as the adjuvant composition is high, and the effect of the invention is preferable. It is preferable because it can be obtained.
  • the “antigen incorporation rate” mainly means the ratio of the antigen carried or included in the adjuvant composition, and the value measured by the method described in the examples is adopted.
  • the vaccine composition may contain other pharmaceutical additives.
  • the vaccine composition may be in the form of a solid preparation such as a tablet, powder or capsule, or in the form of a liquid preparation such as an injection preparation, but is preferably a liquid preparation.
  • a liquid preparation it may be provided as a dry product that is regenerated with water or other suitable excipient at the time of use.
  • the vaccine composition is a tablet or capsule
  • an enteric coating by a usual method.
  • enteric coating those normally used in this field can be used.
  • Capsules can also contain either powder or liquid.
  • excipients for example, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, celluloses such as crystalline cellulose, gum arabic, aluminum metasilicate) Magnesium sulfate, calcium phosphate, etc.), lubricant (eg, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, etc.), binder (eg, mannitol, sugars such as sucrose, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, Hydroxypropylmethylcellulose), disintegrating agents (eg, starches such as potato starch, celluloses such as carboxymethylcellulose, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, etc.), colorants, flavoring agents, and the like.
  • excipients for example, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, celluloses such as crystalline cellulose, gum arabic, aluminum metasilicate) Magnesium sulfate, calcium phosphate, etc.),
  • the vaccine composition when the vaccine composition is a liquid preparation, a solvent (eg, physiological saline, sterilized water, buffer solution, etc.), a membrane stabilizer (eg, cholesterol), an isotonic agent (eg, sodium chloride, glucose, glycerin). Etc.), antioxidants (eg tocopherol, ascorbic acid, glutathione etc.), preservatives (eg chlorbutanol, parabens etc.) and the like.
  • a solvent eg, physiological saline, sterilized water, buffer solution, etc.
  • a membrane stabilizer eg, cholesterol
  • an isotonic agent eg, sodium chloride, glucose, glycerin). Etc.
  • antioxidants eg tocopherol, ascorbic acid, glutathione etc.
  • preservatives eg chlorbutanol, parabens etc.
  • the solvent used for manufacture of a vaccine composition may be sufficient as the said solvent.
  • the vaccine composition can induce cellular immunity by efficiently cross-presenting the antigen.
  • CTL can be induced.
  • inducing cellular immunity refers to a control (ie, a mixture of an antigen and a substance containing aluminum) that has not been treated with a vaccine composition by the ELIspot method described herein. This means that a lot of spot formation can be obtained.
  • the vaccine composition can induce humoral immunity.
  • antibodies such as IgG
  • humoral immunity means that the IgG antibody titer is higher than that of the control administered with the antigen.
  • a method for treating or preventing a disease comprising administering an effective amount of the above vaccine composition to a subject in need of treatment or prevention.
  • the administration method of the vaccine composition is not particularly limited, and is oral administration; intravenous injection, intraarterial injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intrathecal injection, transdermal administration, transdermal absorption, etc.
  • Parenteral administration and the like are used as antigens, administration by the parenteral route, particularly subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intravenous injection.
  • a vaccine composition in which an antigen is not carried in or contained in an adjuvant composition but is mixed independently is administered locally, specifically, in the form of subcutaneous administration, intradermal administration, or intramuscular administration. Is preferred.
  • the above subject is preferably a mammal, particularly preferably a human.
  • diseases include viral infections such as human immunodeficiency syndrome (HIV), hepatitis, influenza; bacterial infections such as pertussis, diphtheria, tetanus, tuberculosis, Helicobacter pylori, pneumococci, etc .; fungal infections such as Candida Protozoal or parasitic infections such as malaria; leukemia, lymphoma, neural tumor, melanoma, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, Vaginal cancer, testicular cancer, prostate cancer, penile cancer, bone tumor, blood vessel tumor, lip cancer, nasopharyngeal cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, laryngeal cancer, lung cancer, bladder cancer, kidney cancer , Brain tumor, thyroid cancer, Hodgkin's disease, non-Ho
  • a method for treating or preventing a disease is provided.
  • the common general technical knowledge at the time of filing can be referred to as appropriate.
  • the vaccine composition can also transport the antigen to cells by culturing. That is, according to one aspect of the present invention, a culture method for transporting an antigen to cells is provided.
  • the culture method includes a step of culturing the cells in a medium containing the vaccine composition.
  • the medium is not particularly limited, and a known medium can be used. Specifically, MEM, DMEM, RPMI, etc. are mentioned.
  • the amount of the vaccine composition added to the medium is not particularly limited, but the molar concentration of the amphiphile is preferably 0.66 ⁇ mol / L to 1.0 mmol / L, preferably 6.6 ⁇ mol / L to 0. It is more preferably 0.888 mmol / L, and even more preferably 7.2 ⁇ mol / L to 0.56 mmol / L.
  • the pH of the medium is preferably 7.0 or more, more preferably 7.2 to 7.8. It is preferable that the pH of the medium is 7.0 or more because destabilization of the pH sensitive compound constituting the pH sensitive carrier in the medium can be prevented.
  • the cells are not particularly limited, and examples include cells collected from subjects and established cultured cells.
  • cells collected from the subject or established cultured cells include dendritic cells, NK (Natural Killer) cells, T cells, B sphere cells, lymphocyte cells, and the like.
  • cells collected from the subject are preferably used, and dendritic cells, NK cells, T cells, lymphocyte cells, etc. collected from the subject are more preferably used, and dendritic cells are used. More preferably.
  • the cells are collected from the subject by blood collection, biopsy, or the like. That is, in one embodiment, the culture method may include a step of collecting cells from a subject.
  • the cultured cells may be administered to the subject.
  • a subject's disease can be treated or prevented. That is, in one embodiment of the present invention, a method for treating or preventing a disease is provided.
  • the treatment or prevention method comprises the steps of collecting cells from a subject, culturing the collected cells in a medium containing a vaccine composition, and administering the cultured cells to the subject. And a step of performing.
  • the disease is as described above.
  • the adjuvant composition according to the present invention is not particularly limited, and can be produced by various methods.
  • an adjuvant composition in which a pH-sensitive carrier and an aluminum-containing substance are independently present can be produced by mixing a pH-sensitive carrier and an aluminum-containing substance.
  • an adjuvant composition in which a substance containing aluminum is supported or included in a pH-sensitive carrier can be produced by associating a pH-sensitive carrier with a substance containing aluminum.
  • the method for producing an adjuvant composition includes deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof
  • At least one pH-sensitive compound selected from the group consisting of: phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms, carbon number 16 From the group consisting of sorbitan fatty acid esters having only ⁇ 18 acyl groups, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil and ⁇ -tocopherol Comprising at least one amphiphile is-
  • the pH-sensitive compound, the amphiphilic substance, and the aluminum-containing substance may be contacted in an aqueous solution. Therefore, the adjuvant composition according to the present embodiment can be produced by bringing a pH-sensitive compound, an amphiphilic substance, and a substance containing aluminum into contact with each other in an aqueous solution.
  • the method of bringing the pH-sensitive compound, the amphiphilic substance, and the aluminum-containing substance into contact with each other in an aqueous solution is not particularly limited as long as they form an aggregate.
  • (1) ⁇ a> prepare an aqueous solution containing a pH-sensitive compound, an aqueous solution containing an amphiphilic substance, and an aqueous solution containing an aluminum-containing substance, and mix these aqueous solutions; A method in which the solution is vigorously stirred and dispersed using an emulsifier or the like to obtain an adjuvant composition;
  • ⁇ C> A pH-sensitive compound
  • the dispersion is mixed with an aluminum-containing substance or an aqueous solution containing an aluminum-containing substance to obtain an adjuvant composition; (2) by a Bangham method known as a liposome production method
  • the method of preparation etc. are mentioned.
  • a concrete method of the said bangham method it can carry out with the following method, for example. That is, the constituents of the pH-sensitive carrier are dissolved in an organic solvent (for example, methanol, chloroform) in a glass container, and the organic solvent is removed by a rotary evaporator or the like to form a thin film on the wall of the glass container.
  • an organic solvent for example, methanol, chloroform
  • the aqueous solution is added to the glass container on which the thin film is formed, and the thin film is swollen at 5 to 35 ° C., and then the glass container is shaken at 5 to 35 ° C.
  • the thin film can be sufficiently dispersed in the aqueous solution by vigorously stirring using an emulsifier, a vortex mixer, and ultrasonic waves.
  • an aqueous solution containing a pH sensitive carrier (dispersion of pH sensitive carrier) can be obtained.
  • An adjuvant composition is obtained by mixing an aqueous solution containing the pH-sensitive carrier (dispersion of pH-sensitive carrier) and an aqueous solution containing a substance containing aluminum.
  • an adjuvant composition can be obtained by dispersing the thin film.
  • liposome production methods such as “Liposome” (Shinochi Nojima, Junzo Sunamoto, Junzo Inoue, Nanedou) and “Liposome in Life Science” (Terada). Hiro, Tetsuro Yoshimura, Springer Fairlake Tokyo).
  • an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave, or the like may be used to disperse strongly when preparing a dispersion.
  • a pH-sensitive compound and a substance containing aluminum may be mixed in an aqueous solution containing an amphiphilic substance.
  • the solvent of the aqueous solution mentioned above can be used as a solvent of an aqueous solution.
  • the temperature at which each aqueous solution is prepared and the temperature at which the aqueous solution is mixed are not particularly limited, but are preferably 5 to 35 ° C., and 15 to 25 ° C. at normal temperature. Is more preferable.
  • the addition method in particular of other components, such as a stabilizer which can be contained in the adjuvant composition containing an aqueous solvent as a component is not restrict
  • it may be added to an aqueous solution containing a pH-sensitive compound, an aqueous solution containing an amphiphilic substance, and / or an aqueous solution containing a substance containing aluminum, or when preparing a thin film by the Bangham method,
  • An aqueous solution containing the adjuvant composition may be obtained by dissolving together with the components of the adjuvant composition and using a thin film containing these components.
  • aqueous solution containing the pH-sensitive compound, the aqueous solution containing the amphiphilic substance, and the aqueous solution containing the aluminum-containing substance are the same as those used in the “method for producing a vaccine composition” described later, or Those prepared with reference may be used.
  • a method for producing a vaccine composition according to one embodiment comprises deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and their At least one pH-sensitive compound selected from the group consisting of salts, phosphatidylcholine having only an acyl group having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having an acyl group having 12 to 18 carbon atoms, carbon number Selected from the group consisting of sorbitan fatty acid esters having only 16-18 acyl groups, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate,
  • the antigen may be mixed with an aqueous solution containing the aggregate.
  • a vaccine composition can be obtained by mixing the adjuvant composition obtained by the above method (1) or (2) with an antigen.
  • (V-1) ⁇ a> an aqueous solution containing a pH sensitive compound, an aqueous solution containing an amphiphilic substance, an aqueous solution containing an aluminum containing substance, an aqueous solution containing an antigen, Are prepared separately, these aqueous solutions are mixed, the solution is vigorously stirred and dispersed using an emulsifier or the like to obtain a vaccine composition;
  • a solution containing an aluminum-containing substance and an antigen may be used as the aqueous solution to be added to the thin film formed of the constituents of the pH-sensitive carrier.
  • an aqueous solution to be added to the thin film an aqueous solution containing an antigen may be used, and then an aqueous solution containing a substance containing aluminum may be mixed.
  • the temperature at which the aqueous solution containing the antigen is mixed with the dispersion of the adjuvant composition or the pH-sensitive carrier is not particularly limited, but is preferably 5 to 35 ° C., preferably 15 to 25 ° C. at normal temperature.
  • aqueous solution containing a pH-sensitive compound an aqueous solution containing an amphiphilic substance, an aqueous solution containing an aluminum-containing substance, an aqueous solution containing an antigen, and an aqueous solution containing an antigen and an aluminum-containing substance are described below. Those prepared as described above can be used.
  • the solution containing the pH sensitive compound contains a pH sensitive compound and a solvent. Moreover, the additive may be included as needed.
  • an aqueous solution containing a saccharide such as a buffer, NaCl, glucose, sucrose, or sterilized water can be used.
  • a saccharide such as a buffer, NaCl, glucose, sucrose, or sterilized water
  • physiological saline, sterilized water, and buffer are preferably used from the viewpoint of suitably administering the vaccine composition to a living body.
  • the molar concentration of the pH-sensitive compound is preferably 5 ⁇ mol / L or more, more preferably 10 ⁇ mol / L or more, and further preferably 50 ⁇ mol / L or more, It is particularly preferably 100 ⁇ mol / L or more, and most preferably 1 mmol / L or more. Further, the molar concentration of the pH sensitive compound in the aqueous solution is preferably 500 mmol / L or less, more preferably 300 mmol / L or less, further preferably 250 mmol / L or less, 200 mmol / L or less. Is particularly preferred.
  • the molar concentration of the pH-sensitive compound is preferably 100 ⁇ mol / L to 300 mmol / L, and more preferably 1 mmol / L to 200 mmol / L.
  • the solution containing the amphiphile contains an amphiphile and a solvent. Moreover, the additive may be included as needed.
  • amphiphilic substance and the solvent those described above can be used, and thus the description thereof is omitted here.
  • the molar concentration of the amphiphile is preferably 5 ⁇ mol / L or more, more preferably 10 ⁇ mol / L or more, and more preferably 50 ⁇ mol / L or more. It is preferably 100 ⁇ mol / L or more, and most preferably 500 ⁇ mol / L or more. Further, the molar concentration of the amphiphile in the aqueous solution is preferably 500 mmol / L or less, more preferably 300 mmol / L or less, further preferably 250 mmol / L or less, and 200 mmol / L. The following is particularly preferable, and it is most preferable that it is 150 mmol / L or less.
  • the molar concentration of the amphiphile is preferably 50 ⁇ mol / L to 200 mmol / L, and more preferably 500 ⁇ mol / L to 150 mmol / L.
  • the solution containing the substance containing aluminum contains a substance containing aluminum and a solvent. Moreover, the additive may be included as needed.
  • the concentration of aluminum in the aqueous solution containing the substance containing aluminum is preferably 1 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L, more preferably 10 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L in terms of aluminum metal.
  • the solution containing the antigen contains an antigen and a solvent.
  • antigen and the solvent those described above can be used, and therefore the description thereof is omitted here.
  • the mixing method of the aqueous solution containing the above-mentioned pH sensitive compound, the aqueous solution containing the amphiphilic substance, the aqueous solution containing the aluminum-containing substance, and the aqueous solution containing the antigen is not particularly limited.
  • the stirring can be performed using, for example, an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave, or the like.
  • the aqueous solution containing the pH-sensitive compound, the aqueous solution containing the amphiphile, the aqueous solution containing the aluminum-containing material, and the aqueous solution containing the antigen are not separate solutions, but two types. It is good also as a liquid mixture which combined the above component.
  • an aqueous solution containing a pH-sensitive compound and a substance containing aluminum may be prepared, and this may be mixed with an aqueous solution containing an amphiphilic substance or an aqueous solution containing an antigen.
  • CpG-DNA CpG-ODN: manufactured by InvivoGen, ODN-2395
  • Tocopherol acetate DL- ⁇ -tocopherol acetate: manufactured by Nacalai Tesque
  • Aluminum hydroxide InvivoGen, Alhydrogel 2%)
  • Aluminum phosphate manufactured by Alpha Diagnostic International, Adjuphos
  • -Potassium aluminum sulfate InvivoGen, alum crystals
  • Solvents, water for injection: (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) ⁇ MES-Na (Merck) ⁇ Sodium chloride (manufactured by Kanto Chemical)
  • PBS Tables Phosphate buffered saline: manufactured by Takara Bio Inc.
  • Methanol Nacalai Tesque
  • Ethanol Karlo Chemical Co., Ltd.
  • Chloroform Chloroform (Wako Pure Chemical Industries) Sodium hydroxide aqueous solution (0.1 mol
  • Ultrasonic irradiation device USC-J Spectrophotometer: FP-6500
  • UV-vis spectrophotometer UV-3600 CO 2
  • incubator MCO20AIC ⁇ Cell culture> The cells were cultured using an incubator (MCO20AIC) set at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • MES Buffer MES: 25 mM and NaCl: 125 mM were prepared.
  • MES Buffer has a pH of 7.4 unless otherwise specified.
  • PBS PBS
  • the PBS was prepared by dissolving 10 tablets of PBS Tables (manufactured by Takara Bio Inc.) in 1000 mL of distilled water. The pH is 7.35 to 7.65. Alternatively, purchased D-PBS was used as PBS.
  • RPMI medium Penicillin (100 units / mL) and streptomycin (100 mg / mL) were added as antibiotics. Further, FBS was additionally added as necessary to obtain a RPMI medium containing 10% serum.
  • -Primary solution of tocopherol 10 mg of tocopherol was weighed and dissolved in 1.0 mL of ethanol. Furthermore, it diluted 10 times with PBS and the primary solution of tocopherol was prepared.
  • -Primary solution of tocopherol acetate 10 mg of tocopherol acetate was weighed and dissolved in 1.0 mL of ethanol. Further, the solution was diluted 10 times with PBS to prepare a primary solution of tocopherol acetate.
  • alum aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and potassium aluminum sulfate (alum) were used.
  • the alum used is aluminum hydroxide
  • the stock solution of the purchased reagent aluminum concentration (aluminum metal equivalent): about 10 mg / mL
  • the adjuvant composition Used for the preparation of
  • the stock solution of the purchased reagent was diluted with PBS to obtain a primary solution of alum, which was used for the preparation of an adjuvant composition.
  • the stock solution of the purchased reagent was diluted 10-fold with PBS and used for the preparation of an adjuvant composition.
  • the final concentration is 1 ⁇ g / 100 ⁇ L, it is diluted 100 times with PBS, and when the final concentration is 0.1 ⁇ g / 100 ⁇ L, a solution diluted 1000 times with PBS is used as the primary solution for alum. Used in the preparation of the adjuvant composition.
  • the alum used is aluminum phosphate, as with aluminum hydroxide, the stock solution of the purchased reagent and the diluted stock solution of the purchased reagent in PBS are used as the primary solution for alum and used for the preparation of the adjuvant composition. It was.
  • a predetermined amount of a pH-sensitive compound was weighed and dissolved in MES Buffer or PBS to prepare a solution of the pH-sensitive compound.
  • a predetermined amount of amphiphilic substance was weighed, added to the previously prepared pH-sensitive compound, and mixed to prepare a pH-sensitive carrier dispersion (solution).
  • the operation was performed at room temperature. Specifically, in the case of a pH sensitive carrier consisting of 1600 nmol deoxycholic acid with respect to 1000 nmol DLPC, 13.8 mg sodium deoxycholate monohydrate is weighed and dissolved in 10 mL MES Buffer or PBS. It was.
  • the ratio of the amphiphile to the pH-sensitive compound was adjusted to a desired ratio. Further, when a plurality of amphiphiles were used, the total amount of the amphiphiles was adjusted to a desired number of moles (1000 nmol). Moreover, the usage-amount of the pH sensitive compound in description of an Example or a figure is a usage-amount with respect to 100 nmol amphiphile.
  • a primary solution of a substance that stimulates innate immunity (hereinafter also referred to as a candidate substance) was added to and mixed with the prepared dispersion (solution) of a pH-sensitive carrier. Additional MES to adjust concentration An adjuvant composition was prepared by adding and mixing Buffer or PBS.
  • a vaccine composition was prepared by adding and mixing PBS in which a predetermined amount of OVA was dissolved to the obtained adjuvant composition.
  • a pH-sensitive carrier, an adjuvant composition, and a vaccine composition were prepared so as to have an amphiphilic substance concentration of 100 nmol / 100 ⁇ L.
  • a dispersion (solution) of a pH sensitive carrier was diluted and used.
  • the vaccine composition was prepared so as to have an amphiphile concentration of 100 nmol / 100 ⁇ L to 0.1 nmol / 100 ⁇ L.
  • CpG-DNA CpG-ODN
  • 200 ⁇ g of CpG-ODN was dissolved in 200 ⁇ L of water for injection to make a primary solution of a candidate substance, which was used for the preparation of an adjuvant composition.
  • comparative sample As a comparative sample, an antigen alone or a mixture of an antigen and a candidate substance (also indicated as a candidate substance alone) was prepared. In the dissolution test, a dispersion of amphiphile alone and a dispersion of pH-sensitive carrier alone were also prepared.
  • ⁇ Measurement method> (Dissolution test: Leakage (dissolution rate) measurement) Leakage (elution rate) Kono et al. Bioconjugate Chem. According to the method described in 2008 19 1040-1048, evaluation was performed using EYPC liposomes encapsulating Pyranine as a fluorescent substance and DPX as a quencher.
  • the elution rate was calculated with 0% for the EYPC liposome dispersion alone and 100% for 30 ⁇ L of 10-fold diluted Triton-X100. Specifically, the dissolution rate was calculated according to the following formula. In the following formula, the measured fluorescence intensity is L, the fluorescence intensity of only the EYPC liposome dispersion containing the fluorescent substance is L 0 , and the fluorescence intensity when Triton-X100 is added is L 100 .
  • EYPC EYPC 1000 nmol
  • MES Buffer 1.0 mL
  • USC-J ultrasonic irradiation apparatus
  • the fusion rate was determined by setting the fluorescence intensity ratio when the double fluorescently labeled EYPC liposome dispersion obtained above and the amphiphile were incubated to 0%, and the double fluorescently labeled EYPC liposome dispersion and the evaluation sample
  • the dispersion was treated with methanol and calculated as 100%.
  • both the double fluorescence-labeled EYPC liposome dispersion and the evaluation sample dispersion were dissolved in methanol, and then formed into a thin film using a rotary evaporator. A 3.0 mL MES buffer and an ultrasonic irradiation device were used. And dispersed.
  • the fusion rate was calculated according to the following formula.
  • the fluorescence intensity ratio obtained by measurement is R
  • the fluorescence intensity ratio when the double fluorescently labeled EYPC liposome dispersion and the amphiphile are incubated is R 0
  • double fluorescence labeled fluorescence intensity ratio of EYPC liposome dispersion and evaluation samples dispersion obtained by methanol treatment was represented as R 100.
  • intradermal injection was performed at 20 ⁇ L / head in one place on the back using the same administration solution as that for subcutaneous administration.
  • the administration was performed once and the assay was performed 7 days after the administration.
  • humoral immunity administration was carried out twice, and the second administration was performed 14 days after the first administration.
  • the assay was performed 14 days after the second dose.
  • mice were euthanized and the spleen was removed. After adding 3.0 mL of 10% serum-containing RPMI medium, the spleen was treated with a BD Falcon cell strainer to obtain a cell suspension. After hemolysis operation using RBC lysis buffer, the cells were washed with RPMI medium containing 10% serum. The cells were dispersed with RPMI medium containing 10% serum, and then the number of cells was counted to obtain a spleen cell dispersion.
  • the ELIspot method was performed using a Mouse IFN ⁇ ELISPOT Set. The day before seeding the cells, the detection antibody attached to the kit was adsorbed to a 96-well ELIspot plate to prepare a plate. The prepared plate was washed with 10% serum-containing RPMI medium, 200 ⁇ L of 10% serum-containing RPMI medium was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours for blocking. When antigen stimulation is added after washing the plate with 10% serum-containing RPMI medium, 100 ⁇ L of 10% serum-containing RPMI medium containing 40 ⁇ g / mL of OVA peptide is added to the plate, and antigen restimulation is added.
  • the plate was colored according to the protocol described in Mouse IFN ⁇ ELISPOT Set and AEC Substrate Set.
  • the OVA protein was dissolved in a coating buffer and added to a 96-well plate so that the concentration was 0.1 ⁇ g / well (100 ⁇ L). After leaving still at 37 degreeC for 2 hours, it replaced with 300 microliters Block buffer, and left still at 4 degreeC overnight. After washing the plate, 100 ⁇ L of serum diluted to a predetermined magnification was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After the plate was washed, 100 ⁇ L of a secondary antibody solution diluted 1000 times with Block buffer was added to each well, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. After the plate was washed, color was developed using a peroxidase coloring kit to determine the antibody titer.
  • the pH sensitive carrier used was a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid per animal.
  • Candidate substances were all 10 ⁇ g per animal, and 80 ⁇ g of OVA protein was used for each antigen.
  • the administration liquid was prepared by adding a pH-sensitive carrier dispersion (solution), a candidate substance, and an antigen in this order to PBS for preparing a dosage and mixing them.
  • the administration solution was prepared so that the pH-sensitive carrier dispersion (solution), candidate substance, and antigen had a predetermined concentration in 100 ⁇ L.
  • the dose was 100 ⁇ L per animal, and the route of administration was subcutaneous. Induction of cellular immunity was evaluated according to the ELIspot method described above.
  • the induction of cellular immunity (CTL) by the ELIspot method was evaluated by the following criteria by comparison with a control (mixture of a substance containing an antigen and aluminum) visually.
  • ⁇ Cellular immunity is clearly induced compared to the control.
  • ⁇ Cellular immunity is slightly induced compared to the control.
  • ⁇ Cellular immunity is equal to or less than that of the control. .
  • tocopherol and pH-sensitive carrier are similar to the number of spots formed by alum alone (antigen + alum in FIG. 2 (D)), and cannot induce cellular immunity. (FIGS. 2E and 2F).
  • the combined use of alum and a pH-sensitive carrier formed a very large number of spots compared to the formation of alum alone (FIG. 2 (G)). It has been shown that the use of alum and a pH-sensitive carrier leads to induction of cellular immunity. From these results, it was shown that alum is a substance that stimulates (activates) innate immunity suitable for use in combination with a pH-sensitive carrier.
  • CpG-ODN is a synthetic oligonucleotide having a specific base sequence and is a reagent that has been reported to induce cellular immunity. Using this reagent as a positive control, the high activity of inducing cellular immunity by the combined use of alum and a pH-sensitive carrier was evaluated. CpG-ODN was used at 10 ⁇ g per animal, and all other experimental conditions were the same as (1). Evaluation was performed on the same plate as the ELIspot of (1).
  • the number of spots formed by the combined use of alum and a pH-sensitive carrier was larger than that obtained by CpG-ODN (FIGS. 3B and 3C). Since the activity was higher than that of CpG-ODN which is a generally known reagent, it was revealed that the combined use of alum and a pH-sensitive carrier enables high induction of cellular immunity.
  • the induced immunity is antigen-specific. Therefore, the antigen specificity was evaluated for cellular immunity induced by the combined use of alum and a pH-sensitive carrier.
  • the evaluation was performed according to the above-described ELIspot method in which no re-stimulation was applied. Specifically, a dispersion of spleen cells collected from the immunized animal was seeded on an ELIspot plate, and spot formation by IFN- ⁇ producing cells was performed without adding SIINFEKL peptide. As a result, no spot formation was observed, and the formation of the spot obtained by the combined use of alum and the pH-sensitive carrier in FIG. 3 (B) completely disappeared (FIG. 3 (D)).
  • the cellular immunity induced by the combined use of alum and a pH sensitive carrier has indeed been shown to be antigen specific. The induced cells reacted with SIINFEKL class I peptide, suggesting that they were CTL.
  • alum aluminum hydroxide
  • Alum used aluminum hydroxide and the pH-sensitive carrier used a complex of DLPC and deoxycholic acid (100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid per animal).
  • Alum was 100-0.1 ⁇ g per mouse, and 80 ⁇ g of OVA protein was used per antigen.
  • the administration liquid was prepared by adding and mixing PBS, alum, and antigen in order of the dosage to a dispersion (solution) of a pH sensitive carrier. The dose was 100 ⁇ L per animal, and the route of administration was subcutaneous. Induction of cellular immunity was evaluated according to the ELIspot method described above.
  • Alum alone refers to a mixture of an antigen and alum.
  • the vaccine composition (100 ⁇ g / 100 ⁇ L to 1 ⁇ g / 100 ⁇ L as the alum concentration in the solution) that is 100 to 1 ⁇ g of alum (in the figure, antigen + alum + pH sensitive carrier) has the number of spots formed, (In the figure, it was more than that due to antigen + alum) (FIGS. 4B, 4C, 4D, and 4E).
  • the amount of alum used was 0.1 ⁇ g, the number of spots formed was equivalent to that of alum alone (FIGS. 4B and 4F).
  • the administration solution prepared with DLPC constituting the pH-sensitive carrier at a concentration of 1 to 1000 nmol / 100 ⁇ L and deoxycholic acid at a concentration of 1.6 to 160 nmol / 1000 ⁇ L induces cellular immunity. It was. That is, it was suggested that the vaccine composition induces cellular immunity when the concentration of the amphiphile constituting the pH-sensitive carrier is 1-1000 nmol / 100 ⁇ L.
  • Induction of humoral immunity was evaluated by IgG antibody titer.
  • a dose per dose 10 ⁇ g of aluminum hydroxide was used for alum, and a complex consisting of 100 nmol of DLPC and 160 nmol of deoxycholic acid was used as the pH sensitive carrier.
  • the antigen was 80 ⁇ g of OVA protein.
  • the administration liquid was prepared by adding and mixing PBS, alum, and antigen in order of the dosage to a dispersion (solution) of a pH sensitive carrier.
  • the dose was 100 ⁇ L per animal, and the route of administration was subcutaneous.
  • administration was performed twice.
  • the antibody titer was evaluated according to the measurement of the antibody titer described above.
  • alum alone showed the highest IgG antibody titer
  • the combined use of alum and a pH-sensitive carrier showed the next highest antibody titer (FIG. 6, twice administration).
  • the combined use of alum and a pH-sensitive carrier showed a high IgG antibody titer compared to the PBS and antigen-only groups (FIG. 6, twice administration). From this result, it was shown that a vaccine composition using alum and a pH-sensitive carrier can induce humoral immunity.
  • the adjuvant composition according to the present invention can be used as an excellent adjuvant.
  • alum is used as a general term for aluminum-containing adjuvants.
  • examples of alum include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate (alum), and aluminum chloride.
  • cell immunity can be obtained by using in combination with a pH-sensitive carrier. We investigated what could be induced.
  • alum used was aluminum phosphate and potassium aluminum sulfate (alum).
  • the pH sensitive carrier used was a complex of DLPC and deoxycholic acid (100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid per animal).
  • alum was 1 to 0.1 ⁇ g per animal, and 80 ⁇ g of OVA protein was used as the antigen.
  • the administration liquid was prepared by adding and mixing PBS, alum, and antigen in order of the dosage to a dispersion (solution) of a pH sensitive carrier. The dose was 100 ⁇ L per animal, and the route of administration was subcutaneous. Induction of cellular immunity was evaluated according to the ELIspot method described above.
  • the mixture of the antigen and aluminum phosphate and the antigen and potassium aluminum sulfate showed almost no spot formation and could not induce cellular immunity (FIGS. 7A and 7D).
  • the vaccine composition using 1 ⁇ g of aluminum phosphate more spots were formed than the mixture of antigen and aluminum phosphate, and cellular immunity was induced (FIG. 7B).
  • the vaccine composition using 0.1 ⁇ g of aluminum phosphate resulted in the same spot formation as the mixing of antigen and aluminum phosphate, and cellular immunity was not induced (FIG. 7C).
  • alum concentration 1 ⁇ g / 100 ⁇ L to 100 ⁇ g / 100 ⁇ L
  • the vaccine composition using 1 ⁇ g of potassium aluminum sulfate showed slightly more spot formation than the mixture of antigen and potassium aluminum sulfate, suggesting that cellular immunity was induced (FIG. 7 (E)).
  • aluminum hydroxide and aluminum phosphate are particularly useful as components of a vaccine composition that induces cellular immunity in combination with a pH-sensitive carrier.
  • a pH-sensitive carrier dispersion (solution) was mixed with alum so that the total amount of the evaluation sample was 100 ⁇ L. After overnight incubation, a dissolution test was performed using a portion (20 ⁇ L) of these evaluation samples. The dissolution test was performed according to the dissolution test described above. As an amount in 100 ⁇ L, the pH sensitive carrier uses a complex of 100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid, and alum uses 10 ⁇ g aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate (alum). did.
  • Deoxycholic acid alone has an elution rate of about 1% or less at pH 7.4 and about 15% at pH 5.0.
  • a pH-sensitive carrier not mixed with alum is 1% or less at pH 7.4, pH 5 The dissolution rate was about 60% at 0.0 (FIG. 8A). Since the dissolution rate of DLPC alone was 2% or less at pH 5.0 (FIG. 10 (A)), the pH-sensitive carrier surely had an effect of promoting the membrane destruction function.
  • pH sensitive carriers mixed with any of alum such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and potassium aluminum sulfate (alum), they hardly cause elution at pH 7.4, and about 60% at pH 5.0. Elution was caused (FIG. 8 (A)).
  • the pH-sensitive carrier satisfies the formulas (1) and (2) and certainly has an effect of promoting the membrane destruction function. Further, in any alum, the pH-sensitive carrier mixed with alum showed the same elution rate as the pH-sensitive carrier not mixed with alum at pH 7.4 and 5.0. It became clear that the mixing did not affect the effect of promoting the film breaking function of the pH-sensitive carrier.
  • Alum of aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate (alum) is mixed with 100 nmol of DLPC and 160 nmol of deoxycholic acid as a pH sensitive carrier so as to be 0 to 100 ⁇ g (total amount 100 ⁇ L), After overnight incubation, a dissolution test was performed. In addition, since the solution of 100 micrograms potassium aluminum sulfate (alum) became low pH, it did not measure. As a result, in any addition amount of any alum, the elution rate at pH 5.0 showed a value of about 60%, which was not changed from the case where no alum was mixed (FIG. 8 (B)). . Therefore, it was suggested that alum does not affect the effect of promoting the membrane destruction function of the pH-sensitive carrier at any kind and in any addition amount.
  • FIG. 9 shows the results of examining the membrane fusion function promoting effect of the pH-sensitive carrier when mixed with various alums.
  • the amphiphile was 100 nmol DLPC
  • the pH sensitive compound was 160 nmol deoxycholic acid
  • the alum was 10 ⁇ g.
  • a dispersion (solution) of pH-sensitive carrier and alum were mixed so that the total amount was 100 ⁇ L, and incubated overnight, and then a part of these mixed solutions was evaluated by a membrane fusion test.
  • the membrane fusion test was performed according to the membrane fusion test described above.
  • the pH-sensitive carrier showed a fusion rate of about 70% at pH 5.0 when any alum was mixed, and the result satisfied the formula (3) (FIG. 9). That is, the pH-sensitive carrier mixed with alum surely had a membrane fusion function promoting effect. Moreover, in any alum, the pH-sensitive carrier mixed with alum showed the same fusion rate as the pH-sensitive carrier not mixed with alum at pH 7.4 and 5.0 (FIG. 9). Therefore, it was confirmed that mixing with alum does not affect the membrane fusion function promoting effect of the pH-sensitive carrier.
  • the pH-sensitive carrier showed the same effect of promoting the membrane disruption function and the membrane fusion function regardless of the mixing with alum, so that the mixing with alum should not affect the function of the pH-sensitive carrier. Became clear.
  • the pH-sensitive carrier mixed with alum had an elution rate equivalent to that not mixed with alum in any amount of deoxycholic acid (FIGS. 10A and 10B). That is, it was shown that the mixing of alum with 100 nmol DLPC and 10-640 nmol pH-sensitive carrier, which is a pH-sensitive compound, does not affect the function. It was suggested that in any pH sensitive carrier, which is the amount of any pH sensitive compound, mixing of alum does not affect function.
  • the pH-sensitive carrier mixed with alum satisfies the formulas (1) and (2) regardless of the amount of the pH-sensitive compound in the range of 10 to 640 nmol, and certainly has an effect of promoting the membrane destruction function. I did it.
  • These pH-sensitive carriers are considered to induce cellular immunity by mixing with alum.
  • any pH-sensitive carrier prepared using any pH-sensitive compound those mixed with alum showed an equivalent elution rate compared to those not mixed with alum (Table 1, pH 7.4, and pH 5.0).
  • any pH sensitive compound mixing with alum was confirmed not to affect the function of the pH sensitive carrier.
  • the pH-sensitive carrier mixed with alum satisfies the formulas (1) and (2) regardless of the pH-sensitive compound, and certainly has an effect of promoting the membrane destruction function. Therefore, these pH-sensitive carriers are considered to induce cellular immunity by mixing with alum (Table 1).
  • any pH-sensitive carrier prepared using any amphiphile those mixed with alum showed elution rates equal to or higher than those not mixed with alum (Tables 2-2 and Tables). 2-3).
  • the elution rate with deoxycholic acid (pH sensitive compound) alone was about 1% or less at pH 7.4 and about 15% at pH 5.0.
  • the pH-sensitive carrier mixed with alum satisfies the formulas (1) and (2) regardless of which amphiphile is used, and certainly has an effect of promoting the membrane destruction function. . Therefore, these pH-sensitive carriers are considered to induce cellular immunity by mixing with alum (Tables 2-2 and 2-3).
  • Alum used aluminum hydroxide and the pH sensitive carrier used a complex of DLPC and deoxycholic acid (100 nmol DLPC and 160 nmol deoxycholic acid).
  • the dose per animal was set to 100 ⁇ L, and a pH-sensitive carrier containing 10 ⁇ g of alum, 80 ⁇ g of OVA, and 100 nmol of DLPC was administered.
  • the dose per animal was 20 ⁇ L, and a pH sensitive carrier containing 2 ⁇ g of alum, 16 ⁇ g of OVA, and 20 nmol of DLPC was administered.
  • the dose described above was prepared by using the administration solution used for subcutaneous administration and changing the dose from 100 ⁇ L to 20 ⁇ L. Induction of cellular immunity was evaluated according to the ELIspot method described above.
  • the combined use of alum and a pH-sensitive carrier in intradermal administration formed a larger number of spots compared to alum alone (FIGS. 11C and 11D). It was confirmed that the vaccine composition induces cellular immunity even in the intradermal route of administration. Moreover, when the obtained results were compared with subcutaneous administration, the intradermal administration of the vaccine composition formed a larger number of spots than the subcutaneous administration of the vaccine composition despite the small dose (FIG. 11). (B) (D)). It was revealed that the effect of inducing cellular immunity of the vaccine composition is further enhanced by intradermal administration.
  • the antigen specificity of the induced cellular immunity was evaluated.
  • the evaluation was performed according to the above-described ELIspot method in which no re-stimulation was applied.
  • intradermal administration of the vaccine composition did not form a spot (FIG. 11 (H)).
  • the cellular immunity induced by intradermal administration of the vaccine composition was found to be antigen specific.

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Abstract

本発明は、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物に関する。本発明によれば、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントが提供される。

Description

アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物
　本発明は、アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
　免疫系とは、生体内に侵入した異物や異常細胞等を排除して、生体を病気等から保護する防御機構である。また、アジュバントとは、ワクチンの効果を増強するために用いられる物質である。
　免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。
　液性免疫は、抗体や補体など血清中に溶解して存在する成分を中心とした機構である。抗体の誘導は、ワクチンの観点から重要であり、通常、以下のように発現する。すなわち、生体内に侵入した細菌等の外因性抗原が、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、抗原提示細胞内のエンドソームでタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が、サイトカインの放出等を行うことにより、最終的にＢ細胞から抗体が産生される。なお、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞等に発現する。抗体を増強させるアジュバントは、公的に承認されたものが多数存在している。中でもアルミニウムを含有する物質は、古い歴史を有しており、全世界において広く使用されている。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらは単に、ａｌｕｍと総称されることもある。
　一方、細胞性免疫は、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞など、異物排除を担当する細胞を中心とした機構である。細胞性免疫の誘導は、ウイルス感染細胞や癌細胞などを排除することができるため、免疫による治療の観点から大きく注目されている。特に、ＣＴＬの誘導は癌免疫療法への応用から、実現が期待されている。ＣＴＬの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞や癌細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へと分化する。なお、上記ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどすべての有核細胞および血小板の細胞表面に存在する。
　近年では、外因性抗原を用いて積極的にＣＴＬを誘導する、いわゆるクロスプレゼンテーションについての検討も多くなされている。より詳細には、外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。しかしながら、クロスプレゼンテーションにおいては、一部の量でも、外因性抗原を細胞膜あるいはエンドソームの膜を通過させて細胞質基質に移行させることにより、細胞質基質に移行した外因性抗原が内因性抗原のように作用し、最終的にＭＨＣクラスＩ分子と結合して、ＣＴＬを誘導する。
　クロスプレゼンテーションにおいては、外因性抗原がエンドソームの膜を通過する必要があり、これについて種々の検討がなされている。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ　Ｃｈｅｍ．　２００９　Ｆｅｂ．２０（２）：２４１－２４８には、ｐＨ感受性のポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）共役体を用いて抗原を効率良く細胞質基質に輸送することが記載されている。また、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｎｅｔｗ．　２０１３　Ｏｃｔ　１３（５）　１７７－１８３には、癌免疫療法のためのナノ粒子に基づくワクチンデリバリーが記載されている。
　細胞性免疫を増強させるアジュバントは、現時点において、公的に承認されたものは存在しておらず、物質の探索や新規合成、あるいはウイルス成分の利用などが試みられている。アルミニウムを含有する物質など、抗体を増強するためのアジュバントは、残念ながら細胞性免疫を増強する効果を有していないことが報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２００４　８２，４９７－５０５）。
　ＣＴＬをはじめとする細胞性免疫の誘導は、治療を目的としたワクチン開発の観点から、実現が強く望まれており、アジュバント分子の探索やクロスプレゼンテーションを促進される検討が盛んに行われているが、依然として誘導の効果は十分とは言えない。
　また、検討の多くは、新規の合成材料や、ウイルスの成分を用いたものが多く、安全性の観点から懸念が存在している。
　そこで、本発明は、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントの提供を目的とする。
　本発明者は鋭意研究を行った。その結果、ｐＨに感受性を有する担体に、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、単に「自然免疫を活性化する物質」と称する場合もある。）としてアルミニウムを含有する物質を併用することで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の上記課題は以下の手段により達成される。
　（１）ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物；
　（２）前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上である、（１）に記載のアジュバント組成物；
　（３）前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、（１）または（２）に記載のアジュバント組成物；
　（４）前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１～１０００μｇで含有される、（３）に記載のアジュバント組成物；
　（５）前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して１０ｍｏｌ以上の割合で含有される、（３）または（４）に記載のアジュバント組成物；
　（６）（１）または（２）に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物；
　（７）（３）～（５）のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物；
　（８）前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２～４００μｇである、（７）に記載のワクチン組成物；
　（９）前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、（６）～（８）のいずれかに記載のワクチン組成物；
　（１０）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
　アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法；
　（１１）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
　アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程；および
　前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
図１は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。 図２は、ワクチン組成物および比較試料（組成物）のＥＬＩｓｐｏｔ法による細胞性免疫（ＣＴＬ）の誘導を評価した結果を示す図である。ＭＨＣクラスＩ拘束性のペプチドであるＳＩＩＮＦＥＫＬに反応し、ＩＦＮγを産生した細胞をｓｐｏｔの形成により検出した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原とトコフェロールとの混合、（Ｃ）は抗原と酢酸トコフェロールとの混合、（Ｄ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｅ）は抗原とトコフェロールとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と酢酸トコフェロールとｐＨ感受性担体との混合、（Ｇ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣおよびデオキシコール酸の複合体を使用した。 図３は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、ＣｐＧ－ＯＤＮとの比較、および誘導した細胞性免疫の抗原特異性を評価した結果を示す図である。（Ａ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｂ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｃ）は抗原とＣｐＧ－ＯＤＮとの混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。（Ｄ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合により得られた組成物でマウスを免疫し、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えずにｓｐｏｔ形成を試みた結果である。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣおよびデオキシコール酸の複合体を使用した。 図４は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するために必要となるａｌｕｍの量を調べた結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原と１０μｇのａｌｕｍとの混合、（Ｃ）は抗原と１００μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原と１０μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｅ）は抗原と１μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と０．１μｇのａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。 図５は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するために必要なｐＨ感受性担体の量を調べた結果を示す図である。ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を基準とし、当該複合体を所定の濃度に希釈して各評価に用いた。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原のみ、（Ｂ）は抗原とａｌｕｍとの混合、（Ｃ）は抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原とａｌｕｍと、１０倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、（Ｅ）は抗原とａｌｕｍと、１００倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原とａｌｕｍと、１０００倍希釈したｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。 図６は、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した結果を示す図である。液性免疫の誘導は、ＩｇＧ抗体価によって評価した。 図７は、ＥＬＩｓｐｏｔ法により、細胞性免疫を誘導するワクチン組成物の構成成分として適切なａｌｕｍの種類を調べた結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は抗原と１０μｇのリン酸アルミニウムとの混合、（Ｂ）は抗原と１μｇのリン酸アルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｃ）は抗原と０．１μｇのリン酸アルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｄ）は抗原と１０μｇの硫酸カリウムアルミニウムとの混合、（Ｅ）は抗原と１μｇの硫酸カリウムアルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、（Ｆ）は抗原と０．１μｇの硫酸カリウムアルミニウムとｐＨ感受性担体との混合、により得られた組成物で免疫した場合の結果である。 図８は、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した場合における、ａｌｕｍが及ぼすｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果への影響について評価した結果を示す図である。（Ａ）はａｌｕｍの種類、（Ｂ）はａｌｕｍの量に関して、評価した結果である。 図９は、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果に及ぼす、ａｌｕｍの影響を調べた結果を示す図である。 図１０は、ｐＨ感受性担体の組成、特にデオキシコール酸の量を変化させた場合における、ａｌｕｍが及ぼすｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果への影響について評価した結果を示す図である。（Ａ）はデオキシコール酸の量が０～６４０ｎｍｏｌの範囲を調べた結果であり、（Ｂ）は０～１００ｎｍｏｌの範囲を拡大したものである。 図１１は、皮内の投与経路における、ワクチン組成物による細胞性免疫の誘導をＥＬＩｓｐｏｔ法により評価した結果を示す図である。各評価において、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用し、ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用した。（Ａ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｂ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｃ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮内投与した結果であり、（Ｄ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮内投与した結果である。また、（Ｅ）～（Ｈ）は、抗原特異性の評価であり、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えずにｓｐｏｔ形成を試みたものである。（Ｅ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｆ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮下投与した結果であり、（Ｇ）は、抗原とａｌｕｍとを混合した組成物を皮内投与した結果であり、（Ｈ）は、抗原とａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した組成物を皮内投与した結果である。
　本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物が提供される。上記アジュバント組成物により、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導することができるアジュバントが提供される。また、当該アジュバント組成物により、安全性の高いアジュバントが提供される。
　＜アジュバント組成物＞
　本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体（以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある）と、アルミニウムを含有する物質と、を含む。すなわち、本形態のアジュバント組成物は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（自然免疫を活性化する物質）として、アルミニウムを含有する物質を含むものである。
　本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、水性溶媒と、を含む。よって、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、が水性溶媒中に分散された形態であるのが好ましい。
　また、本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する。
　以下、図面を参照しながら、本実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
　また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で行う。
　図１は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
　図１によれば、アジュバント組成物４は、両親媒性物質１と、ｐＨ感受性化合物２と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質であるアルミニウムを含有する物質３と、を含む。図１に示すように、一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質３は、両親媒性物質１を構成する疎水性部分に、ｐＨ感受性化合物２とともに会合する。この場合、アジュバント組成物４は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質３は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２を含むｐＨ感受性担体と独立して存在する。
　また、ワクチン組成物６は、アジュバント組成物４と、抗原５とを含む。図１に示されるように、抗原５は、上記２つの形態に係るアジュバント組成物４に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体４に抗原５が包含されるワクチン組成物６については、ワクチン複合体ともいうことができる。
　本明細書において、「アジュバント組成物」とは、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合したものであってもよいし、ｐＨ感受性担体にアルミニウムを含有する物質を担持または包含したもの（アジュバント複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
　また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される２種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの（ワクチン複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
　［ｐＨ感受性担体］
　ｐＨ感受性担体は、ｐＨに感受性を有し、ｐＨが酸性になると細胞内の抗原を細胞質基質に輸送できる機能を有する。
　ｐＨ感受性担体としては、特に制限されないが、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現するものであることが好ましい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
　以下、上記のｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む、膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体について詳細に説明する。
　なお、本形態に係るｐＨ感受性担体は、２０１３年５月２４日に出願された国際公開第２０１３／１８０２５３号に記載された「ｐＨ感受性担体」が同様に使用できる。
　（ｐＨ感受性担体の構造）
　ｐＨ感受性担体は、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質を構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、ｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
　（膜破壊機能促進効果）
　「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
　また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質が複合体（ｐＨ感受性担体）を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａおよび両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、２．５以上であることがより好ましく、５以上であることがさらに好ましく、１０以上であることが特に好ましく、３０以上であることがもっとも好ましい。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、２．５以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましく、５以上であることがさらにより好ましく、１０以上であることが特に好ましく、１５以上であることがもっとも好ましい。
　本発明の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ２以上（好ましくは５以上）であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むｐＨ感受性担体が好ましい。また、本発明の別の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ２以上（好ましくは５以上）であり、かつ、グリチルリチン酸またはグリチルレチン酸、および脂質を含むｐＨ感受性担体であることが好ましい。
　ここで、本明細書において「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
　ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
　ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合の状態を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答することによって膜破壊機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、細胞質基質）に溶出等する。
　ｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。本形態のアジュバント組成物においては、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ５．０で２０％より大きいものであることが好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。本形態のアジュバント組成物は、上述のような膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体を用いればよい。
　また、ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
　本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
　また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４、と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘ、と表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。
　上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸および脂質を含むものが好ましい。
　ｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
　すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、抗原）は、再配列される膜から排除、放出される。
　上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム（endosome）に取り囲まれ、細胞（抗原提示細胞等）に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される（その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示されうる）。このため、ほとんどの抗原は細胞質基質内にデリバリーされない。
　これに対して、本形態に係るｐＨ感受性担体を使用すると、抗原（例えば、外因性抗原）を細胞質基質にデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨが低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。この膜破壊機能（または膜融合機能および膜破壊機能）に伴い、抗原がエンドソームから細胞質基質にデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすれば細胞質基質への輸送が可能となりうることから、抗原とｐＨ感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がｐＨ感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
　（ｐＨ感受性化合物）
　ｐＨ感受性化合物は、上記のように、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。上記「それらの塩」としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
　また、本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが特に好ましい。
　ｐＨ感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、ｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはそれらの塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましい。
　ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１０ｍｏｌ以上の割合で含有されることが好ましく、１０～６４０ｍｏｌの割合で含有されることがより好ましく、２０～３２０ｍｏｌの割合で含有されることがさらに好ましく、２０～１６０ｍｏｌの割合で含有されることが特に好ましい。なお、本明細書において、ｐＨ感受性化合物の、両親媒性物質１００ｍｏｌに対する含有量を、「ｐＨ感受性化合物の複合化量」とも称する。
　（両親媒性物質）
　両親媒性物質は、上記のように、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
　炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加した各ポリオキシエチレン鎖の重合度の合計が、１０～２００であることが好ましく、１５～１００であることがより好ましく、２０～５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１６～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）を用いることが好ましい。
　炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル；ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５を用いることが好ましい。
　モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）は、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’－ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
　ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３～２００であることが好ましく、５～１００であることがより好ましく、１０～５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。例えば、ポリオキシエチレンの重合度が１０であるＰＥＧ（１０）ヒマシ油が好適に用いられる。
　α－トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
　上述の両親媒性物質のうち、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択されることがより好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択されることがさらに好ましい。
　（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
　ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
　ｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα－トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα－トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。
　より好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα－トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα－トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。
　さらに好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣである。
　［アルミニウムを含有する物質］
　本発明のアジュバント組成物は、上述した両親媒性物質およびｐＨ感受性化合物から構成されるｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、「自然免疫を活性化する物質」と称する。）としてアルミニウムを含有する物質と、を含む。
　アルミニウムを含有する物質は、自然免疫を活性化する物質の１種である。自然免疫を活性化する物質とは、構造パターン認識受容体に認識される、あるいは免疫担当細胞に刺激を与え、免疫担当細胞を活性な状態に導く物質を意味する。
　本明細書中において、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として「ａｌｕｍ」と表記する。よって、「ａｌｕｍ」としては、「アルミニウムを含有する物質」も意味する。
　本発明で用いられるアルミニウムを含有する物質としては、ｐＨ感受性担体との併用によって細胞性免疫が誘導可能なものであれば特に制限されないが、アルミニウム塩であるのが好ましく、例えば、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン、ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）などが挙げられる。これらのうち、細胞性免疫の誘導の効果の観点から、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上であるのが好ましい。また、アルミニウムを含有する物質が水酸化アルミニウムであるのがより好ましい。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは水に不溶であり、そのためアジュバント組成物に用いる際には分散媒体に分散させて用いるのが好ましく、このような水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムを用いることで、ゲルタイプアジュバントとすることができる。
　アルミニウムを含有する物質としては、市販品として入手できるアルミニウム化合物を用いることができる。
　例えば、水酸化アルミニウムとしては、シグマ－アルドリッチ製「水酸化アルミニウム」、ＯＺ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ製「ＡｌｕｍＶａｘ　Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　２％」、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ　２％」等が挙げられる。上述の水酸化アルミニウムのうち、「ＡｌｕｍＶａｘ　Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　２％」、「Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ　２％」は、アルミニウムが、金属換算で約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に分散された形態である。
　リン酸アルミニウムとしては、シグマ－アルドリッチ製「リン酸アルミニウム」、ＯＺ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ製「ＡｌｕｍＶａｘ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　２％」、Ａｌｐｈａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｉｎｃ製「Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ」等が挙げられる。上述のリン酸アルミニウムのうち、「Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ」は、アルミニウムが、金属換算で約５ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液に分散された形態である。また、「ＡｌｕｍＶａｘ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　２％」についても、リン酸アルミニウムが水溶液に分散された形態である。
　硫酸アルミニウムとしては、シグマ－アルドリッチ製「硫酸アルミニウム」等を用いることができる。
　硫酸カリウムアルミニウム（Aluminium potassium sulfate）としては、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製「ａｌｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌｓ」等が挙げられる。
　塩化アルミニウムとしては、シグマ－アルドリッチ製「塩化アルミニウム」等を用いることができる。
　分散液形態の「アルミニウムを含有する物質」は分散液のまま用いることができる。特に、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムについては、水溶液中のアルミニウムの凝集粒子が制御しやすいという観点では、分散液の形態の「アルミニウムを含有する物質」をｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液（溶液））と混合するのが好ましい。
　また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムとして固体状態のアルミニウム化合物を用いる場合は、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合させる前にあらかじめ、アルミニウム化合物を分散媒体に分散させて分散液とした形態で用いるのが好ましい。
　アルミニウムを含有する物質として硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、塩化アルミニウムを用いる場合は、固体状態のままｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合してもよいし、あらかじめこれらアルミニウム化合物を水性溶媒に溶解させてから、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性担体の分散液）と混合してもよい。
　アルミニウムを含有する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、アルミニウムを含有する物質の含有量は、使用するアルミニウムを含有する物質の種類によっても異なるが、アルミニウムを含有する物質が、両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１～１０００μｇで含有されるのが好ましく、１～５００μｇで含有されるのがより好ましく、１～１００μｇで含有されるのがさらに好ましい。両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が１μｇ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が１０００μｇ以下であると、副反応が低減できることから好ましい。また、特に、アジュバント組成物１００μＬ中に含まれる両親媒性物質が１０ｎｍｏｌ未満の場合、両親媒性物質１ｎｍｏｌ当たりのアルミニウムを含有する物質の割合は１０～１００μｇとなるのが好ましい。
　アジュバント組成物中のアルミニウムを含有する物質の含有量（濃度）は、アジュバント組成物が水性溶媒に分散された形態である場合、アルミニウムの金属換算で、１μｇ／１００μＬ以上であることが好ましく、１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬであることがより好ましく、１０μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬであることがさらに好ましい。アルミニウムを含有する物質の含有量が１μｇ／１００μＬ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、アルミニウムを含有する物質の含有量が１００μｇ／１００μＬ以下であると、副反応が低減できることから好ましい。
　［水性溶媒］
　アジュバント組成物は、水性溶媒（以下、「水性媒体」と称する場合もある。）を含んでいてもよい。
　アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、ｐＨ感受性担体、アルミニウムを含有する物質は、水性溶媒中で分散した分散液（以下、「水性溶液」とも称する。）となりうる。
　この際、ｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性媒体中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である）を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が１０～２００ｎｍであることが好ましく、１０～１００ｎｍであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎｏＺＳ９０）により測定することができる。
　また、アジュバント組成物は、水性媒体中で、複合体を形成したｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含む複合体（アジュバント複合体）を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、ｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物および両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、１０～２００ｎｍであることが好ましく、１０～１００ｎｍであることがより好ましい。
　なお、アジュバント組成物を含む水性溶液中、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも１つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
　本発明のアジュバント組成物を含む水性溶液の溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
　緩衝剤としては、アジュバント組成物のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン－塩酸緩衝剤、グリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤；トリス－ホウ酸緩衝剤、ホウ酸－ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤；またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１～２００ｍＭであることが好ましく、１～１００ｍＭであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
　ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１～２００ｍＭであることが好ましく、１～１５０ｍＭであることがより好ましい。
　水性溶液中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、７．３μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、８．０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、６．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましく、４．２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがもっとも好ましい。
　さらに、副反応の低減の観点から、特に好ましい形態としては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、１００μｍｏｌ／Ｌ～３００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ～２８０ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
　また、水性溶液中のアルミニウムを含有する物質は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬ、より好ましくは１０μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬの濃度となるようにアルミニウムを含有する物質を用いるのが好ましい。
　［他の成分］
　アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
　安定化剤としては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、１－オクタノール、１－ドデカノール、１－ヘキサドデカノール、１－エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４～２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２～１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸エチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８～１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１～３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のＤ（Ｌ）－アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２～１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８～１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８～１６のジ脂肪酸グリセロール；α－トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
　これら他の成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１５０ｍｏｌ以下であることが好ましく、０ｍｏｌを超えて６６．４ｍｏｌ以下であることがより好ましい。
　本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
　すなわち、本形態に係るアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体に、アルミニウムを含有する物質を併用しても、ｐＨ感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）を好適に発揮することができる。また、ｐＨ感受性担体とともにアルミニウムを含有する物質を用いると、アルミニウムを含有する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
　すなわち、ｐＨ感受性担体は、好ましい形態において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果（場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果）を有する。この際、前記膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）は、上述のように、酸性環境下におけるｐＨ感受性化合物によるｐＨ感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、ｐＨ感受性担体にアルミニウムを含有する物質を併用しても、ｐＨ感受性化合物のｐＨ感受性は変動しないため、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨ感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、ｐＨ感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、アルミニウムを含有する物質をｐＨ感受性担体と併用しても、ｐＨ感受性担体の機能は損なわれない。そして、アルミニウムを含有する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりｐＨ感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にｐＨ感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、ｐＨ感受性担体の機能により抗原を細胞質基質に導入することができるとともに、アルミニウムを含有する物質が作用することにより、細胞質基質に導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的に細胞性免疫（ＣＴＬ）を誘導することができる。
　なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本発明の好ましい一実施形態によれば、液性免疫をも好適に誘導することができる。
　上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。
　本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、ＣＴＬを誘導する場合には、ｐＨ感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原やアルミニウムを含有する物質が細胞質基質に導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原およびアルミニウムを含有する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
　したがって、本発明の別の一実施形態によれば、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
　＜ワクチン組成物＞
　ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
　［アジュバント組成物］
　アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
　［抗原］
　抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
　前記ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、癌抗原、アレルギー関連抗原、疾患関連抗原、移植片拒絶関連抗原等が挙げられる。
　前記ウイルス抗原としては、特に制限されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ－Ｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、並びにＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス抗原；風疹ウイルス抗原；ロタウイルス抗原；サイトメガロウイルス抗原；呼吸器合胞体ウイルス抗原；単純ヘルペスウイルス抗原；水痘帯状疱疹ウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
　前記細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原；ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原、連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、他のマイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；肺炎球菌細菌性抗原；インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌細菌性抗原；リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
　前記真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；ヒストプラズマ真菌性抗原；クリプトコッカス真菌性抗原；コクシジオイデス真菌性抗原；白癬真菌性抗原等が挙げられる。
　前記原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；リーシュマニア抗原；トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
　前記癌抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来する癌抗原が挙げられる。当該癌としては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、***癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、癌抗原の具体例を挙げると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｈｕｍａｎ　ＥＧＦＲ　ｒｅｌａｔｅｄ　２）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＸＡＧＥ（Ｘ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ／ｍａｒｔ－１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｐ５３、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＭＵＣ－１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＷＴ－１（Ｗｉｌｍｓ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　１）、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ　Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、等が挙げられる。
　前記アレルギー関連抗原としては、特に制限されないが、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原；ライグラス花粉抗原等の花粉抗原；イエダニ抗原、ネコ抗原等の動物由来抗原；組織適合性抗原、ペニシリン等の治療薬等が挙げられる。
　前記疾患関連抗原（自己免疫疾患、アレルギー等）は、特に制限されないが、糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、ウェゲナー肉芽腫症、スティーブンス・ジョンソン症候群、間質性肺線維症等が挙げられる。具体例を挙げると、例えば、自己免疫疾患に関与する抗原の例として、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡ９Ｄ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、サイログロブリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。
　前記移植片拒絶関連抗原としては、特に制限されないが、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植片コンポーネント等の移植片レシピエントに移植される移植片の抗原性コンポーネントが挙げられる。
　上述の抗原は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　抗原の含有量は、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２～４００μｇであることが好ましく、１６μｇ～８０μｇであることがより好ましい。
　抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、３％以上であることが好ましく、５～８０％であることがより好ましく、１０～６０％であることがより好ましい。組込率が３％以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、実施例に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
　［添加剤］
　ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
　使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
　ワクチン組成物が錠剤およびカプセルである場合には、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末又は液体のいずれを含有することもできる。
　また、ワクチン組成物が固形製剤である場合には、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、
ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含みうる。
　一方、ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。なお、前記溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
　本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原を効率良くクロスプレゼンテーションさせることにより、細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、ＣＴＬを誘導することができる。なお、本明細書において、「細胞性免疫を誘導する」とは、本明細書に記載のＥＬＩｓｐｏｔ法にて、ワクチン組成物未処置のコントロール（すなわち、抗原とアルミニウムを含有する物質との混合物）と対比して、多くのｓｐｏｔ形成を得られることを意味する。
　また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫を誘導することができる。これにより、ＩｇＧ等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、抗原を投与したコントロールと対比して高いＩｇＧ抗体価となることを意味する。
　［用途］
　本形態のワクチン組成物は、対象者に投与されると、ワクチン組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よく細胞質基質に放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫を誘導することができ、免疫を付与することができる。
　よって、本発明の一形態によると、治療または予防を必要とする対象者に、上記のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
　ワクチン組成物の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与；静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。
　上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
　上記疾患としては、例えば、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）、肝炎、インフルエンザ等のウイルス感染症；百日咳、ジフテリア、破傷風、結核、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌等による細菌感染症；カンジダ等の真菌感染症；マラリア等の原虫性または寄生虫性感染症；白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、***癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等の癌；スギ花粉等によるアレルギー；糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の移植による拒絶反応が挙げられる。
　本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
　また、本発明の一実施形態において、ワクチン組成物は、培養により、細胞に抗原を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、抗原を細胞に輸送するための培養方法が提供される。
　前記培養方法は、細胞を、ワクチン組成物を含む培地で培養する工程を含む。
　前記培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等が挙げられる。
　前記培地へのワクチン組成物の添加量としては、特に制限されないが、両親媒性物質のモル濃度が０．６６μｍｏｌ／Ｌ～１．０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、６．６μｍｏｌ／Ｌ～０．８８ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、７．２μｍｏｌ／Ｌ～０．５６ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
　また、前記培地のｐＨは、７．０以上であることが好ましく、７．２～７．８であることがより好ましい。培地のｐＨが７．０以上であると、培地中でのｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物の不安定化を防止できることから好ましい。
　前記細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
　この際、前記対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
　上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、リンパ球細胞等を用いることがより好ましく、樹状細胞を用いることがさらに好ましい。
　対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者から採血、生検等により当該細胞を採取する。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
　なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
　好ましい一実施形態において、前記治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、ワクチン組成物を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
　これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、前記疾患は上述のとおりである。
　＜アジュバント組成物の製造方法＞
　本発明に係るアジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。
　例えば、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合することにより製造することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、ｐＨ感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とを会合させることにより製造することができる。
　以下、ｐＨ感受性担体として、所定のｐＨ感受性化合物および所定の両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体を用いる好ましい形態について、以下に詳細に説明する。
　本形態に係るアジュバント組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程を含む。
　ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質を会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質が、水性溶液中で接触すればよい。したがって、本形態に係るアジュバント組成物は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。
　ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）＜ａ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法；＜ｂ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法；＜ｃ＞ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。なお、前記バンガム法の具体的な方法としては、例えば以下の方法で行うことができる。すなわち、ガラス容器中で、ｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５～３５℃で薄膜を膨潤させた後、５～３５℃でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。薄膜成分を水性溶液に分散することで、ｐＨ感受性担体を含む水溶液（ｐＨ感受性担体の分散液）が得られる。当該ｐＨ感受性担体を含む水性溶液（ｐＨ感受性担体の分散液）とアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを混合することにより、アジュバント組成物が得られる。ここで、薄膜に添加する水性溶液としてアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を用いる場合は、薄膜を分散することによりアジュバント組成物を得ることができる。バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
　上記の（１）製造方法において、分散液を調製する際に強く分散させるには、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いればよい。また、両親媒性物質を含む水性溶液に、ｐＨ感受性化合物、アルミニウムを含有する物質を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。上記（１）の方法では、各水性溶液を調製する際の温度および水性溶液を混合する温度は、特に制限されないが、５～３５℃であるのが好ましく、常温の１５～２５℃であるのがより好ましい。
　なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および／またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、アジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
　ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液は、後述の「ワクチン組成物の製造方法」に用いる溶液と同様のもの、またはそれを参考にして調製したものが用いられうる。
　＜ワクチン組成物の製造方法＞
　本発明に係るワクチン組成物の製造方法は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。一実施形態に係るワクチン組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程；および前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む。
　会合体に抗原を混合する工程においては、会合体を含む水性溶液に、抗原を混合すればよい。例えば、上記（１）または（２）の方法により得られたアジュバント組成物と、抗原と、を混合することで、ワクチン組成物が得られる。具体的には、（Ｖ－１）＜ａ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液と、抗原を含む水性溶液と、を別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてワクチン組成物を得る方法；＜ｂ＞ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質（またはそれを含む水性溶液）および抗原（またはそれを含む水性溶液）を混合して、ワクチン組成物を得る方法；＜ｃ＞ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてｐＨ感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質（またはそれを含む水性溶液）および抗原（またはそれを含む水性溶液）を混合して、ワクチン組成物を得る方法；（Ｖ－２）上記（２）のバンガム法により得られたアジュバント組成物に、抗原または抗原を含む水性溶液を混合し、ワクチン組成物を得る方法、が挙げられる。この際、ｐＨ感受性担体の構成成分で形成される薄膜に添加する水性溶液として、アルミニウムを含有する物質と抗原とを含む溶液を用いてもよい。また、薄膜に添加する水性溶液として、抗原を含む水性溶液を用いて、その後にアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合してもよい。
　アジュバント組成物またはｐＨ感受性担体の分散液に抗原を含む水性溶液を混合する際の温度は、特に制限されないが、５～３５℃、好ましくは常温の１５～２５℃であるのが好ましい。
　ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液、および抗原とアルミニウムを含有する物質とを含む水性溶液は、下記のように調製したものが用いられうる。
　（ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液）
　前記ｐＨ感受性化合物を含む溶液は、ｐＨ感受性化合物および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
　前記ｐＨ感受性化合物としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
　前記溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液の他、滅菌水等が用いられうる。これらのうち、ワクチン組成物を生体に好適に投与する観点から、生理食塩水、滅菌水、緩衝液を用いることが好ましい。
　前記ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液において、ｐＨ感受性化合物のモル濃度は、５μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、１０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中のｐＨ感受性化合物のモル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましい。
　さらに、副反応の低減の観点から、ｐＨ感受性化合物のモル濃度は、１００μｍｏｌ／Ｌ～３００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ～２００ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
　（両親媒性物質を含む水性溶液）
　前記両親媒性物質を含む溶液は、両親媒性物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
　前記両親媒性物質および前記溶媒としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
　前記両親媒性物質を含む水性溶液において、両親媒性物質のモル濃度は、５μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが好ましく、１０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがより好ましく、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがさらに好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのが特に好ましく、５００μｍｏｌ／Ｌ以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中の両親媒性物質のモル濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが好ましく、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがより好ましく、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがさらに好ましく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのが特に好ましく、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるのがもっとも好ましい。
　さらに、副反応の低減の観点から、両親媒性物質のモル濃度は、５０μｍｏｌ／Ｌ～２００ｍｍｏｌ／Ｌであるのが好ましく、５００μｍｏｌ／Ｌ～１５０ｍｍｏｌ／Ｌであるのがより好ましい。
　（アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液）
　前記アルミニウムを含有する物質を含む溶液は、アルミニウムを含有する物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
　前記アルミニウムを含有する物質および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
　前記アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液におけるアルミニウムの濃度は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬ、より好ましくは１０μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬである。
　（抗原を含む水性溶液）
　前記抗原を含む溶液は、抗原および溶媒を含む。
　前記抗原および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
　混合
　上述のｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液の混合方法は特に制限されない。
　得られた混合液を撹拌することにより構成成分を分散させることが好ましく、当該撹拌は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
　なお、一実施形態において、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液は、別々の溶液とせず、２種以上の成分を組み合わせた混合液としてもよい。例えば、ｐＨ感受性化合物およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を調製し、これを、両親媒性物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液と混合してもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
　＜原料＞
　実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
　（１）ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質等
・デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・コール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・ケノデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ヒオデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・グリコデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・グリチルリチン酸モノアンモニウム（東京化成工業社製）
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＣ－５０）
・ＤＤＰＣ（１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ－１０１０）
・ＤＬＰＣ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ－１２１２）
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０，８０：東京化成工業社製）
・ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ８０：ナカライテスク社製－ソルビタンモノオレエート）
・ポリオキシエチレンヒマシ油（和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン１０ヒマシ油）・トコフェロール（ナカライテスク社製、ＤＬ－α－トコフェロール）
　（２）自然免疫を活性化する刺激を有する物質等
・ＣｐＧ－ＤＮＡ（ＣｐＧ－ＯＤＮ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、ＯＤＮ－２３９５）
・酢酸トコフェロール（酢酸ＤＬ－α－トコフェロール：ナカライテスク社製）
・水酸化アルミニウム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ　２％）
・リン酸アルミニウム（Ａｌｐｈａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉａｏｎａｌ社製、Ａｄｊｕｐｈｏｓ）
・硫酸カリウムアルミニウム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製、ａｌｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌｓ）
　（３）溶媒等
・注射用水：（大塚製薬株式会社製）
・ＭＥＳ－Ｎａ（メルク社製）
・塩化ナトリウム（関東化学社製）
・ＰＢＳ　Ｔａｂｌｔｅｓ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ：タカラバイオ社製）
・メタノール（ナカライテスク社製）
・エタノール（関東化学社製）
・クロロホルム（和光純薬工業社製）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・ＯＶＡペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ピーエイチジャパン委託合成）（以下、単に「ペプチド」とも称する。）
・ＯＶＡタンパク質（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：和光純薬工業社製、オボアルブミン低エンドトキシン）（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する。）
　（４）培地等
・ＲＰＭＩ（ナカライテスク社製、ＲＰＭＩ　１６４０培地（液体））
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ　Ｍｉｘｅｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ　Ｏｒｉｇｉｎ：Ｇｉｂｃｏ社製）
・ＲＢＣ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）：赤血球溶血バッファー
・ＨＢＳＳ（Ｈａｂｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ナカライテスク社製）
・Ｄ－ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ：ナカライテスク社製）
　（５）その他試薬
・リン脂質Ｃ－テストワコー（和光純薬工業株式会社製）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社製）
・ＤＰＸ（ｐ－ｘｙｌｅｎｅ－ｂｉｓ－ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（和光純薬工業社製）
・ＮＢＤ－ＰＥ（１，２－Ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ（７－ｎｉｔｒｏ－２－１，３－ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ　ｐｏｌａｒ　ｌｉｐｉｄｓ社製）・Ｒｈ－ＰＥ（１，２－Ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＡｖＡｎｔｉ　ｐｏｌａｒ　ｌｉｐｉｄｓ社製）：蛍光標識脂質
・Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔ（ＢＤ　バイオサイエンス社製）
・ＡＥＣ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｅｔ（ＢＤ　バイオサイエンス社製）
・炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）
・炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・二次抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社製）
・アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト株式会社製）
　（６）動物
　雌、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢）は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
　＜使用機器＞
　超音波照射装置：ＵＳＣ－Ｊ
　分光光度計：ＦＰ－６５００
　ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計：ＵＶ－３６００
　ＣＯ２、インキュベーター：ＭＣＯ２０ＡＩＣ
　＜細胞の培養＞
　細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。
　＜試料の調製等＞
（ＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ）
　ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭの配合量で調製した。ＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒは、特別な記載のない限りｐＨは７．４である。
（ＰＢＳ）
　ＰＢＳは、１０錠のＰＢＳ　Ｔａｂｌｔｅｓ（タカラバイオ社製）を、１０００ｍＬの蒸留水に溶解させ、調製した。なお、ｐＨは、７．３５～７．６５である。あるいは、購入したＤ－ＰＢＳをＰＢＳとして使用した。
（ＲＰＭＩメディウム）
　抗生物質としてペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。また、必要に応じてＦＢＳを追加で添加し、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムとした。
（自然免疫を刺激する物質の候補（以下、候補物質とも表記）の一次溶液）
・トコフェロールの一次溶液
　１０ｍｇのトコフェロールを秤量し、１．０ｍＬのエタノールに溶解させた。さらに、ＰＢＳにて１０倍に希釈し、トコフェロールの一次溶液を調製した。
・酢酸トコフェロールの一次溶液
１０ｍｇの酢酸トコフェロールを秤量し、１．０ｍＬのエタノールに溶解させた。さらに、ＰＢＳにて１０倍に希釈し、酢酸トコフェロールの一次溶液を調製した。
・ａｌｕｍの一次溶液
　ａｌｕｍとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。
　用いたａｌｕｍが水酸化アルミニウムの場合、最終濃度が１００μｇ／１００μＬにおいては、購入した試薬の原液（アルミニウムの濃度（アルミニウム金属換算）：約１０ｍｇ／ｍＬ）を、ａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が、１００μｇ／１００μＬよりも薄い場合、購入した試薬の原液をＰＢＳにて希釈し、ａｌｕｍの一次溶液とした後、アジュバント組成物の調製に用いた。具体的には、最終濃度が１０μｇ／１００μＬの場合、購入した試薬の原液をＰＢＳにて１０倍に希釈し、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が１μｇ／１００μＬの場合は、ＰＢＳにて１００倍に希釈し、最終濃度が０．１μｇ／１００μＬの場合は、ＰＢＳにて１０００倍に希釈したものを、ａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。
　用いたａｌｕｍがリン酸アルミニウムの場合、水酸化アルミニウムと同様に、購入した試薬の原液、および購入した試薬の原液をＰＢＳにて希釈したものをａｌｕｍの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。
　硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）は、１０ｍｇを秤量し、１ｍＬの注射用水にて溶解させた。本溶液を、水酸化アルミニウムにおける、購入した試薬の原液と同様に扱い、アジュバント組成物の調製に使用した。
　（ｐＨ感受性担体の調製）
　バンガム法による製造
　メタノール（またはクロロホルム）に溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、メタノール（またはクロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物を、１０ｍＬナスフラスコ混合し、溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に０．５ｍＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（溶出性試験および膜融合試験の場合）または０．５ｍＬのＰＢＳ（マウスへの免疫の場合）を添加し、超音波照射装置を用いて分散させ、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、ＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳにて希釈した。
　混合による製造
　所定量のｐＨ感受性化合物を秤量し、ＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳに溶解させ、ｐＨ感受性化合物の溶液を調製した。次に、所定量の両親媒性物質を秤量し、先に調製したｐＨ感受性化合物に溶液に添加し、混合することで、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。操作は、室温にて実施した。具体的には、１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸から成るｐＨ感受性担体の場合、１３．８ｍｇのデオキシコール酸ナトリウム一水和物を秤量し、１０ｍＬのＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳに溶解させた。次に、１２．４ｍｇのＤＬＰＣを秤量し、先に調製したデオキシコール酸の溶液に添加し、混合することで、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、ＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳにて希釈した。
　なお、両親媒性物質とｐＨ感受性化合物との比率は、所望の比率となるよう調整した。また、複数の両親媒性物質を使用する場合は、両親媒性物質の総量が、所望のモル数（１０００ｎｍｏｌ）となるように調整した。また、実施例や図の説明におけるｐＨ感受性化合物の使用量は、１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対する使用量である。
　（アジュバント組成物およびワクチン組成物の調製）
　調製したｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、自然免疫を刺激する物質の候補（以下、候補物質とも表記）の一次溶液を添加し、混合した。濃度を調製するための追加のＭＥＳ
　ＢｕｆｆｅｒあるいはＰＢＳを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。
　また、得られたアジュバント組成物に、所定量のＯＶＡを溶解させたＰＢＳを添加し、混合することで、ワクチン組成物を調製した。
　評価（４）の実験以外は、１００ｎｍｏｌ／１００μＬの両親媒性物質の濃度になるように、ｐＨ感受性担体、アジュバント組成物、およびワクチン組成物を調製した。評価（４）の実験は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を、希釈して使用した。最終的に、１００ｎｍｏｌ／１００μＬ～０．１ｎｍｏｌ／１００μＬの両親媒性物質の濃度となるようにワクチン組成物を調製した。
　ＣｐＧ－ＤＮＡ（ＣｐＧ－ＯＤＮ）を用いる場合は、２００μｇのＣｐＧ－ＯＤＮを２００μＬの注射用水に溶解させ、候補物質の一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に使用した。
　（比較試料の調製）
　比較試料として、抗原のみ、抗原と候補物質の混合（候補物質単独とも表記）、を調製した。また、溶出性試験においては、両親媒性物質単独の分散液、ｐＨ感受性担体単独の分散液も調製した。
　＜測定方法＞
　（溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定）
　Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２００８　１９　１０４０－１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。
　クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ－Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒとＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ－テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて濃度を調整した。
　濃度を調製したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調整した２９６０μＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ－６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。
　なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　（膜融合試験：Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）の測定）
　Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２００８　２９　４０２９－４０３６に記載の方法に従い、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して評価した。蛍光標識は、ＮＢＤ－ＰＥ、Ｒｈ－ＰＥを用いた。
　ＥＹＰＣに対して０．６ｍｏｌ％のＮＢＤ－ＰＥ、およびＲｈ－ＰＥを含むＥＹＰＣ（ＥＹＰＣ１０００ｎｍｏｌ）の薄膜を作製し、１．０ｍＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ－Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。
　二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調製した２９６０μＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて６０分間インキュベーションした後、分光光度計（ＦＰ－６５００）を用いて４５０ｎｍの励起光による５００ｎｍ～６２０ｎｍの蛍光スペクトルを測定し、５２０ｎｍと５８０ｎｍとの蛍光強度比を求めた。
　融合率は、上記で得られた二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比を０％とし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と、評価サンプル分散液と、をメタノール処理したものを１００％として算出した。なお、メタノール処理は二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液との両者をメタノールに溶解させた後、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とし、３．０ｍＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒと超音波照射装置を用いて分散させて実施した。
　具体的には、融合率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定して得られた蛍光強度比をＲとし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比をＲ０、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と評価サンプル分散液をメタノール処理して得られた蛍光強度比をＲ１００と表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　（マウスへの免疫）
　投与は麻酔下にて実施した。皮下投与の場合は、背部１箇所に１００μＬ／ｈｅａｄにて皮下注射した。ａｌｕｍの投与量は０～１００μｇ／ｈｅａｄとし、自然免疫を刺激する物質の候補は１０μｇ／ｈｅａｄとした。ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：１００ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：１０～６４０ｎｍｏｌ／ｈｅａｄを、基本の投与濃度とし、一部、希釈した条件にて投与を行った。抗原は、ＯＶＡタンパク質、あるいはＯＶＡペプチドを使用し、８０μｇ／ｈｅａｄとした。また、皮内投与の場合は、皮下投与と同様の投与液を用いて、背部１箇所に２０μＬ／ｈｅａｄにて皮内注射した。細胞性免疫を評価する場合は、投与を１回とし、投与から７日後にアッセイを実施した。液性免疫を評価する場合は、投与を２回とし、初回投与から１４日後に２回目の投与を行った。さらに、２回目の投与から１４日後にアッセイを実施した。
　（マウス脾臓からの細胞分散液の調製）
　最終の投与から７日目においてマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。３．０ｍＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加した後、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。
　（ＥＬＩｓｐｏｔ法）
　ＥＬＩｓｐｏｔ法は、Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔを用いて実施した。細胞を播種する前日に、９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩｓｐｏｔプレートにキットに付属のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて洗浄した後、２００μＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加し、３７℃にて２時間静置しブロッキングを行った。１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにてプレートを洗浄した後、抗原の再刺激を加える場合は、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加し、抗原の再刺激を加えない場合は１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加した。前記プレートに、脾臓の細胞分散液を所定の細胞数となるように播種し、最後に、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて１穴あたりの全量が２００μＬとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。
　プレートの呈色は、Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔ、およびＡＥＣ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｅｔに記載のプロトコールに従って実施した。
　（抗体価の測定）
　２回目の投与を行う前日に部分採血を行い、１回投与の抗体価を調べた。また、２回目の投与から１４日後に採血を行い、２回投与の抗体価を調べた。採血した血液を室温にて２時間静置し、遠心分離することにより血清を得た。５００ｍＬのＰＢＳに５ｇのアルブミンを溶解し、Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒとした。１．４７ｇの炭酸水素ナトリウムと０．８０ｇの炭酸ナトリウムを５００ｍＬの水に溶解させ、Ｃｏａｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒとした。プレートの洗浄には、５００ｍＬのＰＢＳに２．５ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を添加したものを使用した。
　ＯＶＡタンパク質をＣｏａｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、０．１μｇ／ｗｅｌｌ（１００μＬ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに添加した。３７℃にて２時間静置した後、３００μＬのＢｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒと置換し、４℃にて一晩静置した。プレートを洗浄した後、所定の倍率に希釈した血清を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒにて１０００倍希釈した二次抗体溶液を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、３７℃にて２時間静置した。プレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色を行い、抗体価を求めた。
　［評価］
　前記記載の方法に従って調製した分散液を用いて各種評価を行った。
　（１）ｐＨ感受性担体との併用に適切な、自然免疫を活性化する物質の選定
　ｐＨ感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導する高い効果を有する、自然免疫を活性化する物質の選定を行った。入手性および注射実績を考慮して、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ａｌｕｍ（水酸化アルミニウム）を、自然免疫を活性化する物質の候補（以下、候補物質とも表記）とし、ｐＨ感受性担体との併用による、細胞性免疫誘導の効果を調べた。
　ｐＨ感受性担体は、１匹あたり１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸の複合体を使用した。候補物質らは、いずれも１匹あたり１０μｇとし、抗原は、１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、投与量を調製するためのＰＢＳに、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）、候補物質、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。なお、投与液は、１００μＬ中、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）、候補物質、抗原が所定の濃度となるように調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。
　また、比較試料としては、抗原のみ、抗原と候補物質との混合とし、投与液としては、ＰＢＳに抗原、または抗原および候補物質を混合して調製し、１匹あたり１００μＬを投与した。
　また、ＥＬＩｓｐｏｔ法による細胞性免疫（ＣＴＬ）の誘導は、コントロール（抗原およびアルミニウムを含有する物質の混合）との比較を目視で行い、以下の基準により評価した。
　○：コントロールと比べて、明確に細胞性免疫の誘導が見られる
　△：コントロールと比べて、わずかに細胞性免疫の誘導が見られる
　×：コントロールと同等または同等以下の細胞性免疫の誘導である。
　評価の結果、当然のことながら、抗原のみはｓｐｏｔの形成に至らず、細胞性免疫は誘導されなかった（図２（Ａ））。また、比較試料である、トコフェロール、および酢酸トコフェロールにおいても、抗原のみと同等にｓｐｏｔは形成されず、細胞性免疫は誘導されなかった（図２（Ｂ）（Ｃ））。さらに、ａｌｕｍは細胞性免疫を誘導できないことが広く知られていることから、図２（Ｄ）におけるｓｐｏｔ形成は、細胞性免疫を誘導していないものと判断した。それゆえ、図２（Ｄ）よりも多くのｓｐｏｔ形成数である場合において、細胞性免疫を誘導したものと考える。
　トコフェロールとｐＨ感受性担体との併用、および酢酸トコフェロールとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独（図２（Ｄ）の抗原＋ａｌｕｍ）によるｓｐｏｔ形成数と同程度であり、細胞性免疫を誘導できなかった（図２（Ｅ）（Ｆ））。一方、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独のｓｐｏｔ形成と比較して、非常に多くのｓｐｏｔを形成した（図２（Ｇ））。ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用することにより、細胞性免疫の誘導に至ることが示された。本結果から、ａｌｕｍは、ｐＨ感受性担体との併用に適切な、自然免疫を刺激（活性化）する物質であると示された。
　（２）ＣｐＧ－ＯＤＮとの比較、および抗原特異性の評価
　ＣｐＧ－ＯＤＮは特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドであり、細胞性免疫を誘導することが報告されている試薬である。本試薬をポジティブコントロールとして用いることで、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、細胞性免疫の誘導活性の高さを評価した。ＣｐＧ－ＯＤＮは、１匹あたり１０μｇを使用し、他の実験条件は全て（１）と同じとした。評価は（１）のＥＬＩｓｐｏｔと同一のプレートにて、実施した。
　ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって得られたｓｐｏｔ形成は、ＣｐＧ－ＯＤＮによって得られたものと比較して、多数であった（図３（Ｂ）（Ｃ））。一般に知られている試薬であるＣｐＧ－ＯＤＮと比較して高い活性であったことから、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、細胞性免疫の高い誘導を可能とすることが明らかとなった。
　また、誘導した免疫が抗原特異的であることは、実使用の観点から非常に重要である。そこで、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫に対して、抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。具体的には、免疫した動物から回収した脾臓細胞の分散液を、ＥＬＩｓｐｏｔプレートに播種し、ＳＩＩＮＦＥＫＬのペプチドを加えることなく、ＩＦＮ－γ産生細胞によるｓｐｏｔ形成を行った。その結果、ｓｐｏｔ形成は全く見られず、図３（Ｂ）における、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって得られるｓｐｏｔの形成は、完全に消失した（図３（Ｄ））。ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫は、確かに抗原特異的であることが示された。また、誘導された細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬのクラスＩペプチドに反応したことからＣＴＬであることが示唆された。
　（３）細胞性免疫を誘導するために必要なａｌｕｍの量について
　ａｌｕｍ（水酸化アルミニウム）は、ｐＨ感受性担体との併用し、細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。そこで、細胞性免疫を誘導するために必要となるａｌｕｍの量を調べた。ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１匹あたり、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。ａｌｕｍは、１匹あたり１００～０．１μｇとし、抗原は１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。なお、ａｌｕｍ単独とは、抗原とａｌｕｍとを混合したものを指す。
　評価の結果、１００～１μｇのａｌｕｍであるワクチン組成物（溶液中のａｌｕｍ濃度としては１００μｇ／１００μＬ～１μｇ／１００μＬ）（図中、抗原＋ａｌｕｍ＋ｐＨ感受性担体）は、形成されたｓｐｏｔ数が、ａｌｕｍ単独（図中、抗原＋ａｌｕｍ）によるそれより多かった（図４（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ））。一方、ａｌｕｍの使用量が０．１μｇの場合、形成されたｓｐｏｔ数は、ａｌｕｍ単独のそれと同等であった（図４（Ｂ）（Ｆ））。以上の結果から、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１～１００μｇのａｌｕｍの量（溶液中のａｌｕｍ濃度としては１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導する効果が確認された。１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対して、１～１００μｇのａｌｕｍの量（ａｌｕｍ濃度：１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。
　（４）細胞性免疫を誘導するために必要なｐＨ感受性担体の量について
　次に、細胞性免疫を誘導するために必要な、ｐＨ感受性担体の量を調べた。１匹あたり１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、種々の倍率に希釈したｐＨ感受性担体の分散液を用いて、投与液を調製した。ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して、１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸である複合体を使用した。その他の条件は（１）および（３）と同様とした。
　評価の結果、ｐＨ感受性担体の希釈倍率が、１～１００倍である場合、調製した投与液によるｓｐｏｔの形成は、ａｌｕｍ単独よりも、多数であった（図５（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ））。一方、希釈倍率が１０００倍の投与液は、ａｌｕｍ単独よりも若干多めのｓｐｏｔ形成数であった（図５（Ｂ）（Ｆ））。以上より、ｐＨ感受性担体を構成するＤＬＰＣが１～１０００ｎｍｏｌ／１００μＬの濃度、デオキシコール酸が１．６～１６０ｎｍｏｌ／１０００μＬの濃度にて調製した投与液は、細胞性免疫を誘導することが確認された。すなわち、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質の濃度が、１～１０００ｎｍｏｌ／１００μＬである場合、ワクチン組成物は、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。
　（５）液性免疫の誘導について
　ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した。液性免疫の誘導は、ＩｇＧ抗体価によって評価した。１回あたりの投与量として、ａｌｕｍは１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体は１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸からなる複合体を使用した。抗原は、８０μｇのＯＶＡタンパク質とした。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。液性免疫を評価するため、投与は２回行った。抗体価の評価は、前記記載の抗体価の測定に従って実施した。
　評価の結果、ａｌｕｍ単独が最も高いＩｇＧ抗体価を示し、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、次に高い抗体価を示した（図６、２回投与）。また、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ＰＢＳや抗原のみの群と比較して、高いＩｇＧ抗体価を示した（図６、２回投与）。この結果から、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用したワクチン組成物は、液性免疫を誘導することが可能であることが示された。
　ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを併用したワクチン組成物は、細胞性免疫および液性免疫の双方を誘導・増強することが可能であると明らかとなった。したがって、本発明に係るアジュバント組成物は、優秀なアジュバントとして利用されうる。
　（６）ａｌｕｍの種類に関して
　本明細書中において、ａｌｕｍは、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として用いている。ａｌｕｍの種類としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらの中から、入手が可能、かつｐＨ感受性担体との併用によって、細胞性免疫の誘導が可能なものを調べた。
　本実施例において、ａｌｕｍはリン酸アルミニウム、および硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。また、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１匹あたり、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。ａｌｕｍは、（３）の実施例を参考にして、１匹あたり１～０．１μｇとし、抗原は１匹あたり８０μｇのＯＶＡタンパク質を使用した。投与液は、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、投与量を調製するためのＰＢＳ、ａｌｕｍ、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、１匹あたり１００μＬとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。
　評価の結果、抗原とリン酸アルミニウム、および抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものは、ｓｐｏｔの形成をほとんど認められず、細胞性免疫を誘導できなかった（図７（Ａ）（Ｄ））。１μｇのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合よりも多くのｓｐｏｔ形成がなされ、細胞性免疫が誘導された（図７（Ｂ））。一方、０．１μｇのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合と、同様のｓｐｏｔ形成となり、細胞性免疫は誘導されなかった（図７（Ｃ））。ワクチン組成物における、細胞性免疫を誘導するａｌｕｍの最小量として、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様の結果を示したことから、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様に、１００ｎｍｏｌの両親媒性物質に対して、１～１００μｇのａｌｕｍの量（ａｌｕｍ濃度：１μｇ／１００μＬ～１００μｇ／１００μＬ）において、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。
　また、１μｇの硫酸カリウムアルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものよりも若干多くのｓｐｏｔ形成が見られ、細胞性免疫が誘導されていることが示唆された（図７（Ｅ））。
　以上の結果から、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは、硫酸カリウムアルミニウムに比べて効果が高いことがわかった。
　ｐＨ感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導するワクチン組成物の構成成分として、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムは、特に有用であることが明らかとなった。
　（７）ａｌｕｍが及ぼす、ｐＨ感受性担体の機能への影響について
　（７－１）膜破壊機能促進効果に及ぼす、ａｌｕｍの種類、およびａｌｕｍの量の影響について
　ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果は、細胞のエンドソーム膜を破壊し、クロスプレゼンテーションを促進させるための、重要な機能である。また、ａｌｕｍは種々の物質を吸着させることが知られている。そのため、ａｌｕｍとｐＨ感受性担体とを混合した場合における、ｐＨ感受性担体の機能への影響を調べた。
　まず、膜破壊機能促進効果に及ぼす影響について調べた。評価サンプルの全量を１００μＬとなるように、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合して調製した。一晩インキュベートした後、これらの評価サンプルの一部（２０μＬ）を用いて、溶出性試験を行った。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。１００μＬ中の量として、ｐＨ感受性担体は、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸である複合体を使用し、ａｌｕｍは、１０μｇの、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）を使用した。
　デオキシコール酸単独は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて１５％程度の溶出率であり、ａｌｕｍを混合していないｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて６０％程度の溶出率であった（図８（Ａ））。ＤＬＰＣ単独の溶出率は、ｐＨ５．０にて２％以下であったことから（図１０（Ａ））、確かに、ｐＨ感受性担体は膜破壊機能促進効果を有していた。また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）の、いずれのａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体においても、それらはｐＨ７．４においてほとんど溶出を引き起こさず、ｐＨ５．０では６０％程度の溶出を引き起こした（図８（Ａ））。すなわち、いずれのａｌｕｍを混合した場合においても、ｐＨ感受性担体は、式（１）および式（２）を満たし、確かに膜破壊機能促進効果を有することが確認された。また、いずれのａｌｕｍにおいても、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４および５．０において、ａｌｕｍと混合していないｐＨ感受性担体と、同様の溶出率を示したことから、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
　続いて、混合するａｌｕｍの量の影響について検討した。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）のａｌｕｍを、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸であるｐＨ感受性担体に対して、０～１００μｇとなるように混合し（全量１００μＬ）、一晩インキュベートした後、溶出性試験を行った。なお、１００μｇの硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）の溶液は、低いｐＨとなったため、測定を行わなかった。その結果、いずれのａｌｕｍの、いずれの添加量においても、ｐＨ５．０の溶出率は６０％程度の値を示し、ａｌｕｍを混合しなかったものから、変化しなかった（８図（Ｂ））。したがって、いずれの種類の、いずれの添加量においても、ａｌｕｍは、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが示唆された。
　（７－２）膜融合機能促進効果に及ぼすａｌｕｍの影響
　続いて、膜融合機能促進効果に及ぼすａｌｕｍの影響を調べた。図９は、種々のａｌｕｍと混合した場合における、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果を調べた結果である。両親媒性物質は１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣとし、ｐＨ感受性化合物は１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸とし、ａｌｕｍは１０μｇとした。全量を１００μＬとなるように、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を膜融合試験にて評価した。膜融合試験は、前記記載の膜融合試験に従って実施した。
　ｐＨ感受性担体は、いずれのａｌｕｍを混合した場合においても、ｐＨ５．０において約７０％もの融合率を示し、式（３）を満たす結果となった（図９）。すなわち、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、確かに膜融合機能促進効果を有していた。また、いずれのａｌｕｍにおいても、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ７．４および５．０において、ａｌｕｍと混合していないｐＨ感受性担体と同様の融合率を示した（図９）。それゆえ、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の膜融合機能促進効果に影響を及ぼさないことが確認された。
　ｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合に関わらず、同様の膜破壊機能促進効果、および膜融合機能促進効果を示したことから、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
　（７－３）種々のデオキシコール酸量であるｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
　次に、ｐＨ感受性担体の組成を変化させた場合における、ｐＨ感受性担体の機能に及ぼすａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとして、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体として、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと、種々の量のデオキシコール酸からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７－１）と同様に、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
　ｐＨ５．０において、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれの量のデオキシコール酸においても、ａｌｕｍと混合していないものと同等の溶出率であった（図１０（Ａ）（Ｂ））。すなわち、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと、１０～６４０ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物であるｐＨ感受性担体に対して、ａｌｕｍとの混合は、機能に影響を及ぼさないことが示された。いずれのｐＨ感受性化合物の量である、ｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍの混合は、機能に影響を及ぼさないと示唆された。
　また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物の量が１０～６４０ｎｍｏｌのいずれの量においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。
　（７－４）種々のｐＨ感受性化合物から成るｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
　さらに、種々のｐＨ感受性化合物から構成されるｐＨ感受性担体の機能において、ａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとしては、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体としては、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌの種々のｐＨ感受性化合物からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７－１）と同様に、ｐＨ感受性担体とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。ＤＬＰＣ（両親媒性物質）単独による溶出率は、ｐＨ５．０にて２．０％以下であった。
　いずれのｐＨ感受性化合物を用いて調製したｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍと混合したものは、ａｌｕｍと混合していないものと比べて、同等の溶出率を示した（表１、ｐＨ７．４、およびｐＨ５．０）。いずれのｐＨ感受性化合物においても、ａｌｕｍとの混合は、ｐＨ感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが確認された。
　また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれのｐＨ感受性化合物を用いた場合においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（７－５）種々の両親媒性物質からなるｐＨ感受性担体における、ａｌｕｍの影響
　また、種々の両親媒性物質からなるｐＨ感受性担体の機能において、ａｌｕｍの影響を調べた。ａｌｕｍとしては、１０μｇの水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体としては、１００ｎｍｏｌの種々の両親媒性物質および１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸からなる複合体を使用した（全量１００μＬ）。（７－１）と同様に、１００ｎｍｏｌの所定の両親媒性物質および１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むｐＨ感受性担体の分散液（溶液）とａｌｕｍとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
　いずれの両親媒性物質を用いて調製したｐＨ感受性担体においても、ａｌｕｍと混合したものは、ａｌｕｍと混合していないものと比べて、同等以上の溶出率を示した（表２－２、表２－３）。なお、デオキシコール酸（ｐＨ感受性化合物）単独による溶出率は、ｐＨ７．４にて１％以下、ｐＨ５．０にて１５％程度であった。
　また、ａｌｕｍと混合したｐＨ感受性担体は、いずれの両親媒性物質を用いた場合においても、式（１）および式（２）を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのｐＨ感受性担体は、ａｌｕｍとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる（表２－２、表２－３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（８）投与経路の検討
　一般的に、皮内には多くの免疫担当細胞が存在しており、皮内にワクチンを接種することで、免疫惹起の亢進や抗原量の削減が可能であることが知られている。そこで、ワクチン組成物を皮内に投与した場合における、細胞性免疫の誘導を確認した。
　ａｌｕｍは水酸化アルミニウムを使用し、ｐＨ感受性担体はＤＬＰＣとデオキシコール酸の複合体を使用した（１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣおよび１６０ｎｍｏｌのデオキシコール酸）。皮下投与の場合、１匹あたりの投与量を１００μＬとし、１０μｇのａｌｕｍ、８０μｇのＯＶＡ、１００ｎｍｏｌのＤＬＰＣを含むｐＨ感受性担体を投与した。また、皮内投与の場合、１匹あたりの投与量を２０μＬとし、２μｇのａｌｕｍ、１６μｇのＯＶＡ、２０ｎｍｏｌのＤＬＰＣを含むｐＨ感受性担体を投与した。具体的には、皮内投与は、皮下投与に用いた投与液を使用し、投与量を１００μＬから２０μＬとすることで、前記記載の量を調製した。細胞性免疫の誘導は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法に従って評価した。
　評価の結果、皮内投与におけるａｌｕｍとｐＨ感受性担体との併用は、ａｌｕｍ単独と比較して、多数のｓｐｏｔを形成した（図１１（Ｃ）（Ｄ））。ワクチン組成物は、皮内の投与経路においても、細胞性免疫を誘導することが確認された。また、得られた結果を皮下投与と比較したところ、ワクチン組成物の皮内投与は、少ない投与量であるにも関わらず、ワクチン組成物の皮下投与よりも多数のｓｐｏｔを形成した（図１１（Ｂ）（Ｄ））。ワクチン組成物の細胞性免疫を誘導する効果は、皮内投与によって、より高まることが明らかとなった。
　続いて、誘導した細胞性免疫の抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のＥＬＩｓｐｏｔ法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。その結果、ワクチン組成物の皮内投与は、ｓｐｏｔを形成しなかった（図１１（Ｈ））。ワクチン組成物を皮内投与することによって誘導された細胞性免疫は、抗原特異的であることが明らかとなった。
　本出願は、２０１５年６月２日に出願された日本特許出願番号２０１５－１１２５１９号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として組み入れられている。

Claims (11)

  1. 　ｐＨ感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物。
  2. 　前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
  3. 　前記ｐＨ感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
    　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
    を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
  4. 　前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、アルミニウム金属換算で１～１０００μｇで含有される、請求項３に記載のアジュバント組成物。
  5. 　前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性物質１００ｍｏｌに対して１０ｍｏｌ以上の割合で含有される、請求項３または４に記載のアジュバント組成物。
  6. 　請求項１または２に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
  7. 　請求項３～５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
  8. 　前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２～４００μｇである、請求項７に記載のワクチン組成物。
  9. 　前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、請求項６～８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
  10. 　デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
    　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
    　アルミニウムを含有する物質と、
    を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法。
  11. 　デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
    　炭素数１０～１２のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
    　アルミニウムを含有する物質と、
    を会合させる工程；および
    　前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
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