JPWO2016194685A1 - アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物 - Google Patents
アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物に関する。本発明によれば、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントが提供される。【選択図】図1
Description
本発明は、アルミニウムを含有するアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
免疫系とは、生体内に侵入した異物や異常細胞等を排除して、生体を病気等から保護する防御機構である。また、アジュバントとは、ワクチンの効果を増強するために用いられる物質である。
免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という2種の機構を介して発現する。
液性免疫は、抗体や補体など血清中に溶解して存在する成分を中心とした機構である。抗体の誘導は、ワクチンの観点から重要であり、通常、以下のように発現する。すなわち、生体内に侵入した細菌等の外因性抗原が、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、抗原提示細胞内のエンドソームでタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でCD4陽性T細胞に提示されて、CD4陽性T細胞が活性化される。そして、活性化されたCD4陽性T細胞が、サイトカインの放出等を行うことにより、最終的にB細胞から抗体が産生される。なお、上記MHCクラスII分子は、マクロファージ、樹状細胞、活性化T細胞、B細胞等に発現する。抗体を増強させるアジュバントは、公的に承認されたものが多数存在している。中でもアルミニウムを含有する物質は、古い歴史を有しており、全世界において広く使用されている。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらは単に、alumと総称されることもある。
一方、細胞性免疫は、マクロファージ、細胞傷害性T細胞(CTL)、ナチュラルキラー細胞など、異物排除を担当する細胞を中心とした機構である。細胞性免疫の誘導は、ウイルス感染細胞や癌細胞などを排除することができるため、免疫による治療の観点から大きく注目されている。特に、CTLの誘導は癌免疫療法への応用から、実現が期待されている。CTLの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞や癌細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、MHCクラスI分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でCD8陽性T細胞に提示されて、CD8陽性T細胞が活性化される。そして、活性化されたCD8陽性T細胞が、細胞傷害性T細胞(CTL)へと分化する。なお、上記MHCクラスI分子は、ほとんどすべての有核細胞および血小板の細胞表面に存在する。
近年では、外因性抗原を用いて積極的にCTLを誘導する、いわゆるクロスプレゼンテーションについての検討も多くなされている。より詳細には、外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、MHCクラスII分子と結合する。しかしながら、クロスプレゼンテーションにおいては、一部の量でも、外因性抗原を細胞膜あるいはエンドソームの膜を通過させて細胞質基質に移行させることにより、細胞質基質に移行した外因性抗原が内因性抗原のように作用し、最終的にMHCクラスI分子と結合して、CTLを誘導する。
クロスプレゼンテーションにおいては、外因性抗原がエンドソームの膜を通過する必要があり、これについて種々の検討がなされている。例えば、Bioconjug Chem. 2009 Feb.20(2):241−248には、pH感受性のポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)共役体を用いて抗原を効率良く細胞質基質に輸送することが記載されている。また、Immune Netw. 2013 Oct 13(5) 177−183には、癌免疫療法のためのナノ粒子に基づくワクチンデリバリーが記載されている。
細胞性免疫を増強させるアジュバントは、現時点において、公的に承認されたものは存在しておらず、物質の探索や新規合成、あるいはウイルス成分の利用などが試みられている。アルミニウムを含有する物質など、抗体を増強するためのアジュバントは、残念ながら細胞性免疫を増強する効果を有していないことが報告されている(Immunology and Cell Biology 2004 82,497−505)。
CTLをはじめとする細胞性免疫の誘導は、治療を目的としたワクチン開発の観点から、実現が強く望まれており、アジュバント分子の探索やクロスプレゼンテーションを促進される検討が盛んに行われているが、依然として誘導の効果は十分とは言えない。
また、検討の多くは、新規の合成材料や、ウイルスの成分を用いたものが多く、安全性の観点から懸念が存在している。
そこで、本発明は、安全性が高く、かつ、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導するアジュバントの提供を目的とする。
本発明者は鋭意研究を行った。その結果、pHに感受性を有する担体に、自然免疫を活性化する刺激を有する物質(以下、単に「自然免疫を活性化する物質」と称する場合もある。)としてアルミニウムを含有する物質を併用することで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の上記課題は以下の手段により達成される。
(1)pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物;
(2)前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される1種以上である、(1)に記載のアジュバント組成物;
(3)前記pH感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、(1)または(2)に記載のアジュバント組成物;
(4)前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質100nmolに対して、アルミニウム金属換算で1〜1000μgで含有される、(3)に記載のアジュバント組成物;
(5)前記pH感受性化合物が、前記両親媒性物質100molに対して10mol以上の割合で含有される、(3)または(4)に記載のアジュバント組成物;
(6)(1)または(2)に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物;
(7)(3)〜(5)のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物;
(8)前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質100nmolに対して、3.2〜400μgである、(7)に記載のワクチン組成物;
(9)前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、(6)〜(8)のいずれかに記載のワクチン組成物;
(10)デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法;
(11)デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程;および
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
(2)前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される1種以上である、(1)に記載のアジュバント組成物;
(3)前記pH感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、(1)または(2)に記載のアジュバント組成物;
(4)前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質100nmolに対して、アルミニウム金属換算で1〜1000μgで含有される、(3)に記載のアジュバント組成物;
(5)前記pH感受性化合物が、前記両親媒性物質100molに対して10mol以上の割合で含有される、(3)または(4)に記載のアジュバント組成物;
(6)(1)または(2)に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物;
(7)(3)〜(5)のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物;
(8)前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質100nmolに対して、3.2〜400μgである、(7)に記載のワクチン組成物;
(9)前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、(6)〜(8)のいずれかに記載のワクチン組成物;
(10)デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法;
(11)デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程;および
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
本発明の一実施形態によれば、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物が提供される。上記アジュバント組成物により、クロスプレゼンテーションを通じて、効果的に細胞性免疫を誘導することができるアジュバントが提供される。また、当該アジュバント組成物により、安全性の高いアジュバントが提供される。
<アジュバント組成物>
本形態に係るアジュバント組成物は、pH感受性担体(以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある)と、アルミニウムを含有する物質と、を含む。すなわち、本形態のアジュバント組成物は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質(自然免疫を活性化する物質)として、アルミニウムを含有する物質を含むものである。
本形態に係るアジュバント組成物は、pH感受性担体(以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある)と、アルミニウムを含有する物質と、を含む。すなわち、本形態のアジュバント組成物は、自然免疫を活性化する刺激を有する物質(自然免疫を活性化する物質)として、アルミニウムを含有する物質を含むものである。
本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、水性溶媒と、を含む。よって、本形態に係るアジュバント組成物は、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、が水性溶媒中に分散された形態であるのが好ましい。
また、本形態に係るアジュバント組成物は、好ましい実施形態によれば、pH感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現する。
以下、図面を参照しながら、本実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温(20〜25℃)/相対湿度40〜50%RHの条件で行う。
図1は、本発明の一実施形態に係るアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
図1によれば、アジュバント組成物4は、両親媒性物質1と、pH感受性化合物2と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質であるアルミニウムを含有する物質3と、を含む。図1に示すように、一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質3は、両親媒性物質1を構成する疎水性部分に、pH感受性化合物2とともに会合する。この場合、アジュバント組成物4は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、アルミニウムを含有する物質3は、両親媒性物質1およびpH感受性化合物2を含むpH感受性担体と独立して存在する。
また、ワクチン組成物6は、アジュバント組成物4と、抗原5とを含む。図1に示されるように、抗原5は、上記2つの形態に係るアジュバント組成物4に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体4に抗原5が包含されるワクチン組成物6については、ワクチン複合体ともいうことができる。
本明細書において、「アジュバント組成物」とは、pH感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、pH感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合したものであってもよいし、pH感受性担体にアルミニウムを含有する物質を担持または包含したもの(アジュバント複合体)であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される2種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの(ワクチン複合体)であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
[pH感受性担体]
pH感受性担体は、pHに感受性を有し、pHが酸性になると細胞内の抗原を細胞質基質に輸送できる機能を有する。
pH感受性担体は、pHに感受性を有し、pHが酸性になると細胞内の抗原を細胞質基質に輸送できる機能を有する。
pH感受性担体としては、特に制限されないが、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、を含み、膜破壊機能促進効果を発現するものであることが好ましい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
以下、上記のpH感受性化合物および両親媒性物質を含む、膜破壊機能促進効果を発現するpH感受性担体について詳細に説明する。
なお、本形態に係るpH感受性担体は、2013年5月24日に出願された国際公開第2013/180253号に記載された「pH感受性担体」が同様に使用できる。
(pH感受性担体の構造)
pH感受性担体は、生理的pH以上において、pH感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、pH感受性担体は、pH感受性化合物が、両親媒性物質を構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、pH感受性担体の当該会合形式は推測であり、pH感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
pH感受性担体は、生理的pH以上において、pH感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、pH感受性担体は、pH感受性化合物が、両親媒性物質を構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、pH感受性担体の当該会合形式は推測であり、pH感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
(膜破壊機能促進効果)
「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム(分散液)と、評価サンプル分散液とを、所定のpHに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を37℃で90分間あるいは30分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量を測定することができ、pH感受性担体の膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム(分散液)と、評価サンプル分散液とを、所定のpHに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を37℃で90分間あるいは30分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量を測定することができ、pH感受性担体の膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、(1)溶出性試験において、生理的pHにおける溶出率よりも生理的pH未満の所定のpHにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がpH感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、(2)当該生理的pH未満の所定のpHでの溶出性試験において、pH感受性化合物と両親媒性物質が複合体(pH感受性担体)を形成したときの溶出率が、pH感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、pH7.4とpH5.0またはpH4.5との溶出性試験において、pH感受性担体(pH感受性化合物と両親媒性物質との複合体)の溶出率Lcが、pH感受性化合物単独の溶出率Laおよび両親媒性物質単独の溶出率Lbと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記(1)が、下記式(1)で表され、上記(2)が下記式(2)で表される。なお、下記式中、pH7.4の溶出率を、それぞれ、Lc7.4、La7.4、Lb7.4と表し、pH5.0または4.5の溶出率を、それぞれ、Lcx、Lax、Lbxと表す。
上記式(1)において、Δは、0を超えていればよいが、2以上であることが好ましく、2.5以上であることがより好ましく、5以上であることがさらに好ましく、10以上であることが特に好ましく、30以上であることがもっとも好ましい。また、上記式(2)において、Δ’は、0を超えていればよいが、2以上であることが好ましく、2.5以上であることがより好ましく、3以上であることがさらに好ましく、5以上であることがさらにより好ましく、10以上であることが特に好ましく、15以上であることがもっとも好ましい。
本発明の一実施形態において、上記式(1)および上記式(2)におけるΔおよびΔ’が、それぞれ2以上(好ましくは5以上)であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むpH感受性担体が好ましい。また、本発明の別の一実施形態において、上記式(1)および上記式(2)におけるΔおよびΔ’が、それぞれ2以上(好ましくは5以上)であり、かつ、グリチルリチン酸またはグリチルレチン酸、および脂質を含むpH感受性担体であることが好ましい。
ここで、本明細書において「生理的pH」とは、正常組織や正常体液におけるpHを意味する。生理的pHは、通常、7.4であるが、正常組織や正常体液によって若干(±0.1)異なる。また、「生理的pH未満の所定のpH」とは、pH7.4未満であればよく、好ましくはpH3.0以上、pH7.4未満、より好ましくはpH4.0以上、pH7.3未満、さらに好ましくはpH4.5以上、pH7.0未満である。
pH感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
pH感受性担体は、周辺環境が生理的pH未満となった場合には、pH感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、pH感受性担体と、生体膜(例えば、細胞膜、小胞膜など)とが存在している系で、pHが生理的pH未満となった場合、pH感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、pH感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、pHが弱酸性に変化することで、pH感受性担体中のpH感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、pH感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、pH感受性化合物は、pHが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合の状態を変化させる分子であると考えられる。つまり、pH感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答することによって膜破壊機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜(例えば、エンドソーム)の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部(例えば、細胞質基質)に溶出等する。
pH感受性担体は、溶出性試験における溶出率がpH7.4で20%未満であり、かつ、pH4.0で20%より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がpH6.5で20%未満であり、かつ、pH4.0で20%より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてpH7.4またはpH6.5での溶出率が、15%以下であることがより好ましく、10%以下であることがさらに好ましい。また、pH4.0での溶出率が、40%以上であることがより好ましく、50%以上であることがさらに好ましい。本形態のアジュバント組成物においては、溶出性試験における溶出率がpH7.4で20%未満であり、かつ、pH5.0で20%より大きいものであることが好ましい。pH感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性pHにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。本形態のアジュバント組成物は、上述のような膜破壊機能促進効果を有するpH感受性担体を用いればよい。
また、pH感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、2種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム(分散液)と、評価サンプル分散液とを、所定のpHに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を37℃で60分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光強度を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた2種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、pH感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的pHにおける融合率よりも生理的pH未満の所定のpHにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がpH感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、pH7.4とpH5.0との膜融合試験において、pH感受性担体(pH感受性化合物と両親媒性物質との複合体)の融合率Rc(%)が、pH感受性化合物単独の融合率Ra(%)と、下記式(3)の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、pH7.4の融合率を、それぞれ、Rc7.4、Ra7.4、と表し、pH5.0の融合率を、それぞれ、Rcx、Rax、と表す。
上記式(3)においてΔRは、0を超えていればよいが、2以上であることが好ましく、5以上であることがより好ましく、10以上であることがさらに好ましい。
上記式(3)においてΔRが2以上であるpH感受性担体であって、該担体は胆汁酸および脂質を含むものが好ましい。
pH感受性担体は、弱酸性pH(生理的pH未満の所定のpH)において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
すなわち、本発明のpH感受性担体は、周辺環境が生理的pH未満となった場合、pH感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分(例えば、抗原)は、再配列される膜から排除、放出される。
上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム(endosome)に取り囲まれ、細胞(抗原提示細胞等)に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のpHが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される(その後、MHCクラスII分子と複合体を形成して、CD4陽性T細胞に抗原提示されうる)。このため、ほとんどの抗原は細胞質基質内にデリバリーされない。
これに対して、本形態に係るpH感受性担体を使用すると、抗原(例えば、外因性抗原)を細胞質基質にデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がpH感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、pHが低下した環境に導かれる。そして、pHの低下(酸性化)に伴い、pH感受性化合物がpH感受性担体を不安定化させ、エンドソームとpH感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、pH感受性担体による膜破壊機能(場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能)が生じる。この膜破壊機能(または膜融合機能および膜破壊機能)に伴い、抗原がエンドソームから細胞質基質にデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はpH感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすれば細胞質基質への輸送が可能となりうることから、抗原とpH感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がpH感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
(pH感受性化合物)
pH感受性化合物は、上記のように、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。上記「それらの塩」としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩;マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩などが挙げられる。これらのpH感受性化合物は、単独で用いても、2種以上を併用してもよい。
pH感受性化合物は、上記のように、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。上記「それらの塩」としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩;マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩などが挙げられる。これらのpH感受性化合物は、単独で用いても、2種以上を併用してもよい。
本発明の一実施形態によれば、pH感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種であることがより好ましい。
また、本発明の別の一実施形態によれば、pH感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種であることがさらに好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種であることが特に好ましい。
pH感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として1920年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム(別名デスオキシコール酸ナトリウム)とウルソデオキシコール酸(別名ウルソデスオキシコール酸)はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、pH感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはそれらの塩(例えば、ナトリウム塩)を用いることがさらに好ましい。
pH感受性化合物は、両親媒性物質100molに対して、10mol以上の割合で含有されることが好ましく、10〜640molの割合で含有されることがより好ましく、20〜320molの割合で含有されることがさらに好ましく、20〜160molの割合で含有されることが特に好ましい。なお、本明細書において、pH感受性化合物の、両親媒性物質100molに対する含有量を、「pH感受性化合物の複合化量」とも称する。
(両親媒性物質)
両親媒性物質は、上記のように、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、2種以上を併用してもよい。
両親媒性物質は、上記のように、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、2種以上を併用してもよい。
なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC;1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン)、ジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC;1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン)が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート)、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加した各ポリオキシエチレン鎖の重合度の合計が、10〜200であることが好ましく、15〜100であることがより好ましく、20〜50であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Tween20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル)、Tween40(ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル)、Tween60(ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル)、Tween80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル)として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数16〜18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80)を用いることが好ましい。
炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル(ソルビタンモノパルミテート)、ソルビタンモノステアリン酸エステル(ソルビタンモノステアレート)、ソルビタンモノオレイン酸エステル(ソルビタンモノオレート)等のソルビタンモノ脂肪酸エステル;ソルビタントリパルミチン酸エステル(ソルビタントリパルミテート)、ソルビタントリステアリン酸エステル(ソルビタントリステアレート)、ソルビタントリオレイン酸エステル(ソルビタントリオレート)等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、SPAN40(ソルビタンパルミチン酸エステル)、SPAN60(ソルビタンステアリン酸エステル)、SPAN80(ソルビタンオレイン酸エステル)、SPAN65(ソルビタントリステアリン酸エステル)、SPAN85(ソルビタントリオレイン酸エステル)として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、SPAN80、SPAN65、SPAN85を用いることが好ましい。
モノオレイン酸グリセロール(モノオレイン酸グリセリル)、ジラウリン酸グリセロール(ジラウリン酸グリセリル)、ジステアリン酸グリセロール(ジステアリン酸グリセリル)、ジオレイン酸グリセロール(ジオレイン酸グリセリル)は、グリセリンに1または2分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのC1位またはC2位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのC1位およびC2位、またはC1位およびC3位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、C1位およびC3位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、C1位およびC2位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、3〜200であることが好ましく、5〜100であることがより好ましく、10〜50であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。例えば、ポリオキシエチレンの重合度が10であるPEG(10)ヒマシ油が好適に用いられる。
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
上述の両親媒性物質のうち、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることがより好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択されることがさらに好ましい。
(pH感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ)
pH感受性担体は、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のpHにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるpHは異なる。これはpH感受性化合物によってpKaが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するpHを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
pH感受性担体は、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のpHにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるpHは異なる。これはpH感受性化合物によってpKaが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するpHを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
pH感受性担体において、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween40、デオキシコール酸およびTween60、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN40、デオキシコール酸およびSPAN60、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN65、デオキシコール酸およびSPAN85、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’−ジラウリン)、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、グリコデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびDDPC、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびTween20、ウルソデオキシコール酸およびTween40、ウルソデオキシコール酸およびTween60、ウルソデオキシコール酸およびTween80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN40、ウルソデオキシコール酸およびSPAN60、ウルソデオキシコール酸およびSPAN80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN65、ウルソデオキシコール酸およびSPAN85、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’−ジラウリン)、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびDDPC、グリチルリチン酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびTween20、グリチルリチン酸およびTween40、グリチルリチン酸およびTween60、グリチルリチン酸およびTween80、グリチルリチン酸およびSPAN40、グリチルリチン酸およびSPAN60、グリチルリチン酸およびSPAN80、グリチルリチン酸およびSPAN65、グリチルリチン酸およびSPAN85、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’−ジラウリン)、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。
より好ましくは、コール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween40、デオキシコール酸およびTween60、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN40、デオキシコール酸およびSPAN60、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN65、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN85、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、グリコデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびDDPC、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびTween40、ウルソデオキシコール酸およびTween60、ウルソデオキシコール酸およびTween80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN40、ウルソデオキシコール酸およびSPAN65、ウルソデオキシコール酸およびSPAN85、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびDDPC、グリチルリチン酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびTween40、グリチルリチン酸およびTween60、グリチルリチン酸およびTween80、グリチルリチン酸およびSPAN40、グリチルリチン酸およびSPAN65、グリチルリチン酸およびSPAN85、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。
さらに好ましくは、コール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween40、デオキシコール酸およびTween60、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN40、デオキシコール酸およびSPAN60、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN65、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN85、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、グリコデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびDDPC、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびDLPCである。
[アルミニウムを含有する物質]
本発明のアジュバント組成物は、上述した両親媒性物質およびpH感受性化合物から構成されるpH感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質(以下、「自然免疫を活性化する物質」と称する。)としてアルミニウムを含有する物質と、を含む。
本発明のアジュバント組成物は、上述した両親媒性物質およびpH感受性化合物から構成されるpH感受性担体と、自然免疫を活性化する刺激を有する物質(以下、「自然免疫を活性化する物質」と称する。)としてアルミニウムを含有する物質と、を含む。
アルミニウムを含有する物質は、自然免疫を活性化する物質の1種である。自然免疫を活性化する物質とは、構造パターン認識受容体に認識される、あるいは免疫担当細胞に刺激を与え、免疫担当細胞を活性な状態に導く物質を意味する。
本明細書中において、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として「alum」と表記する。よって、「alum」としては、「アルミニウムを含有する物質」も意味する。
本発明で用いられるアルミニウムを含有する物質としては、pH感受性担体との併用によって細胞性免疫が誘導可能なものであれば特に制限されないが、アルミニウム塩であるのが好ましく、例えば、水酸化アルミニウム(Al(OH)3)、リン酸アルミニウム(AlPO4)、硫酸アルミニウム(Al2(SO4)3)、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン、AlK(SO4)2・12H2O)、塩化アルミニウム(AlCl3)などが挙げられる。これらのうち、細胞性免疫の誘導の効果の観点から、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される1種以上であるのが好ましい。また、アルミニウムを含有する物質が水酸化アルミニウムであるのがより好ましい。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは水に不溶であり、そのためアジュバント組成物に用いる際には分散媒体に分散させて用いるのが好ましく、このような水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウムを用いることで、ゲルタイプアジュバントとすることができる。
アルミニウムを含有する物質としては、市販品として入手できるアルミニウム化合物を用いることができる。
例えば、水酸化アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「水酸化アルミニウム」、OZ BIOSCIENCES製「AlumVax Hydroxide 2%」、InvivoGen製「Alhydrogel adjuvant 2%」等が挙げられる。上述の水酸化アルミニウムのうち、「AlumVax Hydroxide 2%」、「Alhydrogel adjuvant 2%」は、アルミニウムが、金属換算で約10mg/mLの濃度で水溶液に分散された形態である。
リン酸アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「リン酸アルミニウム」、OZ BIOSCIENCES製「AlumVax Phosphate 2%」、Alpha Diagnostic International, Inc製「Adju−Phos」等が挙げられる。上述のリン酸アルミニウムのうち、「Adju−Phos」は、アルミニウムが、金属換算で約5mg/mLの濃度で水溶液に分散された形態である。また、「AlumVax Phosphate 2%」についても、リン酸アルミニウムが水溶液に分散された形態である。
硫酸アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「硫酸アルミニウム」等を用いることができる。
硫酸カリウムアルミニウム(Aluminium potassium sulfate)としては、InvivoGen製「alum crystals」等が挙げられる。
塩化アルミニウムとしては、シグマ−アルドリッチ製「塩化アルミニウム」等を用いることができる。
分散液形態の「アルミニウムを含有する物質」は分散液のまま用いることができる。特に、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムについては、水溶液中のアルミニウムの凝集粒子が制御しやすいという観点では、分散液の形態の「アルミニウムを含有する物質」をpH感受性担体(pH感受性担体の分散液(溶液))と混合するのが好ましい。
また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムとして固体状態のアルミニウム化合物を用いる場合は、pH感受性担体(pH感受性担体の分散液)と混合させる前にあらかじめ、アルミニウム化合物を分散媒体に分散させて分散液とした形態で用いるのが好ましい。
アルミニウムを含有する物質として硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、塩化アルミニウムを用いる場合は、固体状態のままpH感受性担体(pH感受性担体の分散液)と混合してもよいし、あらかじめこれらアルミニウム化合物を水性溶媒に溶解させてから、pH感受性担体(pH感受性担体の分散液)と混合してもよい。
アルミニウムを含有する物質は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、アルミニウムを含有する物質の含有量は、使用するアルミニウムを含有する物質の種類によっても異なるが、アルミニウムを含有する物質が、両親媒性物質100nmolに対して、アルミニウム金属換算で1〜1000μgで含有されるのが好ましく、1〜500μgで含有されるのがより好ましく、1〜100μgで含有されるのがさらに好ましい。両親媒性物質100nmolに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が1μg以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、両親媒性物質100nmolに対するアルミニウムを含有する物質の含有量が1000μg以下であると、副反応が低減できることから好ましい。また、特に、アジュバント組成物100μL中に含まれる両親媒性物質が10nmol未満の場合、両親媒性物質1nmol当たりのアルミニウムを含有する物質の割合は10〜100μgとなるのが好ましい。
アジュバント組成物中のアルミニウムを含有する物質の含有量(濃度)は、アジュバント組成物が水性溶媒に分散された形態である場合、アルミニウムの金属換算で、1μg/100μL以上であることが好ましく、1μg/100μL〜100μg/100μLであることがより好ましく、10μg/100μL〜100μg/100μLであることがさらに好ましい。アルミニウムを含有する物質の含有量が1μg/100μL以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、アルミニウムを含有する物質の含有量が100μg/100μL以下であると、副反応が低減できることから好ましい。
[水性溶媒]
アジュバント組成物は、水性溶媒(以下、「水性媒体」と称する場合もある。)を含んでいてもよい。
アジュバント組成物は、水性溶媒(以下、「水性媒体」と称する場合もある。)を含んでいてもよい。
アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、pH感受性担体、アルミニウムを含有する物質は、水性溶媒中で分散した分散液(以下、「水性溶液」とも称する。)となりうる。
この際、pH感受性担体は、好ましくは、水性媒体中で、pH感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、pH感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にpH感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、pH感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子(pH感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である)を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が10〜200nmであることが好ましく、10〜100nmであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造(例えば、リポソーム)を形成するものは含まない。また、本明細書中、pH感受性担体の粒子径は、動的光散乱法(MALVERN Instruments社製、NanoZS90)により測定することができる。
また、アジュバント組成物は、水性媒体中で、複合体を形成したpH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含む複合体(アジュバント複合体)を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、pH感受性担体を構成するpH感受性化合物および両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、10〜200nmであることが好ましく、10〜100nmであることがより好ましい。
なお、アジュバント組成物を含む水性溶液中、pH感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも1つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
本発明のアジュバント組成物を含む水性溶液の溶媒としては、緩衝剤、NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
緩衝剤としては、アジュバント組成物のpHを生理的pH以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−HCl緩衝剤(トリス塩酸緩衝剤)、MES緩衝剤(2−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤)、TES緩衝剤(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤)、酢酸緩衝剤、MOPS緩衝剤(3−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤)、MOPS−NaOH緩衝剤、HEPES緩衝剤(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤)、HEPES−NaOH緩衝剤などのGOOD緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−NaOH緩衝剤、グリシルグリシン−NaOH緩衝剤、グリシルグリシン−KOH緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤;トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−NaOH緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤;またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、MES緩衝剤、酢酸緩衝剤、HEPES−NaOH緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、0.1〜200mMであることが好ましく、1〜100mMであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度(mM)をいう。
NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、0.1〜200mMであることが好ましく、1〜150mMであることがより好ましい。
水性溶液中のpH感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、pH感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、7.3μmol/L以上であるのが好ましく、8.0μmol/L以上であるのがより好ましく、50μmol/L以上であるのがさらに好ましく、100μmol/L以上であるのが特に好ましく、1mmol/L以上であるのがもっとも好ましい。また、pH感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、500mmol/L以下であるのが好ましく、300mmol/L以下であるのがより好ましく、280mmol/L以下であるのがさらに好ましく、6.5mmol/L以下であるのが特に好ましく、4.2mmol/L以下であるのがもっとも好ましい。
さらに、副反応の低減の観点から、特に好ましい形態としては、pH感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、100μmol/L〜300mmol/Lであるのが好ましく、1mmol/L〜280mmol/Lであるのがより好ましい。
また、水性溶液中のアルミニウムを含有する物質は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは1μg/100μL〜100μg/100μL、より好ましくは10μg/100μL〜100μg/100μLの濃度となるようにアルミニウムを含有する物質を用いるのが好ましい。
[他の成分]
アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
安定化剤としては、pH感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、1−オクタノール、1−ドデカノール、1−ヘキサドデカノール、1−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数4〜20のアルコール;ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数12〜18の脂肪酸;カプリル酸メチル(オクタン酸メチル)、カプリル酸エチル(オクタン酸エチル)、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数8〜18の脂肪酸アルキルエステル(炭素数1〜3のアルキル);D(L)−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のD(L)−アミノ酸;トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド;ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数12〜18のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル(例えば、Tween65、Tween85);ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数12〜18のポリオキシエチレンアルキルエステル(例えば、PEG20ステアリルエーテル、PEG23ラウリルエーテル);ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油(例えば、PEG10硬化ヒマシ油、PEG40硬化ヒマシ油、PEG60硬化ヒマシ油);カプリリン(オクタン酸グリセロール)、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数8〜18のモノ脂肪酸グリセロールエステル;ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数8〜16のジ脂肪酸グリセロール;α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
これら他の成分の含有量としては、pH感受性担体およびアルミニウムを含有する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質100molに対して、150mol以下であることが好ましく、0molを超えて66.4mol以下であることがより好ましい。
本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にCTLを誘導することができる。
すなわち、本形態に係るアジュバント組成物においては、pH感受性担体に、アルミニウムを含有する物質を併用しても、pH感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果(および膜融合機能促進効果)を好適に発揮することができる。また、pH感受性担体とともにアルミニウムを含有する物質を用いると、アルミニウムを含有する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
すなわち、pH感受性担体は、好ましい形態において、pH感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果(場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果)を有する。この際、前記膜破壊機能促進効果(および膜融合機能促進効果)は、上述のように、酸性環境下におけるpH感受性化合物によるpH感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、pH感受性担体にアルミニウムを含有する物質を併用しても、pH感受性化合物のpH感受性は変動しないため、pH感受性化合物は、pH感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、pH感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、アルミニウムを含有する物質をpH感受性担体と併用しても、pH感受性担体の機能は損なわれない。そして、アルミニウムを含有する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりpH感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にpH感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、pH感受性担体の機能により抗原を細胞質基質に導入することができるとともに、アルミニウムを含有する物質が作用することにより、細胞質基質に導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的に細胞性免疫(CTL)を誘導することができる。
なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本発明の好ましい一実施形態によれば、液性免疫をも好適に誘導することができる。
上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、MHCクラスII分子と複合体を形成して、CD4陽性T細胞に提示される。
本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、CTLを誘導する場合には、pH感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原やアルミニウムを含有する物質が細胞質基質に導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原およびアルミニウムを含有する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、MHCクラスII分子と複合体を形成して、CD4陽性T細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン(例えば、IFNγ)を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
したがって、本発明の別の一実施形態によれば、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
<ワクチン組成物>
ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
[アジュバント組成物]
アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
[抗原]
抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
前記ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、癌抗原、アレルギー関連抗原、疾患関連抗原、移植片拒絶関連抗原等が挙げられる。
前記ウイルス抗原としては、特に制限されないが、gag、pol、およびenv遺伝子の遺伝子産物、Nefタンパク質、逆転写酵素、並びに他のHIVコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原;B型肝炎ウイルスのS、M、およびLタンパク質、B型肝炎ウイルスのpre−S抗原、C型肝炎ウイルスRNA、並びにA、B、およびC型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原;赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原;麻疹ウイルス抗原;風疹ウイルス抗原;ロタウイルス抗原;サイトメガロウイルス抗原;呼吸器合胞体ウイルス抗原;単純ヘルペスウイルス抗原;水痘帯状疱疹ウイルス抗原;日本脳炎ウイルス抗原;狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス(flavirvirus)、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス(papilomavirus)、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
前記細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、FIM2、FIM3、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原;ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原;破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原、連鎖球菌細菌性抗原;リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原;ミコール酸、熱ショックタンパク質65(HSP65)、30kDa主要分泌タンパク質、抗原85A、他のマイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原;ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント;肺炎球菌細菌性抗原;インフルエンザ菌細菌性抗原;炭疽菌細菌性抗原;リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
前記真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント;ヒストプラズマ真菌性抗原;クリプトコッカス真菌性抗原;コクシジオイデス真菌性抗原;白癬真菌性抗原等が挙げられる。
前記原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原;トキソプラズマ抗原;住血吸虫抗原;リーシュマニア抗原;トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
前記癌抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来する癌抗原が挙げられる。当該癌としては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、***癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、癌抗原の具体例を挙げると、HER2/neu(Human EGFR related 2)、CEA(Carcinogenic Embryonic Antigen)、MAGE(Melanoma−associated Antigen)、XAGE(X antigen family member)、NY−ESO−1、gp100、Melan/mart−1、Tyrosinase、PSA(Prostate Specific Antigen)、PAP(Prostate Acid Phosphatase)、p53、K−ras、N−ras、Bcr−Abl、MUC−1(Mucin−1)、PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen)、survivin、WT−1(Wilms tumor suppressor gene 1)、AFP(Alpha Fetoprotein)、GPC(Glypican)、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)、等が挙げられる。
前記アレルギー関連抗原としては、特に制限されないが、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原;ライグラス花粉抗原等の花粉抗原;イエダニ抗原、ネコ抗原等の動物由来抗原;組織適合性抗原、ペニシリン等の治療薬等が挙げられる。
前記疾患関連抗原(自己免疫疾患、アレルギー等)は、特に制限されないが、糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、潰瘍性大腸炎、結膜炎、角結膜炎、喘息、アレルギー性喘息、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、再生不良性貧血、赤芽球貧血症、特発性血小板減少症、ウェゲナー肉芽腫症、スティーブンス・ジョンソン症候群、間質性肺線維症等が挙げられる。具体例を挙げると、例えば、自己免疫疾患に関与する抗原の例として、グルタミン酸脱炭酸酵素65(GA9D65)、天然DNA、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体コンポーネント、サイログロブリン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)受容体が挙げられる。
前記移植片拒絶関連抗原としては、特に制限されないが、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経移植片コンポーネント等の移植片レシピエントに移植される移植片の抗原性コンポーネントが挙げられる。
上述の抗原は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
抗原の含有量は、pH感受性担体を構成する両親媒性物質100nmolに対して、3.2〜400μgであることが好ましく、16μg〜80μgであることがより好ましい。
抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、3%以上であることが好ましく、5〜80%であることがより好ましく、10〜60%であることがより好ましい。組込率が3%以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、実施例に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
[添加剤]
ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
ワクチン組成物が錠剤およびカプセルである場合には、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末又は液体のいずれを含有することもできる。
また、ワクチン組成物が固形製剤である場合には、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど)、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、
ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤(例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど)、着色剤、矯味矯臭剤などを含みうる。
ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤(例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど)、着色剤、矯味矯臭剤などを含みうる。
一方、ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒(例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など)、膜安定剤(例えばコレステロールなど)、等張化剤(例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど)、抗酸化剤(例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど)、防腐剤(例えばクロルブタノール、パラベンなど)などを含みうる。なお、前記溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原を効率良くクロスプレゼンテーションさせることにより、細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、CTLを誘導することができる。なお、本明細書において、「細胞性免疫を誘導する」とは、本明細書に記載のELIspot法にて、ワクチン組成物未処置のコントロール(すなわち、抗原とアルミニウムを含有する物質との混合物)と対比して、多くのspot形成を得られることを意味する。
また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫を誘導することができる。これにより、IgG等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、抗原を投与したコントロールと対比して高いIgG抗体価となることを意味する。
[用途]
本形態のワクチン組成物は、対象者に投与されると、ワクチン組成物の外部環境が生理的pH未満(例えば、pH6.5)となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よく細胞質基質に放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫を誘導することができ、免疫を付与することができる。
本形態のワクチン組成物は、対象者に投与されると、ワクチン組成物の外部環境が生理的pH未満(例えば、pH6.5)となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よく細胞質基質に放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫を誘導することができ、免疫を付与することができる。
よって、本発明の一形態によると、治療または予防を必要とする対象者に、上記のワクチン組成物の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
ワクチン組成物の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与;静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
上記疾患としては、例えば、ヒト免疫不全症候群(HIV)、肝炎、インフルエンザ等のウイルス感染症;百日咳、ジフテリア、破傷風、結核、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌等による細菌感染症;カンジダ等の真菌感染症;マラリア等の原虫性または寄生虫性感染症;白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、***癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等の癌;スギ花粉等によるアレルギー;糖尿病、関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患;移植片対宿主病(GVHD)等の移植による拒絶反応が挙げられる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
また、本発明の一実施形態において、ワクチン組成物は、培養により、細胞に抗原を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、抗原を細胞に輸送するための培養方法が提供される。
前記培養方法は、細胞を、ワクチン組成物を含む培地で培養する工程を含む。
前記培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、MEM、DMEM、RPMI等が挙げられる。
前記培地へのワクチン組成物の添加量としては、特に制限されないが、両親媒性物質のモル濃度が0.66μmol/L〜1.0mmol/Lであることが好ましく、6.6μmol/L〜0.88mmol/Lであることがより好ましく、7.2μmol/L〜0.56mmol/Lであることがさらに好ましい。
また、前記培地のpHは、7.0以上であることが好ましく、7.2〜7.8であることがより好ましい。培地のpHが7.0以上であると、培地中でのpH感受性担体を構成するpH感受性化合物の不安定化を防止できることから好ましい。
前記細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
この際、前記対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、NK(Natural Killer)細胞、T細胞、B球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、NK細胞、T細胞、リンパ球細胞等を用いることがより好ましく、樹状細胞を用いることがさらに好ましい。
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者から採血、生検等により当該細胞を採取する。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
好ましい一実施形態において、前記治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、ワクチン組成物を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、前記疾患は上述のとおりである。
<アジュバント組成物の製造方法>
本発明に係るアジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。
本発明に係るアジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。
例えば、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、pH感受性担体およびアルミニウムを含有する物質を混合することにより製造することができる。また、アルミニウムを含有する物質が、pH感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質とを会合させることにより製造することができる。
以下、pH感受性担体として、所定のpH感受性化合物および所定の両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果を有するpH感受性担体を用いる好ましい形態について、以下に詳細に説明する。
本形態に係るアジュバント組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程を含む。
pH感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質を会合させる方法としては、pH感受性化合物、両親媒性物質、およびアルミニウムを含有する物質が、水性溶液中で接触すればよい。したがって、本形態に係るアジュバント組成物は、pH感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。
pH感受性化合物と、両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、(1)<a>pH感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法;<b>pH感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてpH感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法;<c>pH感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてpH感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合して、アジュバント組成物を得る方法;(2)リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。なお、前記バンガム法の具体的な方法としては、例えば以下の方法で行うことができる。すなわち、ガラス容器中で、pH感受性担体の構成成分を有機溶媒(例えば、メタノール、クロロホルム)に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、5〜35℃で薄膜を膨潤させた後、5〜35℃でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。薄膜成分を水性溶液に分散することで、pH感受性担体を含む水溶液(pH感受性担体の分散液)が得られる。当該pH感受性担体を含む水性溶液(pH感受性担体の分散液)とアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液とを混合することにより、アジュバント組成物が得られる。ここで、薄膜に添加する水性溶液としてアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を用いる場合は、薄膜を分散することによりアジュバント組成物を得ることができる。バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」(野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂)および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」(寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京)に記載されている。
上記の(1)製造方法において、分散液を調製する際に強く分散させるには、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いればよい。また、両親媒性物質を含む水性溶液に、pH感受性化合物、アルミニウムを含有する物質を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。上記(1)の方法では、各水性溶液を調製する際の温度および水性溶液を混合する温度は、特に制限されないが、5〜35℃であるのが好ましく、常温の15〜25℃であるのがより好ましい。
なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、pH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および/またはアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、アジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
pH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液は、後述の「ワクチン組成物の製造方法」に用いる溶液と同様のもの、またはそれを参考にして調製したものが用いられうる。
<ワクチン組成物の製造方法>
本発明に係るワクチン組成物の製造方法は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。一実施形態に係るワクチン組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程;および前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む。
本発明に係るワクチン組成物の製造方法は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。一実施形態に係るワクチン組成物の製造方法は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、アルミニウムを含有する物質と、を会合させる工程;および前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む。
会合体に抗原を混合する工程においては、会合体を含む水性溶液に、抗原を混合すればよい。例えば、上記(1)または(2)の方法により得られたアジュバント組成物と、抗原と、を混合することで、ワクチン組成物が得られる。具体的には、(V−1)<a>pH感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液と、抗原を含む水性溶液と、を別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてワクチン組成物を得る方法;<b>pH感受性化合物を含む水性溶液と両親媒性物質とを含む水性溶液とを混合し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてpH感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質(またはそれを含む水性溶液)および抗原(またはそれを含む水性溶液)を混合して、ワクチン組成物を得る方法;<c>pH感受性化合物と両親媒性物質とを水性溶液に分散し、当該溶液を、乳化機などを用いて強く撹拌し分散させてpH感受性担体の分散液を得た後、当該分散液に、アルミニウムを含有する物質(またはそれを含む水性溶液)および抗原(またはそれを含む水性溶液)を混合して、ワクチン組成物を得る方法;(V−2)上記(2)のバンガム法により得られたアジュバント組成物に、抗原または抗原を含む水性溶液を混合し、ワクチン組成物を得る方法、が挙げられる。この際、pH感受性担体の構成成分で形成される薄膜に添加する水性溶液として、アルミニウムを含有する物質と抗原とを含む溶液を用いてもよい。また、薄膜に添加する水性溶液として、抗原を含む水性溶液を用いて、その後にアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を混合してもよい。
アジュバント組成物またはpH感受性担体の分散液に抗原を含む水性溶液を混合する際の温度は、特に制限されないが、5〜35℃、好ましくは常温の15〜25℃であるのが好ましい。
pH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液、および抗原とアルミニウムを含有する物質とを含む水性溶液は、下記のように調製したものが用いられうる。
(pH感受性化合物を含む水性溶液)
前記pH感受性化合物を含む溶液は、pH感受性化合物および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記pH感受性化合物を含む溶液は、pH感受性化合物および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記pH感受性化合物としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
前記溶媒としては、緩衝剤、NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液の他、滅菌水等が用いられうる。これらのうち、ワクチン組成物を生体に好適に投与する観点から、生理食塩水、滅菌水、緩衝液を用いることが好ましい。
前記pH感受性化合物を含む水性溶液において、pH感受性化合物のモル濃度は、5μmol/L以上であるのが好ましく、10μmol/L以上であるのがより好ましく、50μmol/L以上であるのがさらに好ましく、100μmol/L以上であるのが特に好ましく、1mmol/L以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中のpH感受性化合物のモル濃度が、500mmol/L以下であるのが好ましく、300mmol/L以下であるのがより好ましく、250mmol/L以下であるのがさらに好ましく、200mmol/L以下であるのが特に好ましい。
さらに、副反応の低減の観点から、pH感受性化合物のモル濃度は、100μmol/L〜300mmol/Lであるのが好ましく、1mmol/L〜200mmol/Lであるのがより好ましい。
(両親媒性物質を含む水性溶液)
前記両親媒性物質を含む溶液は、両親媒性物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記両親媒性物質を含む溶液は、両親媒性物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記両親媒性物質および前記溶媒としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
前記両親媒性物質を含む水性溶液において、両親媒性物質のモル濃度は、5μmol/L以上であるのが好ましく、10μmol/L以上であるのがより好ましく、50μmol/L以上であるのがさらに好ましく、100μmol/L以上であるのが特に好ましく、500μmol/L以上であるのがもっとも好ましい。また、水性溶液中の両親媒性物質のモル濃度が、500mmol/L以下であるのが好ましく、300mmol/L以下であるのがより好ましく、250mmol/L以下であるのがさらに好ましく、200mmol/L以下であるのが特に好ましく、150mmol/L以下であるのがもっとも好ましい。
さらに、副反応の低減の観点から、両親媒性物質のモル濃度は、50μmol/L〜200mmol/Lであるのが好ましく、500μmol/L〜150mmol/Lであるのがより好ましい。
(アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液)
前記アルミニウムを含有する物質を含む溶液は、アルミニウムを含有する物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記アルミニウムを含有する物質を含む溶液は、アルミニウムを含有する物質および溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
前記アルミニウムを含有する物質および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
前記アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液におけるアルミニウムの濃度は、アルミニウムの金属換算で、好ましくは1μg/100μL〜100μg/100μL、より好ましくは10μg/100μL〜100μg/100μLである。
(抗原を含む水性溶液)
前記抗原を含む溶液は、抗原および溶媒を含む。
前記抗原を含む溶液は、抗原および溶媒を含む。
前記抗原および前記溶媒としては、上述したものが使用されうることからここでは説明を省略する。
混合
上述のpH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液の混合方法は特に制限されない。
上述のpH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液の混合方法は特に制限されない。
得られた混合液を撹拌することにより構成成分を分散させることが好ましく、当該撹拌は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
なお、一実施形態において、pH感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、アルミニウムを含有する物質を含む水性溶液、および抗原を含む水性溶液は、別々の溶液とせず、2種以上の成分を組み合わせた混合液としてもよい。例えば、pH感受性化合物およびアルミニウムを含有する物質を含む水性溶液を調製し、これを、両親媒性物質を含む水性溶液、抗原を含む水性溶液と混合してもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
<原料>
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
(1)pH感受性化合物、両親媒性物質等
・デオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・コール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム(東京化成工業社製)
・ケノデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ヒオデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・グリコデオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・グリチルリチン酸モノアンモニウム(東京化成工業社製)
・EYPC(未水添卵黄ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME NC−50)
・DDPC(1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC−1010)
・DLPC(1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC−1212)
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル(Tween20,80:東京化成工業社製)
・ソルビタン脂肪酸エステル(SPAN80:ナカライテスク社製−ソルビタンモノオレエート)
・ポリオキシエチレンヒマシ油(和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン10ヒマシ油)・トコフェロール(ナカライテスク社製、DL−α−トコフェロール)
(2)自然免疫を活性化する刺激を有する物質等
・CpG−DNA(CpG−ODN:InvivoGen社製、ODN−2395)
・酢酸トコフェロール(酢酸DL−α−トコフェロール:ナカライテスク社製)
・水酸化アルミニウム(InvivoGen社製、Alhydrogel 2%)
・リン酸アルミニウム(Alpha Diagnostic Internatiaonal社製、Adjuphos)
・硫酸カリウムアルミニウム(InvivoGen社製、alum crystals)
(3)溶媒等
・注射用水:(大塚製薬株式会社製)
・MES−Na(メルク社製)
・塩化ナトリウム(関東化学社製)
・PBS Tabltes(Phosphate buffered saline:タカラバイオ社製)
・メタノール(ナカライテスク社製)
・エタノール(関東化学社製)
・クロロホルム(和光純薬工業社製)
・水酸化ナトリウム水溶液(0.1mol/L:ナカライテスク社製)
・塩酸(0.1mol/L、1mol/L:ナカライテスク社製)
・OVAペプチド:SIINFEKL(ピーエイチジャパン委託合成)(以下、単に「ペプチド」とも称する。)
・OVAタンパク質(Ovalbumin:和光純薬工業社製、オボアルブミン低エンドトキシン)(以下、単に「OVA」とも称する。)
(4)培地等
・RPMI(ナカライテスク社製、RPMI 1640培地(液体))
・Penicillin−Streptamycin Mixed Solution(ナカライテスク社製)
・FBS(Fetal Bovine Serum,Centified,Heat Inactivatied,US Origin:Gibco社製)
・RBC lysis buffer(Santa Cruz Biotechnology社製):赤血球溶血バッファー
・HBSS(Habk’s Balanced Salt Solution:ナカライテスク社製)
・D−PBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline:ナカライテスク社製)
(5)その他試薬
・リン脂質C−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)
・Pyranine(東京化成工業社製)
・DPX(p−xylene−bis−pyridinium bromide:Molecular probes社製)
・Triton−X100(和光純薬工業社製)
・NBD−PE(1,2−Dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N(7−nitro−2−1,3−benzoxadiazol−4−yl)ammonium:AvAnti polar lipids社製)・Rh−PE(1,2−Dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoehanolamine−N−(lissamine rhodamine B sulfonyl)ammonium:AvAnti polar lipids社製):蛍光標識脂質
・Mouse IFNγ ELISPOT Set(BD バイオサイエンス社製)
・AEC Substrate Set(BD バイオサイエンス社製)
・炭酸水素ナトリウム(和光純薬工業社製)
・炭酸ナトリウム(和光純薬工業社製)
・二次抗体(anti−mouse IgG HRP conjugate、R&D system社製)
・アルブミン(Albumin from bovine serum、Sigma社製)
・ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト株式会社製)
(6)動物
雌、C57BL/6Nマウス(6−8週齢)は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
・デオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・コール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム(東京化成工業社製)
・ケノデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ヒオデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・グリコデオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク社製)
・グリチルリチン酸モノアンモニウム(東京化成工業社製)
・EYPC(未水添卵黄ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME NC−50)
・DDPC(1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC−1010)
・DLPC(1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC−1212)
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル(Tween20,80:東京化成工業社製)
・ソルビタン脂肪酸エステル(SPAN80:ナカライテスク社製−ソルビタンモノオレエート)
・ポリオキシエチレンヒマシ油(和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン10ヒマシ油)・トコフェロール(ナカライテスク社製、DL−α−トコフェロール)
(2)自然免疫を活性化する刺激を有する物質等
・CpG−DNA(CpG−ODN:InvivoGen社製、ODN−2395)
・酢酸トコフェロール(酢酸DL−α−トコフェロール:ナカライテスク社製)
・水酸化アルミニウム(InvivoGen社製、Alhydrogel 2%)
・リン酸アルミニウム(Alpha Diagnostic Internatiaonal社製、Adjuphos)
・硫酸カリウムアルミニウム(InvivoGen社製、alum crystals)
(3)溶媒等
・注射用水:(大塚製薬株式会社製)
・MES−Na(メルク社製)
・塩化ナトリウム(関東化学社製)
・PBS Tabltes(Phosphate buffered saline:タカラバイオ社製)
・メタノール(ナカライテスク社製)
・エタノール(関東化学社製)
・クロロホルム(和光純薬工業社製)
・水酸化ナトリウム水溶液(0.1mol/L:ナカライテスク社製)
・塩酸(0.1mol/L、1mol/L:ナカライテスク社製)
・OVAペプチド:SIINFEKL(ピーエイチジャパン委託合成)(以下、単に「ペプチド」とも称する。)
・OVAタンパク質(Ovalbumin:和光純薬工業社製、オボアルブミン低エンドトキシン)(以下、単に「OVA」とも称する。)
(4)培地等
・RPMI(ナカライテスク社製、RPMI 1640培地(液体))
・Penicillin−Streptamycin Mixed Solution(ナカライテスク社製)
・FBS(Fetal Bovine Serum,Centified,Heat Inactivatied,US Origin:Gibco社製)
・RBC lysis buffer(Santa Cruz Biotechnology社製):赤血球溶血バッファー
・HBSS(Habk’s Balanced Salt Solution:ナカライテスク社製)
・D−PBS(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline:ナカライテスク社製)
(5)その他試薬
・リン脂質C−テストワコー(和光純薬工業株式会社製)
・Pyranine(東京化成工業社製)
・DPX(p−xylene−bis−pyridinium bromide:Molecular probes社製)
・Triton−X100(和光純薬工業社製)
・NBD−PE(1,2−Dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N(7−nitro−2−1,3−benzoxadiazol−4−yl)ammonium:AvAnti polar lipids社製)・Rh−PE(1,2−Dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoehanolamine−N−(lissamine rhodamine B sulfonyl)ammonium:AvAnti polar lipids社製):蛍光標識脂質
・Mouse IFNγ ELISPOT Set(BD バイオサイエンス社製)
・AEC Substrate Set(BD バイオサイエンス社製)
・炭酸水素ナトリウム(和光純薬工業社製)
・炭酸ナトリウム(和光純薬工業社製)
・二次抗体(anti−mouse IgG HRP conjugate、R&D system社製)
・アルブミン(Albumin from bovine serum、Sigma社製)
・ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト株式会社製)
(6)動物
雌、C57BL/6Nマウス(6−8週齢)は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
<使用機器>
超音波照射装置:USC−J
分光光度計:FP−6500
UV−vis分光光度計:UV−3600
CO2、インキュベーター:MCO20AIC
<細胞の培養>
細胞の培養は、5%CO2、37℃に設定したインキュベーター(MCO20AIC)を用いて実施した。
超音波照射装置:USC−J
分光光度計:FP−6500
UV−vis分光光度計:UV−3600
CO2、インキュベーター:MCO20AIC
<細胞の培養>
細胞の培養は、5%CO2、37℃に設定したインキュベーター(MCO20AIC)を用いて実施した。
<試料の調製等>
(MES Buffer)
MES:25mM、NaCl:125mMの配合量で調製した。MES Bufferは、特別な記載のない限りpHは7.4である。
(PBS)
PBSは、10錠のPBS Tabltes(タカラバイオ社製)を、1000mLの蒸留水に溶解させ、調製した。なお、pHは、7.35〜7.65である。あるいは、購入したD−PBSをPBSとして使用した。
(RPMIメディウム)
抗生物質としてペニシリン(100unit/mL)およびストレプトマイシン(100mg/mL)を添加した。また、必要に応じてFBSを追加で添加し、10%血清含有RPMIメディウムとした。
(自然免疫を刺激する物質の候補(以下、候補物質とも表記)の一次溶液)
・トコフェロールの一次溶液
10mgのトコフェロールを秤量し、1.0mLのエタノールに溶解させた。さらに、PBSにて10倍に希釈し、トコフェロールの一次溶液を調製した。
・酢酸トコフェロールの一次溶液
10mgの酢酸トコフェロールを秤量し、1.0mLのエタノールに溶解させた。さらに、PBSにて10倍に希釈し、酢酸トコフェロールの一次溶液を調製した。
・alumの一次溶液
alumとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)を使用した。
(MES Buffer)
MES:25mM、NaCl:125mMの配合量で調製した。MES Bufferは、特別な記載のない限りpHは7.4である。
(PBS)
PBSは、10錠のPBS Tabltes(タカラバイオ社製)を、1000mLの蒸留水に溶解させ、調製した。なお、pHは、7.35〜7.65である。あるいは、購入したD−PBSをPBSとして使用した。
(RPMIメディウム)
抗生物質としてペニシリン(100unit/mL)およびストレプトマイシン(100mg/mL)を添加した。また、必要に応じてFBSを追加で添加し、10%血清含有RPMIメディウムとした。
(自然免疫を刺激する物質の候補(以下、候補物質とも表記)の一次溶液)
・トコフェロールの一次溶液
10mgのトコフェロールを秤量し、1.0mLのエタノールに溶解させた。さらに、PBSにて10倍に希釈し、トコフェロールの一次溶液を調製した。
・酢酸トコフェロールの一次溶液
10mgの酢酸トコフェロールを秤量し、1.0mLのエタノールに溶解させた。さらに、PBSにて10倍に希釈し、酢酸トコフェロールの一次溶液を調製した。
・alumの一次溶液
alumとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)を使用した。
用いたalumが水酸化アルミニウムの場合、最終濃度が100μg/100μLにおいては、購入した試薬の原液(アルミニウムの濃度(アルミニウム金属換算):約10mg/mL)を、alumの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が、100μg/100μLよりも薄い場合、購入した試薬の原液をPBSにて希釈し、alumの一次溶液とした後、アジュバント組成物の調製に用いた。具体的には、最終濃度が10μg/100μLの場合、購入した試薬の原液をPBSにて10倍に希釈し、アジュバント組成物の調製に用いた。また、最終濃度が1μg/100μLの場合は、PBSにて100倍に希釈し、最終濃度が0.1μg/100μLの場合は、PBSにて1000倍に希釈したものを、alumの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。
用いたalumがリン酸アルミニウムの場合、水酸化アルミニウムと同様に、購入した試薬の原液、および購入した試薬の原液をPBSにて希釈したものをalumの一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に用いた。
硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)は、10mgを秤量し、1mLの注射用水にて溶解させた。本溶液を、水酸化アルミニウムにおける、購入した試薬の原液と同様に扱い、アジュバント組成物の調製に使用した。
(pH感受性担体の調製)
バンガム法による製造
メタノール(またはクロロホルム)に溶解した1000nmolの両親媒性物質と、メタノール(またはクロロホルム)に溶解したpH感受性化合物を、10mLナスフラスコ混合し、溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に0.5mLのMES Buffer(溶出性試験および膜融合試験の場合)または0.5mLのPBS(マウスへの免疫の場合)を添加し、超音波照射装置を用いて分散させ、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、MES BufferあるいはPBSにて希釈した。
バンガム法による製造
メタノール(またはクロロホルム)に溶解した1000nmolの両親媒性物質と、メタノール(またはクロロホルム)に溶解したpH感受性化合物を、10mLナスフラスコ混合し、溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に0.5mLのMES Buffer(溶出性試験および膜融合試験の場合)または0.5mLのPBS(マウスへの免疫の場合)を添加し、超音波照射装置を用いて分散させ、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、MES BufferあるいはPBSにて希釈した。
混合による製造
所定量のpH感受性化合物を秤量し、MES BufferあるいはPBSに溶解させ、pH感受性化合物の溶液を調製した。次に、所定量の両親媒性物質を秤量し、先に調製したpH感受性化合物に溶液に添加し、混合することで、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。操作は、室温にて実施した。具体的には、1000nmolのDLPCに対して、1600nmolのデオキシコール酸から成るpH感受性担体の場合、13.8mgのデオキシコール酸ナトリウム一水和物を秤量し、10mLのMES BufferあるいはPBSに溶解させた。次に、12.4mgのDLPCを秤量し、先に調製したデオキシコール酸の溶液に添加し、混合することで、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、MES BufferあるいはPBSにて希釈した。
所定量のpH感受性化合物を秤量し、MES BufferあるいはPBSに溶解させ、pH感受性化合物の溶液を調製した。次に、所定量の両親媒性物質を秤量し、先に調製したpH感受性化合物に溶液に添加し、混合することで、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。操作は、室温にて実施した。具体的には、1000nmolのDLPCに対して、1600nmolのデオキシコール酸から成るpH感受性担体の場合、13.8mgのデオキシコール酸ナトリウム一水和物を秤量し、10mLのMES BufferあるいはPBSに溶解させた。次に、12.4mgのDLPCを秤量し、先に調製したデオキシコール酸の溶液に添加し、混合することで、pH感受性担体の分散液(溶液)を調製した。また、使用時には、全量を考慮して、MES BufferあるいはPBSにて希釈した。
なお、両親媒性物質とpH感受性化合物との比率は、所望の比率となるよう調整した。また、複数の両親媒性物質を使用する場合は、両親媒性物質の総量が、所望のモル数(1000nmol)となるように調整した。また、実施例や図の説明におけるpH感受性化合物の使用量は、100nmolの両親媒性物質に対する使用量である。
(アジュバント組成物およびワクチン組成物の調製)
調製したpH感受性担体の分散液(溶液)に、自然免疫を刺激する物質の候補(以下、候補物質とも表記)の一次溶液を添加し、混合した。濃度を調製するための追加のMES
BufferあるいはPBSを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。
調製したpH感受性担体の分散液(溶液)に、自然免疫を刺激する物質の候補(以下、候補物質とも表記)の一次溶液を添加し、混合した。濃度を調製するための追加のMES
BufferあるいはPBSを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。
また、得られたアジュバント組成物に、所定量のOVAを溶解させたPBSを添加し、混合することで、ワクチン組成物を調製した。
評価(4)の実験以外は、100nmol/100μLの両親媒性物質の濃度になるように、pH感受性担体、アジュバント組成物、およびワクチン組成物を調製した。評価(4)の実験は、pH感受性担体の分散液(溶液)を、希釈して使用した。最終的に、100nmol/100μL〜0.1nmol/100μLの両親媒性物質の濃度となるようにワクチン組成物を調製した。
CpG−DNA(CpG−ODN)を用いる場合は、200μgのCpG−ODNを200μLの注射用水に溶解させ、候補物質の一次溶液とし、アジュバント組成物の調製に使用した。
(比較試料の調製)
比較試料として、抗原のみ、抗原と候補物質の混合(候補物質単独とも表記)、を調製した。また、溶出性試験においては、両親媒性物質単独の分散液、pH感受性担体単独の分散液も調製した。
比較試料として、抗原のみ、抗原と候補物質の混合(候補物質単独とも表記)、を調製した。また、溶出性試験においては、両親媒性物質単独の分散液、pH感受性担体単独の分散液も調製した。
<測定方法>
(溶出性試験:Leakage(溶出率)の測定)
Leakage(溶出率)は、K.Kono et al. Bioconjugate Chem. 2008 19 1040−1048に記載の方法に従い、蛍光物質であるPyranineと消光剤であるDPXとを内包したEYPCリポソームを用いて評価した。
(溶出性試験:Leakage(溶出率)の測定)
Leakage(溶出率)は、K.Kono et al. Bioconjugate Chem. 2008 19 1040−1048に記載の方法に従い、蛍光物質であるPyranineと消光剤であるDPXとを内包したEYPCリポソームを用いて評価した。
クロロホルムに溶解させた3000nmolのEYPCを10mLナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Pyranine溶液(Pyranine:35mM、DPX:50mM、MES:25mM、pH7.4)500μLを加え、超音波照射装置(USC−J)を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径100nmのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。MES BufferとG100カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したEYPCリポソーム分散液を得た。リン脂質C−テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が1.0mmol/LとなるようにMES Bufferを用いて濃度を調整した。
濃度を調製したEYPCリポソーム分散液20μLと、評価サンプル分散液20μLを、pHを調整した2960μLのMES Bufferに投与し、37℃にて90あるいは30分間インキュベーションした後(実施例において、特別な記載のない限り、90分間の結果である)、分光光度計FP−6500を用いてEx416、Em512nmの蛍光を観察することにより、Leakageをモニターした。
なお、EYPCリポソーム分散液のみの場合を0%とし、10倍希釈したTriton−X100を30μL加えた場合の値を100%として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をLとし、蛍光物質を内包したEYPCリポソーム分散液のみの蛍光強度をL0、Triton−X100を加えた場合の蛍光強度をL100と表す。
(膜融合試験:Fusion(膜融合)の測定)
Fusion(膜融合)は、K.Kono et al.Biomaterials 2008 29 4029−4036に記載の方法に従い、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を利用して評価した。蛍光標識は、NBD−PE、Rh−PEを用いた。
Fusion(膜融合)は、K.Kono et al.Biomaterials 2008 29 4029−4036に記載の方法に従い、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を利用して評価した。蛍光標識は、NBD−PE、Rh−PEを用いた。
EYPCに対して0.6mol%のNBD−PE、およびRh−PEを含むEYPC(EYPC1000nmol)の薄膜を作製し、1.0mLのMES Bufferを加え、超音波照射装置(USC−J)を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径100nmのポリカーボネート膜を通し、二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液を得た。
二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液20μLと、評価サンプル分散液20μLを、pHを調製した2960μLのMES Bufferに投与し、37℃にて60分間インキュベーションした後、分光光度計(FP−6500)を用いて450nmの励起光による500nm〜620nmの蛍光スペクトルを測定し、520nmと580nmとの蛍光強度比を求めた。
融合率は、上記で得られた二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比を0%とし、二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液と、評価サンプル分散液と、をメタノール処理したものを100%として算出した。なお、メタノール処理は二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液と評価サンプル分散液との両者をメタノールに溶解させた後、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とし、3.0mLのMES Bufferと超音波照射装置を用いて分散させて実施した。
具体的には、融合率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定して得られた蛍光強度比をRとし、二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比をR0、二重蛍光標識したEYPCリポソーム分散液と評価サンプル分散液をメタノール処理して得られた蛍光強度比をR100と表す。
(マウスへの免疫)
投与は麻酔下にて実施した。皮下投与の場合は、背部1箇所に100μL/headにて皮下注射した。alumの投与量は0〜100μg/headとし、自然免疫を刺激する物質の候補は10μg/headとした。pH感受性担体は、両親媒性物質:100nmol/head、pH感受性化合物:10〜640nmol/headを、基本の投与濃度とし、一部、希釈した条件にて投与を行った。抗原は、OVAタンパク質、あるいはOVAペプチドを使用し、80μg/headとした。また、皮内投与の場合は、皮下投与と同様の投与液を用いて、背部1箇所に20μL/headにて皮内注射した。細胞性免疫を評価する場合は、投与を1回とし、投与から7日後にアッセイを実施した。液性免疫を評価する場合は、投与を2回とし、初回投与から14日後に2回目の投与を行った。さらに、2回目の投与から14日後にアッセイを実施した。
投与は麻酔下にて実施した。皮下投与の場合は、背部1箇所に100μL/headにて皮下注射した。alumの投与量は0〜100μg/headとし、自然免疫を刺激する物質の候補は10μg/headとした。pH感受性担体は、両親媒性物質:100nmol/head、pH感受性化合物:10〜640nmol/headを、基本の投与濃度とし、一部、希釈した条件にて投与を行った。抗原は、OVAタンパク質、あるいはOVAペプチドを使用し、80μg/headとした。また、皮内投与の場合は、皮下投与と同様の投与液を用いて、背部1箇所に20μL/headにて皮内注射した。細胞性免疫を評価する場合は、投与を1回とし、投与から7日後にアッセイを実施した。液性免疫を評価する場合は、投与を2回とし、初回投与から14日後に2回目の投与を行った。さらに、2回目の投与から14日後にアッセイを実施した。
(マウス脾臓からの細胞分散液の調製)
最終の投与から7日目においてマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。3.0mLの10%血清含有RPMIメディウムを添加した後、BD Falconセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。RBC lysis bufferを用いて溶血操作を行った後、10%血清含有RPMIメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を10%血清含有RPMIメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。
最終の投与から7日目においてマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。3.0mLの10%血清含有RPMIメディウムを添加した後、BD Falconセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。RBC lysis bufferを用いて溶血操作を行った後、10%血清含有RPMIメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を10%血清含有RPMIメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。
(ELIspot法)
ELIspot法は、Mouse IFNγ ELISPOT Setを用いて実施した。細胞を播種する前日に、96well ELIspotプレートにキットに付属のdetection antibodyを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを10%血清含有RPMIメディウムにて洗浄した後、200μLの10%血清含有RPMIメディウムを添加し、37℃にて2時間静置しブロッキングを行った。10%血清含有RPMIメディウムにてプレートを洗浄した後、抗原の再刺激を加える場合は、40μg/mLのOVAペプチドを含む10%血清含有RPMIメディウム100μLをプレートに添加し、抗原の再刺激を加えない場合は10%血清含有RPMIメディウム100μLをプレートに添加した。前記プレートに、脾臓の細胞分散液を所定の細胞数となるように播種し、最後に、10%血清含有RPMIメディウムを用いて1穴あたりの全量が200μLとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。
ELIspot法は、Mouse IFNγ ELISPOT Setを用いて実施した。細胞を播種する前日に、96well ELIspotプレートにキットに付属のdetection antibodyを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを10%血清含有RPMIメディウムにて洗浄した後、200μLの10%血清含有RPMIメディウムを添加し、37℃にて2時間静置しブロッキングを行った。10%血清含有RPMIメディウムにてプレートを洗浄した後、抗原の再刺激を加える場合は、40μg/mLのOVAペプチドを含む10%血清含有RPMIメディウム100μLをプレートに添加し、抗原の再刺激を加えない場合は10%血清含有RPMIメディウム100μLをプレートに添加した。前記プレートに、脾臓の細胞分散液を所定の細胞数となるように播種し、最後に、10%血清含有RPMIメディウムを用いて1穴あたりの全量が200μLとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。
プレートの呈色は、Mouse IFNγ ELISPOT Set、およびAEC Substrate Setに記載のプロトコールに従って実施した。
(抗体価の測定)
2回目の投与を行う前日に部分採血を行い、1回投与の抗体価を調べた。また、2回目の投与から14日後に採血を行い、2回投与の抗体価を調べた。採血した血液を室温にて2時間静置し、遠心分離することにより血清を得た。500mLのPBSに5gのアルブミンを溶解し、Block bufferとした。1.47gの炭酸水素ナトリウムと0.80gの炭酸ナトリウムを500mLの水に溶解させ、Coating Bufferとした。プレートの洗浄には、500mLのPBSに2.5mLのTween20を添加したものを使用した。
2回目の投与を行う前日に部分採血を行い、1回投与の抗体価を調べた。また、2回目の投与から14日後に採血を行い、2回投与の抗体価を調べた。採血した血液を室温にて2時間静置し、遠心分離することにより血清を得た。500mLのPBSに5gのアルブミンを溶解し、Block bufferとした。1.47gの炭酸水素ナトリウムと0.80gの炭酸ナトリウムを500mLの水に溶解させ、Coating Bufferとした。プレートの洗浄には、500mLのPBSに2.5mLのTween20を添加したものを使用した。
OVAタンパク質をCoating Bufferに溶解させ、0.1μg/well(100μL)となるように、96wellプレートに添加した。37℃にて2時間静置した後、300μLのBlock bufferと置換し、4℃にて一晩静置した。プレートを洗浄した後、所定の倍率に希釈した血清を各wellに100μL添加し、37℃にて2時間静置した。プレートを洗浄した後、Block bufferにて1000倍希釈した二次抗体溶液を各wellに100μL添加し、37℃にて2時間静置した。プレートを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットを用いて発色を行い、抗体価を求めた。
[評価]
前記記載の方法に従って調製した分散液を用いて各種評価を行った。
前記記載の方法に従って調製した分散液を用いて各種評価を行った。
(1)pH感受性担体との併用に適切な、自然免疫を活性化する物質の選定
pH感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導する高い効果を有する、自然免疫を活性化する物質の選定を行った。入手性および注射実績を考慮して、トコフェロール、酢酸トコフェロール、alum(水酸化アルミニウム)を、自然免疫を活性化する物質の候補(以下、候補物質とも表記)とし、pH感受性担体との併用による、細胞性免疫誘導の効果を調べた。
pH感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導する高い効果を有する、自然免疫を活性化する物質の選定を行った。入手性および注射実績を考慮して、トコフェロール、酢酸トコフェロール、alum(水酸化アルミニウム)を、自然免疫を活性化する物質の候補(以下、候補物質とも表記)とし、pH感受性担体との併用による、細胞性免疫誘導の効果を調べた。
pH感受性担体は、1匹あたり100nmolのDLPCおよび160nmolのデオキシコール酸の複合体を使用した。候補物質らは、いずれも1匹あたり10μgとし、抗原は、1匹あたり80μgのOVAタンパク質を使用した。投与液は、投与量を調製するためのPBSに、pH感受性担体の分散液(溶液)、候補物質、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。なお、投与液は、100μL中、pH感受性担体の分散液(溶液)、候補物質、抗原が所定の濃度となるように調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のELIspot法に従って評価した。
また、比較試料としては、抗原のみ、抗原と候補物質との混合とし、投与液としては、PBSに抗原、または抗原および候補物質を混合して調製し、1匹あたり100μLを投与した。
また、ELIspot法による細胞性免疫(CTL)の誘導は、コントロール(抗原およびアルミニウムを含有する物質の混合)との比較を目視で行い、以下の基準により評価した。
○:コントロールと比べて、明確に細胞性免疫の誘導が見られる
△:コントロールと比べて、わずかに細胞性免疫の誘導が見られる
×:コントロールと同等または同等以下の細胞性免疫の誘導である。
△:コントロールと比べて、わずかに細胞性免疫の誘導が見られる
×:コントロールと同等または同等以下の細胞性免疫の誘導である。
評価の結果、当然のことながら、抗原のみはspotの形成に至らず、細胞性免疫は誘導されなかった(図2(A))。また、比較試料である、トコフェロール、および酢酸トコフェロールにおいても、抗原のみと同等にspotは形成されず、細胞性免疫は誘導されなかった(図2(B)(C))。さらに、alumは細胞性免疫を誘導できないことが広く知られていることから、図2(D)におけるspot形成は、細胞性免疫を誘導していないものと判断した。それゆえ、図2(D)よりも多くのspot形成数である場合において、細胞性免疫を誘導したものと考える。
トコフェロールとpH感受性担体との併用、および酢酸トコフェロールとpH感受性担体との併用は、alum単独(図2(D)の抗原+alum)によるspot形成数と同程度であり、細胞性免疫を誘導できなかった(図2(E)(F))。一方、alumとpH感受性担体との併用は、alum単独のspot形成と比較して、非常に多くのspotを形成した(図2(G))。alumとpH感受性担体とを併用することにより、細胞性免疫の誘導に至ることが示された。本結果から、alumは、pH感受性担体との併用に適切な、自然免疫を刺激(活性化)する物質であると示された。
(2)CpG−ODNとの比較、および抗原特異性の評価
CpG−ODNは特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドであり、細胞性免疫を誘導することが報告されている試薬である。本試薬をポジティブコントロールとして用いることで、alumとpH感受性担体との併用による、細胞性免疫の誘導活性の高さを評価した。CpG−ODNは、1匹あたり10μgを使用し、他の実験条件は全て(1)と同じとした。評価は(1)のELIspotと同一のプレートにて、実施した。
CpG−ODNは特定の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドであり、細胞性免疫を誘導することが報告されている試薬である。本試薬をポジティブコントロールとして用いることで、alumとpH感受性担体との併用による、細胞性免疫の誘導活性の高さを評価した。CpG−ODNは、1匹あたり10μgを使用し、他の実験条件は全て(1)と同じとした。評価は(1)のELIspotと同一のプレートにて、実施した。
alumとpH感受性担体との併用によって得られたspot形成は、CpG−ODNによって得られたものと比較して、多数であった(図3(B)(C))。一般に知られている試薬であるCpG−ODNと比較して高い活性であったことから、alumとpH感受性担体との併用は、細胞性免疫の高い誘導を可能とすることが明らかとなった。
また、誘導した免疫が抗原特異的であることは、実使用の観点から非常に重要である。そこで、alumとpH感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫に対して、抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のELIspot法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。具体的には、免疫した動物から回収した脾臓細胞の分散液を、ELIspotプレートに播種し、SIINFEKLのペプチドを加えることなく、IFN−γ産生細胞によるspot形成を行った。その結果、spot形成は全く見られず、図3(B)における、alumとpH感受性担体との併用によって得られるspotの形成は、完全に消失した(図3(D))。alumとpH感受性担体との併用によって誘導した細胞性免疫は、確かに抗原特異的であることが示された。また、誘導された細胞は、SIINFEKLのクラスIペプチドに反応したことからCTLであることが示唆された。
(3)細胞性免疫を誘導するために必要なalumの量について
alum(水酸化アルミニウム)は、pH感受性担体との併用し、細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。そこで、細胞性免疫を誘導するために必要となるalumの量を調べた。alumは水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体はDLPCとデオキシコール酸の複合体を使用した(1匹あたり、100nmolのDLPCおよび160nmolのデオキシコール酸)。alumは、1匹あたり100〜0.1μgとし、抗原は1匹あたり80μgのOVAタンパク質を使用した。投与液は、pH感受性担体の分散液(溶液)に、投与量を調製するためのPBS、alum、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のELIspot法に従って評価した。なお、alum単独とは、抗原とalumとを混合したものを指す。
alum(水酸化アルミニウム)は、pH感受性担体との併用し、細胞性免疫を誘導することが明らかとなった。そこで、細胞性免疫を誘導するために必要となるalumの量を調べた。alumは水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体はDLPCとデオキシコール酸の複合体を使用した(1匹あたり、100nmolのDLPCおよび160nmolのデオキシコール酸)。alumは、1匹あたり100〜0.1μgとし、抗原は1匹あたり80μgのOVAタンパク質を使用した。投与液は、pH感受性担体の分散液(溶液)に、投与量を調製するためのPBS、alum、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のELIspot法に従って評価した。なお、alum単独とは、抗原とalumとを混合したものを指す。
評価の結果、100〜1μgのalumであるワクチン組成物(溶液中のalum濃度としては100μg/100μL〜1μg/100μL)(図中、抗原+alum+pH感受性担体)は、形成されたspot数が、alum単独(図中、抗原+alum)によるそれより多かった(図4(B)(C)(D)(E))。一方、alumの使用量が0.1μgの場合、形成されたspot数は、alum単独のそれと同等であった(図4(B)(F))。以上の結果から、100nmolのDLPCに対して、1〜100μgのalumの量(溶液中のalum濃度としては1μg/100μL〜100μg/100μL)において、細胞性免疫を誘導する効果が確認された。100nmolの両親媒性物質に対して、1〜100μgのalumの量(alum濃度:1μg/100μL〜100μg/100μL)において、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。
(4)細胞性免疫を誘導するために必要なpH感受性担体の量について
次に、細胞性免疫を誘導するために必要な、pH感受性担体の量を調べた。1匹あたり10μgの水酸化アルミニウムを使用し、種々の倍率に希釈したpH感受性担体の分散液を用いて、投与液を調製した。pH感受性担体は、100nmolのDLPCに対して、160nmolのデオキシコール酸である複合体を使用した。その他の条件は(1)および(3)と同様とした。
次に、細胞性免疫を誘導するために必要な、pH感受性担体の量を調べた。1匹あたり10μgの水酸化アルミニウムを使用し、種々の倍率に希釈したpH感受性担体の分散液を用いて、投与液を調製した。pH感受性担体は、100nmolのDLPCに対して、160nmolのデオキシコール酸である複合体を使用した。その他の条件は(1)および(3)と同様とした。
評価の結果、pH感受性担体の希釈倍率が、1〜100倍である場合、調製した投与液によるspotの形成は、alum単独よりも、多数であった(図5(B)(C)(D)(E))。一方、希釈倍率が1000倍の投与液は、alum単独よりも若干多めのspot形成数であった(図5(B)(F))。以上より、pH感受性担体を構成するDLPCが1〜1000nmol/100μLの濃度、デオキシコール酸が1.6〜160nmol/1000μLの濃度にて調製した投与液は、細胞性免疫を誘導することが確認された。すなわち、pH感受性担体を構成する両親媒性物質の濃度が、1〜1000nmol/100μLである場合、ワクチン組成物は、細胞性免疫を誘導するものと示唆された。
(5)液性免疫の誘導について
alumとpH感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した。液性免疫の誘導は、IgG抗体価によって評価した。1回あたりの投与量として、alumは10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体は100nmolのDLPCと160nmolのデオキシコール酸からなる複合体を使用した。抗原は、80μgのOVAタンパク質とした。投与液は、pH感受性担体の分散液(溶液)に、投与量を調製するためのPBS、alum、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。液性免疫を評価するため、投与は2回行った。抗体価の評価は、前記記載の抗体価の測定に従って実施した。
alumとpH感受性担体との併用による、液性免疫の誘導について検証した。液性免疫の誘導は、IgG抗体価によって評価した。1回あたりの投与量として、alumは10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体は100nmolのDLPCと160nmolのデオキシコール酸からなる複合体を使用した。抗原は、80μgのOVAタンパク質とした。投与液は、pH感受性担体の分散液(溶液)に、投与量を調製するためのPBS、alum、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。液性免疫を評価するため、投与は2回行った。抗体価の評価は、前記記載の抗体価の測定に従って実施した。
評価の結果、alum単独が最も高いIgG抗体価を示し、alumとpH感受性担体との併用は、次に高い抗体価を示した(図6、2回投与)。また、alumとpH感受性担体との併用は、PBSや抗原のみの群と比較して、高いIgG抗体価を示した(図6、2回投与)。この結果から、alumとpH感受性担体とを併用したワクチン組成物は、液性免疫を誘導することが可能であることが示された。
alumとpH感受性担体とを併用したワクチン組成物は、細胞性免疫および液性免疫の双方を誘導・増強することが可能であると明らかとなった。したがって、本発明に係るアジュバント組成物は、優秀なアジュバントとして利用されうる。
(6)alumの種類に関して
本明細書中において、alumは、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として用いている。alumの種類としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらの中から、入手が可能、かつpH感受性担体との併用によって、細胞性免疫の誘導が可能なものを調べた。
本明細書中において、alumは、アルミニウムを含有するアジュバントの総称として用いている。alumの種類としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)、塩化アルミニウムなどが挙げられ、これらの中から、入手が可能、かつpH感受性担体との併用によって、細胞性免疫の誘導が可能なものを調べた。
本実施例において、alumはリン酸アルミニウム、および硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)を使用した。また、pH感受性担体はDLPCとデオキシコール酸の複合体を使用した(1匹あたり、100nmolのDLPCおよび160nmolのデオキシコール酸)。alumは、(3)の実施例を参考にして、1匹あたり1〜0.1μgとし、抗原は1匹あたり80μgのOVAタンパク質を使用した。投与液は、pH感受性担体の分散液(溶液)に、投与量を調製するためのPBS、alum、抗原の順に添加し、混合することにより調製した。投与量は、1匹あたり100μLとし、投与経路は皮下とした。細胞性免疫の誘導は、前記記載のELIspot法に従って評価した。
評価の結果、抗原とリン酸アルミニウム、および抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものは、spotの形成をほとんど認められず、細胞性免疫を誘導できなかった(図7(A)(D))。1μgのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合よりも多くのspot形成がなされ、細胞性免疫が誘導された(図7(B))。一方、0.1μgのリン酸アルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原とリン酸アルミニウムの混合と、同様のspot形成となり、細胞性免疫は誘導されなかった(図7(C))。ワクチン組成物における、細胞性免疫を誘導するalumの最小量として、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様の結果を示したことから、リン酸アルミニウムは、水酸化アルミニウムと同様に、100nmolの両親媒性物質に対して、1〜100μgのalumの量(alum濃度:1μg/100μL〜100μg/100μL)において、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。
また、1μgの硫酸カリウムアルミニウムを使用したワクチン組成物は、抗原と硫酸カリウムアルミニウムを混合したものよりも若干多くのspot形成が見られ、細胞性免疫が誘導されていることが示唆された(図7(E))。
以上の結果から、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムは、硫酸カリウムアルミニウムに比べて効果が高いことがわかった。
pH感受性担体と併用し、細胞性免疫を誘導するワクチン組成物の構成成分として、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムは、特に有用であることが明らかとなった。
(7)alumが及ぼす、pH感受性担体の機能への影響について
(7−1)膜破壊機能促進効果に及ぼす、alumの種類、およびalumの量の影響について
pH感受性担体の膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果は、細胞のエンドソーム膜を破壊し、クロスプレゼンテーションを促進させるための、重要な機能である。また、alumは種々の物質を吸着させることが知られている。そのため、alumとpH感受性担体とを混合した場合における、pH感受性担体の機能への影響を調べた。
(7−1)膜破壊機能促進効果に及ぼす、alumの種類、およびalumの量の影響について
pH感受性担体の膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果は、細胞のエンドソーム膜を破壊し、クロスプレゼンテーションを促進させるための、重要な機能である。また、alumは種々の物質を吸着させることが知られている。そのため、alumとpH感受性担体とを混合した場合における、pH感受性担体の機能への影響を調べた。
まず、膜破壊機能促進効果に及ぼす影響について調べた。評価サンプルの全量を100μLとなるように、pH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合して調製した。一晩インキュベートした後、これらの評価サンプルの一部(20μL)を用いて、溶出性試験を行った。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。100μL中の量として、pH感受性担体は、100nmolのDLPCと160nmolのデオキシコール酸である複合体を使用し、alumは、10μgの、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)を使用した。
デオキシコール酸単独は、pH7.4にて1%以下、pH5.0にて15%程度の溶出率であり、alumを混合していないpH感受性担体は、pH7.4にて1%以下、pH5.0にて60%程度の溶出率であった(図8(A))。DLPC単独の溶出率は、pH5.0にて2%以下であったことから(図10(A))、確かに、pH感受性担体は膜破壊機能促進効果を有していた。また、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)の、いずれのalumと混合したpH感受性担体においても、それらはpH7.4においてほとんど溶出を引き起こさず、pH5.0では60%程度の溶出を引き起こした(図8(A))。すなわち、いずれのalumを混合した場合においても、pH感受性担体は、式(1)および式(2)を満たし、確かに膜破壊機能促進効果を有することが確認された。また、いずれのalumにおいても、alumと混合したpH感受性担体は、pH7.4および5.0において、alumと混合していないpH感受性担体と、同様の溶出率を示したことから、alumとの混合は、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
続いて、混合するalumの量の影響について検討した。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)のalumを、100nmolのDLPCと160nmolのデオキシコール酸であるpH感受性担体に対して、0〜100μgとなるように混合し(全量100μL)、一晩インキュベートした後、溶出性試験を行った。なお、100μgの硫酸カリウムアルミニウム(ミョウバン)の溶液は、低いpHとなったため、測定を行わなかった。その結果、いずれのalumの、いずれの添加量においても、pH5.0の溶出率は60%程度の値を示し、alumを混合しなかったものから、変化しなかった(8図(B))。したがって、いずれの種類の、いずれの添加量においても、alumは、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果に影響を及ぼさないことが示唆された。
(7−2)膜融合機能促進効果に及ぼすalumの影響
続いて、膜融合機能促進効果に及ぼすalumの影響を調べた。図9は、種々のalumと混合した場合における、pH感受性担体の膜融合機能促進効果を調べた結果である。両親媒性物質は100nmolのDLPCとし、pH感受性化合物は160nmolのデオキシコール酸とし、alumは10μgとした。全量を100μLとなるように、pH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を膜融合試験にて評価した。膜融合試験は、前記記載の膜融合試験に従って実施した。
続いて、膜融合機能促進効果に及ぼすalumの影響を調べた。図9は、種々のalumと混合した場合における、pH感受性担体の膜融合機能促進効果を調べた結果である。両親媒性物質は100nmolのDLPCとし、pH感受性化合物は160nmolのデオキシコール酸とし、alumは10μgとした。全量を100μLとなるように、pH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を膜融合試験にて評価した。膜融合試験は、前記記載の膜融合試験に従って実施した。
pH感受性担体は、いずれのalumを混合した場合においても、pH5.0において約70%もの融合率を示し、式(3)を満たす結果となった(図9)。すなわち、alumと混合したpH感受性担体は、確かに膜融合機能促進効果を有していた。また、いずれのalumにおいても、alumと混合したpH感受性担体は、pH7.4および5.0において、alumと混合していないpH感受性担体と同様の融合率を示した(図9)。それゆえ、alumとの混合は、pH感受性担体の膜融合機能促進効果に影響を及ぼさないことが確認された。
pH感受性担体は、alumとの混合に関わらず、同様の膜破壊機能促進効果、および膜融合機能促進効果を示したことから、alumとの混合は、pH感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
(7−3)種々のデオキシコール酸量であるpH感受性担体における、alumの影響
次に、pH感受性担体の組成を変化させた場合における、pH感受性担体の機能に及ぼすalumの影響を調べた。alumとして、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体として、100nmolのDLPCと、種々の量のデオキシコール酸からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、pH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
次に、pH感受性担体の組成を変化させた場合における、pH感受性担体の機能に及ぼすalumの影響を調べた。alumとして、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体として、100nmolのDLPCと、種々の量のデオキシコール酸からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、pH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
pH5.0において、alumと混合したpH感受性担体は、いずれの量のデオキシコール酸においても、alumと混合していないものと同等の溶出率であった(図10(A)(B))。すなわち、100nmolのDLPCと、10〜640nmolのpH感受性化合物であるpH感受性担体に対して、alumとの混合は、機能に影響を及ぼさないことが示された。いずれのpH感受性化合物の量である、pH感受性担体においても、alumの混合は、機能に影響を及ぼさないと示唆された。
また、alumと混合したpH感受性担体は、pH感受性化合物の量が10〜640nmolのいずれの量においても、式(1)および式(2)を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。これらのpH感受性担体は、alumとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる。
(7−4)種々のpH感受性化合物から成るpH感受性担体における、alumの影響
さらに、種々のpH感受性化合物から構成されるpH感受性担体の機能において、alumの影響を調べた。alumとしては、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体としては、100nmolのDLPCおよび160nmolの種々のpH感受性化合物からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、pH感受性担体とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。DLPC(両親媒性物質)単独による溶出率は、pH5.0にて2.0%以下であった。
さらに、種々のpH感受性化合物から構成されるpH感受性担体の機能において、alumの影響を調べた。alumとしては、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体としては、100nmolのDLPCおよび160nmolの種々のpH感受性化合物からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、pH感受性担体とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。DLPC(両親媒性物質)単独による溶出率は、pH5.0にて2.0%以下であった。
いずれのpH感受性化合物を用いて調製したpH感受性担体においても、alumと混合したものは、alumと混合していないものと比べて、同等の溶出率を示した(表1、pH7.4、およびpH5.0)。いずれのpH感受性化合物においても、alumとの混合は、pH感受性担体の機能に影響を及ぼさないことが確認された。
また、alumと混合したpH感受性担体は、いずれのpH感受性化合物を用いた場合においても、式(1)および式(2)を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのpH感受性担体は、alumとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる(表1)。
(7−5)種々の両親媒性物質からなるpH感受性担体における、alumの影響
また、種々の両親媒性物質からなるpH感受性担体の機能において、alumの影響を調べた。alumとしては、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体としては、100nmolの種々の両親媒性物質および160nmolのデオキシコール酸からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、100nmolの所定の両親媒性物質および160nmolのデオキシコール酸を含むpH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
また、種々の両親媒性物質からなるpH感受性担体の機能において、alumの影響を調べた。alumとしては、10μgの水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体としては、100nmolの種々の両親媒性物質および160nmolのデオキシコール酸からなる複合体を使用した(全量100μL)。(7−1)と同様に、100nmolの所定の両親媒性物質および160nmolのデオキシコール酸を含むpH感受性担体の分散液(溶液)とalumとを混合し、一晩インキュベートした後、これらの混合溶液の一部を溶出性試験にて評価した。溶出性試験は、前記記載の溶出性試験に従って実施した。
いずれの両親媒性物質を用いて調製したpH感受性担体においても、alumと混合したものは、alumと混合していないものと比べて、同等以上の溶出率を示した(表2−2、表2−3)。なお、デオキシコール酸(pH感受性化合物)単独による溶出率は、pH7.4にて1%以下、pH5.0にて15%程度であった。
また、alumと混合したpH感受性担体は、いずれの両親媒性物質を用いた場合においても、式(1)および式(2)を満たしており、確かに膜破壊機能促進効果を有してした。したがって、これらのpH感受性担体は、alumとの混合により、細胞性免疫を誘導するものと考えられる(表2−2、表2−3)。
(8)投与経路の検討
一般的に、皮内には多くの免疫担当細胞が存在しており、皮内にワクチンを接種することで、免疫惹起の亢進や抗原量の削減が可能であることが知られている。そこで、ワクチン組成物を皮内に投与した場合における、細胞性免疫の誘導を確認した。
一般的に、皮内には多くの免疫担当細胞が存在しており、皮内にワクチンを接種することで、免疫惹起の亢進や抗原量の削減が可能であることが知られている。そこで、ワクチン組成物を皮内に投与した場合における、細胞性免疫の誘導を確認した。
alumは水酸化アルミニウムを使用し、pH感受性担体はDLPCとデオキシコール酸の複合体を使用した(100nmolのDLPCおよび160nmolのデオキシコール酸)。皮下投与の場合、1匹あたりの投与量を100μLとし、10μgのalum、80μgのOVA、100nmolのDLPCを含むpH感受性担体を投与した。また、皮内投与の場合、1匹あたりの投与量を20μLとし、2μgのalum、16μgのOVA、20nmolのDLPCを含むpH感受性担体を投与した。具体的には、皮内投与は、皮下投与に用いた投与液を使用し、投与量を100μLから20μLとすることで、前記記載の量を調製した。細胞性免疫の誘導は、前記記載のELIspot法に従って評価した。
評価の結果、皮内投与におけるalumとpH感受性担体との併用は、alum単独と比較して、多数のspotを形成した(図11(C)(D))。ワクチン組成物は、皮内の投与経路においても、細胞性免疫を誘導することが確認された。また、得られた結果を皮下投与と比較したところ、ワクチン組成物の皮内投与は、少ない投与量であるにも関わらず、ワクチン組成物の皮下投与よりも多数のspotを形成した(図11(B)(D))。ワクチン組成物の細胞性免疫を誘導する効果は、皮内投与によって、より高まることが明らかとなった。
続いて、誘導した細胞性免疫の抗原特異性を評価した。評価は、前記記載のELIspot法における、再刺激を加えない方法に従って実施した。その結果、ワクチン組成物の皮内投与は、spotを形成しなかった(図11(H))。ワクチン組成物を皮内投与することによって誘導された細胞性免疫は、抗原特異的であることが明らかとなった。
本出願は、2015年6月2日に出願された日本特許出願番号2015−112519号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として組み入れられている。
Claims (11)
- pH感受性担体と、アルミニウムを含有する物質と、を含むアジュバント組成物。
- 前記アルミニウムを含有する物質が、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムからなる群より選択される1種以上である、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記pH感受性担体が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
を含み、膜破壊機能促進効果を発現する、請求項1または2に記載のアジュバント組成物。 - 前記アルミニウムを含有する物質が、前記両親媒性物質100nmolに対して、アルミニウム金属換算で1〜1000μgで含有される、請求項3に記載のアジュバント組成物。
- 前記pH感受性化合物が、前記両親媒性物質100molに対して10mol以上の割合で含有される、請求項3または4に記載のアジュバント組成物。
- 請求項1または2に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
- 前記抗原の含有量が、前記両親媒性物質100nmolに対して、3.2〜400μgである、請求項7に記載のワクチン組成物。
- 前記抗原がペプチドまたはタンパク質である、請求項6〜8のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程を含む、アジュバント組成物の製造方法。 - デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、
炭素数10〜12のアシル基のみを有するホスファチジルコリン、炭素数12〜18のアシル基を有するポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16〜18のアシル基のみを有するソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、
アルミニウムを含有する物質と、
を会合させる工程;および
前記会合により得られた会合体に抗原を混合する工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
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