WO2018207841A1 - 複合体、複合体を含むpH感受性組成物、および複合体の製造方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a complex useful as a DDS (Drug Delivery System), a pH-sensitive composition containing the complex, and a method for producing the complex.
- DDS Drug Delivery System
- DDS carriers carriers
- Carriers that are sensitive to weakly acidic pH are expected to deliver to sites where pH is lowered in vivo, such as tumors and inflammation, and to deliver cells to the cytosol of cells through endosome escape .
- cytosol since delivery to cytosol can be utilized in various fields, the demand for realization is extremely high.
- delivery of nucleic acid to cytosol enables gene therapy, and delivery of antigen to cytosol induces antigen-specific CTL (Cytoxic T Lymphocyte) useful for immunotherapy and treatment of allergy.
- CTL Cytoxic T Lymphocyte
- Treg regulatory T cell
- application to new drugs with intracellular drug targets is also being studied.
- 2016/194585 (corresponding to European Patent Application Publication No. 3305320) It is disclosed that it is useful for induction of antigen-specific CTL when used together with Lipid A, a substance that stimulates immunity, an oligonucleotide having a CpG motif, an aluminum compound, and the like.
- the pH-sensitive carrier that realizes endosome escape is integrated with the bioactive substance to be delivered and the carrier, so that the probability of being trapped inside the same endosome is improved, and the bioactive substance is more efficiently converted into the cytosol. It is known that it can be delivered.
- a pH-sensitive carrier composed of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance and having an effect of promoting a membrane disruption function, and physiological properties of proteins, peptides, and the like are disclosed. It has been suggested that the active substance can be integrated.
- the present invention has been made in view of the above-described problems, and is obtained by simply combining a carrier and a physiologically active substance, which are easily obtained, have excellent integration efficiency of the physiologically active substance, and have a good effect of promoting the membrane destruction function. It is an object to provide a conjugated complex.
- the present invention for achieving the above object is a complex in which a physiologically active substance is supported on an aggregate of a pH-sensitive carrier that is aggregated under acidic conditions.
- FIG. 1A is a photograph showing the appearance when a pH-sensitive carrier dispersion is set to various pHs.
- FIG. 1B is a photograph showing the change over time when the pH of the dispersion of the pH-sensitive carrier is set to 4.5.
- FIG. 1C is a graph showing the elution rate at pH 7.4 and pH 5.0 of aggregates of pH sensitive carriers aggregated at various pHs.
- FIG. 1D is a graph showing the elution rate of DLPC alone or deoxycholic acid alone at pH 7.4 and pH 5.0.
- FIG. 2A is a photograph showing the appearance before and after filtering after acidifying a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and OVA.
- FIG. 2B is a graph showing changes in absorbance (corresponding to phospholipid concentration) before and after filtering after acidification of a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and OVA.
- FIG. 3A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering of a solution containing OVA.
- FIG. 3B is a graph in which the vertical axis of FIG. 3A is converted into protein concentration.
- FIG. 4A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering of a mixed solution (pH 3.5) containing OVA and a pH-sensitive carrier.
- FIG. 4B is a graph showing the change in absorbance (corresponding to the OVA concentration) before and after the filter treatment after acidifying the mixed solution containing OVA and the pH-sensitive carrier.
- FIG. 5A is a photograph showing the appearance when a mixed solution containing OVA and a pH-sensitive carrier is set to various pHs.
- FIG. 5B is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering after a mixed solution containing OVA and a pH-sensitive carrier was set at various pHs and allowed to stand for 1 hour.
- FIG. 5C is a graph showing the change in absorbance (corresponding to the OVA concentration) before and after filtering after the mixed solution containing OVA and pH-sensitive carrier was set to various pHs and allowed to stand for 1 day.
- FIG. 5A is a photograph showing the appearance when a mixed solution containing OVA and a pH-sensitive carrier is set to various pHs.
- FIG. 5B is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and
- FIG. 6 is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering after acidifying a mixed solution containing various concentrations of OVA and a pH-sensitive carrier.
- FIG. 7A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering after acidification of a mixed solution containing OVA and pH-sensitive carriers of various concentrations.
- FIG. 7B is a photograph showing the appearance when a mixed solution containing OVA and 1000 nmol / mL or 100 nmol / mL pH-sensitive carrier is acidified. It is a graph which shows the change of the light absorbency (corresponding to OVA density
- concentration corresponding to OVA density
- FIG. 9A is a graph showing the effect of promoting the membrane breaking function of aggregates of pH-sensitive carriers carrying OVA.
- FIG. 9B is a graph showing the influence of the composite in the presence of aluminum hydroxide on the effect of promoting the film destruction function, and the vertical axis shows the elution rate (%).
- FIG. 10A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to the OVA concentration) before and after filtering after acidifying a solution containing a pH-sensitive carrier containing various amphiphiles and OVA.
- FIG. 10B is a graph showing changes in absorbance (corresponding to OVA concentration) before and after filtering after acidifying a solution containing a pH-sensitive carrier containing various pH-sensitive compounds and OVA.
- FIG. 10A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to the OVA concentration) before and after filtering after acidifying a solution containing a pH-sensitive carrier containing various pH-sensitive compounds and OVA.
- FIG. 11 is a graph showing changes in absorbance (corresponding to DNA concentration) before and after filtering after acidification of a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and deoxyribonucleic acid (denoted as DNA in the figure).
- FIG. 12A is a graph showing changes in absorbance (corresponding to peptide concentration) before and after filtering after acidifying a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and a SIINFEKL peptide.
- FIG. 12B is a graph showing changes in absorbance (corresponding to peptide concentration) before and after filtering after acidifying a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and RGPESRLL peptide.
- FIG. 13A is a photograph showing the appearance of a pH-sensitive carrier aggregate carrying OVA immediately after standing at pH 7.4.
- FIG. 13B is a photograph showing the appearance of an aggregate of pH-sensitive carrier on which OVA is supported after standing at pH 7.4 for 1 day.
- FIG. 13C is a graph showing the elution rate when the pH of a liquid containing aggregates of pH-sensitive carriers carrying OVA is changed to neutral.
- FIG. 13D is a graph showing changes in absorbance (corresponding to the OVA concentration) before and after changing the pH of a solution containing aggregates of pH-sensitive carriers carrying OVA to neutral.
- FIG. 14A is a photograph showing a change in appearance over time when the pH of a solution containing an aggregate of a pH-sensitive carrier on which OVA is supported is set to neutral.
- FIG. 14B is a graph showing a change with time in absorbance (corresponding to the OVA concentration) when the pH of the liquid containing the aggregate of the pH-sensitive carrier on which OVA is supported is set to neutral.
- FIG. 15A is a photograph showing the appearance of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE and aggregates of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15B is a photograph of a mouse after intradermal injection of a pH sensitive carrier fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15C is a photograph of excitation light applied to a mouse after intradermal injection of a pH-sensitive carrier fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15A is a photograph showing the appearance of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE and aggregates of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15B is a photograph of a mouse after intradermal injection of a pH sensitive
- FIG. 15D is a photograph of a mouse after intradermal injection of pH sensitive carrier aggregates fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15E is a photograph of excitation light applied to a mouse after intradermal injection of an aggregate of a pH-sensitive carrier fluorescently modified with rhodamine PE.
- FIG. 15F is a photograph of a mouse after multiple intradermal injections of pH sensitive carrier aggregates fluorescently modified with rhodamine PE.
- a complex in which a physiologically active substance is supported on an aggregate of a pH-sensitive carrier that is aggregated under acidic conditions.
- a complex obtained by integrating a carrier and a physiologically active substance, which is easily obtained, is excellent in the integration efficiency of the physiologically active substance, and has a good effect of promoting the membrane destruction function, is provided.
- International Publication No. 2013/180253 discloses a technique for integrating a pH-sensitive carrier composed of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance and having a membrane destruction function promoting effect and a model protein of a physiologically active substance.
- a physiologically active substance having a large size is used, so that the physiologically active substance can be taken into endosomes, delivered to the cytosol, As a result, it is suggested that subsequent functional expression is not sufficient.
- the present inventor examined improvement of the integration technology. As a result, by mixing a pH-sensitive carrier and a physiologically active substance and exposing the mixture to an acidic environment, a complex in which both are integrated can be easily obtained. Furthermore, the complex is a physiologically active substance. It has been found that it is excellent in the integration efficiency of the film and can exhibit a good effect of promoting the film breaking function.
- PH-sensitive carriers form aggregates under acidic conditions, and it is considered that hydrophobic interaction mainly contributes to this. That is, the pH-sensitive carrier is formed such that the pH-sensitive compound is associated with the hydrophobic portion of the amphiphile, and when such a pH-sensitive carrier is exposed to an acidic environment, the pH-sensitive compound is charged. Decreases and the association structure becomes unstable. This induces a structural change in the pH-sensitive carrier, and attempts to move to a more stable state using the hydrophobic interaction as a driving force. As a result, it is believed that aggregates involving a large number of pH sensitive carriers are formed.
- the physiologically active substance when a hydrophobic physiologically active substance is mixed with the carrier and exposed to an acidic environment, the physiologically active substance co-aggregates with the carrier due to hydrophobic interaction and is taken into the aggregate formed by the carrier.
- the association form of pH-sensitive carriers is destabilized under acidic conditions, so that when they come into contact with other carriers, rearrangement of the amphiphile occurs between the carriers and the carriers are fused. It is thought that it becomes easy to do.
- the pH-sensitive carrier is considered to aggregate while forming a crosslinked structure with other carriers.
- the physiologically active substance when the carrier and the physiologically active substance are mixed and exposed to an acidic environment, the physiologically active substance is physically trapped in the crosslinked structure of the aggregate of the carrier regardless of its hydrophilicity / hydrophobicity. At this time, a physiologically active substance having a large size such as a protein is not easily passed through the cross-linked structure of the aggregate of the carrier, and thus is easily trapped in the aggregate.
- a complex in which both are integrated can be easily obtained by mixing a pH-sensitive carrier and a physiologically active substance and exposing them to an acidic environment.
- the complex is considered to be excellent in the integration efficiency of physiologically active substances (particularly hydrophobic physiologically active substances and physiologically active substances having a large size).
- the pH-sensitive carrier retains the association form of the pH-sensitive compound and the amphiphile to some extent even when aggregated. Therefore, in a system in which the complex of the present invention and a biological membrane (for example, a cell membrane, a vesicle membrane, etc.) are present, when the pH becomes less than physiological pH, the pH-sensitive carrier constituting the complex After the aggregate form of the aggregate is changed and comes into contact with the biological membrane, the membrane structure of the biological membrane is also changed by being induced by the change. Therefore, the composite of the present invention can exhibit a good effect of promoting the membrane destruction function.
- a biological membrane for example, a cell membrane, a vesicle membrane, etc.
- the “aggregate” is not particularly limited as long as it is a structure in which a plurality of pH-sensitive carriers are aggregated, and may be amorphous or regular. At this time, the structure of each pH-sensitive carrier may be maintained, or a plurality of carriers may be fused.
- the form of the aggregate can be confirmed by a known observation means such as a transmission electron microscope (TEM) or a scanning probe microscope (SPM).
- TEM transmission electron microscope
- SPM scanning probe microscope
- a solution containing a pH-sensitive carrier is treated with a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m, and the phospholipid concentration of the liquid that has passed through the filter is less than the phospholipid concentration before passing through the filter, the pH-sensitive Assume that aggregates of carriers are formed.
- the phospholipid concentration can be determined using a known phospholipid quantification means such as Test Wako. When quantifying phospholipids using Test Wako, it shall conform to the vendor's protocol.
- support means that a physiologically active substance is physically trapped (for example, caught on a cross-linked structure) or chemically inside an aggregate formed by aggregation of a pH-sensitive carrier under acidic conditions. It is retained through a bond (eg, hydrophobic interaction, ionic bond, hydrogen bond, etc.).
- the presence state of the physiologically active substance in the aggregate is not particularly limited, and may exist between the membrane of the pH sensitive carrier forming the aggregate and the membrane of the other carrier, or the membrane of the carrier. It may be inserted in.
- the “membrane breaking function” means a function that causes dissolution in a dissolution test.
- the dissolution test in this specification refers to a liposome (dispersion) encapsulating an aqueous solution containing a quenching substance and a fluorescent substance, and a complex (an aggregate of a pH-sensitive carrier carrying a physiologically active substance).
- an evaluation sample dispersion such as a liquid to be contained is added to an aqueous solution adjusted to a predetermined pH, and the aqueous solution is incubated at 37 ° C. for 90 minutes or 30 minutes, and then the fluorescence of the aqueous solution is measured.
- the amount of fluorescent substance eluted from the liposome can be measured, and the membrane breaking function of the complex liposome can be confirmed.
- components that can be contained inside the membrane of the biological membrane eg, endosome
- the biological membrane eg, cytoplasmic substrate
- expressing a membrane destruction function promoting effect means (1) in the dissolution test, the dissolution rate at a predetermined pH lower than the physiological pH is higher than the dissolution rate at the physiological pH, and (2) In the dissolution test at a predetermined pH lower than the physiological pH, the dissolution rate of the complex is pH sensitive. It means that both the elution rate of the compound alone and the sum of the elution rates of the amphiphilic substance alone are satisfied. More specifically, the expression of the membrane destruction function promoting effect means that in the dissolution test at pH 7.4 and pH 5.0 or pH 4.5, the dissolution rate Lc of the complex is the dissolution rate La of the pH sensitive compound alone.
- ⁇ only needs to exceed 0, but is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and even more preferably 30 or more.
- ⁇ ′ only needs to exceed 0, but is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and even more preferably 15 or more.
- under acidity means less than pH 7.0, preferably less than 6.4.
- physiological pH means pH in normal tissue or normal body fluid.
- the physiological pH is usually 7.4, but varies slightly ( ⁇ 0.1) depending on normal tissues and normal body fluids.
- the “predetermined pH less than physiological pH” may be less than pH 7.4, preferably pH 3.0 or more and less than pH 7.4, more preferably pH 4.0 or more and less than pH 7.3, and still more preferably.
- the pH is 4.5 or more and less than 7.0.
- neutral pH means pH 6 or more and pH 8 or less (specifically, pH 6.0 or more and pH 8.0 or less).
- X to Y indicating a range includes X and Y, and means “X or more and Y or less”.
- measurement of operation and physical properties is performed under conditions of room temperature (20 ° C. or more and 25 ° C. or less) / relative humidity of 40% RH or more and 50% RH or less.
- the complex of the present invention is such that a physiologically active substance is supported on an aggregate of a pH-sensitive carrier that is aggregated under acidic conditions.
- the pH-sensitive carrier mainly comprises a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance. It consists of.
- the pH sensitive compound is selected from the group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof. At least one kind. Among them, the pH sensitive compound is at least one selected from the group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid and salts thereof. More preferably.
- the salt of the pH sensitive compound is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal salts such as lithium, sodium and potassium, alkaline earth metal salts such as magnesium, calcium and barium, and ammonium salts. These pH sensitive compounds may be used alone or in combination of two or more.
- Bile acids Deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids and glycodeoxycholic acids preferably used in the present invention are collectively referred to as bile acids.
- Bile acid has long been known as a representative steroid derivative and is also used in the field of bacteriology. Bile acids form a complex with cholesterol, lipids, and fat-soluble vitamins in the human body, and have a function of assisting in their absorption.
- deoxycholic acid ursodeoxycholic acid or a salt thereof (for example, sodium salt) as the pH sensitive compound of the present invention.
- deoxycholic acid is particularly preferable from the viewpoint of excellent pH responsiveness.
- the pH-sensitive compound is preferably contained at a ratio of 10 mol or more with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. More preferably, it is 10 to 640 mol, more preferably 20 to 320 mol, and particularly preferably 20 to 160 mol with respect to 100 mol of the amphiphile.
- amphiphile examples of the amphiphilic substance used in the present invention include phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms, sorbitan fatty acid ester having 16 to 18 carbon atoms, glycerol monooleate, and dilaurin. It is at least one selected from the group consisting of acid glycerol, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil, and ⁇ -tocopherol. These amphiphiles may be used alone or in combination of two or more.
- the “carbon number” in the amphiphilic substance means the carbon number of the fatty acid component (acyl group) constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
- diacylphosphatidylcholine having a saturated acyl group is preferable.
- diacylphosphatidylcholine having a saturated acyl group is preferable.
- DDPC didecanoylphosphatidylcholine
- DLPC dilauroylphosphatidylcholine
- 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine.
- the phosphatidylcholine may be naturally derived or synthesized by a known method, or a commercially available one can be used.
- polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms examples include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), polyoxyethylene sorbitan myristate (polyoxyethylene sorbitan monomyristate), Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (polyoxyethylene sorbitan palmitate), polyoxyethylene sorbitan monostearate (polyoxyethylene sorbitan monostearate), polyoxyethylene sorbitan monooleate (polyoxyethylene sorbitan monooleate) Art).
- the degree of polymerization of polyoxyethylene is not particularly limited, but the total degree of polymerization of the polyoxyethylene chains added to sorbitan is preferably 10 to 200, more preferably 15 to 100, and even more preferably 20 to 50.
- the polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used. Examples of commercially available products of polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester include Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate), Tween 60 (polyoxyethylene sorbitan monostearate), What is marketed as Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) can be preferably used.
- Examples of the sorbitan fatty acid ester having 16 to 18 carbon atoms include sorbitan monopalmitate (sorbitan monopalmitate), sorbitan monostearate (sorbitan monostearate), sorbitan monooleate (sorbitan monooleate) and the like.
- Examples include sorbitan trifatty acid esters such as fatty acid esters, sorbitan tripalmitate (sorbitan tripalmitate), sorbitan tristearate (sorbitan tristearate), sorbitan trioleate (sorbitan trioleate), and the like.
- sorbitan fatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used.
- sorbitan fatty acid esters examples include SPAN40 (sorbitan palmitate), SPAN60 (sorbitan stearate), SPAN80 (sorbitan oleate), SPAN65 (sorbitan tristearate), and SPAN85 (sorbitan trioleate). What is marketed as ester is preferably used. Among these, SPAN80, SPAN65, and SPAN85 are preferable.
- Glycerol monooleate (glyceryl monooleate), glycerol dilaurate (glyceryl dilaurate), glycerol distearate (glyceryl distearate), glycerol dioleate (glyceryl dioleate) are esters of one or two molecules of fatty acid in glycerin It is a bound acylglycerol, and the site to which the fatty acid binds is not particularly limited.
- a fatty acid may be ester-bonded to the C1 position or C2 position of glycerol.
- glycerol dilaurate, glycerol distearate, and glycerol dioleate which are diacylglycerols
- fatty acids may be ester-bonded at the C1 and C2 positions, or the C1 and C3 positions of glycerol.
- glycerol dilaurate is preferably ⁇ , ⁇ '-dilaurin in which the C1 and C3 positions are substituted.
- diacylglycerol substituted at the C1 position and the C2 position is preferable.
- synthetic products or commercially available products may be used.
- Polyoxyethylene castor oil is obtained by adding polyoxyethylene to castor oil.
- the degree of polymerization of polyoxyethylene is not particularly limited, but is preferably 3 to 200, more preferably 5 to 100, and still more preferably 10 to 50.
- As the polyoxyethylene castor oil a synthetic product or a commercially available product may be used.
- ⁇ -tocopherol may be naturally derived or synthesized by a known method, or a commercially available product may be used.
- the amphiphilic substance is preferably phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, particularly preferably dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC) having 12 carbon atoms.
- DLPC dilauroyl phosphatidylcholine
- the pH-sensitive carrier can express a membrane destruction function promoting effect at a desired pH by a combination of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance, and can maintain the effect even when an aggregate is formed. .
- the pH at which the effect of promoting the membrane destruction function of the pH-sensitive carrier begins to appear varies depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. This is considered to be due to the fact that the pKa varies depending on the pH-sensitive compound, and that the mode of association with the amphiphilic substance differs depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. Therefore, by appropriately changing the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphile, it is possible to select a pH that expresses the function, and to set in vivo delivery and intracellular delivery in detail. Can be said to be possible.
- combinations of pH-sensitive compounds and amphiphiles include deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic acid and Tween 60, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and SPAN40, deoxycholic acid and SPAN60, deoxycholic acid and SPAN80, deoxycholic acid and SPAN65, deoxycholic acid and SPAN85, deoxycholic acid and SPAN85, deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol, deoxycholic acid and Glycerol monooleate, deoxycholic acid and glycerol distearate, deoxycholic acid and glycerol dioleate , Deoxycholic acid and glycerol dilaurate ( ⁇ , ⁇ ′-dilaurin), deoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil (preferably PEG10), deoxycholic acid and polyoxyethylene
- deoxycholic acid and DDPC deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic acid and Tween 60, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and SPAN 40, deoxycholic acid and SPAN40, SPAN65, deoxycholic acid and SPAN80, deoxycholic acid and SPAN85, deoxycholic acid and PEG10 castor oil, deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol, deoxycholic acid and monoolein, deoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil, ursodeoxycholic Acid and DDPC, Ursodeoxycholic acid and DLPC, Ursodeoxycholic acid and Tween 40 Ursodeoxycholic acid and Tween 60, Ursodeoxycholic acid and Tween 80, Ursodeoxycholic acid and SPAN40, Ursodeoxycholic acid and SPAN65,
- deoxycholic acid and DDPC deoxycholic acid and DLPC
- deoxycholic acid and DLPC deoxycholic acid and Tween 20
- deoxycholic acid and Tween 80 deoxycholic acid and SPAN 80
- deoxycholic acid and PEG10 castor oil deoxycholic acid and PEG10 castor oil
- ursodeoxycholic acid and DLPC chenodeoxycholic acid and A combination of DLPC, hyodeoxycholic acid and DLPC, cholic acid and DLPC, glycyrrhizic acid and DLPC, glycodeoxycholic acid and DLPC is preferred.
- the pH-sensitive compound may be a salt.
- the pH sensitive carrier is deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid.
- At least one pH-sensitive compound selected from the group consisting of salts thereof, phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms, and sorbitan fatty acid having 16 to 18 carbon atoms
- At least one amphiphile selected from the group consisting of esters, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil and ⁇ -tocopherol Including the.
- the pH-sensitive compound may be a salt.
- the complex of the present invention is excellent in the integration efficiency of physiologically active substances and expresses a membrane destruction function promoting effect at a site where pH is lowered, so that the physiologically active substance can be selectively delivered to a treatment site such as inflammation. Can do.
- the complex of the present invention can deliver a physiologically active substance to the cytosol of a cell.
- the type of the physiologically active substance contained in the complex is not particularly limited, and examples include nucleic acids, low molecular compounds, proteins, and peptides. Especially, it is preferable that a physiologically active substance is a protein, a peptide, or a nucleic acid from a viewpoint of expressing the outstanding pharmaceutical effect in a cell.
- nucleic acid examples include nucleic acids having therapeutic effects such as siRNA, ODN (oligodeoxynucleotide), deoxyribonucleic acid (DNA) and the like.
- the length of the nucleic acid is preferably 500 bp or more.
- Low molecular weight compounds include cytotoxic agents such as mitomycin, docetaxel, methotrexate; prodrugs such as 5-aminolevulinic acid and protoporphyrin IX; anti-inflammatory agents such as ganciclovir, dexamethasone, ribavirin, vidarabine; DOTA (1,4,7 , 10-tetraazacycloclodedecane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic acid), DTPA (1,4,7,10-tetraazacyclodekane-N, N ′, N ′′, N ′ ′′-tetraacetic) acid) and the like; and neuroprotective agents such as edaravone.
- cytotoxic agents such as mitomycin, docetaxel, methotrexate
- prodrugs such as 5-aminolevulinic acid and protoporphyrin IX
- anti-inflammatory agents such as ganciclovir, dexamethas
- Proteins include SOD (Superoxide dismutase), redox enzymes such as indophenol oxidase; cytokines such as IL-10, growth factors such as b-FGF, thrombolytic agents such as t-PA, hormones such as erythropoietin, PSD ( Examples thereof include cell death inhibitory proteins such as Postsynthetic density protein (FNK) and FNK (Anti cell death Factor); antibodies such as Fab (Fragment), IgG, and IgE.
- the molecular weight of the protein is preferably 5 to 200 kDa.
- peptide drugs such as cyclosporin A and JIP-1 (JNK-interacting protein 1).
- JNK-interacting protein 1 JNK-interacting protein 1
- tumor antigen peptide etc. are mentioned.
- the molecular weight of the peptide is preferably 5,000 to 45,000, and more preferably 6,000 to 20,000.
- the size of the physiologically active substance is not particularly limited, but the larger the size, the more preferable it is because it is easily captured by the cross-linked structure formed by the aggregates of the pH-sensitive carrier.
- the physiologically active substance may be a hydrophilic substance or a hydrophobic substance.
- a hydrophobic substance is preferable because it is easily incorporated into the aggregate of the pH-sensitive carrier by hydrophobic interaction.
- a suitable loading amount of the physiologically active substance in the complex of the present invention is, for example, 0.001 to 10 mg with respect to 1000 nmol of the amphiphilic substance constituting the pH sensitive carrier.
- a more suitable loading amount can be appropriately selected according to the type of physiologically active substance.
- the complex according to the present invention can be obtained by mixing the above pH-sensitive carrier and a physiologically active substance and exposing the mixture to an acidic environment. Therefore, for example, by preparing a mixed solution containing a pH-sensitive carrier and a physiologically active substance and acidifying the pH of the mixed solution, the complex of the present invention can be obtained in a liquid medium. Therefore, the present invention prepares a pH-sensitive carrier containing a pH-sensitive compound and an amphiphile (step 1), mixes the pH-sensitive carrier and a physiologically active substance to prepare a mixed solution (step 2), There is also provided a method for producing a composite, which comprises adjusting the pH of the mixed solution to less than 6.4 (Step 3).
- Step 1 Preparation of pH-sensitive carrier
- the pH-sensitive carrier is prepared by associating the pH-sensitive compound with an amphiphile.
- the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance may be contacted in an aqueous solution.
- an aqueous solution containing a pH sensitive compound and an amphiphilic substance is prepared, and the solution is vigorously stirred and dispersed using an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave, etc.
- a dispersion of a pH-sensitive carrier associated with an amphiphile can be obtained.
- an aqueous solution containing a pH-sensitive compound and an aqueous solution containing an amphiphile are separately prepared, the aqueous solutions are mixed, and the solution is mixed with an emulsifier, a vortex mixer, And a method of obtaining a pH-sensitive carrier by vigorously stirring and dispersing using ultrasonic waves and the like; and (2) a method of preparing by a Bangham method known as a method for producing liposomes.
- a Bangham method components of pH-sensitive carriers such as pH-sensitive compounds and amphiphiles are dissolved in an organic solvent (for example, methanol, chloroform) in a glass container, and organically removed by a rotary evaporator or the like.
- the solvent is removed to form a thin film on the wall of the glass container.
- the aqueous solution is added to the glass container on which the thin film is formed, and the thin film is swollen at room temperature (5-35 ° C.), and then the glass container is shaken at room temperature (5-35 ° C.).
- the thin film can be sufficiently dispersed in the aqueous solution by vigorously stirring using an emulsifier, a vortex mixer, and ultrasonic waves.
- the solvent of the aqueous solution mentioned above can be used as a solvent of an aqueous solution.
- the details of the Bangham method can be referred to known liposome production methods, including “Liposome” (Shinochi Nojima, Junzo Sunamoto, Junzo Inoue, Nanedou) and “Liposome in Life Science” (Terada) Hiro, Tetsuro Yoshimura, Springer Fairlake Tokyo).
- the pH-sensitive compound is preferably blended at a ratio of 10 mol or more per 100 mol of the amphiphile.
- the blending amount of the pH sensitive compound is preferably 40 mol or more and 640 mol or less, more preferably 160 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance.
- the amount is 640 mol or less, and more preferably 320 mol or more and 640 mol or less.
- the concentration of the amphiphile in the aqueous solution is preferably 6 to 2000 nmol / mL, and more preferably 10 to 1000 nmol / mL.
- the concentration of the pH sensitive compound in the aqueous solution is preferably 400 to 6400 nmol / mL.
- solvent As a solvent used for the aqueous solution, an aqueous solution containing a saccharide such as a buffer, NaCl, glucose, sucrose is preferable.
- any known buffer can be used as appropriate as long as the pH of the aqueous solution containing the pH-sensitive carrier is maintained at a physiological pH or higher, and is not particularly limited.
- the buffer include phosphate buffer, citrate buffer, citrate-phosphate buffer, trishydroxymethylaminomethane-HCl buffer (Tris-HCl buffer), MES buffer (2-morpholinoethanesulfone).
- Acid buffer TES buffer (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid buffer), acetate buffer, MOPS buffer (3-morpholinopropanesulfonic acid buffer), MOPS-NaOH buffer Agent, HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid buffer), GOOD buffer such as HEPES-NaOH buffer, glycine-hydrochloric acid buffer, glycine-NaOH buffer, glycyl Amino acid buffer such as glycine-NaOH buffer, glycylglycine-KOH buffer, Tris- C acid buffer, borate -NaOH buffer, borate buffer such as borate buffer, or the like imidazole buffer are used.
- concentration of the buffer is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 100 mM.
- concentration of the buffering agent refers to the concentration (mM) of the buffering agent contained in the aqueous solution.
- the concentration of sugars such as NaCl, glucose and sucrose is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 150 mM.
- additives such as stabilizers may be added to the aqueous solution.
- the content of the additive is not particularly limited as long as the pH-sensitive carrier is not destroyed, but is preferably 150 mol or less, more preferably 66.4 mol or less with respect to 100 mol of the amphiphile. preferable.
- the stabilizer is not particularly limited as long as it does not destroy the pH sensitive carrier.
- saturated and unsaturated carbon atoms having 4 carbon atoms such as 1-octanol, 1-dodecanol, 1-hexadodecanol, 1-eicosanol and the like.
- Alcohol having ⁇ 20 saturated and unsaturated fatty acid having 12 to 18 carbon atoms such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and oleic acid; methyl caprylate (methyl octoate), methyl caprylate (ethyl octoate) ), Saturated and unsaturated fatty acid alkyl esters of 8 to 18 carbon atoms (1 to 1 carbon atoms) such as methyl laurate, ethyl laurate, ethyl myristate, ethyl palmitate, ethyl stearate, methyl oleate, ethyl oleate, etc.
- D (L) -alanine, arginine, asparagine, aspa D (L) -amino acids such as formic acid, cysteine, glutamine, glycine, histidine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, phenylalanine; amino acid triglycerides such as tricaproin and tricaprylin; C12-18 polyoxyethylene sorbitan trifatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitan tripalmitate and polyoxyethylene sorbitan trioleate (for example, Tween 65, Tween 85); polyoxyethylene laurate, polyoxyethylene Polyoxygen having 12 to 18 carbon atoms such as myristic acid ester, polyoxyethylene palmitic acid ester, polyoxyethylene stearic acid ester Ethylene alkyl esters (eg, PEG20 stearic acid este
- additives such as stabilizers.
- it may be added to an aqueous solution containing a pH-sensitive compound or an aqueous solution containing an amphiphile, and when the thin film is prepared, it is dissolved together with the components of the pH-sensitive carrier.
- An aqueous solution containing a pH sensitive carrier may be obtained using a thin film containing the components.
- Step 2 Mixed solution preparation step
- the pH-sensitive carrier obtained in the above step 1 and a physiologically active substance are mixed to prepare a mixed solution.
- a known method can be appropriately selected according to the type of the physiologically active substance.
- the method is not particularly limited, and examples thereof include a method of mixing a pH-sensitive carrier and a physiologically active substance with a medium such as an aqueous solvent or excipient.
- a physiologically active substance may be added to the dispersion of the pH sensitive carrier obtained in step 1.
- the physiologically active substance may be added as it is, or may be added after previously dissolved or dispersed in a solvent.
- the solvent for dissolving or dispersing the physiologically active substance for example, the solvents mentioned in the above step 1 can be used.
- the concentration of the pH-sensitive carrier in the mixed solution is preferably 50 nmol / mL or more, more preferably 100 nmol / mL or more, even more preferably 200 nmol / mL or more, and particularly preferably 500 nmol / mL or more. . If it is the said range, since a pH sensitive support
- the preferable content of the physiologically active substance in the mixed solution is, for example, 0.001 to 10 mg with respect to 1000 nmol of the amphiphilic substance constituting the pH sensitive carrier.
- a more suitable content can be appropriately selected according to the type of the physiologically active substance.
- a substance having a stimulus that activates innate immunity described later or a known additive may be further added to the mixed solution. That is, the complex of the present invention can also contain such a substance.
- Step 3 pH adjustment step
- the pH of the mixed solution obtained in step 2 is adjusted to less than 6.4.
- the pH-sensitive carrier can form an aggregate while taking in the physiologically active substance.
- the method of adjusting the pH is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a known acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid to the mixed solution.
- a known acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid
- the addition amount of the acid can be appropriately adjusted depending on the target pH.
- the target pH in this step is not particularly limited as long as it is less than 6.4.
- the pH is preferably as low as possible from the viewpoint that the cross-linked structure of the aggregate becomes more precise and the physiologically active substance can be captured more.
- the pH of the solution is preferably adjusted to 2.0 or more and 5.0 or less, and more preferably adjusted to 2.0 or more and 4.0 or less.
- the mixture After adjusting the mixed solution to a desired acidic pH, the mixture is allowed to stand, whereby a denser pH-sensitive carrier aggregate can be obtained.
- the lower limit of the standing time is not particularly limited, but is preferably 10 minutes or more, more preferably 30 minutes or more, and even more preferably 1 hour or more. If it is the said range, since a dense aggregate is formed, a bioactive substance can be favorably hold
- the upper limit of the standing time is not particularly limited.
- the standing temperature is not particularly limited, but is preferably about room temperature (25 ° C.) to 40 ° C.
- step 3 a complex in which the aggregate of the pH sensitive carrier and the physiologically active substance are integrated can be obtained.
- the complex may be isolated by removing the solvent by a known means such as filtration.
- the liquid containing the complex obtained above is treated with a filter (for example, with a pore size of 0.22 ⁇ m), and the concentration of the physiologically active substance (added) is measured by measuring the concentration of the physiologically active substance before and after the filter treatment.
- concentration of the physiologically active substance can be confirmed.
- the concentration of the physiologically active substance can be measured by a known method.
- the integration efficiency of the physiologically active substance is a value calculated by the following equation 3 based on the absorbance measurement before and after the filter treatment.
- the absorbance may be measured at a wavelength corresponding to the absorption wavelength region of the physiologically active substance (for example, 280 nm for proteins and peptides, 260 nm for nucleic acids).
- the absorbance may be measured at a wavelength recommended by the protocol of the kit.
- the complex according to the present invention can be used for treating a subject alone or as a composition (hereinafter also referred to as a pH-sensitive composition) formed by mixing with other components.
- a composition hereinafter also referred to as a pH-sensitive composition
- the pH-sensitive composition may be in the form of a solid preparation such as a tablet, powder or capsule, but is preferably in the form of a liquid preparation such as an injection preparation.
- the liquid formulation may be provided as a dry product that is regenerated with water or other suitable excipient at the time of use.
- Tablets and capsules are preferably enteric coated by the usual method.
- enteric coating those normally used in this field can be used.
- Capsules can also contain either powder or liquid.
- pH-sensitive composition Other components that can be included in the pH-sensitive composition include substances having stimuli that activate innate immunity, pharmaceutical additives, and the like.
- a substance having a stimulus that activates innate immunity means a substance that is recognized by a structural pattern recognition receptor and leads to activation of immunocompetent cells.
- the said substance may overlap with said physiologically active substance.
- the substance having a stimulus that activates innate immunity is not particularly limited, but is preferably an agonist for a Toll-like receptor.
- substances having stimuli that activate innate immunity include, but are not limited to, mineral salts such as alum; gel type adjuvants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and calcium phosphate; immunoregulatory DNA containing a CpG motif Sequences, immunostimulatory RNA molecules, endotoxins (lipopolysaccharide (LPS; endotoxin), monophosphoryl lipid A (MPL®)), exotoxins (cholera toxin, E.
- mineral salts such as alum
- gel type adjuvants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and calcium phosphate
- immunoregulatory DNA containing a CpG motif Sequences immunostimulatory RNA molecules
- endotoxins lipopolysaccharide (LPS; endotoxin), monophosphoryl lipid A (MPL®)
- exotoxins cholera toxin, E.
- aluminum compounds such as aluminum hydroxide and aluminum phosphate are preferable from the viewpoint of safety. That is, a preferred embodiment of the present invention is a pH sensitive composition comprising the pH sensitive
- the substances having stimuli that activate innate immunity may be used alone or in combination of two or more.
- the content of the substance having a stimulus that activates innate immunity varies depending on the type of the substance, but is preferably 0.0227 to 1280 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance constituting the complex.
- the amount is more preferably 0.0227 to 22.7 mol, and further preferably 0.2 to 2.27 mol. It is preferable that the content of the substance having a stimulus that activates innate immunity is 0.0227 mol or more because an immune response can be suitably induced. On the other hand, the content of the substance having a stimulus that activates innate immunity is preferably 1280 mol or less because the cost can be reduced.
- an aluminum compound as a substance which has the irritation
- the pharmaceutical additive includes a solvent (eg, physiological saline, sterilized water, buffer, etc.), a membrane stabilizer (eg, cholesterol), an isotonic agent (eg, sodium chloride, glucose). , Glycerin, etc.), antioxidants (eg tocopherol, ascorbic acid, glutathione etc.), preservatives (eg chlorobutanol, parabens etc.) and the like.
- the solvent may be a solvent used when producing the composite.
- the pH of the solvent used is preferably less than 7.0, and more preferably less than 6.4, in order to prevent the aggregation of the pH-sensitive carrier from dissociating and releasing the physiologically active substance. preferable.
- the pharmaceutical additive may contain excipients (eg, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, celluloses such as crystalline cellulose, gum arabic, Magnesium aluminate, calcium phosphate, etc.), lubricant (eg, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, etc.), binder (eg, saccharides such as mannitol, sucrose, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, etc.), Disintegrating agents (for example, starches such as potato starch, celluloses such as carboxymethyl cellulose, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, etc.), coloring agents, flavoring agents and the like can be included.
- excipients eg, sugars such as lactose, sucrose, starches such as corn starch, celluloses such as crystalline cellulose, gum arabic, Magnesium aluminate, calcium phosphate, etc.
- Method of treatment There are no particular limitations on the mode of administration when the complex of the present invention or the pH-sensitive composition containing the same is used for treatment of a subject.
- oral administration intravenous injection, intraarterial injection, subcutaneous injection, intradermal injection
- parenteral administration such as intramuscular injection, intrathecal injection, transdermal administration or transdermal absorption.
- parenteral administration particularly administration by subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, or intravenous injection is preferred.
- the complex of the present invention or a pH sensitive composition containing the same When the complex of the present invention or a pH sensitive composition containing the same is administered to a subject, the external environment of the complex or the pH sensitive composition containing the complex becomes less than physiological pH (eg, less than pH 6.4). When this occurs, the membrane destruction function promoting effect, the membrane destruction function promoting effect and the membrane fusion function promoting effect are expressed, and the physiologically active substance can be specifically and efficiently released.
- physiological pH eg, less than pH 6.4
- treatment or prevention of a disease comprising orally or parenterally administering an effective amount of the above-mentioned complex or a pH-sensitive composition containing the same to a subject in need of treatment or prevention.
- a method is provided.
- the above subject is preferably a mammal, particularly preferably a human.
- diseases include cancers such as prostate cancer, lung cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, brain tumor, breast cancer; HIV (Human Immunodefectivity Virus), infectious diseases such as hepatitis C, hepatitis B; Alzheimer's disease, Central nervous system diseases such as Parkinson's disease are included.
- cancers such as prostate cancer, lung cancer, colon cancer, kidney cancer, stomach cancer, brain tumor, breast cancer; HIV (Human Immunodefectivity Virus), infectious diseases such as hepatitis C, hepatitis B; Alzheimer's disease, Central nervous system diseases such as Parkinson's disease are included.
- a method for treating or preventing a disease is provided.
- the common general technical knowledge at the time of filing can be referred to as appropriate.
- the complex of the present invention can also transport a physiologically active substance directly to cells by culturing. That is, according to one aspect of the present invention, a culture method for transporting a cell to a physiologically active substance is provided.
- the culture method includes a step of culturing cells in a medium containing the complex of the present invention.
- the medium is not particularly limited, and a known medium can be used. Specifically, MEM, DMEM, RPMI, etc. are mentioned.
- the amount of the complex added to the medium is not particularly limited, but the total molar concentration of the pH-sensitive compound and the amphiphile is preferably 0.73 ⁇ mol / L to 7.4 mmol / L. More preferably, it is 3 ⁇ mol / L to 6.5 mmol / L, and even more preferably 8.0 ⁇ mol / L to 4.2 mmol / L.
- the pH of the medium is preferably 8.0 to 6.5 from the viewpoint of preventing destabilization of the pH sensitive compound while maintaining the complex form.
- the cells to which the physiologically active substance is transported are not particularly limited, and examples include cells collected from the subject and established cultured cells.
- cells collected from the subject or established cultured cells include dendritic cells, NK (Natural Killer) cells, T lymphocytes, B lymphocyte cells, lymphocyte cells, and the like. .
- cells collected from the subject are preferably used, and dendritic cells, NK cells, T cells, lymphocytes, etc. collected from the subject are more preferably used.
- the subject can be collected by blood collection, biopsy or the like. That is, in one embodiment, the culture method may include a step of collecting cells from a subject.
- the cultured cells may be administered to the subject.
- a subject's disease can be treated or prevented. That is, in one embodiment of the present invention, a method for treating or preventing a disease is provided.
- the treatment or prevention method comprises a step of collecting cells from a subject, a step of culturing the collected cells in a medium containing the complex of the present invention, and the cultured cells to the subject. Administering.
- the complex according to the present invention can maintain the aggregation state for a certain time even when exposed to a physiological pH environment. Therefore, after the complex of the present invention is delivered to a desired site in the living body, it remains at the site while maintaining the aggregated form, and the physiologically active substance can be released slowly.
- the aggregate formed by aggregation of the pH-sensitive carrier under acidic conditions can function as a sustained release device for a physiologically active substance. Therefore, one preferable embodiment of the present invention is a sustained release agent containing the above complex.
- the dosage form and dosage form are the same as described above.
- [PH-sensitive compound] ⁇ Deoxycholic acid (Pharmace grade, manufactured by Sigma) ⁇ Ursodeoxycholic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ⁇ Chenodeoxycholic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ⁇ Hiodeoxycholic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ⁇ Cholic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ⁇ Glycyrrhizic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) ⁇ Glycodeoxycholic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [Amphiphile] DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine: NOF Corporation, COATSOME MC-1212) DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine: NOF Corporation
- MES buffer MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7.4
- USC-J ultrasonic irradiation device
- EYPC egg yolk phosphatidylcholine
- a rotary evaporator BuCHI
- a polycarbonate membrane having a pore size of 100 nm using an extruder The particle diameter was made uniform.
- the outer water layer was replaced using a MES buffer (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7.4) and a G100 column to obtain an EYPC liposome dispersion containing a fluorescent substance.
- the concentration of phospholipid (choline group) is determined using phospholipid C-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and MES buffer (MES: 25 mM, NaCl: so that the phospholipid concentration becomes 1.0 mmol / L). The concentration was adjusted using 125 mM pH 7.4).
- the elution rate was calculated with 0% for the EYPC liposome dispersion alone and 100% for 30 ⁇ L of 10-fold diluted Triton-X100.
- the dissolution rate was calculated according to the following formula 4.
- the measured fluorescence intensity is L
- the fluorescence intensity of only the EYPC liposome dispersion containing the fluorescent substance is L 0
- the fluorescence intensity when Triton-X100 is added is L 100 .
- the pH-sensitive carrier has an effect of promoting the membrane destruction function, but it has been clarified that the effect is maintained even when aggregated (FIGS. 1C and D).
- the data corresponding to FIG. 1C is shown in Table 1 below, and the data corresponding to FIG. 1D is shown in Table 2 below.
- OVA was mixed with a dispersion of a pH sensitive carrier to prepare a mixed solution, and then hydrochloric acid was added to lower the pH of the mixed solution from 7.4 to 4.0. Furthermore, after leaving still for about 2 hours, it passed through a 0.22 ⁇ m filter (SLGV033RS manufactured by Merck Millipore). The solution containing the precipitate had a transparent appearance due to the filter, suggesting separation of aggregates of the pH-sensitive carrier (FIG. 2A). Further, the solution before and after the filter treatment was colored using phospholipid C-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the absorbance was measured at a wavelength of 600 nm.
- phospholipid C-Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- the absorbance before the filter was 0.295 (phospholipid) It was 0.001 (corresponding to a phospholipid concentration of 0.0 mg / mL) after the filter (corresponding to a concentration of 1.5 mg / mL) (FIG. 2B). It was revealed that aggregates of the pH-sensitive carrier can be separated almost completely by this filter.
- ⁇ OVA was mixed with a dispersion of a pH-sensitive carrier to prepare a mixture, the mixture was set at various pHs, allowed to stand for 1 hour or 1 day, and then subjected to 2 in Experiment 2.
- the absorbance was measured before and after the filter treatment by the same method as above to evaluate the integration.
- the pH 7.4, 6.8, and 6.4
- the absorbance hardly changed before and after the filter (FIGS. 5A to 5C).
- the pH was 5.9 to 1.9
- the absorbance after the filter was smaller than that before the filter (FIGS. 5A to 5C). In this pH range (pH 5.9 to 1.9), it was suggested that aggregates of pH-sensitive carriers and proteins can be integrated.
- pH-sensitive carrier concentration enabling integration Next, the concentration of the pH-sensitive carrier that enables integration with the protein was examined. OVA was used as the protein, and the concentration was 0.8 mg / mL.
- the pH sensitive carrier dispersion used was 1600 nmol deoxycholic acid with respect to 1000 nmol DLPC in 1 mL. The pH was adjusted to 4 using 0.1N hydrochloric acid. The time for standing was 1 hour.
- the protein used OVA and the concentration was 0.8 mg / mL.
- As the dispersion of the pH-sensitive carrier a solution in which various amounts of deoxycholic acid are obtained with respect to 1000 nmol of DLPC in 1 mL was used. The pH was adjusted to 4 using 0.1N hydrochloric acid. The time for standing was 1 hour. In Experiment 2, 2. The absorbance was measured before and after the filter treatment by the same method.
- the absorbance after the filter is lower than that before the filter, suggesting the integration of the pH-sensitive carrier aggregate and protein. Met. Therefore, it is considered that the aggregate of the pH-sensitive carrier and the protein are integrated in the blending amount of the deoxycholic acid.
- the integration efficiency of OVA based on the change in absorbance is about 42% at 400 nmol / mL, about 60% at 1600 nmol / mL, and about 64% at 6400 nmol / mL. It was suggested that the integration efficiency of was excellent.
- the data corresponding to FIG. 8 is shown in Table 7 below.
- the effect of promoting the film destruction function of the composite in the presence of aluminum hydroxide was investigated.
- the protein used was OVA, and the concentration was 0.8 mg / mL.
- a dispersion containing a pH sensitive carrier containing 1000 nmol DLPC and 1600 nmol deoxycholic acid in 1 mL was used.
- the pH at which the pH sensitive carrier aggregates were prepared was adjusted to 1.0-3.5 using 1N sulfuric acid.
- the time for standing was 1 hour.
- protein was added and finally pH was adjusted.
- the final concentration of aluminum hydroxide was 1.0 mg / mL. That is, the addition amount of the aluminum element was 1280 mol with respect to 100 mol of DLPC.
- nucleic acid salmon-derived deoxyribonucleic acid (DNA) was used, and the concentration was 0.1 mg / mL.
- the pH at which the aggregates of the pH sensitive carrier were prepared was adjusted to 4 using 1N sulfuric acid.
- the mixed solution was passed through a 0.22 ⁇ m filter, and deoxyribonucleic acid was detected by measuring the absorbance at a wavelength of 260 nm for the solution before and after the filter treatment. The time for standing was 2 hours.
- the peptides used were SIINFEKL and RGPESRLL, and the peptide concentration was 0.8 mg / mL.
- a dispersion containing a pH sensitive carrier containing 1000 nmol DLPC and 1600 nmol deoxycholic acid in 1 mL was used.
- the pH at which the aggregates of the pH sensitive carrier were prepared was adjusted to 4 using 1N sulfuric acid.
- the time for standing was 2 hours.
- the mixed solution was passed through a 0.22 ⁇ m filter, and the solution before and after the filter was colored using a peptide quantification kit (Lowry kit, manufactured by Nacalai Tesque), and the absorbance was measured at a wavelength of 750 nm.
- the above values were 1.40 and 0.82, and it was revealed that about 1/3 of the peptide was integrated with the aggregate of the pH-sensitive carrier (FIG. 12B). . That is, the integration efficiency of the RGPESRLL peptide based on the change in absorbance was about 41%.
- OVA was used as the physiologically active substance, and the concentration was 0.8 mg / mL.
- the state of the integrated physiologically active substance was examined.
- the pH-sensitive carrier aggregate solution integrated with OVA was neutral pH, it was allowed to stand for 1 day to eliminate the precipitate.
- Experiment 2-2 In the same manner as described above, the obtained solution was passed through a filter, and the amount of OVA released in the solution was evaluated.
- the obtained absorbance was 0.61 (FIG. 13D, after being adjusted to pH 7.3, a filter), which was larger than the absorbance (0.10) when neutral pH was not achieved (FIG. 13D). pH 2.6 filter).
- the value of this absorbance was consistent with the absorbance (0.57) before passing through the filter (FIG. 13D, without pH 2.6 filter), suggesting that all of the integrated OVA was dissociated.
- the integrated physiologically active substance is considered to be dissociated and released from the pH-sensitive carrier aggregate.
- OVA OVA was used and the concentration was 0.8 mg / mL.
- the pH at which the aggregates of the pH-sensitive carrier were prepared was adjusted to 2.6 using 0.1N hydrochloric acid, and 0.1N sodium hydroxide was used when returning to a neutral pH. In Experiment 2, 2.
- the absorbance was measured before and after the filter treatment by the same method.
- the pH-sensitive carrier aggregates tended to disappear with time (FIG. 14A). Specifically, precipitation could be confirmed from 0 min to 3 hours, but precipitation could not be confirmed at 5 hours. It was revealed that the aggregates of the pH-sensitive carrier can maintain the state of precipitation for about 3 hours at a neutral pH. Moreover, also in the result of the change in absorbance, it was confirmed that the protein integrated remained from 0 min to 3 hour (FIG. 14B).
- FIG. 15A shows the appearance of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE and aggregates of pH-sensitive carriers fluorescently modified with rhodamine PE.
- the pH-sensitive carrier showed a distribution spreading around the site of intradermal injection (FIGS. 15B and 15C).
- the aggregates of the pH-sensitive carrier showed a linear distribution (FIGS. 15D and 15E).
- aggregates of pH-sensitive carriers were injected intradermally at multiple sites, resulting in linear local kinetics in any administration, confirming reproduction (FIG. 15F). It was confirmed that the pH-sensitive carrier and the aggregate of the pH-sensitive carrier exhibit different local kinetics.
- the aggregates of the pH-sensitive carrier are very large particles, and are considered to exhibit local kinetics different from that of the pH-sensitive carrier.
- the aggregates of the pH sensitive carrier were made into a suspension by pipetting before administration.
- the pH-sensitive carrier and the aggregate of the pH-sensitive carrier showed different local kinetics, the pH-sensitive carrier aggregate exists without being dissociated in the living body and can be used in the living body. It became clear.
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Abstract
本発明によれば、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体が提供される。本発明に係る複合体は、酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる。
Description
本発明は、DDS(Drug Delivery System)として有用な、複合体、ならびに当該複合体を含むpH感受性組成物および当該複合体の製造方法に関する。
近年、生理活性物質を送達するためのDDSキャリア(担体)の研究が盛んに行われている。弱酸性のpHに感受性をもつキャリアは、腫瘍や炎症など生体内においてpHが低下している部位への送達や、エンドソームエスケープを通じた細胞のサイトゾルへの送達を実現するものとして期待されている。
特に、サイトゾルへの送達は、種々の分野に活用可能であることから、実現の要望が極めて高い。例えば、核酸のサイトゾルへの送達は遺伝子治療を可能にするものであり、抗原のサイトゾルへの送達は免疫療法等に有用な抗原特異的CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)の誘導や、アレルギーの治療等に有用な抗原特異的Treg(regulatory T cell)の誘導の鍵となる技術である。また、細胞内をドラッグターゲットとした新規薬剤への適用も検討されている。
前記を実現するpH感受性のキャリアとして、国際公開第2013/180253号公報(米国特許出願公開第2013/323320号明細書、米国特許出願公開第2016/151497号明細書、米国特許出願公開第2018/104343号明細書に対応)では、特定の両親媒性物質および特定のpH感受性化合物を含むpH感受性担体が開示されている。当該pH感受性担体は、中性のpHからエンドソームやリソソームの到達pHであるpH4.0のpH領域で生体膜を破壊し、モデルの生理活性物質を細胞のサイトゾルへ送達する能力を有するとされている。また、国際公開第2015/079952号公報(米国特許出願公開第2016/271246号明細書に対応)および国際公開第2016/194685号公報(欧州特許出願公開第3305320号明細書に対応)では、自然免疫を刺激する物質であるLipid A、CpGモチーフを有するオリゴヌクレオチド、アルミニウム化合物等と共に使用することにより、抗原特異的なCTLの誘導に有用であることが開示されている。
一方、Biomaterials 2008、Vol:29、Iss:29、PP:4029-4036およびBiomaterials 2013、Vol:34、Iss:12、PP3042-3052では、多量の生理活性物質をサイトゾルへ送達するほど、より高い遺伝子発現や、より多数のCTLを誘導できることが報告されている。そのため、サイトゾルへの送達をより効率良くすることが求められている。
エンドソームエスケープを実現するpH感受性のキャリアは、送達する生理活性物質とキャリアと一体化することにより、同一のエンドソームに内に捕捉される確率が向上し、より効率良く生理活性物物質をサイトゾルへ送達できることが知られている。国際公開第2013/180253号公報および国際公開第2015/079952号公報には、pH感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するpH感受性担体と、タンパク質やペプチド等の生理活性物質とを一体化できることが示唆されている。
しかしながら、国際公開第2015/079952号公報に記載の技術の場合、pH感受性担体と抗原とを一体化するのに凍結乾燥を行わなければならず、煩雑な工程を必要とする。また、国際公開第2013/180253号公報に記載の技術の場合、pH感受性担体に担持できる生理活性物質の量が限られるため、生理活性物質のエンドソーム内への取り込み、サイトゾルへの送達効率、ひいてはその後の機能発現が十分でないことが示唆される。したがって、より簡便に、かつ、より効率良く生理活性物質をキャリアと一体化できる技術が求められている。
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体を提供することを目的とする。
上記目的を達成するための本発明は、酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体である。
本発明の一実施形態によれば、酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体(以下、単に「複合体」とも称する)が提供される。当該実施形態によれば、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体が提供される。
国際公開第2015/079952号公報では、pH感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するpH感受性担体と、生理活性物質として抗原とを一体化させる技術が開示されているが、当該技術は凍結乾燥を要するため、工業的に十分適しているとは言えなかった。
また、国際公開第2013/180253号公報では、pH感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するpH感受性担体と、生理活性物質のモデルタンパク質とを一体化させる技術が開示されている。しかし、当該技術では、特にサイズの大きい生理活性物質を用いる場合、pH感受性担体に担持できる生理活性物質の量が限られるため、生理活性物質のエンドソーム内への取り込み、サイトゾルへの送達効率、ひいてはその後の機能発現が十分でないことが示唆される。
そこで、本発明者は、一体化技術の改良を検討した。その結果、pH感受性担体と生理活性物質とを混合し、当該混合物を酸性環境に晒すことで、両者が一体化した複合体を簡便に得ることができること、さらには、当該複合体は生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を発現できることを見出した。
上記効果が得られるメカニズムは不明であるが、以下のように推測される。なお、本発明は、以下の推測によって限定されるものではない。
pH感受性担体(以下、担体とも称する)は、酸性下で凝集体を形成するが、これには疎水性相互作用が主に寄与していると考えられる。すなわち、pH感受性担体は、両親媒性物質が構成する疎水性部分にpH感受性化合物が会合するようにして形成されており、かようなpH感受性担体を酸性環境に晒すと、pH感受性化合物のチャージが減少して、会合構造が不安定化する。これにより、pH感受性担体の構造変化が誘起され、疎水性相互作用をドライビングフォースとして、より安定な状態に移ろうとする。その結果として、多数のpH感受性担体が関与する凝集体を形成すると考えられる。ゆえに、疎水性の生理活性物質を当該担体と混合し、酸性環境に晒すと、生理活性物質は疎水性相互作用により担体と共凝集し、担体が形成する凝集体内に取り込まれると考えられる。また、上述したように、酸性下では、pH感受性担体の会合形態が不安定化するため、他の担体と接触すると、互いの担体間で両親媒性物質の再配列が起こり、担体同士が融合しやすくなると考えられる。これにより、pH感受性担体は、他の担体と架橋構造を形成しながら凝集すると考えられる。ゆえに、担体と生理活性物質を混合し、酸性環境に晒した際、生理活性物質は、その親疎水性にかかわらず、担体の凝集体の架橋構造に物理的に捕捉される。この際、タンパク質のようにサイズが大きい生理活性物質は、担体の凝集体の架橋構造を通り抜けにくいため、凝集体内に捕捉されやすい。
上記のようにして、pH感受性担体と生理活性物質とを混合し、酸性環境に晒すことで、両者が一体化した複合体を簡便に得ることができると考えられる。また、当該複合体は、生理活性物質(特に、疎水性の生理活性物質や、サイズの大きい生理活性物質)の一体化効率に優れると考えられる。
また、pH感受性担体は、凝集しても、pH感受性化合物と両親媒性物質との会合形態をある程度保持していると推察される。そのため、本発明の複合体と、生体膜(例えば、細胞膜、小胞膜など)とが存在している系で、pHが生理的pH未満となった場合、複合体を構成するpH感受性担体の凝集体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じる。ゆえに、本発明の複合体は、良好な膜破壊機能促進効果を発現することができる。
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
本明細書において、「凝集体」とは、複数のpH感受性担体が集合してなる構造であれば特に制限されず、不定形であっても定形であってもよい。この際、個々のpH感受性担体の構造は保持されていてもよいし、複数の担体が融合していてもよい。凝集体の形態は、たとえば透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型プローブ顕微鏡(SPM)等の公知の観察手段によって確認することができる。本明細書では、pH感受性担体を含有する溶液をポアサイズ0.22μmのフィルターで処理し、フィルターを通過した液のリン脂質濃度が、フィルターを通過する前のリン脂質濃度未満であれば、pH感受性担体の凝集体が形成されているとする。なお、当該リン脂質濃度は、テストワコーなどの公知のリン脂質定量手段を用いて決定することができる。テストワコーを用いてリン脂質定量を行う場合、販売元のプロトコルに準拠するものとする。
本明細書において、「担持」とは、pH感受性担体が酸性下で凝集してなる凝集体の内部に、生理活性物質が、物理的な捕捉(たとえば、架橋構造への引っ掛かり)や化学的な結合(たとえば、疎水的相互作用、イオン結合、水素結合など)を介して保持されることをいう。この際、凝集体内での生理活性物質の存在状態は特に制限されず、凝集体を形成するpH感受性担体の膜と他方の担体の膜との間に存在していてもよいし、担体の膜内に挿入されていてもよい。
本明細書において、「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム(分散液)と、複合体(生理活性物質が担持されたpH感受性担体の凝集体)を含む液などの評価サンプル分散液とを、所定のpHに調製した水溶液に添加し、当該水溶液を37℃で90分間あるいは30分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、複合体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。かような膜破壊機能を有することにより、生体膜(たとえばエンドソーム)の膜内部に含有されうる成分を生体膜の外部(たとえば細胞質基質)に溶出させうる。なお、上記の溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
本明細書において、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、(1)溶出性試験において、生理的pHにおける溶出率よりも生理的pH未満の所定のpHにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がpH感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、(2)当該生理的pH未満の所定のpHでの溶出性試験において、複合体の溶出率が、pH感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、pH7.4とpH5.0またはpH4.5との溶出性試験において、複合体の溶出率Lcが、pH感受性化合物単独の溶出率Laと両親媒性物質単独の溶出率Lbと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記(1)が、下記式(1)で表され、上記(2)が下記式(2)で表される。なお、下記式中、pH7.4の溶出率を、それぞれ、Lc7.4、La7.4、Lb7.4と表し、pH5.0または4.5の溶出率を、それぞれ、Lcx、Lax、Lbxと表す。
上記式(1)において、Δは、0を超えていればよいが、5以上であるのが好ましく、10以上であるのがより好ましく、30以上であるのがさらに好ましい。また、上記式(2)において、Δ’は、0を超えていればよいが、5以上であるのが好ましく、10以上であるのがより好ましく、15以上であるのがさらに好ましい。
本明細書において、「酸性下」とは、pH7.0未満、好ましくはpH6.4未満を意味する。
本明細書において、「生理的pH」とは、正常組織や正常体液におけるpHを意味する。生理的pHは、通常、7.4であるが、正常組織や正常体液によって若干(±0.1)異なる。また、「生理的pH未満の所定のpH」とは、pH7.4未満であればよく、好ましくはpH3.0以上pH7.4未満、より好ましくはpH4.0以上pH7.3未満、さらに好ましくはpH4.5以上pH7.0未満である。
本明細書において、「中性のpH」とは、pH6以上pH8以下(具体的にはpH6.0以上pH8.0以下)を意味する。
本明細書において、範囲を示す「X~Y」は、XおよびYを含み、「X以上Y以下」を意味する。また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温(20℃以上25℃以下)/相対湿度40%RH以上50%RH以下の条件で行う。
<複合体の構成成分>
[pH感受性担体]
本発明の複合体は、酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなるものであり、当該pH感受性担体は、主にpH感受性化合物と両親媒性物質とで構成される。
[pH感受性担体]
本発明の複合体は、酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなるものであり、当該pH感受性担体は、主にpH感受性化合物と両親媒性物質とで構成される。
(pH感受性化合物)
pH感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種である。中でも、pH感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種であることがより好ましい。pH感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、などが挙げられる。これらのpH感受性化合物は、単独で用いても、2種以上を併用して用いてもよい。
pH感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種である。中でも、pH感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種であることがより好ましい。pH感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、などが挙げられる。これらのpH感受性化合物は、単独で用いても、2種以上を併用して用いてもよい。
本発明で好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として古くから知られており、細菌学の分野においても利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム(別名デスオキシコール酸ナトリウム)とウルソデオキシコール酸(別名ウルソデスオキシコール酸)は、ヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、本発明のpH感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩(例えば、ナトリウム塩)を用いることがさらに好ましい。中でも、優れたpH応答性の観点から、デオキシコール酸が特に好ましい。
pH感受性化合物は、両親媒性物質100モルに対して10モル以上の割合で含有されるのが好ましい。より好ましくは、両親媒性物質100モルに対して10~640モル、さらに好ましくは20~320モル、特に好ましくは20~160モルである。
(両親媒性物質)
本発明で用いられる両親媒性物質としては、炭素数10~12のホスファチジルコリン、炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16~18のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα-トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種である。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、2種以上を併用して用いてもよい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
本発明で用いられる両親媒性物質としては、炭素数10~12のホスファチジルコリン、炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16~18のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα-トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種である。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、2種以上を併用して用いてもよい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
炭素数10~12のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC;1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン)、ジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC;1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン)が挙げられる。ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート)、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、10~200が好ましく、15~100がより好ましく、20~50がさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Tween20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル)、Tween40(ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル)、Tween60(ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル)、Tween80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル)として販売されているものを好ましく用いることができる。
炭素数16~18のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル(ソルビタンモノパルミテート)、ソルビタンモノステアリン酸エステル(ソルビタンモノステアレート)、ソルビタンモノオレイン酸エステル(ソルビタンモノオレート)等のソルビタンモノ脂肪酸エステル、ソルビタントリパルミチン酸エステル(ソルビタントリパルミテート)、ソルビタントリステアリン酸エステル(ソルビタントリステアレート)、ソルビタントリオレイン酸エステル(ソルビタントリオレート)等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、SPAN40(ソルビタンパルミチン酸エステル)、SPAN60(ソルビタンステアリン酸エステル)、SPAN80(ソルビタンオレイン酸エステル)、SPAN65(ソルビタントリステアリン酸エステル)、SPAN85(ソルビタントリオレイン酸エステル)として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、SPAN80、SPAN65、SPAN85が好ましい。
モノオレイン酸グリセロール(モノオレイン酸グリセリル)、ジラウリン酸グリセロール(ジラウリン酸グリセリル)、ジステアリン酸グリセロール(ジステアリン酸グリセリル)、ジオレイン酸グリセロール(ジオレイン酸グリセリル)としては、グリセリンに1または2分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのC1位またはC2位に脂肪酸がエステル結合していてもよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのC1位およびC2位、またはC1位およびC3位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、C1位およびC3位が置換された、α、α’-ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、C1位およびC2位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
ポリオキシエチレンヒマシ油としては、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、3~200が好ましく、5~100がより好ましく、10~50がさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
α-トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
本発明の一実施形態において、両親媒性物質は、炭素数10~12のホスファチジルコリンが好ましく、炭素数12のジラウロイルホスファチジルコリン(DLPC)が特に好ましい。
(pH感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ)
pH感受性担体は、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のpHにおいて、膜破壊機能促進効果を発現することができ、凝集体を形成してもその効果を維持することができる。この際、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるpHは異なる。これはpH感受性化合物によってpKaが異なること、さらには両親媒性物質との会合様式が、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するpHを選択することが可能であり、生体内のデリバリー、および細胞内のデリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
pH感受性担体は、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のpHにおいて、膜破壊機能促進効果を発現することができ、凝集体を形成してもその効果を維持することができる。この際、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、pH感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるpHは異なる。これはpH感受性化合物によってpKaが異なること、さらには両親媒性物質との会合様式が、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するpHを選択することが可能であり、生体内のデリバリー、および細胞内のデリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
本発明のpH感受性担体において、pH感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween40、デオキシコール酸およびTween60、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN40、デオキシコール酸およびSPAN60、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN65、デオキシコール酸およびSPAN85、デオキシコール酸およびα-トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’-ジラウリン)、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油(好ましくはPEG10ヒマシ油)、ウルソデオキシコール酸およびDDPC、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびTween20、ウルソデオキシコール酸およびTween40、ウルソデオキシコール酸およびTween60、ウルソデオキシコール酸およびTween80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN40、ウルソデオキシコール酸およびSPAN60、ウルソデオキシコール酸およびSPAN80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN65、ウルソデオキシコール酸およびSPAN85、ウルソデオキシコール酸およびα-トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’-ジラウリン)、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、コール酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびDDPC、グリチルリチン酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびTween20、グリチルリチン酸およびTween40、グリチルリチン酸およびTween60、グリチルリチン酸およびTween80、グリチルリチン酸およびSPAN40、グリチルリチン酸およびSPAN60、グリチルリチン酸およびSPAN80、グリチルリチン酸およびSPAN65、グリチルリチン酸およびSPAN85、グリチルリチン酸およびα-トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール(α、α’-ジラウリン)、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリコデオキシコール酸およびDLPCが好ましい。上記においてpH感受性化合物は塩であってもよい。
より好ましくは、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween40、デオキシコール酸およびTween60、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN40、デオキシコール酸およびSPAN65、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびSPAN85、デオキシコール酸およびPEG10ヒマシ油、デオキシコール酸およびα-トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびDDPC、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、ウルソデオキシコール酸およびTween40、ウルソデオキシコール酸およびTween60、ウルソデオキシコール酸およびTween80、ウルソデオキシコール酸およびSPAN40、ウルソデオキシコール酸およびSPAN65、ウルソデオキシコール酸およびSPAN85、ウルソデオキシコール酸およびα-トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、コール酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびDDPC、グリチルリチン酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびTween40、グリチルリチン酸およびTween60、グリチルリチン酸およびTween80、グリチルリチン酸およびSPAN40、グリチルリチン酸およびSPAN65、グリチルリチン酸およびSPAN85、グリチルリチン酸およびα-トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリコデオキシコール酸およびDLPCである。上記においてpH感受性化合物は塩であってもよい。
中でも、デオキシコール酸およびDDPC、デオキシコール酸およびDLPC、デオキシコール酸およびTween20、デオキシコール酸およびTween80、デオキシコール酸およびSPAN80、デオキシコール酸およびPEG10ヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびDLPC、ケノデオキシコール酸およびDLPC、ヒオデオキシコール酸およびDLPC、コール酸およびDLPC、グリチルリチン酸およびDLPC、グリコデオキシコール酸およびDLPCの組み合わせが好ましい。上記においてpH感受性化合物は塩であってもよい。
すなわち、本発明の好ましい一実施形態において、pH感受性担体は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10~12のホスファチジルコリン、炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16~18のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα-トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質を含む。上記においてpH感受性化合物は塩であってもよい。
[生理活性物質]
本発明の複合体は、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつpHの低下した部位で膜破壊機能促進効果を発現するため、炎症等の治療部位に生理活性物質を選択的に送達することができる。また、本発明の複合体は、生理活性物質を細胞のサイトゾルへ送達することができる。
本発明の複合体は、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつpHの低下した部位で膜破壊機能促進効果を発現するため、炎症等の治療部位に生理活性物質を選択的に送達することができる。また、本発明の複合体は、生理活性物質を細胞のサイトゾルへ送達することができる。
複合体に含まれる生理活性物質の種類は特に限定されず、核酸、低分子化合物、タンパク質、ペプチドが挙げられる。中でも、細胞内にて優れた薬効を発現する観点から、生理活性物質は、タンパク質、ペプチドまたは核酸であることが好ましい。
核酸としては、siRNA、ODN(オリゴデオキシヌクレオチド)、デオキシリボ核酸(DNA)等の治療効果を有する核酸が挙げられる。核酸の長さとしては、500bp以上であることが好ましい。
低分子化合物としては、マイトマイシン、ドセタキセル、メトトレキサート等の細胞毒性剤;5-アミノレブリン酸、プロトポルフィリンIX等のプロドラッグ;ガンシクロビル、デキサメタゾン、リバビリン、ビダラビン等の抗炎剤;DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclotetradecane-N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid)、DTPA(1,4,7,10-tetraazacyclodecane-N,N’,N’’,N’’’-tetraacetic acid)等の造影剤;エダラボン等の神経保護剤が挙げられる。
タンパク質としては、SOD(Superoxide dismutase)、インドフェノールオキシダーゼ等の酸化還元酵素;IL-10等のサイトカイン、b-FGF等の増殖因子、t-PA等の血栓溶解薬、エリスロポエチン等のホルモン、PSD(Postsynaptic density protein)やFNK(Anti cell death Factor)等の細胞死抑制タンパク質;Fab(Fragment)、IgG、IgE等の抗体が挙げられる。タンパク質の分子量としては、5~200kDaであることが好ましい。
ペプチドとしては、シクロスポリンA、JIP-1(JNK-interracting protein 1)等のペプチド医薬が挙げられる。また、腫瘍抗原ペプチド等が挙げられる。ペプチドの分子量としては、5,000~45,000であることが好ましく、さらに6,000~20,000であることがより好ましい。
生理活性物質のサイズは、特に制限されないが、サイズが大きいほどpH感受性担体の凝集体が形成する架橋構造に捕捉されやすいため、好ましい。
生理活性物質は、親水性物質であってもよいし、疎水性物質であってもよい。このうち、疎水性物質であれば、疎水的相互作用によりpH感受性担体の凝集体内に取り込まれやすくなるため、好ましい。
本発明の複合体における生理活性物質の好適な担持量は、例えば、pH感受性担体を構成する両親媒性物質1000nmolに対して、0.001~10mgである。なお、より好適な担持量は、生理活性物質の種類に応じて適宜選択されうる。
<複合体の製造方法>
本発明に係る複合体は、上記のpH感受性担体と生理活性物質とを混合し、当該混合物を酸性環境に晒すことで、得ることができる。したがって、たとえば、pH感受性担体と生理活性物質とを含む混合液を調製し、その混合液のpHを酸性化することで、本発明の複合体を液体媒体中に得ることができる。したがって、本発明は、pH感受性化合物および両親媒性物質を含むpH感受性担体を調製し(工程1)、前記pH感受性担体と生理活性物質とを混合して混合液を調製し(工程2)、前記混合液のpHを6.4未満に調整する(工程3)ことを有する、複合体の製造方法についても提供する。
本発明に係る複合体は、上記のpH感受性担体と生理活性物質とを混合し、当該混合物を酸性環境に晒すことで、得ることができる。したがって、たとえば、pH感受性担体と生理活性物質とを含む混合液を調製し、その混合液のpHを酸性化することで、本発明の複合体を液体媒体中に得ることができる。したがって、本発明は、pH感受性化合物および両親媒性物質を含むpH感受性担体を調製し(工程1)、前記pH感受性担体と生理活性物質とを混合して混合液を調製し(工程2)、前記混合液のpHを6.4未満に調整する(工程3)ことを有する、複合体の製造方法についても提供する。
以下、本発明に係る複合体の製造方法の各工程について説明する。
[工程1:pH感受性担体の調製工程]
当該工程では、上記のpH感受性化合物と両親媒性物質とを会合させて、pH感受性担体を調製する。
当該工程では、上記のpH感受性化合物と両親媒性物質とを会合させて、pH感受性担体を調製する。
pH感受性化合物と両親媒性物質とを会合させる方法としては、pH感受性化合物と、両親媒性物質とが、水性溶液中で接触すればよい。具体的には、pH感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を作製し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散することで、pH感受性化合物と両親媒性物質とが会合したpH感受性担体の分散液を得ることができる。
より具体的には、(1)pH感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液とを別々に調製し、それら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散させてpH感受性担体を得る方法;(2)リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法;が挙げられる。バンガム法としては、具体的には、ガラス容器中で、pH感受性化合物および両親媒性物質等のpH感受性担体の構成成分を有機溶媒(例えば、メタノール、クロロホルム)に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、常温(5~35℃)で薄膜を膨潤させた後、常温(5~35℃)でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く攪拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。また、上記の(1)製造方法において、両親媒性物質を含む水性溶液に、pH感受性化合物を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。
なお、バンガム法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」(野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂)および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」(寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京)に記載されている。
pH感受性化合物は、両親媒性物質100モルに対して10モル以上の割合で配合するのが好ましい。中でも、生理活性物質の一体化効率のさらなる向上の観点から、pH感受性化合物の配合量は、両親媒性物質100モルに対して、好ましくは40モル以上640モル以下であり、より好ましくは160モル以上640モル以下であり、さらにより好ましくは320モル以上640モル以下である。
水性溶液中の両親媒性物質の濃度は、6~2000nmol/mLとすることが好ましく、さらに10~1000nmol/mLとすることがより好ましい。
水性溶液中のpH感受性化合物の濃度は、400~6400nmol/mLとすることが好ましい。
(溶媒)
上記の水性溶液に用いられる溶媒としては、緩衝剤、NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液が好ましい。
上記の水性溶液に用いられる溶媒としては、緩衝剤、NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液が好ましい。
緩衝剤としては、pH感受性担体を含む水性溶液のpHを生理的pH以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸-リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン-HCl緩衝剤(トリス塩酸緩衝剤)、MES緩衝剤(2-モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤)、TES緩衝剤(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸緩衝剤)、酢酸緩衝剤、MOPS緩衝剤(3-モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤)、MOPS-NaOH緩衝剤、HEPES緩衝剤(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤)、HEPES-NaOH緩衝剤などのGOOD緩衝剤、グリシン-塩酸緩衝剤、グリシン-NaOH緩衝剤、グリシルグリシン-NaOH緩衝剤、グリシルグリシン-KOH緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス-ホウ酸緩衝剤、ホウ酸-NaOH緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸-リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、MES緩衝剤、酢酸緩衝剤、HEPES-NaOH緩衝剤が好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、0.1~200mMであるのが好ましく、1~100mMであるのがより好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度(mM)をいう。
NaCl、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、0.1~200mMであるのが好ましく、1~150mMであるのがより好ましい。
当該工程では、安定化剤等の添加剤を水性溶液に添加してもよい。添加剤の含有量としては、pH感受性担体を破壊しなければ特に制限されないが、両親媒性物質100モルに対して、150モル以下であるのが好ましく、66.4モル以下であるのがより好ましい。
(安定化剤)
安定化剤としては、pH感受性担体を破壊しないものであれば特に制限されず、例えば、1-オクタノール、1-ドデカノール、1-ヘキサドデカノール、1-エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数4~20のアルコール;ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数12~18の脂肪酸;カプリル酸メチル(オクタン酸メチル)、カプリル酸メチル(オクタン酸エチル)、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数8~18の脂肪酸アルキルエステル(炭素数1~3のアルキル);D(L)-アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のD(L)-アミノ酸;トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド;ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル(例えば、Tween65、Tween85);ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数12~18のポリオキシエチレンアルキルエステル(例えば、PEG20ステアリルエーテル、PEG23ラウリルエーテル);ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油(例えば、PEG10硬化ヒマシ油、PEG40硬化ヒマシ油、PEG60硬化ヒマシ油);カプリリン(オクタン酸グリセロール)、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数8~18のモノ脂肪酸グリセロールエステル;ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数8~16のジ脂肪酸グリセロール;α-トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、「炭素数」とは疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
安定化剤としては、pH感受性担体を破壊しないものであれば特に制限されず、例えば、1-オクタノール、1-ドデカノール、1-ヘキサドデカノール、1-エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数4~20のアルコール;ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数12~18の脂肪酸;カプリル酸メチル(オクタン酸メチル)、カプリル酸メチル(オクタン酸エチル)、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数8~18の脂肪酸アルキルエステル(炭素数1~3のアルキル);D(L)-アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のD(L)-アミノ酸;トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド;ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル(例えば、Tween65、Tween85);ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数12~18のポリオキシエチレンアルキルエステル(例えば、PEG20ステアリルエーテル、PEG23ラウリルエーテル);ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油(例えば、PEG10硬化ヒマシ油、PEG40硬化ヒマシ油、PEG60硬化ヒマシ油);カプリリン(オクタン酸グリセロール)、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数8~18のモノ脂肪酸グリセロールエステル;ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数8~16のジ脂肪酸グリセロール;α-トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、「炭素数」とは疎水部を構成する脂肪酸成分(アシル基)の炭素数を意味する。
安定化剤等の添加剤の添加方法としては、特に制限されない。例えば、pH感受性化合物を含む水性溶液、または両親媒性物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、薄膜を調製する際に、pH感受性担体の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、pH感受性担体を含む水性溶液を得てもよい。
[工程2:混合液調製工程]
当該工程では、上記工程1で得られたpH感受性担体と、生理活性物質とを混合して、混合液を調製する。
当該工程では、上記工程1で得られたpH感受性担体と、生理活性物質とを混合して、混合液を調製する。
pH感受性担体と生理活性物質とを混合する方法としては、生理活性物質の種類に応じて公知の方法を適宜選択することができる。該方法としては特に制限されないが、例えば、pH感受性担体および生理活性物質を、水性溶媒、賦形剤等の媒体に混合する方法等が挙げられる。たとえば、工程1で得られたpH感受性担体の分散液に対して、生理活性物質を添加してもよい。その際、生理活性物質は、そのまま添加してもよいし、予め溶媒に溶解または分散させてから添加してもよい。ここで、生理活性物質を溶解または分散させるための溶媒としては、たとえば上記工程1で挙げた溶媒を使用することができる。
混合液中のpH感受性担体の濃度は、好ましくは50nmol/mL以上であり、より好ましくは100nmol/mL以上であり、さらにより好ましくは200nmol/mL以上であり、特に好ましくは500nmol/mL以上である。上記範囲であれば、後述のpH調整工程でpH感受性担体が緻密な凝集体を形成するため、生理活性物質をより良好に捕捉することができる。また、安全性の観点から、pH感受性担体の濃度は、1000nmol/mL以下であることが好ましい。
混合液中の生理活性物質の好ましい含有量は、例えば、pH感受性担体を構成する両親媒性物質1000nmolに対して、0.001~10mgである。なお、より好適な含有量は、生理活性物質の種類に応じて適宜選択されうる。
当該工程において、混合液には、後述する自然免疫を活性化する刺激を有する物質や、公知の添加剤をさらに添加してもよい。すなわち、本発明の複合体は、かような物質も含みうる。
[工程3:pH調整工程]
当該工程では、工程2で得られた混合液のpHを6.4未満に調整する。これにより、生理活性物質を取り込みながら、pH感受性担体は凝集体を形成しうる。
当該工程では、工程2で得られた混合液のpHを6.4未満に調整する。これにより、生理活性物質を取り込みながら、pH感受性担体は凝集体を形成しうる。
pHを調整する方法としては特に制限されず、塩酸、硫酸、硝酸等の公知の酸を混合液に添加する方法が挙げられる。酸の添加量は、目標とするpHによって適宜調節することができる。
当該工程において目標とするpHは、6.4未満であれば特に制限されないが、凝集体の架橋構造がより緻密になり、生理活性物質をより捕捉できる観点では、pHが低いほど好ましい。ただし、あまりにpHが低い場合、生理活性物質が変性するおそれがある。よって、当該工程では、溶液のpHを2.0以上5.0以下に調整することが好ましく、2.0以上4.0以下に調整することがより好ましい。
混合液を所望の酸性pHに調整した後、静置することで、より緻密なpH感受性担体の凝集体を得ることができる。この際、静置時間の下限は、特に制限されないが、10分以上であることが好ましく、30分以上であることがより好ましく、1時間以上であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、緻密な凝集体が形成されるため、生理活性物質を凝集体内に良好に保持することができる。また、静置時間の上限は、特に制限されない。静置温度も、特に制限されないが、好ましくは室温(25℃)~40℃程度である。
上記の工程1~3により、pH感受性担体の凝集体と生理活性物質とが一体化した複合体を得ることができる。工程3の後、ろ過などの公知の手段により溶媒を除去して、複合体を単離してもよい。
上記で得られた複合体を含む液を、(例えばポアサイズ0.22μmの)フィルターで処理し、フィルター処理前後の生理活性物質の濃度を測定することで、生理活性物質の一体化率(添加した生理活性物質全量に対するpH感受性担体の凝集体に取り込まれた生理活性物質量の割合)を確認することができる。ここで、生理活性物質の濃度は、公知の方法により測定することができる。なお、本明細書では、生理活性物質の一体化効率は、フィルター処理前後の吸光度測定に基づき、下記式3により算出される値とする。この際、生理活性物質の吸収波長領域に対応する波長(例えば、タンパク質やペプチドの場合は280nm、核酸の場合は260nm)で吸光度を測定してもよい。あるいは、市販の定量キットを用いて液を呈色した後、当該キットのプロトコルで推奨されている波長で吸光度を測定してもよい。
<用途>
本発明に係る複合体は、それ単独で、あるいは、他の成分と混合してなる組成物(以下、pH感受性組成物とも称する)として、対象者の治療に用いることができる。
本発明に係る複合体は、それ単独で、あるいは、他の成分と混合してなる組成物(以下、pH感受性組成物とも称する)として、対象者の治療に用いることができる。
pH感受性組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であってもよいが、注射製剤のような液体製剤の形態が好ましい。該液体製剤は、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。
錠剤およびカプセルは、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末または液体のいずれを含有することもできる。
[他の成分]
pH感受性組成物に含まれうる他の成分としては、自然免疫を活性化する刺激を有する物質、医薬添加剤等が挙げられる。
pH感受性組成物に含まれうる他の成分としては、自然免疫を活性化する刺激を有する物質、医薬添加剤等が挙げられる。
(自然免疫を活性化する刺激を有する物質)
自然免疫を活性化する刺激を有する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。なお、当該物質は、上記の生理活性物質と重複していてもよい。
自然免疫を活性化する刺激を有する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。なお、当該物質は、上記の生理活性物質と重複していてもよい。
自然免疫を活性化する刺激を有する物質としては、特に制限されないが、Toll様受容体に対するアゴニストであることが好ましい。
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の具体例としては、特に制限されないが、ミョウバン等の鉱物塩;水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント;CpGモチーフを含む免疫調節性DNA配列、免疫刺激性RNA分子、内毒素(リポ多糖(LPS;内毒素)、モノホスホリルリピドA(MPL:登録商標))、外毒素(コレラ毒素、大腸菌(E.coli)熱不安定性毒素、百日咳毒素)、ムラミルジペプチド、フラジェリン等の微生物アジュバント;不完全フロイントアジュバント(IFA)等の油性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン等の油性アジュバント生分解性ミクロスフェア、サポニン(QS-21、Quil-A等)、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似物、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド(非CpG合成ポリヌクレオチド等)、イミダゾキノリン等の合成アジュバント;DOTAP、DC-Chol、DDA等のカチオン性脂質;一本鎖RNA;二本鎖RNA等が挙げられる。中でも、安全性の観点から、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム化合物であることが好ましい。すなわち、本発明の好ましい一実施形態は、上記の複合体およびアルミニウム化合物を含む、pH感受性組成物である。
自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量は、当該物質の種類によっても異なるが、複合体を構成する両親媒性物質100molに対して、0.0227~1280molであることが好ましく、0.0227~22.7molであることがより好ましく、0.2~2.27molであることがさらに好ましい。自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が0.0227mol以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が1280mol以下であると、コストが低減できることから好ましい。なお、自然免疫を活性化する刺激を有する物質としてアルミニウム化合物を使用する場合、上記含有量はアルミニウム元素の含有量を指す。
(医薬添加剤)
pH感受性組成物が液体製剤である場合、医薬添加剤は、溶媒(例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など)、膜安定剤(例えばコレステロールなど)、等張化剤(例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど)、抗酸化剤(例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど)、防腐剤(例えばクロロブタノール、パラベンなど)などを含み得る。上記の溶媒は、複合体を製造する際に用いる溶媒であってもよい。その際、pH感受性担体の凝集が解離して、生理活性物質が放出されることを防止するため、用いる溶媒のpHは7.0未満であることが好ましく、6.4未満であることがより好ましい。
pH感受性組成物が液体製剤である場合、医薬添加剤は、溶媒(例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など)、膜安定剤(例えばコレステロールなど)、等張化剤(例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど)、抗酸化剤(例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど)、防腐剤(例えばクロロブタノール、パラベンなど)などを含み得る。上記の溶媒は、複合体を製造する際に用いる溶媒であってもよい。その際、pH感受性担体の凝集が解離して、生理活性物質が放出されることを防止するため、用いる溶媒のpHは7.0未満であることが好ましく、6.4未満であることがより好ましい。
pH感受性組成物が固形製剤である場合、医薬添加剤は、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど)、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤(例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど)、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。
[治療方法]
本発明の複合体またはこれを含むpH感受性組成物を対象者の治療に用いる場合の投与形態は特に制限されず、例えば、経口投与、および静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、生理活性物質としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口投与、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。
本発明の複合体またはこれを含むpH感受性組成物を対象者の治療に用いる場合の投与形態は特に制限されず、例えば、経口投与、および静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、生理活性物質としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口投与、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。
本発明の複合体またはこれを含むpH感受性組成物を投与する際、複合体が注射針を通過し、所望の部位まで送達されるよう、予めピペッティングやホモジナイザーなどを用いた機械的撹拌を行うこともできる。
本発明の複合体またはこれを含むpH感受性組成物は、対象者に投与して、複合体またはこれを含むpH感受性組成物の外部環境が生理的pH未満(例えば、pH6.4未満)となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、生理活性物質を特異的に効率よく放出させることが可能になる。
よって、本発明により、治療または予防を必要とする対象者に、上記の複合体またはこれを含むpH感受性組成物の有効量を経口または非経口的に投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
上記疾患としては、例えば、前立腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、胃癌、脳腫瘍、乳癌等の癌;HIV(Human Immunodeficiency Virus)、C型肝炎、B型肝炎等の感染症疾患;アルツハイマー病、パーキンソン病等の中枢神経疾患が挙げられる。
すなわち、本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
また、本発明の一実施形態において、本発明の複合体は、培養により、細胞に直接生理活性物質を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、細胞に生理活性物質に輸送するための培養方法が提供される。
培養方法は、細胞を、本発明の複合体を含む培地で培養する工程を含む。
培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、MEM、DMEM、RPMI等が挙げられる。
培地への複合体の添加量としては、特に制限されないが、pH感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、0.73μmol/L~7.4mmol/Lであることが好ましく、7.3μmol/L~6.5mmol/Lであることがより好ましく、8.0μmol/L~4.2mmol/Lであることがさらに好ましい。
また、培地のpHは、複合体の形態を保持しつつ、pH感受性化合物の不安定化を防止する観点から、8.0~6.5であることが好ましい。
生理活性物質が輸送される細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
この際、対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、NK(Natural Killer)細胞、Tリンパ細胞、Bリンパ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、NK細胞、T細胞、リンパ細胞等を用いることがより好ましい。
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者を採血、生検等により当該細胞を採取することができる。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
好ましい一実施形態において、治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、本発明の複合体を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、疾患の具体例は上述のとおりである。
また、本発明に係る複合体は、生理的pH環境に晒されても、凝集状態を一定時間維持することができる。したがって、本発明の複合体は、生体内の所望の部位まで送達された後、凝集形態を保持した状態で部位に留まり、生理活性物質を徐放することができる。言い換えれば、pH感受性担体が酸性下で凝集してなる凝集体は、生理活性物質の徐放デバイスとして機能しうる。したがって、本発明の好ましい一実施形態は、上記複合体を含む徐放剤である。投与形態および剤型は、上記と同様である。
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、疾患の具体例は上述のとおりである。
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。実施例において「部」あるいは「%」の表示を用いる場合があるが、特に断りがない限り、「重量部」あるいは「重量%」を表す。また、特記しない限り、各操作は、室温(25℃)で行われる。
<原料>
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
[pH感受性化合物]
・デオキシコール酸(ファーマグレード、シグマ社製)
・ウルソデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ケノデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ヒオデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・コール酸(東京化成工業社製)
・グリチルリチン酸(東京化成工業社製)
・グリコデオキシコール酸(東京化成工業社製)
[両親媒性物質]
・DLPC(1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC-1212)
・DDPC(1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC-1010)
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル(Tween20(炭素数12)、Tween80(炭素数18):東京化成工業社製)
・ソルビタン脂肪酸エステル(SPAN80(炭素数18)、ナカライテスク社製)
・ポリオキシエチレンヒマシ油(PEG10ヒマシ油、ポリオキシエチレン10ヒマシ油、和光純薬工業社製)
[生理活性物質]
・モデルタンパク質:OVA(分子量45kDa、シグマ-アルドリッチ社製)
・モデルDNA:Salmon由来DNA(分子量500~1000bp、和光純薬工業社製)
・モデルペプチド:SIINFEKL(委託合成)
・モデルペプチド:RGPESRLL(委託合成)
[その他]
・塩酸
・メタノール(ナカライテスク社製)
・クロロホルム(和光純薬工業社製)
・酢酸(和光純薬工業社製)
・酢酸ナトリウム(関東化学社製)
・MES-Na(メルク社製)
・Hepes-Na(ナカライテスク社製)
・塩化ナトリウム(関東化学社製)
・Pyranine(東京化成工業社製)
・DPX(p-xylene-bis-pyridinium bromide:Molecular probes社製)
・PBS(Phosphate Buffered Salts:タカラバイオ社製、PBS Tablets)
・水酸化ナトリウム水溶液(0.1mol/L:ナカライテスク社製)
・塩酸(0.1mol/L、1mol/L:ナカライテスク社製)
・Triton-X100(和光純薬工業社製、トリトンX100)
・DMEM(ナカライテスク社製、ダルベッコ変法イーグル培地)。
・デオキシコール酸(ファーマグレード、シグマ社製)
・ウルソデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ケノデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・ヒオデオキシコール酸(東京化成工業社製)
・コール酸(東京化成工業社製)
・グリチルリチン酸(東京化成工業社製)
・グリコデオキシコール酸(東京化成工業社製)
[両親媒性物質]
・DLPC(1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC-1212)
・DDPC(1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン:日油社製、COATSOME MC-1010)
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル(Tween20(炭素数12)、Tween80(炭素数18):東京化成工業社製)
・ソルビタン脂肪酸エステル(SPAN80(炭素数18)、ナカライテスク社製)
・ポリオキシエチレンヒマシ油(PEG10ヒマシ油、ポリオキシエチレン10ヒマシ油、和光純薬工業社製)
[生理活性物質]
・モデルタンパク質:OVA(分子量45kDa、シグマ-アルドリッチ社製)
・モデルDNA:Salmon由来DNA(分子量500~1000bp、和光純薬工業社製)
・モデルペプチド:SIINFEKL(委託合成)
・モデルペプチド:RGPESRLL(委託合成)
[その他]
・塩酸
・メタノール(ナカライテスク社製)
・クロロホルム(和光純薬工業社製)
・酢酸(和光純薬工業社製)
・酢酸ナトリウム(関東化学社製)
・MES-Na(メルク社製)
・Hepes-Na(ナカライテスク社製)
・塩化ナトリウム(関東化学社製)
・Pyranine(東京化成工業社製)
・DPX(p-xylene-bis-pyridinium bromide:Molecular probes社製)
・PBS(Phosphate Buffered Salts:タカラバイオ社製、PBS Tablets)
・水酸化ナトリウム水溶液(0.1mol/L:ナカライテスク社製)
・塩酸(0.1mol/L、1mol/L:ナカライテスク社製)
・Triton-X100(和光純薬工業社製、トリトンX100)
・DMEM(ナカライテスク社製、ダルベッコ変法イーグル培地)。
<pH感受性担体溶液の調製>
クロロホルムに溶解した両親媒性物質と、メタノールあるいはクロロホルムに溶解したpH感受性化合物と、を10mLナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーター(BuCHI)により薄膜とした。なお、両親媒性物質とpH感受性化合物との比率は、所望の比率(モル比100:10、100:20、100:640等)となるよう調整した。
クロロホルムに溶解した両親媒性物質と、メタノールあるいはクロロホルムに溶解したpH感受性化合物と、を10mLナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーター(BuCHI)により薄膜とした。なお、両親媒性物質とpH感受性化合物との比率は、所望の比率(モル比100:10、100:20、100:640等)となるよう調整した。
作製した薄膜にMES buffer(MES:25mM、NaCl:125mM pH7.4)1mLを添加し、超音波照射装置(USC-J)を用いて常温で1分間超音波を照射して分散させ、pH感受性担体の分散液を得た。
<溶出性試験:Leakage(溶出率)の測定>
Leakage(溶出率)は、K.Kono et al.Bioconjugate Chem.2008 19 1040-1048に記載の方法に従い、蛍光物質であるPyranineと消光剤であるDPXとを内包したEYPCリポソームを用いて評価した。
Leakage(溶出率)は、K.Kono et al.Bioconjugate Chem.2008 19 1040-1048に記載の方法に従い、蛍光物質であるPyranineと消光剤であるDPXとを内包したEYPCリポソームを用いて評価した。
クロロホルムに溶解させた3000nmolのEYPC(卵黄ホスファチジルコリン)を10mLナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーター(BuCHI)を用いて薄膜とした。Pyranine溶液(Pyraine:35mM、DPX:50mM、MES:25mM、pH7.4)500μLを加え、超音波照射装置(USC-J)を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径100nmのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。MES buffer(MES:25mM、NaCl:125mM pH7.4)とG100カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したEYPCリポソーム分散液を得た。リン脂質C-テストワコー(和光純薬工業社製)を用いてリン脂質(コリン基)の濃度を求め、リン脂質濃度が1.0mmol/LとなるようにMES buffer(MES:25mM、NaCl:125mM pH7.4)を用いて濃度を調整した。
濃度を調整したEYPCリポソーム分散液20μLと、評価サンプル分散液20μLを、種々のpHに調整したMES buffer(MES:25mM、NaCl:125mM)2960μL中に投与し、37℃にて90あるいは30分間インキュベーションした後(実施例において、特別な記載のない限り、90分間の結果である)、分光光度計FP-6500を用いてEx416nm、Em512nmの蛍光を観察することにより、Leakageをモニターした。pH4.0~pH3.0の測定は酢酸buffer(酢酸:25mM、NaCl:125mM)を用いて実施した。
なお、EYPCリポソーム分散液のみの場合を0%とし、10倍希釈したTriton-X100を30μL加えた場合の値を100%として、溶出率を算出した。
具体的には、溶出率は、下記式4に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をLとし、蛍光物質を内包したEYPCリポソーム分散液のみの蛍光強度をL0、Triton-X100を加えた場合の蛍光強度をL100と表す。
<実験1.pH感受性担体の凝集体の機能評価>
pH感受性担体の凝集体の膜破壊機能促進効果を評価した。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して調整した。
pH感受性担体の凝集体の膜破壊機能促進効果を評価した。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して調整した。
pH感受性担体の分散液のpHを種々に設定したところ、pHの低下に伴い、沈殿が生じた(図1A)。沈殿は低pHとした直後に発生し、ゲルのような状態から時間と共に小さくなる挙動を示した(図1B)。低pHの環境において、pH感受性担体が互いに融合し、沈殿となったものと考えられる。以下、この沈殿物を「pH感受性担体の凝集体」とも称する。各pHにおいて生じたpH感受性担体の凝集体について膜破壊機能促進効果を測定したところ、驚くべきことに、いずれのpH感受性担体の凝集体も膜破壊機能促進効果を有していた。pH感受性担体は膜破壊機能促進効果を有するが、凝集体となってもその効果を維持することが明らかとなった(図1C、D)。なお、図1Cに対応するデータを下記表1に、図1Dに対応するデータを下記表2に、それぞれ示す。
<実験2.pH感受性担体の凝集体およびタンパク質の一体化>
pH感受性担体が凝集体を形成する際に、生理活性物質を巻き込み、複合体を形成することが期待された。そこで、まず評価系の確認を行った。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して調整した。
pH感受性担体が凝集体を形成する際に、生理活性物質を巻き込み、複合体を形成することが期待された。そこで、まず評価系の確認を行った。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して調整した。
1.最初に、pH感受性担体の分散液にOVAを混合して混合液を調製した後、塩酸を添加し、混合液のpHを7.4から4.0へ低下させた。さらに、約2時間静置した後、0.22μmのフィルター(メルクミリポア社製SLGV033RS)を通した。沈殿を含む溶液はフィルターにより透明な外観となり、pH感受性担体の凝集体の分離が示唆された(図2A)。さらに、フィルター処理前後の溶液をリン脂質C-テストワコー(和光純薬工業社製)を用いて呈色し、波長600nmで吸光度測定を行ったところ、フィルター前の吸光度は0.295(リン脂質濃度1.5mg/mLに相当)であったのに対して、フィルター後は0.001(リン脂質濃度0.0mg/mLに相当)であった(図2B)。pH感受性担体の凝集体は、本フィルターにより、ほぼ完全に分離できることが明らかとなった。
2.次に、タンパク質の分離を確認した。OVAを含むpH7.4のPBSを、先ほどと同様に0.22μmのフィルターに通した。フィルター処理前後の液をタンパク質定量キット(プロテインアッセイCBB溶液、ナカライテスク社製)を用いて呈色し、波長595nmで吸光度測定を行ったところ、フィルター前の吸光度は0.616であり、フィルター後の吸光度の0.601と同様の値を示した(図3A)。なお、検定線を用いて吸光度を濃度に変換したところ、フィルター前のOVA濃度は0.81mg/mLであるのに対し、フィルター後のOVA濃度は0.79mg/mLであり、得られた濃度は仕込み濃度に一致した(図3B)。遊離しているOVAは本フィルターに捕えられることなく、全て通り抜けることが確認された。したがって、pH感受性担体の凝集体およびタンパク質の一体化は、フィルター(孔径0.22μm)を通す前後のタンパク質濃度を測定することにより評価可能であると判断した。
3.続いて、タンパク質とpH感受性担体との一体化を評価した。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して調整した。静置する時間は約2時間とした。
pH感受性担体の分散液にOVAを混合して混合液を調製した後、実験2の2.と同様の試験方法にて、フィルターに通し、フィルター処理前後の吸光度(OVA濃度に対応)の変化を調べた。中性のpHの場合、フィルター前の吸光度は0.59およびフィルター後の吸光度は0.58であり、フィルターを通す前後で吸光度は変化せず、pH感受性担体はOVAと一体化していないと示唆された(図4A)。一方、pH3.5とした場合、フィルター前の吸光度は0.57であるのに対し、フィルター後の吸光度は0.011であり、フィルター前のそれと比べて非常に小さな値となった(図4B)。この結果から、タンパク質を含むpH感受性担体のpHを低下させることにより、pH感受性担体の凝集体とタンパク質との複合体が得られることが示唆された。
<実験3.一体化を可能とするpHの検討>
タンパク質とpH感受性担体の凝集体との一体化を可能とするpHの範囲を調べた。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して調整した。静置する時間は1時間、および1日とした。
タンパク質とpH感受性担体の凝集体との一体化を可能とするpHの範囲を調べた。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して調整した。静置する時間は1時間、および1日とした。
pH感受性担体の分散液にOVAを混合して混合液を調製し、混合液を種々のpHに設定し、1時間または1日間静置した後、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、一体化の評価を行った。その結果、pHを7.4、6.8、6.4とした場合、吸光度はフィルター前後でほとんど変化しなかった(図5A~C)。一方、pHを5.9~1.9とした場合、フィルター後の吸光度は、フィルター前のそれに比べて小さな値となった(図5A~C)。本pHの範囲(pH5.9~1.9)において、pH感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化が可能であることが示唆された。
なお、フィルター処理前後の吸光度の変動は、1時間静置した場合(図5B)と、1日間静置した場合(図5C)において、同様の傾向を示した。一体化を可能とするpHの範囲は、静置する時間に依存しないことが明らかとなった。なお、図5Bに対応するデータを下記表3に、図5Cに対応するデータを下記表4に、それぞれ示す。
<実験4.一体化が可能なタンパク質量の検討>
また、種々の濃度のOVAにて一体化の操作を行い、一体化が可能なタンパク質の量を求めた。OVAの濃度は0.001mg/mL~10mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して2に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、得られた吸光度をOVA濃度に変換した。
また、種々の濃度のOVAにて一体化の操作を行い、一体化が可能なタンパク質の量を求めた。OVAの濃度は0.001mg/mL~10mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して2に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、得られた吸光度をOVA濃度に変換した。
その結果、1000nmol/mLのDLPCであるpH感受性担体の分散液に対して、OVAが0.001~10mg/mLの濃度の範囲において、フィルター処理によるOVA濃度の減少が確認された(図6)。したがって、前記濃度範囲にて、pH感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化が可能であると示唆された。なお、図6に対応するデータを下記表5に示す。
<5.一体化を可能とするpH感受性担体の濃度の検討>
次に、タンパク質との一体化を可能とするpH感受性担体の濃度について調べた。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCに対して1600nmolのデオキシコール酸となるものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。
次に、タンパク質との一体化を可能とするpH感受性担体の濃度について調べた。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCに対して1600nmolのデオキシコール酸となるものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。
種々のDLPC濃度のpH感受性担体の分散液を用意し、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、タンパク質との一体化を評価した。低DLPC濃度のpH感受性担体の分散液を使用した場合、フィルター処理前後の吸光度の変化が小さくなる傾向を示した(図7A)。一体化するタンパク質の量が低下したものと考えられる。低DLPC濃度のpH感受性担体の分散液は、低密度の凝集体を形成しており、前記結果になったものと考えられる(図7B)。
しかしながら、評価を行ったDLPC 1000~50nmol/mLのpH感受性担体の濃度の範囲において、フィルター後の吸光度はフィルター前の吸光度に比べて小さな値であり、pH感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化を示唆する結果であった。したがって、前記範囲の濃度において、pH感受性担体の凝集体とタンパク質は複合体を形成しているものと考えられる。なお、図7Aに対応するデータを下記表6に示す。
<実験6.デオキシコール酸の配合量が及ぼす一体化への影響>
デオキシコール酸の配合量が異なるpH感受性担体を調製し、タンパク質の一体化に及ぼす影響を調べた。
デオキシコール酸の配合量が異なるpH感受性担体を調製し、タンパク質の一体化に及ぼす影響を調べた。
タンパク質はOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCに対して種々の量のデオキシコール酸となるものを使用した。pHは0.1Nの塩酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。
評価の結果、デオキシコール酸の配合量が少量である場合、フィルター前後の吸光度の変化が小さいものとなる傾向を示した(図8)。一体化するタンパク質の量は少量となることが示唆された。
しかしながら、評価を行った400~6400nmol/mLのデオキシコール酸の配合量において、フィルター後の吸光度はフィルター前よりも低下しており、pH感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化を示唆する結果であった。したがって、前記のデオキシコール酸の配合量において、pH感受性担体の凝集体とタンパク質が一体化しているものと考えられる。中でも、吸光度変化に基づくOVAの一体化効率は、400nmol/mLでは約42%、1600nmol/mLでは約60%、6400nmol/mLでは約64%であり、デオキシコール酸の配合量が多いほど、タンパク質の一体化効率に優れることが示唆された。なお、図8に対応するデータを下記表7に示す。
<実験7.複合体の膜破壊機能促進効果>
pH感受性担体の凝集体にタンパク質が担持された複合体の膜破壊機能促進効果を評価した。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0~10mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して3.5に調整した。静置する時間は1時間とした。
pH感受性担体の凝集体にタンパク質が担持された複合体の膜破壊機能促進効果を評価した。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0~10mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を使用して3.5に調整した。静置する時間は1時間とした。
上記の方法にて溶出性試験を行ったところ、一体化するOVAの量が増大するに従い、pH5.0における溶出率は僅かに低下する傾向を示した。しかしながら、いずれのOVA量においても、複合体は膜破壊機能促進効果の定義を満たした(図9A)。pH感受性担体の凝集体にタンパク質が担持されてなる複合体は、膜破壊機能促進効果を有していることが明らかとなった。
また、水酸化アルミニウム存在下における、複合体の膜破壊機能促進効果を調べた。タンパク質はOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して1.0~3.5に調整した。静置する時間は1時間とした。なお、pH感受性担体に水酸化アルミニウムを添加した後、タンパク質を添加し、最後にpHを調製した。水酸化アルミニウムの最終濃度は、1.0mg/mLとした。すなわち、アルミニウム元素の添加量としては、DLPC100molに対して1280molであった。
上記の方法にて溶出性試験を行ったところ、水酸化アルミニウム(Alum)存在下において、いずれのpHに調整した複合体も、通常のpH感受性担体と同様の溶出率を示した(図9B)。複合体の膜破壊機能促進効果は、水酸化アルミニウムの影響を受けないことが明らかとなった。なお、図9Aに対応するデータを下記表8に、図9Bに対応するデータを下記表9に、それぞれ示す。
<実験8.タンパク質の一体化に及ぼすpH感受性担体の両親媒性物質およびpH感受性化合物の影響>
まず、種々の両親媒性物質を用いて形成されたpH感受性担体を用いて、タンパク質との一体化を試みた。タンパク質はOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolの両親媒性物質と1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。
まず、種々の両親媒性物質を用いて形成されたpH感受性担体を用いて、タンパク質との一体化を試みた。タンパク質はOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolの両親媒性物質と1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。
OVAのみの場合において、フィルター処理前後で吸光度はほとんど変化しなかった。一方、DDPC、Tween20、Tween80、SPAN80、PEG10ヒマシ油を用いたpH感受性担体の場合においては、フィルター前に比べて、フィルター後の吸光度は非常に小さな値を示した(図10A)。この結果から、種々の両親媒性物質を用いて形成されたpH感受性担体の凝集体とOVAとの一体化が示唆された。両親媒性物質の種類は、pH感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化に大きな影響を及ぼさないものと考えられる。
続いて、種々のpH感受性化合物を用いて形成されたpH感受性担体を用いて、タンパク質との一体化を調べた。タンパク質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolの種々のpH感受性化合物を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。
OVAのみの場合およびデオキシコール酸のみの場合は、フィルターを通す前後にて吸光度の変化がほとんど生じなかった。一方、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリチルリチン酸、グリコデオキシコール酸を用いたpH感受性担体の場合、フィルター前の吸光度に比べて、フィルター後の吸光度は非常に小さな値を示した(図10B)。この結果から、種々のpH感受性化合物を用いて形成されたpH感受性担体の凝集体とOVAとの一体化が示唆された。pH感受性化合物の種類は、pH感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化に大きな影響を及ぼさないものと考えられる。なお、図10Aに対応するデータを下記表10に、図10Bに対応するデータを下記表11に、それぞれ示す。
<実験9.pH感受性担体の凝集体と核酸との一体化>
タンパク質以外の生理活性物質に関しても、pH感受性担体の凝集体と一体化することが期待される。核酸は、遺伝子治療やDNAワクチンを実現するものとして注目されており、サイトゾルへの送達を必要とする医薬品候補の1つである。核酸とpH感受性担体の凝集体とを一体化することで、効率の良いエンドソームエスケープとサイトゾルへの送達が行われ、前記の実現に資するものと考えられる。そこで、pH感受性担体の凝集体と核酸との一体化について検討した。
タンパク質以外の生理活性物質に関しても、pH感受性担体の凝集体と一体化することが期待される。核酸は、遺伝子治療やDNAワクチンを実現するものとして注目されており、サイトゾルへの送達を必要とする医薬品候補の1つである。核酸とpH感受性担体の凝集体とを一体化することで、効率の良いエンドソームエスケープとサイトゾルへの送達が行われ、前記の実現に資するものと考えられる。そこで、pH感受性担体の凝集体と核酸との一体化について検討した。
核酸はsalmon由来のデオキシリボ核酸(DNA)を使用し、濃度は0.1mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。混合液を0.22μmフィルターに通し、フィルター処理前後の液について波長260nmにおける吸光度を測定することで、デオキシリボ核酸を検出した。静置する時間は2時間とした。
中性のpHでpH感受性担体とデオキシリボ核酸を混合した場合、吸光度は2.0となり、デオキシリボ核酸単独の場合と同様の吸光度を示した(図11)。中性のpHにおいて、デオキシリボ核酸とpH感受性担体は一体化していないことが示唆された。一方、pHを低下させてpH感受性担体の凝集体とした場合、フィルター後の吸光度は0.92となり、デオキシリボ核酸単独の場合の約1/2の値となった(図11)。添加した約1/2量のデオキシリボ核酸がpH感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかになった(図11)。すなわち、吸光度変化に基づくデオキシリボ核酸の一体化効率は、約54%であった。なお、図11に対応するデータを下記表12に示す。
<実験10.pH感受性担体の凝集体とペプチドの一体化>
続いて、pH感受性担体の凝集体とペプチドとの一体化を検討した。ペプチドは、がんワクチンの抗原や、細胞内のシグナル伝達阻害剤など、有力な医薬品の候補として盛んに研究されている。これらは、共にサイトゾルへの送達を必要とすることから、pH感受性担体、およびpH感受性担体の凝集体との相乗効果が期待される。
続いて、pH感受性担体の凝集体とペプチドとの一体化を検討した。ペプチドは、がんワクチンの抗原や、細胞内のシグナル伝達阻害剤など、有力な医薬品の候補として盛んに研究されている。これらは、共にサイトゾルへの送達を必要とすることから、pH感受性担体、およびpH感受性担体の凝集体との相乗効果が期待される。
ペプチドはSIINFEKLおよびRGPESRLLを使用し、ペプチドの濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は2時間とした。混合液を0.22μmフィルターに通し、フィルター前後の液をペプチド定量キット(Lowryキット、ナカライテスク社製)を用いて呈色し、波長750nmで吸光度測定を行った。
pH感受性担体とSIINFEKLペプチドの混合液において、中性のpHでのペプチド由来の吸光度(Lowrry法による呈色)は0.44であり、ペプチド単独と同様の吸光度を示した。pH感受性担体とペプチドは一体化していないことが示唆された(図12A)。一方、pHを低下させてpH感受性担体の凝集体とした場合、フィルター後の溶液の吸光度は0.32となり、約1/4量のペプチドがpH感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかとなった(図12A)。すなわち、吸光度変化に基づくSIINFEKLペプチドの一体化効率は、約27%であった。また、RGPESRLLペプチドの場合、前記の値は1.40と0.82であり、約1/3量のペプチドがpH感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかとなった(図12B)。すなわち、吸光度変化に基づくRGPESRLLペプチドの一体化効率は、約41%であった。
いずれの配列を有するペプチドにおいても、pH感受性担体の凝集体と一体化できることが示された。なお、図12Aに対応するデータを下記表13に、図12Bに対応するデータを下記表14に、それぞれ示す。
<実験11.中性のpHにおけるpH感受性担体の凝集体の状態、および一体化した生理活性物質の状態>
血液や血漿のpHは中性である。そのため、pH感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性の環境におけるpH感受性担体の凝集体の状態、および一体化した生理活性物質の状態を調べる必要があると考えた。
血液や血漿のpHは中性である。そのため、pH感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性の環境におけるpH感受性担体の凝集体の状態、および一体化した生理活性物質の状態を調べる必要があると考えた。
生理活性物質としてはOVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pHは、1Nの硫酸を用いて1に調製した(図13C)。あるいは0.1Nの塩酸を使用して2.6に調整した(図13A、B、D)。中性のpHとする時は0.1Nの水酸化ナトリウムを用いた。静置する時間は2時間とした。
pH感受性担体の凝集体の溶液を中性のpHとした後、1日静置したところ、pH感受性担体の凝集体の沈殿は消失した(図13A、B)。得られた溶液を溶出性試験にて評価したところ、操作を加えていない通常のpH感受性担体(図中normal(pH7.4)と表記)と同様の溶出率を示し、膜破壊機能促進効果を有していることが確認された(図13C pH7.4→1.15→7.4)。なお、中性以上のpHとした場合においても、同様の結果が得られた(図13C)。pH感受性担体の凝集体は、中性以上のpHに移すことにより、沈殿を形成する凝集が解離し、pH感受性担体の粒子に戻ることが示唆された。なお、図13Cに対応するデータを下記表15に示す。
続いて、一体化した生理活性物質の状態を調べた。OVAを一体化させたpH感受性担体の凝集体の溶液を中性のpHとした後、1日静置し、沈殿を消失させた。実験2の2.と同様にして、得られた溶液をフィルターに通し、溶液中に遊離しているOVAの量を評価した。その結果、得られた吸光度は0.61となり(図13D pH7.3とした後filter)、中性のpHにしなかった場合の吸光度(0.10)と比べて大きな値を示した(図13D pH2.6filter)。また、本吸光度の値は、フィルターを通す前の吸光度(0.57)と一致しており(図13D pH2.6filterなし)、一体化したOVAが全て解離した状態であることが示唆された。pH感受性担体の凝集体を中性のpHに移すことで、一体化した生理活性物質が解離し、pH感受性担体の凝集体から放出されたものと考えられる。
<実験12.pH感受性担体の凝集体の状態を維持する時間>
中性のpHにおいて、一体化した生理活性物質は、pH感受性担体の凝集体から放出されることが明らかとなった。血液や血漿は中性のpHであることから、生理活性物質を一体化したpH感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性のpHとなることでpH感受性担体の凝集体が、直ちに生理活性物質を放出し、一体化の効果を喪失することが危惧された。そこで、中性のpHにおけるpH感受性担体の凝集体の維持時間を調べた。
中性のpHにおいて、一体化した生理活性物質は、pH感受性担体の凝集体から放出されることが明らかとなった。血液や血漿は中性のpHであることから、生理活性物質を一体化したpH感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性のpHとなることでpH感受性担体の凝集体が、直ちに生理活性物質を放出し、一体化の効果を喪失することが危惧された。そこで、中性のpHにおけるpH感受性担体の凝集体の維持時間を調べた。
OVAを使用し、濃度は0.8mg/mLとした。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。最終的な溶液の全量は、2mLとした。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、0.1Nの塩酸を使用して2.6に調整し、中性のpHに戻す時は0.1Nの水酸化ナトリウムを用いた。また、実験2の2.と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。
中性のpHにおいて、pH感受性担体の凝集体は時間と共に消失する傾向を示した(図14A)。具体的には、0minから3hourでは沈殿を確認できたが、5hourでは、沈殿を確認できなかった。pH感受性担体の凝集体は、中性のpHにおいて3時間程度の間、沈殿の状態を維持できることが明らかとなった。また、吸光度変化の結果においても、0minから3hourまではタンパク質を一体化したものが残存していることを確認できた(図14B)。
<実験13.pH感受性担体の凝集体の体内動態>
ローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体、またはローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体の凝集体をC57BL/6マウスに皮内注射し、生体内における局所動態を比較した。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。
ローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体、またはローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体の凝集体をC57BL/6マウスに皮内注射し、生体内における局所動態を比較した。pH感受性担体の分散液は、1mL中に1000nmolのDLPCと1600nmolのデオキシコール酸を含むものを使用した。pH感受性担体の凝集体を調製する時のpHは、1Nの硫酸を使用して4に調整した。静置する時間は1時間とした。
図15Aは、ローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体、およびローダミンPEで蛍光修飾したpH感受性担体の凝集体の外観である。皮内注射した後、約5分後の局所動態を評価したところ、pH感受性担体は皮内注射した箇所を中心に広がった分布を示した(図15B、C)。一方、pH感受性担体の凝集体は線状の分布を示した(図15D、E)。再現のために、pH感受性担体の凝集体を複数箇所に皮内注射したところ、いずれ投与においても、線状の局所動態となり、再現が確認された(図15F)。pH感受性担体と、pH感受性担体の凝集体とでは、異なる局所動態を示すことが確認された。pH感受性担体の凝集体は、非常に大きな粒子であることから、pH感受性担体と異なる局所動態を示したものと考えられる。なお、pH感受性担体の凝集体は投与の前にピペッティングによって懸濁液とした。
以上より、pH感受性担体とpH感受性担体の凝集体とで、異なる局所動態を示したことから、pH感受性担体の凝集体は、生体内にて解離することなく存在し、生体に使用可能であることが明らかとなった。
本出願は、2017年5月11日に出願された日本特許出願番号2017-094952号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
Claims (6)
- 酸性下で凝集してなるpH感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体。
- 前記酸性下は、pH6.4未満である、請求項1に記載の複合体。
- 前記pH感受性担体は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種のpH感受性化合物と、炭素数10~12のホスファチジルコリン、炭素数12~18のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数16~18のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα-トコフェロールからなる群より選択される少なくとも1種の両親媒性物質と、を含む、請求項1または2に記載の複合体。
- 前記生理活性物質は、タンパク質、ペプチドまたは核酸である、請求項1~3のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の複合体およびアルミニウム化合物を含む、pH感受性組成物。
- pH感受性化合物および両親媒性物質を含むpH感受性担体を調製し、前記pH感受性担体と生理活性物質とを混合して混合液を調製し、前記混合液のpHを6.4未満に調整することを有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の複合体の製造方法。
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