WO2016152946A1 - イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents

イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体 Download PDF

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WO2016152946A1
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immunoglobulin
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潤一 安岡
敬 市居
中村　聡
知範 塩谷
佳織 板谷
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Jsr株式会社
Ｊｓｒライフサイエンス株式会社
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin-binding protein, an affinity carrier using the same, a method for isolating immunoglobulins using the affinity carrier, and a method for producing an antibody drug.
  • Affinity chromatography is chromatography using a column packed with a ligand-immobilized carrier in which a substance (ligand) that specifically binds to a substance intended for separation or purification is immobilized on an insoluble carrier.
  • Affinity chromatography is used, for example, for separation and purification of biological materials such as proteins and nucleic acids (Patent Document 1).
  • the carrier for affinity chromatography for example, cross-linked particles of sugar chains typified by agarose gel and particles mainly composed of a synthetic polymer are used.
  • a ligand which is a substance that specifically binds to the target substance, on the carrier.
  • Staphylococcus aureus protein A (SpA) and variants thereof are known as representative affinity chromatography ligands having a specific binding ability to immunoglobulin. Because SpA has the ability to bind to the Fc region of an immunoglobulin without significantly affecting the high selectivity of the immunoglobulin for the antigen, it can efficiently capture and purify immunoglobulins and Fc region-containing proteins. Can do.
  • Natural type SpA includes five domains of E, D, A, B and C in order from the N-terminus as domains having binding ability to immunoglobulin. These domains and the Z domain, which is a modified domain of the B domain, have been used as affinity chromatography ligands. In addition, for the purpose of enhancing immunoglobulin binding ability, it is also common to use a ligand in which two or more of the above domains are linked.
  • Each of the above-mentioned SpA immunoglobulin binding domains contains three ⁇ -helix structures, and of these, two ⁇ -helix sites on the N-terminal side are known to contribute to the binding to immunoglobulins. ing. Furthermore, in the B and C domains among the above domains, it has been reported that a turn structure is formed by Asn at the N-terminal 3rd position and Lys at the 4th position (Non-patent Document 1). Therefore, in a ligand in which a plurality of Z domains, which are modified domains of B domain, C domain, or B domain, are linked, due to the above-mentioned turn structure, the domains are linked in a bent configuration.
  • Affinity chromatography carriers are usually used repeatedly in bioseparation applications. For this reason, a cleaning step, known as cleaning in place (CIP), is usually performed during repeated use to remove the contaminants and return the carrier to its original state.
  • CIP cleaning in place
  • an alkaline solution such as sodium hydroxide is used.
  • an alkaline condition is severe for a carrier for affinity chromatography using a protein as a ligand, and the ability to bind to a target molecule may be lost when the ligand is deactivated or cleaved.
  • deamidation of Asn and Gln residues is widely known as the main factor.
  • Asn is highly sensitive to alkaline conditions, and its deamidation is structure-dependent and has been reported to occur frequently at amino acid sequence sites represented by Asn-Gly or Asn-Ser (Non-patents). Reference 2).
  • an affinity chromatography carrier capable of maintaining its immunoglobulin binding ability even after CIP using an alkaline solution is performed a plurality of times is provided.
  • Patent Document 2 it is a ligand of a carrier for affinity chromatography containing B domain, C domain or Z domain of SpA, and at least three N-terminal side starting from position 1 or 2 of at least one domain Ligands are provided that contain consecutive amino acid deletions.
  • Patent Document 3 also provides a ligand for an affinity chromatography carrier containing the SpA C domain from which the consecutive amino acids from the 3rd to 6th positions on the N-terminal side are deleted.
  • Patent Document 4 provides a ligand for an affinity chromatography carrier in which the Asn residue in the Z domain or B domain of SpA is modified.
  • the above-described prior art is mainly aimed at increasing the alkali resistance of the carrier, and does not mention increasing the immunoglobulin binding ability of the carrier.
  • JP-A-6-281638 JP 2012-254981 A Japanese Patent No. 5345539 Japanese translation of PCT publication No. 2002-527107
  • One form of the present invention is to provide a novel ligand for an affinity carrier with enhanced binding ability to immunoglobulin.
  • Another form of the present invention is to provide an affinity carrier capable of maintaining the above-described high immunoglobulin binding ability even when CIP using an alkaline solution is repeated.
  • the present invention provides an immunoglobulin binding protein.
  • the immunoglobulin binding protein comprises at least one modified immunoglobulin binding domain, wherein the modified immunoglobulin binding domain is a Staphylococcus aureus protein A (SpA) B domain, Z domain, C domain, and At least one amino acid between positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence of the B domain, Z domain or C domain with respect to the amino acid sequence of an immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of A polypeptide consisting of an amino acid sequence into which residues have been inserted.
  • SpA Staphylococcus aureus protein A
  • the immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of the B domain, Z domain, C domain, and variants thereof is any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the at least one modified immunoglobulin binding domain is selected from the group consisting of: Positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with respect to the immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 70% identity thereto A polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue inserted between them; Positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with respect to the immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 70% identity thereto A polypeptide comprising an amino acid sequence having at least one amino acid residue inserted between; and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or an immunoglobulin binding domain comprising an amino acid sequence having at least 70% identity thereto
  • the at least one amino acid residue is Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and It is at least one selected from the group consisting of Tyr.
  • the immunoglobulin binding domain comprising an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 is a Val1 / Ala29 variant. It is.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises 2 to 12 of the modified immunoglobulin binding domains.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the mutant immunoglobulin binding protein.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a recombinant containing the above vector.
  • the present invention provides a method for producing an immunoglobulin binding protein, which comprises expressing the polynucleotide by a cell-free protein synthesis system or expressing the polynucleotide in the recombinant.
  • the present invention provides a method for producing an immunoglobulin binding protein.
  • the method comprises the step of comparing the B domain with an amino acid sequence of an immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of B domain, Z domain, C domain, and variants thereof of Staphylococcus aureus protein A, It is a method comprising inserting at least one amino acid residue between positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence of the Z domain or C domain.
  • the present invention provides a method for improving the immunoglobulin binding ability of an immunoglobulin binding protein.
  • the method comprises the step of comparing the B domain with an amino acid sequence of an immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of B domain, Z domain, C domain, and variants thereof of Staphylococcus aureus protein A, It is a method comprising inserting at least one amino acid residue between positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence of the Z domain or C domain.
  • the domain is an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, or an amino acid sequence having at least 70% identity with these.
  • the method for producing the immunoglobulin binding protein of the present invention and the method for improving the immunoglobulin binding ability include the following: Positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with respect to the immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 70% identity thereto Inserting at least one amino acid residue between; Positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with respect to the immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 70% identity thereto At least one amino acid residue between; or an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having at least 70% identity thereto, SEQ ID NO: 3 Inserting at least one amino acid residue between positions corresponding to positions 3 and 4 of the amino acid sequence represented by including.
  • the at least one amino acid residue is Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, It is at least one selected from the group consisting of Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and Tyr.
  • the immunoglobulin binding domain consisting of is Val1 / Ala29 mutant.
  • the method for producing an immunoglobulin binding protein and the method for improving immunoglobulin binding ability of the present invention comprise linking 2 to 12 immunoglobulin binding domains into which at least one amino acid residue has been inserted. In addition.
  • the present invention provides an affinity carrier in which the immunoglobulin binding protein is immobilized on a base material that is insoluble in water.
  • the present invention provides a method for isolating immunoglobulin using the above affinity carrier.
  • the present invention provides a method for producing an antibody drug using the above affinity carrier.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is useful as a ligand for a carrier for affinity chromatography.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein is immobilized on the carrier by chemically bonding a reactive side chain such as an amino group, thiol group, or carboxyl group contained in the protein to a functional group present on the surface of the insoluble carrier.
  • a reactive side chain such as an amino group, thiol group, or carboxyl group contained in the protein to a functional group present on the surface of the insoluble carrier.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein has a high immunoglobulin-binding ability and can maintain a high immunoglobulin-binding ability even after repeated CIP using an alkaline solution.
  • the affinity chromatography carrier using the mutated immunoglobulin binding protein as a ligand can purify more immunoglobulin with a fixed amount of carrier when used for purification of immunoglobulin, for example, and can be used repeatedly. Even so, the dynamic binding capacity of the immunoglobulin is unlikely to decrease, and as a result, the immunoglobulin purification process can be carried out at a low cost.
  • sequence identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435-41, 1985). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) is set to 2. Is calculated by the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development).
  • “at least 70% identity” with respect to amino acid sequences and nucleotide sequences refers to 70% or more identity, preferably 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, even more preferably Means 90% or more identity, even more preferably 95% or more identity, still more preferably 98% or more identity, still more preferably 99% or more identity.
  • the “corresponding position” on the amino acid sequence and the nucleotide sequence means that the target sequence and the reference sequence (for example, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3) are conserved in each amino acid sequence or nucleotide sequence. It can be determined by aligning amino acid residues or nucleotides to give maximum homology. The alignment can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-mentioned Lippmann-Person method or the like, but the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-). 4680) with default settings.
  • Clustal W2 or Clustal omega which is a revised version of Clustal W.
  • Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are, for example, European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and Japanese DNA data operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the bank (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]) website.
  • immunoglobulin binding protein refers to a protein having the ability to bind to immunoglobulin.
  • immunoglobulin binding domain refers to a domain involved in immunoglobulin binding, which is included in immunoglobulin binding proteins. Examples thereof include the A domain of Staphylococcus aureus protein A (SpA). , B domain, C domain, D domain, E domain, and Z domain which is a modified domain of B domain.
  • SpA Staphylococcus aureus protein A
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention comprises at least one modified immunoglobulin binding domain derived from the B domain, C domain or Z domain of SpA.
  • the modified immunoglobulin binding domain has at least one between an Asn residue at a position corresponding to position 3 and a Lys residue at a position corresponding to position 4 of the amino acid sequence of the B domain, Z domain, or C domain.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention can be used as a ligand for an affinity carrier.
  • Examples of the parent domain of the modified immunoglobulin-binding domain included in the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention include B domain, Z domain, C domain, which are SpA immunoglobulin-binding domains, and variants thereof. .
  • B domain, Z domain, and C domain are preferable.
  • the B domain, Z domain, and C domain of SpA are polypeptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively. These domains have an Asn residue at position 3 and a Lys residue at position 4 in the amino acid sequence, and have a turn structure composed of these amino acid residues.
  • the B domain, Z domain, or C domain variant that can be used as the parent domain comprises an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3, and an immunological sequence.
  • a polypeptide that has a globulin-binding ability and functions as an immunoglobulin-binding domain is included.
  • the variant has a continuous Asn residue and a Lys residue at positions corresponding to positions 3 to 4 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 in the amino acid sequence; It has a turn structure composed of these amino acid residues.
  • Examples of the B domain, Z domain, or C domain mutant include the Val1 / Ala29 mutant of the immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • the above mutants should be prepared by modifying the SpA B domain, Z domain or C domain by adding, deleting, substituting or deleting amino acid residues, or chemically modifying amino acid residues. Can do.
  • means for adding, deleting, substituting or deleting amino acid residues include known means such as site-specific mutation for the polynucleotide encoding the domain.
  • the modified immunoglobulin binding domain contained in the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention comprises an Asn residue at a position corresponding to position 3 of the amino acid sequence of the B, Z or C domain with respect to the amino acid sequence of the parent domain. It can be obtained by inserting at least one amino acid residue between the Lys residue at the position corresponding to position 4.
  • the modified immunoglobulin binding domain is at least between the Asn residue at position 3 and the Lys residue at position 4 with respect to the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • the modified immunoglobulin binding domain has at least 70% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3, and 3 to 3 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3.
  • At least one amino acid residue between the Asn residue and the Lys residue with respect to the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain variant having an Asn residue and a Lys residue that are continuous at the position corresponding to the 4-position Is a polypeptide consisting of an amino acid sequence inserted.
  • These polypeptides have immunoglobulin binding ability and function as an immunoglobulin binding domain.
  • the at least one amino acid residue to be inserted into the parent domain is not particularly limited.
  • Phe, Leu, Ile and Pro are more preferred, followed by His, Tyr and Trp, Arg, Gln, Glu, Asp, Val and Met are preferred, followed by Thr and Ala.
  • the amino acid residue inserted into the parent domain is preferably at least selected from the group consisting of Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and Tyr. 1, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 2, more preferably at least one selected from the group consisting of His, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and Tyr, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 2, and more preferably at least one selected from the group consisting of Phe, Leu, Ile and Pro, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 2 It is a piece.
  • amino acid residue is preferable because the turn structure composed of the Asn residue at the 3rd position and the Lys residue at the 4th position is changed, and the alkali sensitivity expressed by Asn-Gly and Asn-Ser is high. This is presumably because the amino acid sequence can be avoided.
  • the number of amino acid residues to be inserted is 2 or more, they may be all different types of amino acid residues or may include a plurality of the same type of amino acid residues. More preferably, the amino acid residue inserted into the B, Z or C domain, or a variant thereof is any one selected from Phe, Leu, Ile and Pro.
  • the means for inserting an amino acid residue into the parent domain includes insertion of a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be inserted into the nucleotide sequence encoding the parent domain.
  • Specific methods for inserting nucleotide sequences include site-specific mutation, homologous recombination method, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 1989, 77: 61-68), and the like. These detailed procedures are well known to those skilled in the art.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention may contain at least one modified immunoglobulin binding domain in which an amino acid residue is inserted between Asn and Lys described above.
  • the modified immunoglobulin binding protein It contains two or more domains, more preferably 2 to 12, more preferably 3 to 8. Individual domains are linked to each other. More specifically, the C terminus of one domain and the N terminus of the adjacent domain are joined or vice versa.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has a region in which a plurality of modified immunoglobulin-binding domains are arranged in a straight line, and therefore can prevent steric hindrance and inhibition of immunoglobulin binding due to the bent arrangement of the domains. . Therefore, the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention has a high immunoglobulin binding ability.
  • a variant immunoglobulin binding protein of the invention may comprise an SpA immunoglobulin binding domain (eg, A domain, D domain or E domain) other than the B, Z and C domains or a variant thereof.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention is a B, Z or C domain in which an amino acid residue is not inserted between the above-mentioned position 3 Asn and position 4 Lys, or a variant thereof. But preferably does not include these domains or variants.
  • all of the immunoglobulin binding domains included in the mutated immunoglobulin binding protein of the present invention are B, Z or C domains in which an amino acid residue is inserted between Asn and Lys described above, or their A modified immunoglobulin binding domain derived from a mutant.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has an Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the B domain represented by SEQ ID NO: 1.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has Phe, Leu, Ile and Pro between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the B domain represented by SEQ ID NO: 1.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the B domain represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 One selected from the group consisting of Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and Tyr between Asn-Lys at the position corresponding to the position It includes a polypeptide that functions as an immunoglobulin binding domain, consisting of an amino acid sequence into which 2, 3, or 4 amino acid residues are inserted.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the B domain represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the B domain represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid having a Val1 / Ala29 mutation relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Is an array.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has an Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the Z domain represented by SEQ ID NO: 2, Poly consisting of an amino acid sequence inserted with 1, 2, 3 or 4 amino acid residues selected from the group consisting of His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp and Tyr. Contains peptides.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has a Phe, Leu, Ile and Pro between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the Z domain represented by SEQ ID NO: 2.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 2 in an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the Z domain represented by SEQ ID NO: 2.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 2 in an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the Z domain represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the Z domain represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid having a Val1 / Ala29 mutation relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Is an array.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has an Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the C domain represented by SEQ ID NO: 3.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention has a Phe, Leu, Ile, and Pro between the 3rd position Asn and the 4th position Lys in the amino acid sequence of the C domain represented by SEQ ID NO: 3.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 3 in an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the C domain represented by SEQ ID NO: 3.
  • the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention is 3-4 of SEQ ID NO: 3 in an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the C domain represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the C domain represented by SEQ ID NO: 3 is an amino acid having a Val1 / Ala29 mutation relative to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Is an array.
  • the polypeptide contained in the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention preferably has a state in which Asn-Lys at a position corresponding to positions 3 to 4 of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 is conserved And having an amino acid sequence in which amino acids are inserted between those residues. More preferably, it has an amino acid sequence in which an amino acid is inserted between Asn and Lys in a state where Asp-Asn-Lys or Gln-Asn-Lys corresponding to positions 2 to 4 is preserved.
  • Ala-Asp-Asn-Lys, Gln-Gln-Asn-Lys, or Val-Asp-Asn-Lys at a position corresponding to positions 1 to 4 is preserved between Asn and Lys.
  • the polypeptide contained in the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention has a Val residue at a position corresponding to position 1 of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and / or And an Ala residue at a position corresponding to position 29 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention comprises 2 to 12, more preferably 3 to 8, the above-mentioned polypeptide.
  • Each of the polypeptides may be the same or different.
  • each of the polypeptides is linked at its N-terminus to the C-terminus of an adjacent polypeptide.
  • Each polypeptide may be linked directly to an adjacent polypeptide or may be linked via a peptide having 1 to 10 amino acid residues. Examples of the peptide include a peptide represented by EF.
  • a preferred example of the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is a polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NOs: 4 to 20.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 19 are Asn and 4 in the 3rd position relative to the amino acid sequence in which the 1st position Ala of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with Val and the 29th position Gly is replaced with Ala.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein 1st position Ala is replaced with Val and 29th position Gly is replaced with Ala. It is an amino acid sequence in which four variants of the Z domain having Ile inserted between them are linked.
  • mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention has at least 70% identity with the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 4 to 18, and from position 4 of SEQ ID NOs: 4 to 18 Asn-X-Lys (X is Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr at positions corresponding to positions 6, 63 to 65, 122 to 124, and 181 to 183, respectively. , Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp, or Tyr), and a polypeptide having an immunoglobulin binding ability.
  • these polypeptides have Val at the position corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 3 and Ala at the position corresponding to position 29.
  • mutant immunoglobulin binding protein of the present invention has at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and has 4 to 7 and 64 to 67 in SEQ ID NO: 19.
  • Polypeptides having an immunoglobulin binding ability each consisting of an amino acid sequence in which Asn-Ile-Thr-Lys is arranged at positions corresponding to positions 124, 127 to 184 and 184 to 187, respectively.
  • these polypeptides have Val at the position corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 3 and Ala at the position corresponding to position 29.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention has at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and positions 4 to 6, 63 to 65 of SEQ ID NO: 20.
  • Polypeptides having an immunoglobulin binding ability each consisting of an amino acid sequence in which Asn-Ile-Lys is arranged at positions corresponding to position Nos. 122 to 124 and 181 to 183, respectively.
  • these polypeptides have Val at the position corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 2 and Ala at the position corresponding to position 29.
  • the present invention also provides a polynucleotide (DNA, etc.) encoding the above-described mutant immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the polynucleotide according to one embodiment of the present invention encodes the above-described mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention or an equivalent functional variant thereof.
  • “functional variant” of an immunoglobulin binding protein is an immunoglobulin modified by partial addition, deletion, substitution, chemical modification of amino acid residues, etc.
  • a binding protein that retains at least 70% identity with the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein before modification, and maintains a structure in which at least one amino acid residue is inserted between Asn-Lys described above, And in the immunoglobulin binding activity, it means what can be treated as equivalent to the immunoglobulin binding protein before modification.
  • the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention includes a protein having one or more, preferably 2 to 12, more preferably 3 to 8, immunoglobulin binding domains.
  • An expression plasmid comprising a polynucleotide encoding such a protein and a vector containing the polynucleotide can be prepared by a known method.
  • the polynucleotide encoding the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention encodes the polypeptide represented by any of SEQ ID NOs: 1-20.
  • the polynucleotide encoding the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention encodes an isofunctional variant of the immunoglobulin binding protein represented by any of SEQ ID NOs: 1-20.
  • the polynucleotide encoding the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 23 to 39.
  • the polynucleotide encoding the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention consists of a nucleotide sequence having at least 70% identity with the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 23 to 39, and A polynucleotide encoding an isofunctional variant of an immunoglobulin binding protein represented by any of SEQ ID NOs: 4 to 20.
  • mutant immunoglobulin binding protein As a standard technique for producing the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention from the above-mentioned polynucleotide or vector, for example, Frederick M. et al. Ausbel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Sambrook et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) and other known gene recombination techniques can be used. That is, an expression vector containing a polynucleotide (DNA or the like) encoding the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is transformed into a host such as Escherichia coli, and the resulting recombinant is cultured in an appropriate liquid medium.
  • a polynucleotide DNA or the like
  • any known vector that can be replicated in a host cell can be used.
  • the host for transformation is not particularly limited, and a known host used for expressing recombinant proteins such as bacteria such as E. coli, fungi, insect cells, and mammalian cells can be used.
  • any method known in the art may be used depending on each host.
  • mutant immunoglobulin binding protein of the present invention may be expressed using a cell-free protein synthesis system.
  • Carrier The present invention also provides an affinity carrier in which the mutant immunoglobulin-binding protein of the present invention is immobilized on a base material (carrier) that is insoluble in water.
  • the carrier shape can be in the form of particles, which can be porous or non-porous.
  • the particulate carrier can be used as a packed bed or in a suspended form. Suspension forms include what are known as expanded beds and pure suspensions in which the particles can move freely. For monoliths, packed beds, and fluidized beds, the separation procedure generally follows conventional chromatographic methods with a concentration gradient. For pure suspensions, a batch method is used.
  • the carrier is a filler.
  • the carrier may be in the form of a chip, capillary or filter.
  • the magnetic particles are not particularly limited as long as they can be easily magnetized by magnetic induction.
  • iron trioxide Fe 3 O 4
  • iron trioxide ⁇ -Fe 2 O 3
  • various ferrites Magnetic fine particles composed of metals such as iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, and alloys such as cobalt, nickel, manganese, or hydrophobic polymers and hydrophilic polymers containing these magnetic materials inside Can be mentioned.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of a mother particle containing superparamagnetic fine particles described in JP-A-2008-32411, and at least on the surface of the first polymer layer.
  • a second polymer layer having a glycidyl group is formed, and by chemically modifying the glycidyl group, a polar group containing at least one kind of atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom Introduced magnetic particles.
  • the affinity carrier of the present invention is an affinity chromatography carrier.
  • the affinity carrier according to an embodiment of the present invention is preferably 10 to 500 ⁇ m, more preferably 20 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 100 ⁇ m, still more preferably 30 to 80 ⁇ m, and the carrier is a polysaccharide when the carrier is a synthetic polymer.
  • the particle diameter is more preferably 50 to 200 ⁇ m, still more preferably 60 to 150 ⁇ m.
  • the particle size is less than 10 ⁇ m, the column pressure becomes high under a high flow rate, which is not practical.
  • the particle size exceeds 500 ⁇ m, the amount of binding of the immunoglobulin to the affinity carrier (binding capacity) may be inferior.
  • the “particle size” in this specification is a volume average particle size obtained by a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus.
  • the affinity carrier according to an embodiment of the present invention is preferably porous and has a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, more preferably 80 to 130 m 2 / g.
  • the specific surface area is less than 50 m 2 / g, the binding capacity may be inferior.
  • it exceeds 150 m 2 / g the strength of the carrier is inferior and the carrier is destroyed under a high flow rate. Column pressure may increase.
  • the “specific surface area” in the present specification is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter by the dry weight of the particles.
  • the affinity carrier according to an embodiment of the present invention is preferably 100 to 1400 nm, when the carrier is a synthetic polymer, more preferably 100 to 400 nm, still more preferably 200 to 300 nm, and when the carrier is a polysaccharide, more preferably 500 It has a volume average pore diameter of ⁇ 1400 nm, more preferably 800 to 1200 nm.
  • the volume average pore diameter is less than 100 nm, the decrease in the binding capacity under a high flow rate may become remarkable, while when it exceeds 1400 nm, the binding capacity may decrease regardless of the flow rate.
  • the “volume average pore diameter” is a volume average pore diameter of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter.
  • the carrier satisfies the particle size, specific surface area, and pore size distribution in the above-mentioned range, the balance between the gaps between the particles serving as the flow path of the solution to be purified and the relatively large pore size in the particles and the binding surface area of the molecule to be purified Is optimized and the binding capacity under high flow rates is maintained at a high level.
  • the material of the carrier is, for example, a polymer having a hydrophilic surface, such as a hydroxy group (—OH), a carboxy group (—COOH), aminocarbonyl on the outer surface (and also on the inner surface, if present)
  • the polymer can be a synthetic polymer such as polymethacrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and the like, preferably copolymerized with a polyfunctional monomer such as polyfunctional (meth) acrylate, divinylbenzene, etc.
  • a synthetic polymer such as a coalescence.
  • Such synthetic polymers are easily produced by known methods (see, for example, the method described in J. MATER. CHEM 1991, 1 (3), 371-374).
  • a commercial product such as Toyopearl (Tosoh Corporation) is also used.
  • the polymer in other embodiments is a polysaccharide such as dextran, starch, cellulose, pullulan, agarose and the like.
  • Such polysaccharides are easily produced by known methods (for example, see the method described in Japanese Patent No. 4081143).
  • commercially available products such as Sepharose (GE Healthcare Bioscience) are also used.
  • inorganic carriers such as silica and zirconium oxide may be used.
  • porous particles used as the carrier include, for example, 10 to 50% by mass of a crosslinkable vinyl monomer and 3 to 90% by mass of an epoxy group.
  • porous organic polymer particles containing a vinyl monomer having a particle diameter of 20 to 80 ⁇ m, a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, and a volume average pore diameter of 100 to 400 nm.
  • the infiltration volume (pore volume) of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm when the affinity carrier according to one embodiment of the present invention is measured with a mercury porosimeter is preferably 1.3 to 7.0 mL / g.
  • the carrier is a synthetic polymer, it is more preferably 1.3 to 2.5 mL / g, and when the carrier is a polysaccharide, it is more preferably 3.0 to 6.0 mL / g.
  • Immobilization of a ligand on a carrier As a method for binding the mutant immunoglobulin-binding protein (ligand) of the present invention to the carrier, a general method for immobilizing a protein on a carrier can be used. Examples of the immobilization means include physical adsorption of the ligand to the carrier, chemical binding between the carrier and the ligand, and the like.
  • Examples of the method for chemical bonding between the carrier and the ligand include a method of using a carrier having a carboxy group, activating this carboxy group with N-hydroxysuccinimide and reacting with the amino group of the ligand, amino group
  • a carrier having a carboxy group is used to form an amide bond by reacting with a carboxy group or an amino group of a ligand in the presence of a dehydrating condensing agent such as a water-soluble carbodiimide, or a halogen such as cyanogen bromide using a carrier having a hydroxyl group.
  • Activated with cyanide to react with the amino group of the ligand, or tosylate or tresylate the hydroxyl group of the carrier to react with the amino group of the ligand introduce epoxy group into the carrier with bisepoxide, epichlorohydrin, etc. React with the amino group, hydroxyl group or thiol group of the ligand. That way, and using a carrier having an epoxy group, and a method of reacting with an amino group or a hydroxyl group or a thiol group of the ligand.
  • a binding method in which a ligand is introduced via an epoxy group is desirable.
  • the alcoholic hydroxyl group which is a ring-opened epoxy group formed by the ring opening of the epoxy group, makes the surface of the carrier hydrophilic, prevents non-specific adsorption of proteins, etc., and improves the toughness of the carrier in water. It plays a role in preventing the destruction of the carrier. Therefore, when the residual epoxy group which is not couple
  • the ring opening method of the epoxy group in the carrier include a method of heating or stirring the carrier at room temperature with an acid or alkali in an aqueous solvent.
  • the epoxy group may be ring-opened with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • the most preferred ring-opening epoxy group is a ring-opening epoxy group obtained by opening the epoxy group contained in the carrier with thioglycerol.
  • Thioglycerol is less toxic than mercaptoethanol as a raw material, and the epoxy ring-opening group added with thioglycerol has lower non-specific adsorption than the ring-opening group by a blocking agent having an amino group, and the dynamics of the carrier. There is an advantage that the amount of coupling becomes high.
  • a molecule (spacer) of any length may be introduced between the carrier and the ligand.
  • the spacer include a polymethylene chain, a polyethylene glycol chain, and a saccharide.
  • a bifunctional compound that can be chemically bonded to the surface of the carrier and also bonded to a ligand can be used.
  • the affinity carrier having the mutant immunoglobulin binding protein of the present invention immobilized thereon has a high initial immunoglobulin dynamic binding capacity (DBC) and is washed under alkaline conditions (for example, There is no significant decrease in performance even with respect to (washing with an alkaline solution such as 0.01 to 0.8 M sodium hydroxide).
  • DBC immunoglobulin dynamic binding capacity
  • the method for isolating immunoglobulins according to the present embodiment comprises a step of contacting a sample containing immunoglobulins with an affinity carrier on which the above-mentioned mutant immunoglobulin binding protein of the present invention is immobilized, and adsorbing the immunoglobulins to the carrier. (First step) and a step of eluting the immunoglobulin from the carrier (second step), preferably after the second step, washing the carrier with an alkaline solution (third step) Step).
  • the affinity carrier of the present invention used for the immunoglobulin isolation method of the present invention may be in a suspended form, packed in a column, or like a chip, capillary, filter or magnetic particle. It may be a form.
  • the affinity carrier of the present invention in the first step, is contacted with a sample containing immunoglobulin under conditions that allow the immunoglobulin to adsorb to the ligand.
  • the carrier may be washed with a neutral buffer containing a salt such as NaCl in order to remove a part of the substance weakly held by the ligand.
  • an appropriate buffer solution having a pH of 2 to 5 is flowed to elute the immunoglobulin adsorbed on the ligand.
  • immunoglobulin can be isolated from the sample.
  • the third step is performed subsequent to the second step.
  • the carrier is washed with an alkaline solution (CIP washing).
  • alkaline liquid used in the third step include a sodium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, triethylamine, and tetrabutylammonium hydroxide.
  • the affinity carrier of the present invention stably retains the immunoglobulin binding ability even after washing in the third step due to the improvement of the alkali tolerance of the protein ligand, it should be used repeatedly in the immunoglobulin isolation method of the present invention. Can do.
  • the immunoglobulin to be isolated can be an antibody or a medicament containing it.
  • the present invention provides a method for producing an antibody drug using the affinity carrier of the present invention. The procedure of the method is basically the same as that of the immunoglobulin isolation method described above, except that a sample containing the target antibody drug is used.
  • the obtained aqueous solution was put into a 7 L separable flask, a thermometer, a stirring blade, and a cooling pipe were attached, set in a hot water bath, and stirring was started at 600 rpm in a nitrogen atmosphere. Subsequently, the separable flask was heated with a hot water bath, and when the temperature of the aqueous solution reached 85 ° C., the organic monomer solution was added to the aqueous solution using a dropping funnel, followed by stirring for 5 hours.
  • the reaction solution was transferred to a 5 L polypropylene bottle and allowed to stand until the particles floated, and excess water was sucked out from below and discarded. Further, acetone was added to the reaction solution to precipitate the particles. Next, the reaction solution was allowed to stand for 3 minutes, and acetone was removed by decantation. After repeating this operation twice, water was added to settle the particles. Furthermore, it was left still for 3 minutes and decanted. This operation was repeated twice to wash the particles. Further, the particle dispersion was replaced with acetone again, and air-dried overnight, followed by drying in a vacuum dryer to obtain 90 g of porous particles (hereinafter referred to as PB).
  • the average particle size of PB was 53 ⁇ m and the specific surface area was 95 m 2 / g.
  • Example 1 Production of C Domain Recombinant Immunoglobulin Binding Protein 1 (IgGBPC1) A plasmid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 was prepared, and further used for this, E. coli competent cell BL21 (DE3) (manufactured by STRATAGENE) Was transformed to obtain a recombinant. The resulting recombinant was incubated at 37 ° C. until the absorbance (OD600) reached approximately 10. Thereafter, IPTG (manufactured by Sigma-Aldrich) was added to a final concentration of 1 mM, and further incubated at 37 ° C. for 4 hours to express the recombinant immunoglobulin binding protein.
  • E. coli competent cell BL21 DE3
  • IPTG manufactured by Sigma-Aldrich
  • immunoglobulin was obtained by anion exchange chromatography (Q-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience) and cation exchange chromatography (SP-Sepharose FF, manufactured by GE Healthcare Bioscience). The bound protein was purified. The purified immunoglobulin binding protein was dialyzed for 16 hours against 10 mM citrate buffer pH 6.6. The purity of the immunoglobulin binding protein confirmed by SDS-PAGE was 95% or more. The purified immunoglobulin binding protein was designated as C domain recombinant immunoglobulin binding protein 1 (IgGBPC1).
  • IgGBPC1 C domain recombinant immunoglobulin binding protein 1
  • This protein contains four mutants of the C domain (SEQ ID NO: 3), and Phe is inserted between Asn-Lys at positions corresponding to positions 3 to 4 of SEQ ID NO: 3 in each mutant domain. Yes.
  • Each domain in IgGBPC1 has an alkali tolerance improving mutation A1V / G29A (Protein Science, 2013, 22, 1230-1238).
  • Example 17 Production of Z Domain Recombinant Immunoglobulin Binding Protein 1 (IgGBPZ1)
  • IgGBPZ1 Z Domain Recombinant Immunoglobulin Binding Protein 1
  • SEQ ID NO: 20 A plasmid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 was prepared, and the subsequent Z domain recombination was carried out in substantially the same steps as in Example 1.
  • Type immunoglobulin binding protein 1 (IgGBPZ1) was produced. This protein contains four mutants of the Z domain (SEQ ID NO: 2), and Ile is inserted between Asn-Lys at positions corresponding to positions 3 to 4 of SEQ ID NO: 2 in each mutant domain. Yes.
  • each domain in IgGBPZ1 has an alkali tolerance improving mutation A1V / G29A.
  • IgGBPZ0 Z Domain Recombinant Immunoglobulin Binding Protein 0
  • SEQ ID NO: 22 A plasmid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 was prepared, and thereafter, Z domain recombination was carried out in substantially the same steps as in Example 1.
  • Type immunoglobulin binding protein 0 IgGBPZ0
  • This protein contains four mutants of the Z domain (SEQ ID NO: 2), but amino acid residues are inserted between Asn-Lys at positions corresponding to positions 3 to 4 of SEQ ID NO: 2 of each mutant domain. It has not been.
  • IgGBPZ0 is an immunoglobulin-binding protein with high alkali resistance having an alkali tolerance-enhancing mutant domain A1V / G29A (Protein Science, 2013, 22, 1230-1238).
  • the immunoglobulin binding proteins of Examples 1 to 17 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 1.
  • Test Example 1 Immunoglobulin Binding Ability of Affinity Chromatography Support 1) Immobilization of Immunoglobulin Binding Protein to Support Suspension in 150 ⁇ L of pure water so as to contain 8 mg of PB prepared in Reference Example 1 was performed, and a filter tube (Millipore ) And centrifuged to remove pure water. To this was added 450 mg of 0.1 M carbonate buffer pH 9.8 containing 0.85 M sodium sulfate in which 1 mg of the immunoglobulin-binding protein 1 (IgGBPC1) prepared in Example 1 was dissolved, and the mixture was shaken at 25 ° C. for 5 hours. Immunoglobulin binding protein was bound to PB.
  • IgGBPC1 immunoglobulin-binding protein 1
  • the produced particles were filtered, mixed with 450 ⁇ L of 1M thioglycerol and reacted at 25 ° C. for 16 hours to block the remaining epoxy groups, washed with 0.5 M NaOH, and then washed with 0.1 M sodium citrate buffer (pH 3.2). ) And 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.6) to obtain 450 ⁇ L of bound porous particles (IgGBPC1 / PB).
  • porous particles IgGBPC1-16 / PB and IgGBPZ0-1 / PB
  • Tables 2 and 3 show the results of introduction of immunoglobulin-binding protein, DBC, and alkali resistance test of each carrier for affinity chromatography.
  • the carrier IgGBPC1-16 / PB and IgGBPZ1 / PB
  • the carrier IgGBPC0 / PB and IgGBPZ0 / IgGB
  • IgGBPC1-16 / PB and IgGBPZ1 / PB are equivalent to IgGBPC0 / PB or IgGBPZ0 / PB having an alkali resistance-enhancing mutation even under extremely severe alkaline conditions of exposure to 0.5 M sodium hydroxide for up to 45 hours. It had high alkali resistance and was able to maintain a relatively high DBC. Therefore, by using an immunoglobulin binding protein containing a modified domain in which an amino acid residue is inserted between the 3rd position Asn and the 4th position Lys of the amino acid sequence of the SpA immunoglobulin binding domain as a ligand, high DBC and alkali resistance can be achieved. It was possible to obtain a carrier for affinity chromatography having.

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Abstract

　高いイムノグロブリン結合能およびアルカリ耐性を保持したアフィニティークロマトグラフィー用担体の提供。イムノグロブリン結合タンパク質であって、少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、イムノグロブリン結合タンパク質。

Description

イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体
　本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質、それを用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いたイムノグロブリンの単離方法および抗体医薬の製造方法に関する。
　アフィニティークロマトグラフィーは、分離または精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を不溶性担体に固定化したリガンド固定化担体が充填されたカラムを用いるクロマトグラフィーである。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特許文献１）。アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子や、合成ポリマーを主成分とする粒子が用いられている。
　アフィニティークロマトグラフィー用担体の作製においては、目的の物質と特異的に結合する物質であるリガンドを担体に固定化する必要がある。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）およびその変異体は、イムノグロブリンに対して特異的な結合能を有する代表的なアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして知られている。ＳｐＡは、抗原に対するイムノグロブリンの高い選択性に対して著しい影響を与えることなく、イムノグロブリンのＦｃ領域と結合する能力をもつため、イムノグロブリンおよびＦｃ領域含有タンパク質を効率的に捕捉および精製することができる。
　天然型のＳｐＡには、イムノグロブリンに対して結合能を有するドメインとして、Ｎ末端から順にＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣの５つのドメインが含まれる。これらのドメイン、およびＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインは、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用されている。また、イムノグロブリン結合能を高める目的で、上記ドメインを２個以上連結させたものをリガンドとして用いることも一般的である。
　上記のＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメインには、それぞれ３つのα－ヘリックス構造が含まれ、これらのうちＮ末端側の２つのα－ヘリックス部位がイムノグロブリンとの結合に寄与していることが知られている。さらに、上記のドメインのうちＢおよびＣドメインにおいては、Ｎ末端３位のＡｓｎおよび４位のＬｙｓによってターン構造が形成されていることが報告されている（非特許文献１）。したがって、Ｂドメイン、ＣドメインまたはＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが複数個連結されたリガンドにおいては、上記のターン構造に起因して、各ドメインは互いに屈曲した配置で連結され、この屈曲した配置に起因する立体障害を引き起こしていると推測される。この立体障害は、Ｂドメイン、ＣドメインまたはＺドメインの繰り返し構造をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー用担体を作製するうえで、深刻な問題である。すなわち、上記立体障害に起因してリガンドのイムノグロブリン結合能が低く留まり、結果として一定量のイムノグロブリンを精製するために多くの担体量が要求されることとなる。ＳｐＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー用担体は多くの場合非常に高価であり、多くの担体量が要求されることは、製造コストの観点から望ましくない。
　アフィニティークロマトグラフィー用担体は、バイオセパレーションにおける用途では、通常繰り返し使用される。そのため通常、クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる夾雑物を除去して担体を元の状態に戻すための洗浄工程が、繰り返し使用の間に行われる。ＣＩＰのための試薬としては、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ性液が使用される。しかしながら、リガンドとしてタンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー用担体にとって、このようなアルカリ性条件は過酷であり、リガンドの失活もしくは切断に伴って、標的分子に対する結合能を失うことがある。かかるアルカリ性条件下におけるリガンドの失活については、その主要因としてＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱アミド化が広く知られている。特に、Ａｓｎはアルカリ条件に対する感受性が高く、かつその脱アミド化は構造依存的であり、Ａｓｎ－ＧｌｙまたはＡｓｎ－Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列部位でしばしば発生することが報告されている（非特許文献２）。
　上記のアルカリ性条件下におけるリガンドの失活を回避するための従来技術としては、Ａｓｎ残基の欠失や改変によりアルカリに対する感受性を低下させたリガンドを得ることが挙げられる。かかるリガンドを用いることにより、アルカリ性溶液を使用したＣＩＰを複数回実施した後でも、そのイムノグロブリン結合能を維持できるアフィニティークロマトグラフィー担体が提供されている。例えば、特許文献２においては、ＳｐＡのＢドメイン、ＣドメインまたはＺドメインを含むアフィニティークロマトグラフィー用担体のリガンドであって、少なくとも１つのドメインの１位または２位から始まるＮ末端側の少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含むリガンドが提供されている。また、特許文献３においては、Ｎ末端側３位から６位までの連続したアミノ酸が欠失したＳｐＡのＣドメインを含むアフィニティークロマトグラフィー担体用のリガンドが提供されている。また、特許文献４においては、ＳｐＡのＺドメインやＢドメイン中のＡｓｎ残基を修飾したアフィニティークロマトグラフィー担体用のリガンドが提供されている。しかし、上記の従来技術は、担体のアルカリ耐性を高めることを主な目的としており、担体のイムノグロブリン結合能を高めることに言及していない。
特開平６－２８１６３８号公報 特開２０１２－２５４９８１号公報 特許第５３４５５３９号公報 特表２００２－５２７１０７号公報
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１４，２２：１４６７－１４７７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，８０：１６９－１７８
　高いイムノグロブリン結合能およびアルカリ耐性を保持した、効率的でかつ経済的価値の高いアフィニティー担体が求められている。本発明の一形式は、イムノグロブリンに対する結合能を高めた、新規なアフィニティー担体用リガンドを提供することである。また本発明の別の形式は、アルカリ性溶液を使用したＣＩＰを繰り返し実施した場合においても、上述した高いイムノグロブリン結合能を維持することができるアフィニティー担体を提供することにある。
　したがって一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質を提供する。該イムノグロブリン結合タンパク質は、少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインは以下からなる群より選択される：
　配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
　配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインはＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である。
　一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、２～１２個の前記改変イムノグロブリン結合ドメインを含む。
　別の一態様において、本発明は、上記変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
　別の一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
　別の一態様において、本発明は、上記ベクターを含む組換え体を提供する。
　また別の一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを、無細胞タンパク質合成系により発現させるか、または上記組換え体において発現させることを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法を提供する。
　さらなる一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法を提供する。該方法は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む方法である。
　さらなる一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合能の向上方法を提供する。該方法は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む方法である。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである。
　一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法は、以下：
　配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；
　配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；または
　配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること、
を含む。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである。
　本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインはＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である。
　一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法は、前記少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入されたイムノグロブリン結合ドメインを２～１２個連結することをさらに含む。
　さらなる一態様において、本発明は、上記イムノグロブリン結合タンパク質が、水に対して不溶性の基材に固定化されている、アフィニティー担体を提供する。
　さらなる一態様において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法を提供する。
　さらなる一態様において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法を提供する。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー用担体用のリガンドとして有用である。当該変異イムノグロブリン結合タンパク質は、該タンパク質中に含まれるアミノ基、チオール基、またはカルボキシル基等の反応性側鎖が不溶性担体の表面に存在する官能基と化学結合することにより、該担体に固定化され得る。当該変異イムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合能が高く、かつアルカリ性溶液を使用したＣＩＰを繰り返し実施した後においても高いイムノグロブリン結合能を維持することができる。したがって、当該変異イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー用担体は、例えばイムノグロブリンの精製に用いた場合、一定量の担体でより多くのイムノグロブリンを精製することができ、かつ繰り返し使用してもイムノグロブリンの動的結合容量が低下しにくいため、結果としてイムノグロブリン精製のプロセスを低コストで実施することを可能にする。
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の配列同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ―Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５－４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ―Ｗｉｎ（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する「少なくとも７０％の同一性」とは、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらにより好ましくは９５％以上の同一性、なお好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン－パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
　本明細書において「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに対する結合能を有するタンパク質をいう。本明細書において「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、イムノグロブリン結合に関わるドメインをいい、その例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが挙げられる。
１．アフィニティークロマトグラフィー用担体
１．１．変異イムノグロブリン結合タンパク質
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、ＳｐＡのＢドメイン、ＣドメインまたはＺドメインに由来する、改変イムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含む。該改変イムノグロブリン結合ドメインは、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位に相当する位置のＡｓｎ残基と４位に相当する位置のＬｙｓ残基との間に、少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティー担体のリガンドとして使用することができる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる改変イムノグロブリン結合ドメインの親ドメインとしては、ＳｐＡのイムノグロブリン結合能を有するドメインであるＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体が挙げられる。このうち、Ｂドメイン、ＺドメインおよびＣドメインが好ましい。ＳｐＡのＢドメイン、Ｚドメイン、およびＣドメインは、それぞれ、配列番号１、２、および３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのドメインは、そのアミノ酸配列中の３位にＡｓｎ残基、４位にＬｙｓ残基を有し、これらのアミノ酸残基から構成されるターン構造を持つ。
　上記親ドメインとして使用され得る上記Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインの変異体としては、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合能を有してイムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドが挙げられる。さらに、該変異体は、そのアミノ酸配列中の、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列の３～４位に相当する位置に、連続するＡｓｎ残基とＬｙｓ残基とを有し、これらのアミノ酸残基から構成されるターン構造を持つ。上記Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインの変異体の例としては、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインのＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体が挙げられる。
　上記変異体は、ＳｐＡのＢドメイン、ＺドメインまたはＣドメインに対して、アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失の手段としては、上記ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる改変イムノグロブリン結合ドメインは、上記親ドメインのアミノ酸配列に対して、上記Ｂ、ＺまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位に相当する位置のＡｓｎ残基と４位に相当する位置のＬｙｓ残基との間に、少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することによって得ることができる。例えば、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２または３で示されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、その３位のＡｓｎ残基と４位のＬｙｓ残基との間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。あるいは、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列の３～４位に相当する位置に連続するＡｓｎ残基とＬｙｓ残基とを有するイムノグロブリン結合ドメイン変異体のアミノ酸配列に対して、当該Ａｓｎ残基とＬｙｓ残基との間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、イムノグロブリン結合能を有し、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。
　上記親ドメインに挿入される少なくとも１つのアミノ酸残基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１～４個、より好ましくは１～２個のアミノ酸残基が挙げられる。これらのうち、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏがより好ましく、次いでＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐが好ましく、次いでＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔが好ましく、次いでＴｈｒ、Ａｌａが好ましい。したがって、上記親ドメインに挿入されるアミノ酸残基は、好適にはＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１～４個、より好ましくは１～２個であり、より好適にはＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１～４個、より好ましくは１～２個であり、さらに好適にはＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１～４個、より好ましくは１～２個である。上記アミノ酸残基が好ましい理由としては、３位のＡｓｎ残基と４位のＬｙｓ残基とから構成されるターン構造を変化させるとともに、Ａｓｎ－ＧｌｙおよびＡｓｎ－Ｓｅｒで表されるアルカリ感受性の高いアミノ酸配列を回避することができるためであると推定される。挿入されるアミノ酸残基の数が２個以上の場合、それらは、全て異なる種類のアミノ酸残基であっても、または同じ種類のアミノ酸残基を複数含んでいてもよい。さらに好ましくは、上記Ｂ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体に挿入されるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏから選択されるいずれか１つである。
　上記親ドメインへアミノ酸残基を挿入する手段としては、該親ドメインをコードするヌクレオチド配列に対する、上記の挿入すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列の挿入が挙げられる。ヌクレオチド配列の挿入のための具体的な手法としては、部位特異的突然変異、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などを挙げることができ、これらの詳細な手順は当業者に周知である。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上述したＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入された改変イムノグロブリン結合ドメインを１つ以上含んでいればよいが、好ましくは、該改変イムノグロブリン結合ドメインを２つ以上含み、より好ましくは２～１２個、さらに好ましくは３～８個含む。個々のドメインは、互いに連結されている。より詳細には、あるドメインのＣ末端と隣のドメインのＮ末端とが連結される、またはその逆である。本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、複数の改変イムノグロブリン結合ドメインが直線状に配置された領域を有するため、ドメインの屈曲した配置に起因する立体障害やイムノグロブリン結合阻害を防止することができる。したがって、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、高いイムノグロブリン結合能を有する。
　一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｂ、ＺおよびＣドメイン以外のＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、Ａドメイン、ＤドメインまたはＥドメイン）またはその変異体を含んでいてもよい。別の一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上述した３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入されていないＢ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体を含んでいてもよいが、好ましくは、これらのドメインまたは変異体を含まない。好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれるイムノグロブリン結合ドメインの全ては、上述したＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入されたＢ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体に由来する改変イムノグロブリン結合ドメインである。
　好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
　好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
　好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号３の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号３の３～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１～４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる上記ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列の３位～４位に相当する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓを保存した状態で、それらの残基の間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、２～４位に相当する位置のＡｓｐ－Ａｓｎ－ＬｙｓまたはＧｌｎ－Ａｓｎ－Ｌｙｓを保存した状態で、当該ＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、１～４位に相当する位置のＡｌａ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ、Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ、またはＶａｌ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｌｙｓを保存した状態で、当該ＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。上記３位に相当する位置のＡｓｎを欠失または変異させると、上記ポリペプチドの当該アルカリ耐性は向上するものの、イムノグロブリン結合能が低下することがある。
　好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる上記ポリペプチドは、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌ残基を有し、および／または、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａ残基を有する。
　好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上記ポリペプチドを２～１２個、さらに好ましくは３～８個含む。当該ポリペプチドの各々は、同じものでも異なるものであってもよい。好ましくは、当該ポリペプチドの各々は、そのＮ末端が、隣接するポリペプチドのＣ末端に連結されている。各ポリペプチドは、隣接するポリペプチドと直接連結してもよく、または１～１０個のアミノ酸残基を有するペプチドを介して連結してもよい。当該ペプチドの例としては、ＥＦで表されるペプチドが挙げられる。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例としては、配列番号４～２０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号４～１９で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１位ＡｌａをＶａｌに、２９位ＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列に対して、３位のＡｓｎと４位のＬｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個または２個のアミノ酸残基が挿入されたＣドメインの変異体を４個連結したアミノ酸配列である。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１位ＡｌａをＶａｌに、２９位ＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列に対して、３位のＡｓｎと４位のＬｙｓとの間にＩｌｅが挿入されたＺドメインの変異体を４個連結したアミノ酸配列である。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号４～１８のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号４～１８の４位～６位、６３位～６５位、１２２位～１２４位および１８１位～１８３位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ－Ｘ－Ｌｙｓ（ＸはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＴｙｒ）が配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号３の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号１９で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１９の４位～７位、６４位～６７位、１２４位～１２７位および１８４位～１８７位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓが配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号３の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号２０で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号２０の４位～６位、６３位～６５位、１２２位～１２４位および１８１位～１８３位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ－Ｉｌｅ－Ｌｙｓが配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号２の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
１．２．ポリヌクレオチド、ベクター
　本発明はまた、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）を提供する。本発明の一実施形態にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質あるいはその等機能変異体をコードする。本明細書において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｖａｒｉａｎｔ）」とは、部分的なアミノ酸残基の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を保持し、上述したＡｓｎ－Ｌｙｓの間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入された構造を維持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
　また、上述したように、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質には、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上、好ましくは２～１２個、より好ましくは３～８個有するタンパク質が含まれる。このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチドを含むベクターからなる発現プラスミドは公知の方法で作製することができる。
　一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１～２０のいずれかで示されるポリペプチドをコードする。別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１～２０のいずれかで示されるイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体をコードする。また別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３～３９のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。また別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３～３９のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号４～２０のいずれかで示されるイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体をコードするポリヌクレオチドである。
１．３．変異イムノグロブリン結合タンパク質の製造
　上記ポリヌクレオチドまたはベクターから本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。すなわち、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的の改変タンパク質を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、ほ乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した組換え体（細菌等）を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施例にも例示されている。
　あるいは、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
１．４．担体
　本発明はまた、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質が水に対して不溶性の基材（担体）に固定化されたアフィニティー担体を提供する。該担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、その中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床および流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。また、担体として磁性粒子を用いてもよい。磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだ疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。好適な例としては、特開２００８－３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
　本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、１０～５００μｍ、より好ましくは２０～２００μｍ、担体が合成ポリマーの場合、さらに好ましくは２０～１００μｍ、なお好ましくは３０～８０μｍ、担体が多糖の場合、さらに好ましくは５０～２００μｍ、なお好ましくは６０～１５０μｍの粒径を有する。粒径が１０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が５００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティー担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
　本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、多孔質であり、５０～１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０～１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
　本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、１００～１４００ｎｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１００～４００ｎｍ、さらに好ましくは２００～３００ｎｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５００～１４００ｎｍ、さらに好ましくは８００～１２００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
　担体が上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
　担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面に（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（－ＣＯＮＨ2、またはＮ置換型）、アミノ基（－ＮＨ2、または置換型）、オリゴまたはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３），３７１－３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
　本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体において、担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、１０～５０質量％の架橋性ビニル単量体と３～９０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体を含有し、粒径が２０～８０μｍであり、比表面積が５０～１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００～４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
　なお、本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３～７．０ｍＬ／ｇ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１．３～２．５ｍＬ／ｇ、担体が多糖の場合、より好ましくは３．０～６．０ｍＬ／ｇである。
１．５．担体へのリガンドの固定化
　本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質（リガンド）と上記担体との結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。固定化の手段としては、例えば、担体へのリガンドの物理的吸着、担体とリガンドとの化学的結合などが挙げられる。担体とリガンドとの化学的結合のための方法としては、例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法、または担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法、ビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、およびエポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを導入する結合方法が望ましい。
　エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温下で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させてもよい。最も好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、担体の動的結合量が高くなるといった利点を有する。
　また、必要に応じて担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としてはポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。スペーサーには、例えば担体表面に化学結合でき、かつリガンドとも結合する二官能の化合物を使用することができる。
１．６．作用効果
　本発明の一実施形態に係る、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体は、初期のイムノグロブリン動的結合容量（ＤＢＣ）が高く、かつアルカリ性条件下での洗浄（例えば０．０１～０．８Ｍ水酸化ナトリウム等のアルカリ性液を用いた洗浄）に対しても性能の著しい低下がない。
２．イムノグロブリンを単離する方法
　本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させ、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。本発明のイムノグロブリン単離方法に用いられる本発明のアフィニティー担体は、懸濁形態であってもよく、カラムに充填された状態であってもよく、あるいはチップ、キャピラリー、フィルターまたは磁性粒子のような形態であってもよい。
　好ましい実施形態において、第一の工程では、上記本発明のアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を、リガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて接触させる。この第一の工程では、試料中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されず担体上に残留しない。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
　第二の工程では、ｐＨ２～５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着されたイムノグロブリンを溶出させる。この溶出液を回収することで、試料からイムノグロブリンを単離することができる。
　本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法においては、好ましくは、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われる。第三の工程では、アルカリ性溶液で担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
　本発明のアフィニティー担体は、タンパク質リガンドのアルカリ耐性向上により上記第三の工程での洗浄後もイムノグロブリン結合能を安定に保持しているため、本発明のイムノグロブリン単離方法に繰り返し使用することができる。
　本発明のイムノグロブリン単離方法の一実施形態において、単離すべきイムノグロブリンは、抗体またはそれを含む医薬であり得る。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン単離方法の手順と同様である。
　以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
参考例１　多孔質粒子の合成
　グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６５．９ｇおよびグリセリンモノメタクリレート（日油社製）９０．６ｇを２－オクタノン（東洋合成工業社製）２４５．８ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６２ｇに溶解させ、２，２'－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
　次に、４２４０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）８．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製　エマール１０Ｇ）０．４３ｇおよび硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
　次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間撹拌を行った。
　次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔質粒子（以下、ＰＢと記す）９０ｇを得た。ＰＢの平均粒径は５３μｍ、比表面積は９５ｍ2／ｇであった。
実施例１　Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）の作製
　配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、さらにこれを用いて大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を形質転換して組換え体を得た。得られた組換え体を、吸光度（ＯＤ６００）が約１０に到達するまで３７℃でインキュベートした。その後、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、さらに４時間３７℃でインキュベートして、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ９．５のトリス緩衝液中で破砕した。得られた細胞破砕液から、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）および陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によってイムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．６に対して１６時間透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質を、Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）とした。このタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号３の３位～４位に対応する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にはＰｈｅが挿入されている。またＩｇＧＢＰＣ１中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０－１２３８）を有する。
実施例２～１６　Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質２～１６（ＩｇＧＢＰＣ２～ＩｇＧＢＰＣ１６）の作製
　配列番号５～１９に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドをそれぞれ調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質２～１６（ＩｇＧＢＰＣ２～ＩｇＧＢＰＣ１６）を製造した。これらのタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号３の３位～４位に対応する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間には後述する表１に示すアミノ酸が挿入されている。またＩｇＧＢＰＣ２～１６中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａを有する。
実施例１７　Ｚドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＺ１）の作製
　配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＺドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＺ１）を製造した。このタンパク質は、Ｚドメイン（配列番号２）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号２の３位～４位に対応する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にはＩｌｅが挿入されている。またＩｇＧＢＰＺ１中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａを有する。
比較例１　Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＣ０）の作製
　配列番号２１に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＣドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＣ０）を製造した。このタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含むが、各変異体ドメインの配列番号３の３位～４位に対応する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にアミノ酸残基は挿入されていない。なおＩｇＧＢＰＣ０は、アルカリ耐性向上変異体ドメインＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０－１２３８）を有するアルカリ耐性の高いイムノグロブリン結合タンパク質である。
比較例２　Ｚドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＺ０）の作製
　配列番号２２に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＺドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＺ０）を製造した。このタンパク質は、Ｚドメイン（配列番号２）の変異体を４個含むが、各変異体ドメインの配列番号２の３位～４位に対応する位置のＡｓｎ－Ｌｙｓの間にアミノ酸残基は挿入されていない。なおＩｇＧＢＰＺ０は、アルカリ耐性向上変異体ドメインＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０－１２３８）を有するアルカリ耐性の高いイムノグロブリン結合タンパク質である。
　実施例１～１７および比較例１～２のイムノグロブリン結合タンパク質を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例１　アフィニティークロマトグラフィー用担体のイムノグロブリン結合能
１）担体へのイムノグロブリン結合タンパク質の固定化
　参考例１で調製したＰＢを８ｍｇ含むように１５０μＬの純水に懸濁させ、フィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し遠心して純水を除いた。ここに１ｍｇの実施例１で作製したイムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）を溶解した４５０μＬの０．８５Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．８を加え、２５℃で５時間振盪させ、イムノグロブリン結合タンパク質をＰＢに結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール４５０μＬと混合し２５℃で１６時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、０．５Ｍ　ＮａＯＨで洗浄後、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄し、４５０μＬの結合多孔質粒子（ＩｇＧＢＰＣ１／ＰＢ）を得た。同様の手順で、ＩｇＧＢＰＣ０、ＩｇＧＢＰＣ２～１６およびＩｇＧＢＰＺ０～１のいずれかが結合した多孔質粒子（ＩｇＧＢＰＣ１～１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０～１／ＰＢ）を得た。
２）担体へのイムノグロブリン結合タンパク質導入量の測定
　１ｍｇのＩｇＧＢＰＣ１～１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０～１／ＰＢのいずれかを含む１５０μＬの懸濁液の各々について、ＢＣＡ　Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質の導入量を測定した。
３）ＩｇＧ動的結合容量の測定
　ＩｇＧＢＰＣ０～１６／ＢＰおよびＩｇＧＢＰＺ０～１／ＰＢの各々を内径０．５ｃｍのカラムにベッド高２０ｃｍまで充填した。カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を、線流速３００ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧ濃度が１０％ブレークスルー（破過）のときのヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量と担体体積から動的結合容量（ＤＢＣ）を求めた。
４）耐アルカリ性試験
　３）で用いた担体充填カラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓにセットし、０．５Ｍ水酸化ナトリウム２０ｍＬをカラム内に流した。カラムを装置から外し、密閉した後室温で一定時間（１５、３０、４５時間）放置した後、３）と同様の手順で、線流速３００ｃｍ／時間におけるヒトポリクローナルＩｇＧのＤＢＣを測定した。０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理する前のＤＢＣを１００％とした時の結合容量維持率（％ＤＢＣ）を求めた。
　各アフィニティークロマトグラフィー用担体のイムノグロブリン結合タンパク質導入量、ＤＢＣ、耐アルカリ性試験の結果を表２および表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　担体に対する実施例１～１７および比較例１～２のイムノグロブリン結合タンパク質の結合量はほぼ同等であった。一方で、実施例１～１７のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化した担体（ＩｇＧＢＰＣ１～１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ１／ＰＢ）は、比較例１または２のタンパク質を固定化した担体（ＩｇＧＢＰＣ０／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０／ＰＢ）と比較して、ＤＢＣが向上していた。また、ＩｇＧＢＰＣ１～１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ１／ＰＢは、０．５Ｍ水酸化ナトリウムに最大４５時間曝露するという極めて過酷なアルカリ条件下でも、アルカリ耐性向上変異を有するＩｇＧＢＰＣ０／ＰＢまたはＩｇＧＢＰＺ０／ＰＢと同等の高いアルカリ耐性を有し、比較的高いＤＢＣを維持することができた。したがって、ＳｐＡイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列の３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にアミノ酸残基を挿入した改変ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いることにより、高いＤＢＣとアルカリ耐性とを有するアフィニティークロマトグラフィー用担体を得ることができた。

Claims (20)

  1. 　イムノグロブリン結合タンパク質であって、
    　少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、
    　該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、
    イムノグロブリン結合タンパク質。
  2. 　前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである、
    請求項１記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  3. 　前記少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインが、以下からなる群より選択される、請求項１又は２記載のイムノグロブリン結合タンパク質：
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
    　配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  4. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  5. 　前記配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインがＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である、請求項２～４のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  6. 　２～１２個の前記改変イムノグロブリン結合ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  8. 　請求項７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  9. 　請求項８記載のベクターを含む組換え体。
  10. 　請求項７記載のポリヌクレオチドを、無細胞タンパク質合成系により発現させるか、または請求項８記載の組換え体において発現させることを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
  11. 　イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法であって、
    　黄色ブドウ球菌プロテインＡに由来するＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む、
    方法。
  12. 　イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合能の向上方法であって、
    　黄色ブドウ球菌プロテインＡに由来するＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む、
    方法。
  13. 　前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、
    請求項１１又は１２記載の方法。
  14. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；または
    　配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること、
    を含む、請求項１１～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 　前記配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインがＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である、請求項１３～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入されたイムノグロブリン結合ドメインを２～１２個連結することをさらに含む、請求項１１～１６のいずれか１項記載の方法。
  18. 　請求項１～６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質が、水に対して不溶性の基材に固定化されている、アフィニティー担体。
  19. 　請求項１８記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
  20. 　請求項１８記載のアフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法。
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