JP6722187B2 - アフィニティー担体およびイムノグロブリンを単離する方法 - Google Patents
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Description
アフィニティー担体であって、
固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
該タンパク質リガンドは、下記式(1):
R−R1 (1)
(式(1)中、
Rは、該固相担体と結合するリンカーであって、ポリプロリンを含むリンカーを示し、
R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している)
で表される、
アフィニティー担体、を提供する。
固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
該タンパク質リガンドは、下記式(1):
R−R1 (1)
(式(1)中、
Rは、該固相担体と結合するリンカーであって、長さ0.9nm〜91nmであるリンカーを示し、
R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している)
で表される、
アフィニティー担体、を提供する。
リンカーRとタンパク質リガンドR1とを含み、
該リンカーRはポリプロリンを含み、
該R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している、
アフィニティーリガンド、を提供する。
本発明の一実施形態に係るアフィニティー担体は、固相担体とタンパク質リガンドとを含み、該タンパク質リガンドは、下記式(1):
R−R1 (1)
(式(1)中、
Rは、該固相担体と化学結合するリンカーを示し、
R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している)
で表される。
1.1.1.構成
本発明のアフィニティー担体に含まれる上記固相担体は、好ましくは、水に対して不溶性の基材である。該固相担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層(expanded bed)および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、該形態中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床および流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、本発明の担体は充填剤である。あるいは、該担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。また、固相担体として磁性粒子を用いてもよい。磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄(Fe3O4)、三二酸化鉄(γ−Fe2O3)、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだ疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。好適な例としては、特開2008−32411号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第1ポリマー層が形成され、当該第1ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第2ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
上記固相担体へのリガンドの結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。固定化の手段としては、例えば、担体へのリガンドの物理的吸着、担体とリガンドとの化学的結合などが挙げられる。担体とリガンドとの化学的結合のための方法としては、共有結合が挙げられる。例えば、リガンドのリンカーは、そのカルボキシ基、アミノ基、水酸基またはチオール基を介して担体と共有結合する。さらに、共有結合のための反応性基を担体に導入してもよい。該反応性基としては、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、マレイミド基、またはエポキシ基が好ましく、これらの中でも、温和な条件でリガンドとの反応が進行する点で、エポキシ基がより好ましい。担体へのリガンドの結合方法の具体例としては、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をN−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法、担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法、マレイミド基を有する担体を用い、リガンドのチオール基と反応させチオエーテル結合を形成する方法、ビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、およびエポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを導入する結合方法が望ましい。
1.2.1.リンカー
本発明のアフィニティー担体に含まれるタンパク質リガンドは、リンカーRとタンパク質リガンドR1とを含み、下記一般式(1)で表される。
R−R1 (1)
このタンパク質リガンドを、上述のように、例えば担体上のエポキシ基等と反応させることにより、担体にリガンドを固定化させることができる。
上記式(1)中のR1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質(またはイムノグロブリン結合タンパク質)である。R1の例としては、イムノグロブリンFc領域に結合するFc結合性タンパク質、およびプロテインAに由来するイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1つ含むタンパク質が挙げられる。R1は、工業的に問題にならない限りにおいて、イムノグロブリン結合ドメインをいくつ含んでいてもよい。
本発明のアフィニティー担体に含まれる、上記式(1)で示されるタンパク質リガンドR−R1は、上記リンカーRと上記イムノグロブリン結合タンパク質R1とを含む融合ポリペプチドである。また上述したように、該タンパク質リガンドに含まれるR1は、イムノグロブリン結合ドメインを1個以上、好ましくは2〜12個、より好ましくは3〜8個含む融合ポリペプチドである。これらの融合ポリペプチドは、当該分野で公知のリコンビナント法により生成され得る。
本発明の一実施形態に係るアフィニティー担体は、担体に固定化されたリガンド量が多く、かつ初期のIgG静的結合容量(SBC)が高いことから、下記式に従って算出されるイムノグロブリン結合タンパク質の有効利用度E[%]が高い。 E[%]=[(SBC/抗体の分子量)/(イムノグロブリン結合タンパク質導入量/イムノグロブリン結合タンパク質の分子量)]×100
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記式(1)で示されるタンパク質リガンドR−R1を固定化したアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させ、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程(第一の工程)、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程(第二の工程)を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程(第三の工程)をさらに含む。本発明のイムノグロブリン単離方法に用いられる本発明のアフィニティー担体は、懸濁形態であってもよく、カラムに充填された状態であってもよく、あるいはチップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。
グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)8.2g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)65.9gおよびグリセリンモノメタクリレート(日油社製)90.6gを2−オクタノン(東洋合成工業社製)245.8gおよびアセトフェノン(和光純薬工業社製)62gに溶解させ、2,2'−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)2gを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
(1)組換え型イムノグロブリン結合タンパク質の調製
リンカーなしのイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号4)をコードするプラスミドを化学合成により調製し、大腸菌BL21(STRATAGENE製)に導入して形質転換した。形質転換した大腸菌を、吸光度(OD600)が約10に到達するまで37℃でインキュベートし、次いで終濃度で1mMになるようにIPTG(Sigma−Aldrich製)を添加し、さらに4時間37℃でインキュベートして、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を回収し、pH9.5のトリス緩衝液中でリゾチームを用いて破砕した。得られた組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を含む大腸菌破砕液から、陰イオン交換クロマトグラフィー(Q−セファロースFF、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)および陽イオン交換クロマトグラフィー(SP−セファロースFF、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)によって組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、10mMクエン酸緩衝液pH6.6に対して16時間透析した。SDS−PAGEによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は95%以上であった。該イムノグロブリン結合タンパク質の理論分子量[kDa]を、ExPACy([www.expasy.org/compute_pi/])を用いて求めた。
150μLの純水に参考例1で調製したPB1を8mg懸濁させ、フィルターチューブ(Millipore社)に移し、遠心して純水を除いた。ここに(1)で調製した組換え型イムノグロブリン結合タンパク質1mgを溶解した、0.85M硫酸ナトリウムを含む0.1M炭酸緩衝液(pH9.8)450μLを加え、25℃で5時間振盪させ、イムノグロブリン結合タンパク質をPB1に結合させた。生成した粒子を濾過した後、1Mチオグリセロール450μLと混合し、25℃で16時間反応させて残余のエポキシ基をブロッキングし、0.5M NaOHで洗浄後、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、最後にリン酸緩衝生理的食塩水(BupHTM Modified Dulbecco's PBS、PIERCE社)を400μL加えて、イムノグロブリン結合タンパク質が固定化された多孔質粒子を分散させ、該粒子の懸濁液400μLを得た。
表1に示すシステインリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号5)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリリジンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号6)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号7)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号8)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号9)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号10)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
表1に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号11)をコードするプラスミドを用いて大腸菌BL21を形質転換したこと以外は、比較例1と同様の手順で、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子PB1に固定化した。
参考例1で調製した粒子PB1に対して、過剰量のチオグリセロールを作用させてエポキシ基を開環させたのち、1,4−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)ブタン(BDDGE)(炭素数10)を表面水酸基と等モル量作用させて、炭素鎖のリンカーを導入した。この粒子をPB2とした。8mgのPB2について、比較例1と実質的に同様に組換え型イムノグロブリン結合タンパク質(配列番号4)を固定化し、該粒子の懸濁液400μLを得た。
参考例1で調製した粒子PB1に対して、過剰量のチオグリセロールを作用させてエポキシ基を開環させたのち、1,2−ビス(2,3−エポキシプロポキシ)エタン(EGDG)(炭素数8)を表面水酸基と等モル量作用させて、炭素鎖のリンカーを導入した。この粒子をPB3とした。8mgのPB3について、比較例1と実質的に同様に組換え型イムノグロブリン結合タンパク質(配列番号4)を固定化し、該粒子の懸濁液400μLを得た。
実施例1〜5および比較例1〜5の粒子懸濁液400μLから50μLを分取し、BCA Assyキット(PIERCE社)を用いて、該粒子に結合したイムノグロブリン結合タンパク質の量をそれぞれ測定し、比較例1の結合量を100とした相対値を求めた。
実施例1〜5および比較例1〜5の粒子懸濁液400μLから150μLを分取し、それぞれフィルターチューブ(Millpore社)に投入し、これに5mgのIgGを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.5を300μL投入し、1時間25度で振盪させてIgGを該粒子に吸着させた。遠心後、pH7.5の0.1Mリン酸緩衝液450μLを用いて該粒子を洗浄し、0.1Mクエン酸緩衝液pH3.2を用いて該粒子に吸着したIgGを溶出させ、溶出液の280nmにおける吸光度から該粒子のIgGの静的結合容量(SBC)を測定した。
試験例1および試験例2で測定したリガンド結合量とSBCの値から、下記式に従って、実施例1〜5および比較例1〜5の多孔質粒子におけるイムノグロブリン結合タンパク質の有効利用度E[%]を、下記式に従って算出した。
E[%]=[(SBC/抗体の分子量)/(イムノグロブリン結合タンパク質導入量/イムノグロブリン結合タンパク質の分子量)]×100
Claims (11)
- アフィニティー担体であって、
固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
該タンパク質リガンドは、下記式(1):
R−R1 (1)
(式(1)中、
Rは、該固相担体と結合するリンカーであって、ポリプロリンを含むリンカーを示し、該ポリプロリンにおけるプロリンの数が12〜24個であり、
R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している)
で表される、
アフィニティー担体。 - 前記リンカーの長さが3.6nm〜7.3nmである、請求項1記載のアフィニティー担体。
- 前記リンカーが、前記固相担体と結合する末端に、アミノ基またはチオール基を有するアミノ酸残基を含む、請求項1又は2記載のアフィニティー担体。
- 前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、Fc結合性タンパク質、またはプロテインAに由来するイムノグロブリン結合ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載のアフィニティー担体。
- 前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、配列番号3で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号3で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号3で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のアフィニティー担体。
- 前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、前記イムノグロブリン結合ドメインを2個以上含む、請求項4又は5記載のアフィニティー担体。
- 前記固相担体がチオール基またはアミノ基と結合する反応性基を有する、請求項1〜6のいずれか1項記載のアフィニティー担体。
- 前記反応性基がエポキシ基である、請求項7記載のアフィニティー担体。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のアフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法。
- リンカーRとタンパク質リガンドR1とを含み、
リンカーRはポリプロリンを含み、該ポリプロリンにおけるプロリンの数が12〜24個であり、
R1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
該Rは、該R1のアミノ酸配列のC末端またはN末端に結合している、
アフィニティーリガンド。
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