JP2022081709A - イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents

イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 Download PDF

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Abstract

【課題】標的タンパク質の結合容量が向上したアフィニティー担体の提供。【解決手段】少なくとも１つの変異イムノグロブリン結合ドメイン含むイムノグロブリン結合タンパク質、及び当該イムノグロブリン結合タンパク質を結合した固相担体を含むアフィニティー担体。該変異イムノグロブリン結合ドメインは、特定の配列番号で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ所与の変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有する。【選択図】なし

Description

本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質、それを用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いた抗体の単離方法に関する。
抗体は近年、研究用試薬、抗体医薬などに広く利用されている。これら試薬や医薬用の抗体は、一般に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を経て製造される。抗体のアフィニティー精製には、イムノグロブリンと特異的に結合する物質であるリガンドを固定化したカラムが用いられる。該リガンドには、一般に、プロテインＡなどのイムノグロブリン結合タンパク質が用いられる。
プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の細胞壁タンパク質である。プロテインＡは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン及びＣドメインと呼ばれる５つのイムノグロブリン結合ドメインを有し、各ドメインは単独でイムノグロブリンに結合することができる。プロテインＡの天然型イムノグロブリン結合ドメインとならんで、これらにタンパク質工学的改変を加えた改変イムノグロブリン結合ドメインもまた、アフィニティー精製用のリガンドとして利用されている。
アフィニティーカラムの担体にリガンドとしてイムノグロブリン結合ドメインを固定化する場合、担体表面に存在する官能基に対して、該ドメイン上の官能基を化学結合させる方法が頻用されている。しかしながら、イムノグロブリン結合ドメインは、通常、担体の官能基と反応し得る複数の官能基を有し、これら複数の官能基を介して担体と無秩序な配向で結合し得る。このような担体に対するドメインの無秩序な結合は、担体上でのリガンドの立体障害を引き起こし、それによってリガンドのイムノグロブリン結合能を低下させる。リガンドのイムノグロブリン結合能の低下は、担体当たりのイムノグロブリンの収量低下を招き、イムノグロブリン精製のコストを増大させる。
アフィニティー担体のイムノグロブリン結合能を向上させることができる変異イムノグロブリン結合ドメインが開示されている。特許文献１には、プロテインＡのＣドメイン又はＺドメインにおいて、４、７又は３５位のＬｙｓを他のアミノ酸残基に置換するか、又は３９位以降におけるＬｙｓの数を増やすことによって得られた変異ドメインを含むリガンドにより、アフィニティー担体のイムノグロブリン結合能を向上させたことが記載されている。特許文献２には、プロテインＡのＣドメインの４、７、３５位のうち少なくとも３５位のＬｙｓを他のアミノ酸残基に置換して得られた変異ドメインを介してリガンドを担体に結合させることで、アフィニティー担体のイムノグロブリン結合能が向上したことが記載されている。特許文献３には、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ又はＣドメインにおける全てのＬｙｓを他のアミノ酸残基に置換して得られた変異ドメインを２個以上含むリガンドにより、アフィニティー担体のイムノグロブリン結合能が向上したことが記載されている。特許文献４には、Ｃ末端のリジンが欠失または置換されたプロテインＡのＥ、Ｄ又はＡドメインを２つ以上有するタンパク質が、プロテアーゼ耐性が高く、イムノグロブリン結合活性を保持することができることが記載されている。
特開２００７－２５２３６８号公報 国際公開公報第２０１５／０３４０００号 国際公開公報第２０１４／０４６２７８号 国際公開公報第２０１６／１２５８１１号
イムノグロブリン結合能が向上したアフィニティー担体が求められている。本発明は、アフィニティー担体のイムノグロブリン結合能を向上させることができる、変異イムノグロブリン結合ドメインを含有するイムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体を提供する。また本発明は、該アフィニティー担体を用いた抗体の単離方法を提供する。
本発明は、以下を提供する。
〔１〕イムノグロブリン結合タンパク質であって、
少なくとも１つの変異イムノグロブリン結合ドメインを含み、
該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
該変異イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列は、以下の（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、配列番号３のアミノ酸配列の前半部におけるＬｙｓの位置に相当する位置のうちの少なくとも１つにＬｙｓを有する、
イムノグロブリン結合タンパク質。
〔２〕前記変異イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号３又は９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、〔１〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔３〕前記（ａ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
前記（ｂ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
前記（ｃ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
前記（ｄ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である、
〔１〕又は〔２〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔４〕前記（ａ）の変異を有するアミノ酸配列からなる、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔５〕配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置にＡｒｇを有する、〔４〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔６〕前記変異イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔７〕配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌ、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを有する、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔８〕前記変異イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔９〕〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕〔９〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１１〕〔１０〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔１２〕固相担体と、該固相担体に結合した〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
〔１３〕〔１２〕記載のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
〔１４〕〔１２〕記載のアフィニティー担体又は〔１３〕記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
〔１５〕〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、請求項１２記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
〔１６〕変異イムノグロブリン結合ドメインの製造方法であって、
配列番号１～１２のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれらと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、以下の（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することを含み、かつ
該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の前半部におけるＬｙｓの位置に相当する位置のうちの少なくとも１つにＬｙｓを有する、
方法。
〔１７〕固相担体に、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合活性が高く、アフィニティーリガンドとして有用である。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３－５８７７）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３－４１０）。これらのプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。また、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号３のアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
本明細書において、アミノ酸配列の特定の位置に対する「前」及び「後」の位置とは、それぞれ、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置をいう。例えば、特定の位置の「前」及び「後」の位置へアミノ酸残基を挿入する場合、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置に、挿入後のアミノ酸残基が配置される。
本明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリン（又は抗体もしくは抗体の断片）に対する結合活性を有するタンパク質をいう。本明細書において、「イムノグロブリン」（Ｉｇ）とは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリンを含む。本明細書における「抗体」は、イムノグロブリン又は抗原認識部位を含むその断片をいい、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、その断片、それらの変異体などを含み得る。また本明細書における「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、及び抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。また本明細書における「抗体の断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体の断片としては、例えばイムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。
本明細書において「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、単独でイムノグロブリン（又は抗体もしくは抗体の断片）結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいう。該「イムノグロブリン結合ドメイン」の好ましい例としては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン、ならびにイムノグロブリン結合活性を有するそれらの変異体が挙げられる。
本明細書において、プロテインＡとは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡ（以下、ＰｒｏＡともいう）をいう。ＰｒｏＡのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、ＰｒｏＡのＢドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｅドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが挙げられる。
本明細書において、プロテインＬとは、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａによって生産されるタンパク質の１種であるプロテインＬ（以下、ＰｒｏＬともいう）をいう。ＰｒｏＬのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ３１２株が産生するＰｒｏＬのＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、及びＢ５ドメインや、Ｆ．ｍａｇｎａ ３３１６株が産生するＰｒｏＬのＣ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメインが挙げられる。
１．イムノグロブリン結合タンパク質
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、ＰｒｏＡ又はＰｒｏＬ由来のイムノグロブリン結合ドメインの変異イムノグロブリン結合ドメインを、少なくとも１つ含む。以下の本明細書において、当該変異イムノグロブリン結合ドメインは、親ドメインであるＰｒｏＡ又はＰｒｏＬ由来のイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体に、所定の変異を加えることによって得ることができる。以下、本発明により提供される該変異イムノグロブリン結合ドメインを、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインともいう。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの親ドメインとしては、ＰｒｏＡのイムノグロブリン結合ドメイン、例えば、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、Ｚドメイン、及びそれらの変異体；ならびに、ＰｒｏＬのイムノグロブリン結合ドメイン、例えば、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、Ｃ４ドメイン、及びそれらの変異体、が挙げられる。このうち、ＰｒｏＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、Ｚドメイン、及びそれらの変異体が好ましく、ＰｒｏＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン及びその変異体がより好ましく、ＰｒｏＡのＣドメイン及びその変異体がさらに好ましい。以下、ＰｒｏＡのイムノグロブリン結合ドメインを親ドメインとして使用する場合を例として、本発明のイムノグロブリン結合ドメインの調製の手順について説明する。ただし、ＰｒｏＬのドメインを親ドメインとして用いる場合にも同様の手順で本発明のイムノグロブリン結合ドメインが調製可能である。なお、ＰｒｏＬのイムノグロブリン結合ドメインの配列情報は、公共のデータベースなどから取得することができる。
ＰｒｏＡのＢドメインは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ｂドメインの変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＰｒｏＡのＺドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ｚドメインの変異体としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＰｒｏＡのＣドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ｃドメインの変異体としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＰｒｏＡのＤドメインは、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ｄドメインの変異体としては、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＰｒｏＡのＡドメインは、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ａドメインの変異体としては、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＰｒｏＡのＥドメインは、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。該Ｅドメインの変異体としては、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。
より安定性の高いタンパク質構造を有する、天然イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端領域が欠失したイムノグロブリン結合ドメイン変異体が報告されている（ＷＯ２０１３／１０９３０２、ＷＯ２０１７／１９４５９６等）。したがって、当該親ドメインは、イムノグロブリン結合活性を有する限りにおいて、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２残基（例えば、２残基、４残基、６残基又は７残基）に相当するアミノ酸残基を欠失したイムノグロブリン結合ドメイン変異体であってもよい。そのような親ドメインの例としては、配列番号７～１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、これらは、それぞれ配列番号１～６のアミノ酸配列のＮ末端２～７残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインである。したがって、上述した親ドメインについての配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号７～１２のいずれかのアミノ酸配列、又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
したがって、本発明における好ましい親ドメインの例としては、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。より好ましい親ドメインの例としては、配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。さらに好ましい親ドメインの例としては、配列番号３又は９のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号３又は９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。
形質転換体におけるタンパク質の発現量の増加の観点（ＰＮＡＳ，１９８９，８６：８２４７－８２５１，Ｆｉｇ．２）や、複数のドメインを連結したイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製が容易となる観点（ＷＯ２０１０／１１０２８８）から、当該親ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＡｌａからＶａｌへの置換を含んでいてもよい。また、イムノグロブリン結合タンパク質の化学的な安定性が向上しアルカリ耐性が増大する観点から、当該親ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＧｌｙからＡｌａへの置換をさらに含んでいてもよい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８４８（１）：４０－４７）。したがって、該親ドメインとして用いられる配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌを有するか、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを有してもよい。
上述のＰｒｏＡのイムノグロブリン結合ドメインの変異体は、ＰｒｏＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失の手段としては、該ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上述した親ドメインに対して、以下の（ａ）～（ｄ）：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって得られたポリペプチドである。
当該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該置換される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。また該挿入される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。好ましくは、該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である。さらに好ましくは、該（ａ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換である。
当該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該置換される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。また該挿入される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。好ましくは、該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である。さらに好ましくは、該（ｂ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換である。
当該（ｃ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該置換される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。また該挿入される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。好ましくは、該（ｃ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である。さらに好ましくは、該（ｃ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換である。
当該（ｄ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入である。該置換される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。また該挿入される塩基としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、好ましくはＨｉｓ及びＡｒｇが挙げられ、より好ましくはＡｒｇが挙げられる。好ましくは、該（ｄ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である。さらに好ましくは、該（ｄ）の変異は、配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置におけるＬｙｓからＡｒｇへの置換である。
好ましい実施形態において、当該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、当該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。別の好ましい実施形態において、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、当該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
より好ましい実施形態において、当該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、当該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。別のより好ましい実施形態において、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、当該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
さらに好ましい実施形態において、当該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３又は９のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、当該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することによって製造される。
該導入される変異は、該（ａ）～（ｄ）のいずれか１種であっても２種以上の組み合わせであってもよく、好ましくは該（ａ）、又は該（ａ）と該（ｂ）～（ｄ）のいずれか１つ以上との組み合わせである。好ましい実施形態において、該導入される変異は、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４２Ｒ、ΔＫ５８、ΔＫ５０、ΔＫ４９、及びΔＫ４２からなる群より選択される少なくとも１種、又は２種以上の組み合わせである。より好ましい実施形態において、該導入される変異は、Ｋ５８Ｒ、ΔＫ５８、又は、Ｋ５８Ｒと、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ及びＫ４２Ｒのいずれか１つ以上との組み合わせである。
親ドメインを変異させる手段としては、該親ドメインをコードするポリヌクレオチドに対して、所望のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入等が生じるように変異導入する方法が挙げられる。ポリヌクレオチドに対する変異導入のための具体的な手法としては、部位特異的突然変異、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などを挙げることができ、これらの詳細な手順は当業者に周知である。
製造された本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、変異前の親ドメインと比べてイムノグロブリン結合活性が向上している。したがって、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、アフィニティーリガンドとして好適に使用することができる。
上記手順で得られる本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドである。
好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドである。
より好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３又は９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドである。
該（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種の変異は、該（ａ）～（ｄ）のいずれか１種又は２種以上の組み合わせであればよく、好ましくは、該（ａ）、又は該（ａ）と該（ｂ）～（ｄ）のいずれか１つ以上との組み合わせであり、より好ましくは、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４２Ｒ、ΔＫ５８、ΔＫ５０、ΔＫ４９、及びΔＫ４２からなる群より選択される少なくとも１種又は２種以上の組み合わせであり、さらに好ましくは、Ｋ５８Ｒ、ΔＫ５８、又は、Ｋ５８Ｒと、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ及びＫ４２Ｒのいずれか１つ以上との組み合わせである。
あるいは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの例としては、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ下記（Ａ1）～（Ｄ3）：
（Ａ1）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ａ2）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
（Ａ3）配列番号３のアミノ酸配列の５７位と５８位の間の位置におけるＡｒｇ；
（Ｂ1）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｂ2）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
（Ｂ3）配列番号３のアミノ酸配列の４９位と５０位の間の位置におけるＡｒｇ；
（Ｃ1）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｃ2）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
（Ｃ3）配列番号３のアミノ酸配列の４８位と４９位の間の位置におけるＡｒｇ；
（Ｄ1）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置におけるＡｒｇ；
（Ｄ2）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
（Ｄ3）配列番号３のアミノ酸配列の４１位と４２位の間の位置におけるＡｒｇ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、該（Ａ1）～（Ａ3）のいずれか１つを有するか、又は該（Ａ1）～（Ａ3）のいずれか１つと、該（Ｂ1）～（Ｄ3）のいずれか１つ以上（すなわち、該（Ｂ1）～（Ｂ3）のいずれか１つ、該（Ｃ1）～（Ｃ3）のいずれか１つ、及び該（Ｄ1）～（Ｄ3）のいずれか１つ、からなる群より選択される１つ又は２つ以上）とを組み合わせて有する。より好ましくは、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４２Ｒ、ΔＫ５８、ΔＫ５０、ΔＫ４９、及びΔＫ４２からなる群より選択される少なくとも１種又は２種以上を有し、さらに好ましくは、Ｋ５８Ｒ、ΔＫ５８、又は、Ｋ５８Ｒと、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ及びＫ４２Ｒのいずれか１つ以上との組み合わせを有する。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインの好ましい例としては、配列番号１、２、３、７、８、及び９のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（Ａ1）～（Ｄ3）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチドが挙げられる。本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインのより好ましい例としては、配列番号３又は９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し且つ上記（Ａ1）～（Ｄ3）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、該（Ａ1）～（Ａ3）のいずれか１つを有するか、又は該（Ａ1）～（Ａ3）のいずれか１つと、該（Ｂ1）～（Ｄ3）のいずれか１つ以上（すなわち、該（Ｂ1）～（Ｂ3）のいずれか１つ、該（Ｃ1）～（Ｃ3）のいずれか１つ、及び該（Ｄ1）～（Ｄ3）のいずれか１つ、からなる群より選択される１つ又は２つ以上）とを組み合わせて有する。より好ましくは、該変異イムノグロブリン結合ドメインは、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４２Ｒ、ΔＫ５８、ΔＫ５０、ΔＫ４９、及びΔＫ４２からなる群より選択される少なくとも１種又は２種以上を有し、さらに好ましくは、Ｋ５８Ｒ、ΔＫ５８、又は、Ｋ５８Ｒと、Ｋ５０Ｒ、Ｋ４９Ｒ及びＫ４２Ｒのいずれか１つ以上との組み合わせを有する。
本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、そのイムノグロブリン結合活性向上効果が損なわれない限りにおいて、上記（ａ）～（ｄ）以外の変異を有していてもよい。例えば、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、上記（ａ）～（ｄ）以外の変異に加えて、該ドメインにアフィニティーリガンドとして有利な性質を付与するためのさらなる変異を含み得る。好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＶａｌを有するか、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＡｌａを有する。
好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、その親ドメインのアミノ酸配列の前半部に存在するＬｙｓのうちの少なくとも１つを保持している。より詳細には、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の前半部におけるＬｙｓの位置（例えば、配列番号３のアミノ酸配列の４位、７位及び３５位）に相当する位置のうちの少なくとも１つにＬｙｓを有する。例えば、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列における、少なくとも３５位に相当する位置、好ましくは７位及び３５位に相当する位置、より好ましくは４位、７位及び３５位に相当する位置にＬｙｓを有する。また好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の１１位に相当する位置にＡｓｎを有する。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、上述した本発明の変異イムノグロブリン結合ドメインを１つ以上含んでいればよい。好ましくは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、該変異イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは４個以上含む。一方、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、該変異イムノグロブリン結合ドメインを、好ましくは１２個以下、より好ましくは８個以下、さらに好ましくは７個以下含む。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、該変異イムノグロブリン結合ドメインを、好ましくは２～１２個、より好ましくは３～８個、さらに好ましくは４～７個含む。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質が２個以上の変異イムノグロブリン結合ドメインを含む場合、それらの変異イムノグロブリン結合ドメインは、同じ種類のものであっても、異なる種類のものであってもよいが、好ましくは同じ種類である。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、上述した変異イムノグロブリン結合ドメイン以外の、他のイムノグロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。当該他のドメインの例としては、天然型ＰｒｏＡイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、ＰｒｏＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン又はＤドメイン）、天然型ＰｒｏＬイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、ＰｒｏＬのＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、又はＣ４ドメイン）、又は本発明の変異イムノグロブリン結合ドメイン以外のそれらの変異体が挙げられる。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例としては、配列番号１４～１５、１９～２６、及び２８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、より好ましい例としては、配列番号１４～１５及び１９～２６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。しかしながら、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例は、これらに限定されない。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の担体への固定化量増大、担体への結合点の増加、抗体結合容量の増大などの観点から、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれるイムノグロブリン結合ドメインのＮ末端、Ｃ末端、及びドメイン間のいずれか１箇所以上に、任意のアミノ酸残基又はペプチドを付加又は挿入してもよい。当該付加又は挿入されるアミノ酸残基又はペプチドの好ましい例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、（Ｐｒｏ）ｍ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、及び（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ）ｐ（ｍは２～３００、好ましくは１２～２４の整数であり、ｎは４以上の整数、好ましくは４～１０の整数であり、ｐは２以上の整数、好ましくは２～６の整数である）が挙げられる。
２．イムノグロブリン結合タンパク質の製造
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。すなわち、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体（好ましくは細菌等の微生物細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
したがって、本発明はまた、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）、それを含むベクター、及びそれらを含む形質転換体を提供する。
３．アフィニティー担体
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、該本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティー担体を製造することができる。当該アフィニティー担体は、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとする担体であり、上述した親ドメインをリガンドとする担体に比べて、イムノグロブリン結合容量が向上している。
本発明のアフィニティー担体に含まれる固相担体の形状としては、粒子、膜、プレート、チューブ、針状、繊維状等の任意の形態であることができる。該担体は、多孔性でも非多孔性でもよい。これらの担体は充填ベッドとして使用することもでき、又は懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ）及び純然たる懸濁物として知られるものが包含され、該形態中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床及び流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリー又はフィルターのような形態であってもよい。
一実施形態において、当該固相担体は、粒径が好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、粒径は好ましくは２０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、かつ好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは８０μｍ以下、例えば、好ましくは２０～１００μｍ、より好ましくは３０～８０μｍである。例えば、担体が多糖の場合、粒径が好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは６０μｍ以上、かつ好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、例えば、好ましくは５０～２００μｍ、より好ましくは６０～１５０μｍである。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が２００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティー担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、ＩＳＯ １３３２０及びＪＩＳ Ｚ ８８２５－１に準じたレーザー回折法で測定した体積平均粒子径を意味する。具体的には、レーザー散乱回折法粒度分布測定装置（例えば、ＬＳ １３ ３２０（（株）ベックマン・コールター等）により粒径分布を測定し、Ｆｌｕｉｄ Ｒ．Ｉ．Ｒｅａｌ １．３３３、Ｓａｍｐｌｅ Ｒ．Ｉ．Ｒｅａｌ １．５４ Ｉｍａｇｉｎａｒｙ ０等を光学モデルとして使用し、体積基準の粒度分布を測定して求められる平均粒子径のことをいう。
一実施形態において、当該固相担体は、多孔質であり、好ましくは５０ｍ2／ｇ以上、より好ましくは８０ｍ2／ｇ以上、かつ好ましくは１５０ｍ2／ｇ以下、より好ましくは１３０ｍ2／ｇ以下、例えば、好ましくは５０～１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０～１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
一実施形態において、当該固相担体は、体積平均細孔径が好ましくは１００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、体積平均細孔径は好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、かつ好ましくは４００ｎｍ以下、より好ましくは３００ｎｍ以下であり、例えば、好ましくは１００～４００ｎｍ、さらに好ましくは２００～３００ｎｍである。例えば、担体が多糖の場合、体積平均細孔径は好ましくは５００ｎｍ以上、より好ましくは８００ｎｍ以上、かつ好ましくは１５００ｎｍ以下、より好ましくは１４００ｎｍ以下であり、例えば、好ましくは５００～１５００ｎｍ、さらに好ましくは８００～１４００ｎｍである。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１５００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
当該固相担体が上記範囲の粒径、比表面積、及び細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間及び粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
当該固相担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマー、例えば、親水化処理により外表面に（及び存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（－ＣＯＮＨ2、又はＮ置換型）、アミノ基（－ＮＨ2、又は置換型）、又はオリゴもしくはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、該ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３）：３７１－３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーは、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
一実施形態において、当該固相担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０～５０質量％の架橋性ビニル単量体と３～８０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体、２０～８０質量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０～８０μｍであり、比表面積が５０～１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００～４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
なお、当該固相担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは１．３ｍＬ／ｇ以上、７．０ｍＬ／ｇ以下である。例えば、担体が合成ポリマーの場合、細孔体積は、好ましくは１．３ｍＬ／ｇ以上、かつ好ましくは７．０ｍＬ／ｇ以下、より好ましくは５．０ｍＬ／ｇ以下、さらに好ましくは２．５ｍＬ／ｇ以下であり、例えば、好ましくは１．３～７．０ｍＬ／ｇ、より好ましくは１．３～５．０ｍＬ／ｇ、さらに好ましくは１．３～２．５ｍＬ／ｇである。また、例えば、担体が多糖の場合、細孔体積は、好ましくは３．０～６．０ｍＬ／ｇである。
当該固相担体へのリガンド（すなわち本発明のイムノグロブリン結合タンパク質）の結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法；アミノ基又はカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基又はアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法；水酸基を有する担体を用い、臭化シアン等のハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法；担体の水酸基をトシル化又はトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法；ビスエポキシド、エピクロロヒドリン等によりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基、水酸基又はチオール基と反応させる方法；エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基又、水酸基又はチオール基と反応させる方法、などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを結合させる方法が望ましい。
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基である水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸又はアルカリにより、加熱又は室温で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミン等のアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。より好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノール等よりも毒性が低く、またチオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなる、といった利点を有する。
リガンドの固相担体への接着を防止するため、リガンドと固相担体とをリンカーを介して結合してもよい。該リンカーの例としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられ、好ましくは、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレン（重合度２～１００）グリコールジグリシジルエーテルなどの２官能性エポキシ化合物を用いて、該エポキシ化合物由来の部分構造でリガンドと固相担体とを結合させるものが挙げられる。該リンカーを担体に導入する方法としては、水溶媒中、塩基性条件下、加熱又は室温で該リンカーと担体を撹拌する方法などが挙げられる。
４．抗体又はその断片の単離方法
本発明の一実施形態に係る抗体又はその断片（以下、単に抗体と表記する。）の単離方法を説明する。本実施形態に係る抗体の単離方法は、好適には、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、抗体を含有する試料を通液し、該担体に該抗体を吸着させる工程（第一の工程）、及び、該担体から該抗体を溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。
当該第一の工程では、本発明のアフィニティー担体を充填したカラム等に抗体を含有する試料を、リガンド（本発明のイムノグロブリン結合タンパク質）に抗体が吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中の抗体以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
第二の工程では、ｐＨ２～５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着された抗体を溶出させる。この溶出液を回収することで、試料から抗体を単離することができる。
抗体の純度を高めるために、上記第二の工程で得られた溶出液に含まれる抗体をさらに精製してもよい。抗体の精製は、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて使用して行うことができる。例えば、該第二の工程で得られた溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、抗体を精製することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、ＳＰ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ Ｓ（ＹＭＣ社製）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｓ（ＹＭＣ社製）等を用いて行うことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｑ－セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ Ｑ（ＹＭＣ社製）、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ（ＹＭＣ社製）等を用いて行うことができる。
本実施形態に係る抗体の単離方法においては、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われてもよい。第三の工程では、アルカリ性溶液で該アフィニティー担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。洗浄されたアフィニティー担体は、抗体単離に繰り返し使用することができる。
本発明の抗体の単離方法の一実施形態において、単離された抗体は、抗体医薬として使用される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述した抗体の単離方法の手順と同様である。
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
実施例１ イムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＡ－１～１６）の作製
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡ－１～１６を取得した。ＰｒＡ－１、４及び１５は、それぞれ、プロテインＡのＣドメイン（配列番号３）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（アルカリ耐性向上変異体；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８４８（１）：４０－４７）が直列に連結したホモペンタマー及びホモテトラマー、ならびに該Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体モノマーを含む、イムノグロブリン結合タンパク質である。ＰｒＡ－２、３、５～１４、及び１６はそれぞれ、ＰｒＡ－１、４、及び１５の各ドメインに対して表１記載の変異を導入した変異体である。
Figure 2022081709000001
ＰｒＡ－１～１６の発現と精製はそれぞれ以下のように行った。ＰｒＡ－１～１６をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、培地に終濃度１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、目的タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心して上清を除き、得られた菌体に卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加して菌体を破砕した。得られた細胞破砕液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって組み換えイムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
実施例２ 多孔質活性化湿潤粒子（ＰＢ１～３）の合成
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ－２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
（２）グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
（３）（１）で得た水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に（２）で得た単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加した。
（４）（３）で得た反応液を、８６℃に温度を維持しながら、３時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、ろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質湿潤粒子分散液を得た。
（５）（４）で得た多孔質湿潤粒子１０ｇに、エチレングリコールジグリシジルエーテル１０ｇ（製品名ＥＸ－８１０：ナガセケムテックス株式会社製）、１，４－ジオキサン４０ｇ、及び５０質量％水酸化ナトリウム水溶液１５ｇを添加し、６０℃で８時間撹拌することで、粒子上の１級水酸基を通してリンカー化合物を導入した。反応後の粒子スラリー液を冷却した後にろ過し、純水及びエタノールで洗浄した。斯かる粒子スラリー液を再度ろ過することで多孔質活性化湿潤粒子：ＰＢ１を得た。
（６）（５）の手順と同様に、ただしエチレングリコールジグリシジルエーテルをポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（重合度４：ＥＸ－８３０：ナガセケムテックス株式会社製）に変更して、多孔質活性化湿潤粒子：ＰＢ２を得た。
（７）（５）の手順と同様に、ただしエチレングリコールジグリシジルエーテルをポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（重合度２２：ＥＸ－８６１：ナガセケムテックス株式会社製）に変更して、多孔質活性化湿潤粒子：ＰＢ３を得た。
実施例３ リガンド固定化粒子の調製
実施例２で取得した多孔質活性化湿潤粒子（ＰＢ１）５ｍＬに対して、実施例１で調製したＰｒＡ－１を１２９ｍｇ溶解した、１．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．８）２４．１ｍＬを加え、混合液を２５℃で５時間振盪して、ＰｒＡ－１をＰＢ１に結合させた。粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールを用いてブロッキングした後、０．５Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）を用いて粒子を洗浄し、リガンド固定化粒子（ＰｒＡ－１／ＰＢ１）を得た。同様の手順で、ＰｒＡ－２～１６のいずれかと多孔質活性化湿潤粒子（ＰＢ１～３）のいずれかとを結合させて、リガンド固定化粒子（ＰｒＡ－１～１６／ＰＢ１～３）を得た。
試験例１ 動的結合容量（ＤＢＣ）の測定
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速６０ｃｍ／ｈｒにおける標的タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製ＨＧＧ－１０００）に対するＰｒＡ－１～１６／ＰＢ１～３のＤＢＣを測定した。カラムとして充填剤４ｍＬを充填した容量４ｍＬの容器（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）を用いた。標的タンパク質は、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２５ｍｇ／ｍＬに希釈してカラムに流した。線流速６０ｃｍ／ｈｒでの溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表２に示す。
Figure 2022081709000002

Claims (17)

  1. イムノグロブリン結合タンパク質であって、
    少なくとも１つの変異イムノグロブリン結合ドメインを含み、
    該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
    該変異イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列は、以下の（ａ）～（ｄ）：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、Ｌｙｓの他のアミノ酸残基への置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
    からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、配列番号３のアミノ酸配列の前半部におけるＬｙｓの位置に相当する位置のうちの少なくとも１つにＬｙｓを有する、
    イムノグロブリン結合タンパク質。
  2. 前記変異イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号３又は９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  3. 前記（ａ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
    前記（ｂ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
    前記（ｃ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入であり、
    前記（ｄ）の変異が、配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置における、ＬｙｓのＡｒｇへの置換、Ｌｙｓの欠失、又はＬｙｓの前の位置へのＡｒｇの挿入である、
    請求項１又は２記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  4. 前記（ａ）の変異を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  5. 配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置にＡｒｇを有する、請求項４記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  6. 前記変異イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  7. 配列番号３のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌ、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを有する、請求項１～６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  8. 前記変異イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む、請求項１～７のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
  9. 請求項１～８のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 請求項１０記載のベクターを含む形質転換体。
  12. 固相担体と、該固相担体に結合した請求項１～８のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
  13. 請求項１２記載のアフィニティー担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
  14. 請求項１２記載のアフィニティー担体又は請求項１３記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
  15. 請求項１～８のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、請求項１２記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
  16. 変異イムノグロブリン結合ドメインの製造方法であって、
    配列番号１～１２のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれらと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、以下の（ａ）～（ｄ）：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列の５８位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の５０位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列の４９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入；及び
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の４２位に相当する位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入、
    からなる群より選択される少なくとも１種の変異を導入することを含み、かつ
    該変異イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列の前半部におけるＬｙｓの位置に相当する位置のうちの少なくとも１つにＬｙｓを有する、
    方法。
  17. 固相担体に、請求項１～８のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
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