JP2006304633A - イムノグロブリン結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】アルカリ性溶液による洗浄など苛酷な条件において、化学的安定性がより高いイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定するリガンドとして提供する。
【解決手段】スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくはＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくはＺドメインの等機能変異体において、イ）３３位及び４４位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、ロ）３７位及び４０位のアミノ酸間にイオン結合が形成されるアミノ酸に置換、ハ）５位及び３９位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、ニ）２７位のアミノ酸を、１６位、１７位、２２位及び３１位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸との間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、を行いイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質に関するものであり、より詳しくは、アルカリ性条件下における化学的安定性を高める変異が導入されたプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン及びその変異導入方法に関する。また本発明は、アルカリ性条件下で安定なプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの改変タンパク質をアフィニティリガンドとして結合したアフィニティクロマトグラフィ用担体とその使用に関する。

生物工学及び生化学の分野における研究や製薬産業の分野において、純度の高いタンパク質試薬やタンパク質医薬の需要が高まっている。純度の高いタンパク質を製造するための精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等の様々な原理によるクロマトグラフィが採用されるが、なかでもアフィニティクロマトグラフィは目的タンパク質と夾雑物を分離する効率が極めて高い方法である。

タンパク質をアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィ用担体は、一般に他のクロマトグラフィ担体より高価である。このことから、該アフィニティクロマトグラフィ用担体を充填したアフィニティカラムを用いて試料を精製する場合、該アフィニティカラムは、できる限り多数回の使用が望まれ、前記精製に一定の性能を保持している間、繰り返し使用される。このためタンパク質試薬やタンパク質医薬を、アフィニティカラムを用いて精製する際には、試料をアフィニティクロマトグラフィに供する前に、前回のアフィニティカラムに残留している有機物等を除去し、必要に応じて滅菌するなどの目的でカラムを洗浄する操作が行われる。安価かつ簡便で高い洗浄効果が得られることから、この洗浄操作には、通常ＮａＯＨ溶液が汎用される。０．１〜１．０ＭのＮａＯＨ溶液は、ウイルス、細菌、酵母、核酸、タンパク質及び他の夾雑因子を除去することができる。

一方でこの様な苛酷な洗浄条件は、アフィニティクロマトグラフィ用担体に固定されたリガンド（タンパク質）にとって傷害性が高い。一般にタンパク質は強酸性や強アルカリ性の条件には感受性である場合が多い。例えば上述のＮａＯＨ溶液を用いた洗浄によって、担体に固定されたリガンドの目的分子への特異的結合能力は減衰する。従って上述のアルカリ洗浄を伴う使用におけるアフィニティクロマトグラフィ用担体の有用寿命は、担体に固定されたリガンド（タンパク質）のアルカリ性条件下における安定性に依存する。すなわち、アルカリ性条件下における安定性が高いリガンド（タンパク質）の供給は、安価で高品質なタンパク質を製造するために求められている大きな課題である。

アルカリ性条件に対するタンパク質の感受性に影響しうる既存の要因は、タンパク質中の主としてアスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）、特にＡｓｎにおける脱アミド反応の起こりやすさである。Ａｓｎの脱アミド反応は、環状イミド中間体を介して、約３：１の比率でイソアスパラギン酸及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）を生じる。この反応は生理学的ｐＨの条件下でも進むが、アルカリ性条件下でははるかに速い。イソアスパラギン酸の生成反応は、α−カルボキシル基とα−アミノ基との間に形成されていた正常のアミド結合がβ−カルボキシル基とα−アミノ基との間のアミド結合に転移することを意味し、この反応は、タンパク質骨格中に余分な−ＣＨ_２−鎖及び遊離のα−カルボキシル基を生じさせるとともに、タンパク質の高次構造に変化を及ぼす。また脱アミド反応の結果としてペプチド骨格が切断される場合もある等、Ａｓｎの脱アミド反応に伴うタンパク質の構造的変化は、しばしば多くのタンパク質においてその活性を損なうこと、さらにタンパク質のＡｓｎをアルカリ感受性がより低いアミノ酸に置換すると安定性が増すことが述べられている（Ｔｏｎｉｅ Ｗｒｉｇｈｔ Ｈ． １９９１年、Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻１号、１−５２頁）。酸性条件下におけるＡｓｎの脱アミド反応の生じ易さは、配列及び高次構造に非依存性であるが、アルカリ性条件下におけるＡｓｎの脱アミド反応の生じ易さは、配列及び高次構造に依存性であり、なかでもタンパク質表面に存在するＡｓｎ−グリシン（Ｇｌｙ）配列のＡｓｎは、アルカリ性条件下において他の配列のＡｓｎよりも約７０倍脱アミド化され易い（非特許文献１参照）。この様な知見に基づいて、Ａｓｎを修飾することによりアフィニティ担体に固定化されたリガンドタンパク質を安定化する技術に関する情報が開示されている（特許文献１参照）。

アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの需要は高く、アルカリ性条件下における安定性の高いプロテインＡ及びその使用に関する技術情報も開示されている（特許文献２参照）。本技術情報資料には、プロテインＡに含まれる５つのイムノグロブリン結合ドメインに最も共通なアミノ酸配列を有するＢドメイン及び、Ｂドメインの１位のアラニン（Ａｌａ）をバリン（Ｖａｌ）に、２８−２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列をＡｓｎ−Ａｌａ配列に変換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体（Ｚ−ドメイン）を基本として、その６位、１１位、２３位、２８位及び４３位のＡｓｎをグルタミン（Ｇｌｎ）以外のアミノ酸に置換することにより、アルカリ性条件下での安定性を高めることができると記述されている。しかし、この方法は、全てＡｓｎをアルカリ感受性がより低いアミノ酸に置換する既知の方法に該当する。本技術情報資料において、アルカリ耐性付与に寄与する最良の実施形態として述べられているＡｓｎの置換は、２３位のＡｓｎのスレオニン（Ｔｈｒ）への置換及び該置換と４３位のＡｓｎのグルタミン酸（Ｇｌｕ）への置換との組み合わせであるが、天然型Ｃドメインの２３位及び４３位のアミノ酸は、元よりそれぞれＴｈｒ及びＧｌｕであり、新規な配列ではない。さらに１１位のＡｓｎのセリン（Ｓｅｒ）への置換についても、同様に天然型Ｄドメインに元より含まれる形態である。

また天然型のイムノグロブリン結合ドメインはいずれも２８−２９位にＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を一カ所含んでおり、アルカリ性条件下において不安定であるが、２８−２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列がＡｓｎ−Ａｌａに変換された上述のＺ−ドメインが天然型ドメインと同様にイムノグロブリン結合能を有し、かつ化学的に安定であることは確認されている（非特許文献２参照）。すなわち、既知の知見によれば、アルカリ性条件下での安定性を高める方法は、もっぱらＡｓｎを含んだ配列の化学的不安定性に着目してアルカリ感受性の高い配列をアルカリ感受性の低い配列に変更する方法である。この方法によって実現できるアルカリ性条件に安定なイムノグロブリン結合ドメインの具体例を挙げると、２８−２９位にＡｓｎ−Ａｌａ配列をもち、かつ１１位、２３位及び４３位にそれぞれＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＧｌｕを有する変異体であるといえる。このイムノグロブリン結合タンパク質は、天然型のイムノグロブリン結合タンパク質に比べてアルカリ性条件下での安定性は高いが、その化学的安定性はなお充分なものではない。
国際公開第ＷＯ００／２３５８０号パンフレット 国際公開第ＷＯ０３／０８０６５５号パンフレット テイラー・クロス・アール（Ｔｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓ Ｒ．）他１名、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)、１９９１年、第２６６巻、３３号、ｐ．２２５４９−２２５５６ ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁

本発明の目的は、アルカリ性溶液による洗浄など苛酷な条件において、既存のものに比べて化学的安定性がより高いイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定するリガンドとして提供することにある。

アフィニティクロマトグラフィ用担体に固定するリガンド（タンパク質）に、アルカリ耐性を付与する方法として、アルカリ感受性の高いアミノ酸残基の置換による方法が、一般に多くのタンパク質に比較的共通して適応され得るが、ＡｓｎとそのＣ末端側のアミノ酸置換に限られていたため、自ずと限界があった。一方で、タンパク質の高次構造に着目して構造の安定性を高める様なアミノ酸置換を行うことでタンパク質の化学的安定性を高めることができる。この様な方法によれば、タンパク質毎に異なる構造情報が必要となり普遍性は低いが、アミノ酸配列情報のみによる改変に比べて、より安定性の高い変異体を創出できる。

プロテインＡは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）から単離され、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン及びＣドメインと呼ばれる５つの相同性を有するイムノグロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを有する。該プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、いずれも３個のへリックス構造（Ｎ末端側から順にへリックス−１、へリックス−２及びへリックス−３）とそれらを互いに連結している２個のループ構造（Ｎ末端側から順にループ−１及びループ−２）から構成される。イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与するアミノ酸は５位及び１３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９位、１０位及び３２位のＧｌｎ、１１位及び２８位のＡｓｎ、１４位のチロシン（Ｔｙｒ）、１７位のロイシン（Ｌｅｕ）、３１位のイソロイシン（Ｉｌｅ）及び３５位のリジン（Ｌｙｓ）であり、イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与する全てのアミノ酸が、へリックス−１及びヘリックス−２に存在している（Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ．他 １９９７年 Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｚ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２７２巻４号、５７３−５９０頁）。これらのアミノ酸置換はイムノグロブリンとの結合特性を変化させることが予測される。

Ｚドメインは、へリックス−３が欠落していてもイムノグロブリンと結合できるが、へリックス−３の欠落したＺドメインは安定性が低いことが知られている（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．他 １９９７年、 Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、第９４巻、１００８０−１００８５頁）。また、へリックス−２及びヘリックス−３の間にあるループ２のアミノ酸配列をＧｌｙが４個連続した配列に置換した変異体及びループ２にＧｌｙが６個連続した配列を挿入した変異体は、元のＺドメインタンパク質よりも安定性が低いことが知られている（Ｇｕｌｉｃｈ Ｓ．他 ２０００年、 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ａｌｌｏｗｓ ｍｉｌｄｅｒ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第７６巻、２３３−２４４頁）。すなわち、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、ループ２は、イムノグロブリン結合部位であるヘリックス−１及びへリックス−２と、ドメインの安定性を維持するヘリックス−３との間の相互作用に影響する部位であり、ループ２及びその周辺のアミノ酸を置換することで、プロテインＡのイムノグロブリン結合タンパク質を安定化できる可能性が考えられる。また、一般的にタンパク質におけるループ構造はヘリックス構造に比べてタンパク質表面に存在していることが多く、タンパク質分子が化学的な攻撃を受けやすい部位であると言える。

そこで、本発明者らは、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、へリックス−へリックス間、へリックス−ループ間の相互作用を強めて、タンパク質の構造的な安定度を増し、又はタンパク質の水和表面積を減らすことによって本タンパク質の化学的安定性を高めることを目的とし、本タンパク質の高次構造に関する情報を基に、（１）空間的に互いに近接し、非共有結合が形成可能な距離にあるアミノ酸間に、イオン結合、水素結合又は疎水結合を形成させる置換、（２）本タンパク質において露出表面積が大きく、近辺のアミノ酸との相互作用による高次構造の維持やイムノグロブリンとの結合に直接関与していないと考えられるアミノ酸のうち、電荷を有するなど親水性が高いアミノ酸を水和表面積のより小さいアミノ酸に置換を行った。得られたイムノグロブリン結合タンパク質の変異体について、ＩｇＧ結合活性及びアルカリ安定性を検討した結果、主としてループ１及びループ２及びその周辺部におけるアミノ酸を置換したタンパク質が、ＩｇＧ結合活性を有するとともにアルカリに対する安定性が高いことを見いだした。本発明者らは、さらに研究を進め、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
（１） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）３３位及び／又は４４位のアミノ酸を、３３位及び４４位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ロ）３７位及び／又は４０位のアミノ酸を、３７位及び４０位のアミノ酸間にイオン結合が形成されるアミノ酸に置換、
ハ）５位及び／又は３９位のアミノ酸を、５位及び３９位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、１６位、１７位、２２位及び３１位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸との間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法、
（２） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）３３位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
及び／又は、
ロ）３７位のアミノ酸を、Ｌｙｓに、４０位のアミノ酸を、Ｇｌｕにそれぞれ置換、
ハ）３９位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅに置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、前記（１）に記載の方法、
（３） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
７位及び／又は２５位のアミノ酸を、より水和表面積の小さいアミノ酸に置換することを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法、
（４） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）７位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、及び／又は
ロ）２５位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、
することを特徴とする前記（３）に記載の方法、

（５） 前記（１）〜（４）のいずれかに記載の置換によって改変されたイムノグロブリン結合タンパク質、
（６） 前記（１）〜（４）のいずれかに記載の置換を２つ以上組み合わせて改変されたイムノグロブリン結合タンパク質、
（７） 改変前のイムノグロブリン結合タンパク質がスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメインの等機能変異体であるＧ２９Ａ変異体（配列表：配列番号２）またはその等機能変異体であることを特徴とする、前記（５）又は（６）に記載のイムノグロブリン結合タンパク質、
（８） 配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質又はその等機能変異体、
（９） イムノグロブリン結合タンパク質の単位が２個またはそれ以上連結されており、その中に前記（５）から（８）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質を１又は２以上含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質多量体、
（１０） 前記（５）〜（８）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸配列、
（１１） 前記（１０）に記載の核酸配列を含むことを特徴とする遺伝子発現系、
（１２） アフィニティリガンドとして前記（５）〜（９）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質又はその多量体を含むことを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用担体、
（１３） 前記（１２）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を含むことを特徴とするアフィニティカラム、
（１４） 前記（１３）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いることを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのアフィニティ分離方法、及び
（１５） ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭを前記（１４）に記載のアフィニティカラムを搭載したアフィニティクロマトグラフィに付すこと特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭの分離方法、
に関する。

本発明により、アルカリ性条件下等における化学的安定性を著しく高めたプロテインＡの改変イムノグロブリン結合タンパク質を提供できる。
本発明の化学的により安定なイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとして利用することによって、繰り返し使用される際における、苛酷な条件での洗浄又は滅菌操作を伴う使用におけるアフィニティクロマトグラフィ用担体の有用寿命を延長できる。すなわち、本発明は、安価で高品質なイムノグロブリンを製造するために有用である。

本発明において、「プロテインＡ」とは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に存在する約５８．７ｋＤａのタンパク質で、５３−５８アミノ酸で構成される３個のα−へリックスの束から成るイムノグロブリン結合ドメインの単位を１分子中に５個有しており、Ｃｏｗａｎ Ｉ株の培養液から製造できる［Ｕｈｌｅｎ Ｍ．他 １９８４年 Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ａ ｇｅｎｅ ｅｖｏｌｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｏｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５９巻３号、１６９５−１７０２頁、及び福井三郎他監修 『バイオテクノロジー事典』 （株）シーエムシー、９５８頁（１９８６−１０−９）］。５個のイムノグロブリン結合ドメインは、Ｎ末端から順番にＥ，Ｄ，Ａ，Ｂ，Ｃと呼ばれており、これら各ドメインのアミノ酸配列には互いに高い相同性があり、すべてのドメインが単独でイムノグロブリンと結合する（例えば、米国特許番号ＵＳ５１５１３５０号参照）。

また、本発明において「アミノ酸」というときは、特に断らない限りタンパク質を構成するアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のことをいう。なお、本発明において、各アミノ酸残基は以下の略号で示す。
Ａｌａ（又はＡ）：アラニン、Ａｒｇ（又はＲ）：アルギニン、Ａｓｎ（又はＮ）：アスパラギン、Ａｓｐ（又はＤ）：アスパラギン酸、Ｃｙｓ（又はＣ）：システイン、Ｇｌｕ（又はＥ）：グルタミン酸、Ｇｌｎ（又はＱ）：グルタミン、Ｇｌｙ（又はＧ）：グリシン、Ｈｉｓ（又はＨ）：ヒスチジン、Ｉｌｅ（又はＩ）：イソロイシン、Ｌｅｕ（又はＬ）：ロイシン、Ｌｙｓ（又はＫ）：リジン、Ｍｅｔ（又はＭ）：メチオニン、Ｐｈｅ（又はＦ）：フェニルアラニン、Ｐｒｏ（又はＰ）：プロリン、Ｓｅｒ（又はＳ）：セリン、Ｔｈｒ（又はＴ）：スレオニン、Ｔｒｐ（又はＷ）：トリプトファン、Ｔｙｒ（又はＹ）：チロシン、Ｖａｌ（又はＶ）：バリン

「イムノグロブリン」とは、免疫グロブリンともいいＩｇと略記される。イムノグロブリンは、生体が細菌のような異物（自分以外の物）に反応して、異物に対する免疫抵抗力を与える役目をする抗体及びこれと構造上又は機能上の関連のもつタンパク質をいう。ヒトをはじめとする動物の体液中に存在し、リンパ系細胞、特にＢ細胞によって産生される。イムノグロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥが挙げられる。

例えばイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）は、研究用試薬または医薬としての需要が高い生体高分子であり、抗原により免疫した動物の血清や、モノクローナル抗体の作成技術を用いた細胞培養液などを出発原料として調製される。イムノグロブリンの分離・精製過程には、イムノグロブリンの可変領域（Ｆａ領域）と選択的な親和性を持つ抗原分子をアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが利用できる。しかし、優良なイムノグロブリンのＦａ領域と抗原分子との親和性は極めて強く、場合によっては結合したイムノグロブリンをカラムから流出させて回収する過程で強酸性の緩衝液を用いるなど苛酷な条件を必要とするため、しばしば回収の過程で無視できない量のイムノグロブリンが失活してしまうという問題がある。その様な問題がより小さな方法として、イムノグロブリンの不変領域（Ｆｃ領域）と選択的な親和性を持つプロテインＡをアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが広く利用されている。

「タンパク質」とは、ポリペプチド又はペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、天然型タンパク質の部分的断片や天然型の配列を人為的に改変した変異体を含む。
「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、選択的に結合する「イムノグロブリン結合ドメイン」を含んで成るタンパク質をいう。結合の様式は、イオン結合、水素結合又は疎水結合等の非共有結合である。
「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合能を有するポリペプチドの機能単位を指す。「Ｚドメイン」はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＢドメインをもとに、１位のＡｌａをＶａｌに（Ａ１Ｖ）、２９位のＧｌｙをＡｌａ（Ｇ２９Ａ）に置換した改変ドメインである。

「イムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体」又は「イムノグロブリン結合ドメインの等機能変異体」とは、部分的なアミノ酸の挿入、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質またはイムノグロブリン結合ドメインであって、改変前のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつイムノグロブリン結合特性（活性）において、改変前のタンパク質又はドメインと同等と見なされるものを指す。プロテインＡのＣドメインに係る等機能変異体としては、例えば配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＡのドメインＡ、Ｂ、Ｄ又はＥ等が挙げられる。

「アミノ酸間に疎水結合」又は「アミノ酸間にイオン結合」とは、イムノグロブリン結合タンパク質が高次構造を形成するときに空間的に近接するアミノ酸間に形成される非共有結合の形式をいう。非共有結合が形成可能なアミノ酸間における近接する距離は、結合の種類によって異なる。例えば、イオン結合は、一般に２．６Å〜３．５Åの距離にあるアミノ酸の間に形成される。疎水結合（疎水的相互作用）の強さはアミノ酸周辺の環境によって異なるが、一般に３．０Å〜４．０Åの距離にあるアミノ酸の間に形成される。ただし、互いが結合形成可能なアミノ酸の組み合わせに限られることは言うまでもない。具体的には、イオン結合はＧｌｕ又はＡｓｐ（マイナスの電荷を持つアミノ酸）とＬｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇ（プラスの電荷を持つアミノ酸）の間に限り形成される。また、疎水結合は、一般にＡｌａ，Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＰｒｏといった疎水性アミノ酸同士の間に形成される。タンパク質が高次構造を維持している状態において、近接するアミノ酸間の距離の近似値は、例えば公的なタンパク質データベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）から得たデータを基に、例えば分子設計支援・分子構造表示ソフトウェア「ＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ」（株式会社エルエイシステムズ製）を用いて表示させることができる。具体的には、例えば配列番号１で示されるドメインＺについて説明する。ドメインＺにおいて、３９位のＳｅｒは５位のＰｈｅとの間に疎水結合形成し得ないが、３９位のアミノ酸を例えばＬｅｕに置換することで、５位との距離が約３．５Åとなり、かつＬｅｕ及びＰｈｅはともに疎水性の強いアミノ酸であることから、これらの間には疎水結合が形成される。

「水和表面積の小さいアミノ酸」とは、親水性及び露出表面積がともに小さいアミノ酸をいう。一般にアミノ酸の親水性は、「電荷を持つアミノ酸」＞「極性だが電荷のないアミノ酸」＞＞「疎水性アミノ酸」の順に大きい。「電荷を持つアミノ酸」としては、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕが挙げられる。「極性だが電荷のないアミノ酸」としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｙが挙げられる。「疎水性アミノ酸」としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＰｒｏが挙げられる。アミノ酸の露出表面積は概ねアミノ酸の分子量に比例して大きくなる。
水和表面積の小さいアミノ酸への置換とは、具体的には配列番号１で示される第７位Ｌｙｓや第２５位Ｇｌｕから例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＰｒｏ等への置換が挙げられる。ただし、特別に理由がない限り、化学的性質が特徴的なＣｙｓやペプチド鎖の基本骨格に変化を及ぼす可能性があるＰｒｏ及びＧｌｙへの変換はタンパク質全体の構造を変化させる場合があるので、避けるほうが好ましい。また、イムノグロブリン結合ドメインのような水溶性タンパク質の表面に露出している親水性アミノ酸を疎水性の高いアミノ酸に置換すると、タンパク質全体の特性を変化させる場合があるので、避ける方が好ましい。

「アフィニティ」とは、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、酵素−基質、受容体−リガンド間などに認められる選択的な親和性をいう。
「アフィニティカラムクロマトグラフィ」とは、上記親和性を利用したカラムクロマトグラフィをいうが、一般に生体分子にタンパク質が関与する特異性の高い分子間相互作用を利用したタンパク質の分離方法である。この方法は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、酵素−基質、受容体−リガンド間などに認められる選択的な親和性を利用して、標的分子とそれ以外の分子を効率よく分離することができるものである。標的分子（本発明においてはイムノグロブリン）と特異的相互作用を有する分子（アフィニティリガンド）を共有結合によって固定化した不溶性担体をカラムに充填し、これに標的分子を含む溶液を流して標的分子のみをアフィニティリガンドに結合させ、次いでカラムを洗浄して混在する他の非特異的分子を除去した後、標的分子を溶出させることで、純度の高い試料を調製することができる。標的分子の溶出は、溶離液を変化、例えば塩濃度を徐々に高めるグラジエントにより変化させ、アフィニティリガンドに捕らえられていた標的分子をリガンドから離すことによって実施できる。すなわち、アフィニティクロマトグラフィは極めて効率のよい精製／分離技術であり、簡便かつ迅速に高純度の目的タンパク質を精製できる。「アフィニティカラム」とは、アフィニティクロマトグラフィ用担体を充填したアフニティクロマトグラフィを実施できるカラムをいう。

「アフィニティリガンド」とは、例えば抗原と抗体のペアで代表される特異的親和力に基づいて、例えば抗体を特異的に捕集（結合）する抗原等の官能基をいう。本発明においては、イムノグロブリン（Ｉｇ）を選択的に捕集（結合）する官能基となるイムノグロブリン結合タンパク質をいう。なお、本発明においては、単に「リガンド」ということもある。
「アフィニティクロマトグラフィ用担体」とは、不溶性担体にアフィニティリガンドを固定化させた担体をいう。固定化とは、不溶性担体にアフィニティリガンドを結合させることをいい、これによって不溶性担体が標的分子（イムノグロブリン）の親和性吸着体となる。不溶性担体としては、例えば、キトサン、デキストランなどの天然の高分子材料、ポリアクリルアミド、アセチルセルロース、ポリイミドなどの合成樹脂材料、シリケート結晶子多孔体、セラミック、多孔質ガラスなどからビーズ状に整形したものなどを挙げることができる。アフィニティリガンドの該担体への固定方法としては、担体結合法、架橋法、包括法等が挙げられる。これらは公知の方法に従って行なわれる。

「アルカリ性条件下」とは、タンパク質試薬やタンパク質医薬をアフィニティ精製する際に、使用後のクロマトグラフィにおいて、カラムに残留している有機物等を除去し、必要に応じて滅菌する洗浄が塩基性溶液を用いて行われるが、この洗浄の目的を達成し得る程度のアルカリ性をいう。具体的には、約０．１〜１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液等を用いることにより、前記カラム残留物の除去、滅菌または洗浄等の目的を達成し得る。

「化学的安定性」とは、タンパク質がアルカリ性条件や酸性条件或いは高温条件等において、アミノ酸残基の化学変化又はアミド結合の転移や切断などの変性を受けず、タンパク質の機能（本発明においては、イムノグロブリンの捕集活性）を保持する性質をいう。すなわち「化学的安定性」が高いほど変性、失活が起こりにくいタンパク質である。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を化学的に安定化する方法は、イムノグロブリン結合ドメインのへリックス−へリックス間、へリックス−ループ間の相互作用を強めて、タンパク質の構造的な安定度を増すとともに、露出表面積が大きく機能発現に関係しないアミノ酸の水和表面積を減らすことによって、本タンパク質の化学的安定性を高める変異の導入により実現する。具体的には、３３位及び４４位アミノ酸の組み合わせ、３７位及び４０位アミノ酸の組み合わせ、５位及び３９位のアミノ酸の組み合わせ並びに１６、２２位及び２７位アミノ酸の組み合わせ、１６位、１７位、３１位及び２７位アミノ酸の組み合わせ、さらに、７位及び２５位におけるアミノ酸に適切な置換を導入することで実施される。プロテインＡの化学的安定性を高めるための従来技術から考えると、本発明による変異体作成の基になるイムノグロブリン結合ドメインは、２３位及び２９位のアミノ酸が、それぞれＴｈｒ及びＡｌａであるのが望ましいが、これを必要条件とするものではない。

本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、目的とするイムノグロブリン結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを宿主に形質転換することにより、遺伝子組換え技術を応用して大量かつ経済的に組換えイムノグロブリン結合タンパク質を取得することができる。改変タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、宿主細胞へ導入され、形質転換体が構築される。イムノグロブリン結合タンパク質を製造するための技術としては、公知の方法を利用できる。核酸配列の部位指定突然変異の誘発、目的遺伝子の発現系の構築等についての標準技術は、例えばＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡｕｓｕｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。具体的には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの最小単位は６０アミノ酸程度より成る小さなタンパク質であるので、例えば望まれるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによって繋げ、そのままベクターに挿入して大腸菌を形質転換することで、クローニングすることができる。この場合、大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた遺伝子の塩基配列を採用することは、当業者によって、一般的に行われている。また改変前のクローンＤＮＡを鋳型として、ミスマッチ塩基対を組み込む合成オリゴＤＮＡを一回目のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして利用し、オーバーラップ伸張法を用いて意図した部位に突然変異を導入することもできる。

形質転換された大腸菌を培養し、目的とするイムノグロブリン結合タンパク質を生成させる。該タンパク質は、菌体中に生成されることから、培養後の形質転換体よりイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うことができる。生成された該タンパク質は、培養液中に分泌されることから、この形質転換体の培養上清を用いてイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うことができる。また、形質転換体中に生成されたイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うこともできる。イムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製は、自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。なお、イムノグロブリン結合タンパク質には、例えばヒスチジンタグ等をイムノグロブリン結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加し、ヒスチジンタグ融合タンパク質としてもよい。ヒスチジンタグ融合タンパク質は、例えば金属アフィニティ樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィ等により、容易に分離、精製できる。

さらに、プロテインＡ由来のイムノグロブリン結合タンパク質をイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドとして利用する際には、従来より２個以上、望ましくは４個程度のイムノグロブリン結合ドメインを連結した多量体タンパク質が製造され、使用されている。従って、本発明により得られる化学的に安定なイムノグロブリン結合タンパク質についても、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、望ましくは４個程度を連結した多量体たんぱく質として製造され、利用されることが好ましい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、単量体をコードするｃＤＮＡを意図する数だけ連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミド上に挿入して利用することで、イムノグロブリン結合ドメインの単位が２個またはそれ以上連結された多量体タンパク質を容易に製造することが可能である。目的のｃＤＮＡを連結するには、あらかじめ該ｃＤＮＡの両末端に制限酵素の認識配列を設計しておくと良い。ただし、この様な方法を採用する際には、目的タンパク質単量体の連結部分のアミノ酸配列が、制限酵素の認識配列にコードされるアミノ酸配列に置換又は／及び挿入されることに注意する必要がある。

「遺伝子発現系」とは、本発明の変異タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入される発現ベクター及び／又は該ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを導入した宿主細胞をいう。本発明の変異タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入される発現ベクターは、宿主細胞において複製可能である限りプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターも用いることができる。好ましくは、商業的に入手可能なものを使用することができる。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＱＥ系ベクター（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＥＴ系ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等が挙げられる。中でもｐＥＴ系ベクターが好ましい。

発現ベクターと宿主細胞は適切な組み合わせを選んで使用するのが望ましい。発現ベクターと宿主細胞の適切な組み合わせとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ、又はｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。

培養に使用される培地は、宿主細胞に応じて、適切な培地が選択される。例えば宿主細胞が大腸菌等の細菌の場合、培地は液体培地が適当であり、例えばＬＢ培地（Ｌｕｒｉｓ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ）、２×ＴＹ培地（１Ｌ中に１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌを含む）等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。また、タンパク質の発現誘導剤として、例えばイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記する。）等を添加してもよい。培養は通常約１５〜４０℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。

目的タンパク質を発現した細胞を遠心分離等により集め、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁して超音波処理等にて破砕した後、再び遠心分離することで、目的のイムノグロブリン結合タンパク質を可溶性画分に回収することができる。可溶性画分からイムノグロブリン結合タンパク質を精製するには、イムノグロブリンをアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが利用できる。また目的によっては、発現させるタンパク質のＮ末端部か、又はＣ末端部に２〜６個のヒスチジンから成るタグ（例えば、特開昭６３−２５１０９５号公報、或いは特開平３−１０１６９３号公報参照。）を付加した形で発現させ、金属キレートアフィニティクロマトグラフィを利用して精製することもできる。

本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとしてイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィに用いる際には、公知の好適なマトリックスに固定して使用することができる。典型的にはアガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルスチレン、デキストラン又は他のポリマー等、当該技術分野で公知の任意の固体支持体を用いることができる。

通常、リガンドタンパク質は、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、ビソキシラン、ジビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシル／トレシルクロリド、エピクロロヒドリン、カルボジイミド、グルタールアルデヒド、ヒドラジン、オキシランのようなカップリング剤、そしてまたカルボキシル又はチオール活性化マトリックス等によって、マトリックスに固定される。このようなカップリング剤及びカップリングの化学は、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている（Ｊａｎｓｓｏｎ，
Ｊ．Ｃ．及びＲｙｄｅｎ， Ｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ０−４７１−１８６２６−０）。簡単な固定化を可能にするマトリックスの種々の誘導体としては、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ及びＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ並びにエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６８（アマシャムバイオサイエンス株式会社）が挙げられる。

本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとして上記担体に結合させたアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いることにより、イムノグロブリン、例えばＩｇＧを容易に分離できる。また、該アフィニティクロマトグラフィ用担体は、従来のリガンドよりもアルカリ性条件下において安定であるので、例えば０．１〜０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液での洗浄サイクルを従来よりも多く繰返してもなお有効にイムノグロブリンの分離に用いることができる。

イムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ）の分離方法は、例えば上記アフィニティクロマトグアフィ用担体を充填したアフィニティカラムにＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭを含有する試料溶液を注入する。次いで、緩衝液（ｐＨ約７〜８）を用いて、アフィニティリガンドに結合されないイムノグロブリンや他の物質を完全に洗浄する。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝、クエン酸緩衝液等が挙げられる。アフィニティリガンドに結合したイムノグロブリンは、例えば塩濃度約０．１〜０．５Ｍを含む上記緩衝液又はｐＨ約１〜５程度の緩衝液（例えばクエン酸−塩酸緩衝液等）で溶出する。イムノグロブリンの検出は、例えばＵＶ２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行なうことができる。

以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

Ｚ−ドメインを基にして改変されたイムノグロブリン結合タンパク質の構築とその化学的安定性の評価
（１）発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの構築
目的とするイムノグロブリン結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドクローンを構築する工程を図１に示した。まず、制限酵素（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）を用いてｐＥＴ−３ａプラスミド（ノバジェン、メルク株式会社）を切断し、アガロースゲル電気泳動後、Ｔ７−プロモーター領域を含むベクター部分をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。表１の２対４本の合成オリゴヌクレオチドのうち、ＳＨ６−１Ｒ及びＳＨ６−２Ｕの５’末端をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いてリン酸化した後、ＳＨ６−１ＲをＳＨ６−１Ｕと、ＳＨ６−２ＵをＳＨ６−２Ｒとそれぞれ混合してアニーリングさせた。アニーリングにより得られた２本のＤＮＡ断片を、上述の制限酵素で切断したｐＥＴ−３ａベクターと混合し、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いてライゲーション反応を行った。次いでライゲーション反応物にてＤＨ５αコンピテントセル（インビトロゲン株式会社）と混合後３０分間氷上に置き、９０秒間４２℃に置いた後直ちに氷上に５分間置くことで該宿主大腸菌を形質転換し、次いで０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（以下、ＬＢ＋Ａｍｐと略記する）培地プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に接種し、増殖させ、目的のプラスミドで形質転換された大腸菌クローンを選択した。この大腸菌株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いてプラスミドを精製し、シグナルペプチドをコードする塩基配列（配列表：配列番号７の第５番目〜１９番目；図１中、Ｓｉｇｎａｌで示される。）とヒスチジンタグをコードする塩基配列（配列表：配列番号７の第２６番目〜４３番目；（図１中、６×Ｈｉｓで示される。）の間に制限酵素（ＮｈｅＩ；配列表：配列番号７の第２０番目〜２５番目）を挟む塩基配列を有する発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨを得た。

上記発現ベクターの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。

この２対の合成オリゴヌクレオチドの挿入によって得られる核酸配列は以下の通りである。
TATGGCACAGCACGACGAAGCTAGCCATCACCATCACCACCATTAATAATAAGCGGCCGCTGCAG（配列表の配列番号８）

（２）発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤの構築
発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの制限酵素サイトにイムノグロブリン結合ドメイン（以下、ＩＢＤということもある。）をコードする塩基配列を挿入した発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤを構築した。
まず、本発明の発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤに先立ち、前記発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの制限酵素サイトにＺドメインの等機能改変体（Ｚドメインの１位をＡｌａに置換したＺドメイン；Ｚ−Ｖ１Ａ）及びＣドメインの等機能改変体（Ｃドメインの２９位をＡｌａに置換したＣドメイン；Ｃ−Ｇ２９Ａ）をコードするｃＤＮＡを挿入した、発現用プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築した。

ｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築するために用いた合成オリゴヌクレオチドを表２に示した。表２において５対の合成オリゴヌクレオチド、すなわちＣＺ−１ＵとＣＺ−１Ｒ、Ｚ−２ＵとＺ−２Ｒ、ＣＺ−３ＵとＣＺ−３Ｒ、Ｚ−４ＵとＺ−４Ｒ及びＣＺ−５ＵとＣＺ−５Ｕとをアニーリングし、ｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａの構築に用いた。また同様にＣＺ−１ＵとＣＺ−１Ｒ、Ｃ−２ＵとＣ−２Ｒ、ＣＺ−３ＵとＣＺ−３Ｒ、Ｃ−４ＵとＣ−４Ｒ及びＣＺ−５ＵとＣＺ−５Ｕとをアニーリングし、ｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａの構築に用いた。次いで、ＮｈｅＩ酵素で切断した上記（１）で作製した発現プラスミドｐＥＴ−ＳＨを、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（プロメガ株式会社）を用いて脱リン酸化し、上記５対のアニーリングした合成オリゴヌクレオチドを混合し、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーション反応を行った。なお、ライゲーションに先立ち、ＣＺ−１Ｕ及びＣＺ−５Ｒ以外の合成オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いて５’末端をリン酸化した。また、５対の合成オリゴヌクレオチドから構築されるイムノグロブリン結合ドメインの核酸配列は、Ｎ末端側がＳｐｅＩの認識部位、Ｃ末端側がＮｈｅＩの認識部位となるよう設計した。ＮｈｅＩの切断により生じる開列形状は、ＳｐｅＩにより生じる開列形状と全く同一であるので、イムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片は、プラスミドｐＥＴ−ＳＨのＮｈｅＩ認識部位に、ライゲーション反応によって挿入することができる
ライゲーション反応物にてＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、目的のプラスミドを有するクローンを選択した。選択したプラスミドは、Ｔ７プロモーターの支配下に、シグナルペプチド−Ｚ−Ｖ１Ａ（又はＣ−Ｇ２９Ａ）−ヒスチジンタグの順番で連結されたＺ−Ｖ１Ａ融合タンパク質又はＣ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質をコードする核酸配列を有する発現用プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａであった。

Ｚ−Ｖ１Ａ融合タンパク質（配列表：配列番号２４）及びＣ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質（配列表：配列番号２６）のアミノ酸配列とそれをコードする核酸配列（配列表：配列番号２３及び２５）をそれぞれ以下に示す。
Ｚ−Ｖ１Ａ融合タンパク質：イムノグロブリン結合ドメイン部分は配列番号１に相当

Ｃ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質：イムノグロブリン結合ドメイン部分は配列番号２に相当

（３）本発明イムノグロブリン結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入した発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤの作製
上述の発現プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａの作製方法と同様の方法を用い、表２の５対１０本の核酸配列を改変することで、部位特異的なアミノ酸置換を導入した本発明のイムノグロブリン結合ドメインを得た。各改変体を製造するために用いた５対の合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを表７及び表８に、各合成オリゴヌクレオチドの配列を表５及び表６に示した。
なお、５対の合成オリゴヌクレオチドから構築されるイムノグロブリン結合ドメインの核酸配列は、Ｎ末端側がＳｐｅＩの認識部位、Ｃ末端側がＮｈｅＩの認識部位となるよう設計した。ＮｈｅＩの切断により生じる開列形状は、ＳｐｅＩにより生じる開列形状と全く同一であるので、イムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片は、プラスミドｐＥＴ−ＳＨのＮｈｅＩ認識部位に、ライゲーション反応によって挿入することができる。正しい方向に挿入されたプラスミドを選択すれば、挿入後イムノグロブリン結合ドメイン部分のＮ末端側はＳｐｅＩでもＮｈｅＩでも切断できなくなるが、Ｃ末端側はＮｈｅＩで切断できるので、後に同様の操作を繰り返すことでイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片をＣ末端側にさらに挿入して、複数のイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡを複数連結した。例えば４個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡを連結したプラスミドは、例えばシグナルペプチド（図１中、Ｓで示される。）−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−ヒスチジンタグ（図１中、Ｈｉｓで示される。）を有するタンパク質を製造できる。
なお、シグナルペプチド−イムノグロブリン結合ドメイン間、イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン間及びイムノグロブリン結合ドメイン−ヒスチジンタグ間の連結部位には、それぞれＡｌａ−Ｓｅｒの２アミノ酸の配列が挿入される。

タンパク質の発現及び目的タンパク質の精製：
構築したプラスミドにて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（ノバジェン、メルク株式会社）を形質転換し、次いでアンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ含有ＬＢ培地（Ｌｕｒｉｓ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ；以下、ＬＢ＋Ａｍｐ培地と略記する。）プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に接種して増殖させ、目的のタンパク質を発現する大腸菌株を得た。この大腸菌株を０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて濁度が０．４〜０．５前後に達するまで振とう培養した後、最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに２５℃にて６時間培養し、目的とする融合タンパク質を発現させた。

培養後の大腸菌を遠心分離によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略記する）で洗浄した後、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理して大腸菌を破砕し、遠心分離によって目的の融合タンパク質を上清に回収した。次いでこの溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、Ｈｉｓ Ｔｒａｐ Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社）にアプライし、カラムを４０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で洗浄した後、０．５Ｍ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を用いて目的タンパク質を流出させて回収した。以上の操作により精製された目的タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）によって確認し、タンパク質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて決定した。

イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合活性及びそのアルカリ性条件下における化学安定性の評価：
イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合活性は、酵素結合免疫反応吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法）を応用して測定した。まず、９６ウェルイムノプレート（ＮＡＬＧＥ ＮＵＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｋ．Ｋ．）の各ウェルに５μｇ／ｍｌのヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを入れ、室温にて５〜２４時間放置し、ＩｇＧを吸着させた後、各ウェルを、４％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）を含むＰＢＳ０．２ｍｌで各ウェルをブロッキングした。次いで、各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下Ｔ−ＰＢＳと略記）で洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下反応緩衝液と略記する）を用いて、６．０〜２００ ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈、
調製したイムノグロブリン結合タンパク質の溶液を０．０５ｍｌ加えて室温で１時間放置したのち、ウェルを再度Ｔ−ＰＢＳで洗浄した。次に、反応緩衝液にて８０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｈｉｓタグ抗体（ナカライテスク株式会社）溶液を０．０５ｍｌ加えて室温で１時間放置したのち、再びウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼの基質として２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸［２，２’−Ａｚｉｎｏ ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；以下ＡＢＴＳと略記する。］を用い、ＩｇＧに結合したイムノグロブリン結合タンパク質を比色定量した。すなわち、各ウェルに０．３ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ及び０．００６％過酸化水素を含む０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）を０．１ｍｌ加えて室温で３０分発色させた後、１．５％シュウ酸水溶液を０．１ｍｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍと４９０ｎｍの吸光度差を測定した。

また、あらかじめ０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温したイムノグロブリン結合タンパク質を用いて、同様の測定を同一のプレート上で行った。イムノグロブリン結合タンパク質の濃度と測定した吸光度差との関係のグラフを図２に表す。この結果から、改変Ｚ−ドメイン及び改変Ｃ−ドメインは、等濃度で同程度のＩｇＧ結合活性を示すことが確認できた。また、アルカリ性条件下で処理されたイムノグロブリン結合タンパク質は、同一濃度を用いても、アルカリ処理前よりも測定値が低かった。この結果はアルカリ性条件下での処理によって、これらイムノグロブリン結合タンパク質のＩｇＧ結合活性が低下したことを示している。両ドメインについて、アルカリ処理前の濃度−吸光度曲線を基に、アルカリ性条件下未処理のＩｇＧ結合活性を１００％としたときの０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温した後の残存活性を算出すると、Ｚ−Ｖ１Ａは３１．７±５．０％であったのに対して、Ｃ−Ｇ２９Ａは７９．３±１０．６％であった。

上述の改変Ｚ−Ｖ１Ａを基にして、表７及び８に示す各改変体を製造し、各々のＩｇＧ結合活性及びアルカリ性条件下の処理後残存活性を測定した。構築した改変体のうち、目的タンパク質の発現が確認された改変体について、測定した活性を表９に表した。また、表９に示した改変体のうち、改変Ｚ−ドメインと同程度のＩｇＧ結合活性が認められたものについて、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温し、アルカリ性条件下での処理後残存活性を測定した。その結果を図３に示す。この結果は、８位と４２位、３３位と４４位、３７位と４０位、５位と３９位及び２７位と１６位、１７位、２２位、３１位の少なくとも１つの部位との間に非共有結合を形成させるアミノ酸置換ならびに７位及び２５位の親水性アミノ酸のより水和表面積の小さいアミノ酸への置換によって、Ｚドメイン又はその等機能変異体から成るイムノグロブリン結合タンパク質の化学的安定性が増すことを示している。なおＮ２３Ｋ改変体及びＮ２３Ｄ＋Ｅ２５Ｑ改変体もＺ−ドメインに比べて化学的安定性が増している結果を得たが、Ｎ２３Ｔ改変体より安定でなかったので、これら改変体の安定化は、２３位と２５位との間に非共有結合が形成されたことによるものではなく、２３位のＡｓｎが、アルカリ感受性が低いアミノ酸に置換されたことによる効果であると考えられた。またＥ２５Ａ改変体やＮ２３Ｔ＋Ｅ２５Ｔ改変体がＮ２３Ｔ改変体に比べてより安定であったことから、２５位のアミノ酸をより水和表面積の小さいアミノ酸に置換することによって、Ｃ−ドメインのＧ２９Ａ改変体よりさらに安定な改変体を製造できることを示している。

本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質は、アルカリ性条件下での安定性が高く、イムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドタンパク質として有用である。

図１は、イムノグロブリン結合タンパク質の発現プラスミドを構築する手順を表した図である。 図２は、ＥＬＩＳＡ法の応用によってイムノグロブリン結合タンパク質のＩｇＧ結合活性を測定した図である。 図３は、本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学安定性を比較した図である。

Claims (15)

1. スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
   イ）３３位及び／又は４４位のアミノ酸を、３３位及び４４位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
   ロ）３７位及び／又は４０位のアミノ酸を、３７位及び４０位のアミノ酸間にイオン結合が形成されるアミノ酸に置換、
   ハ）５位及び／又は３９位のアミノ酸を、５位及び３９位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
   ニ）２７位のアミノ酸を、１６位、１７位、２２位及び３１位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸との間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
   のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法。
2. スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
   イ）３３位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
   ロ）３７位のアミノ酸を、Ｌｙｓに、４０位のアミノ酸を、Ｇｌｕにそれぞれ置換、
   ハ）３９位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅに置換、
   ニ）２７位のアミノ酸を、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
   のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
   ７位及び／又は２５位のアミノ酸を、より水和表面積の小さいアミノ酸に置換することを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法。
4. スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
   イ）７位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、及び／又は
   ロ）２５位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、
   することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の置換によって改変されたイムノグロブリン結合タンパク質。
6. 請求項１〜４のいずれかに記載の置換を２つ以上組み合わせて改変されたイムノグロブリン結合タンパク質。
7. 改変前のイムノグロブリン結合タンパク質がスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメインの等機能変異体であるＧ２９Ａ変異体（配列表：配列番号２）またはその等機能変異体であることを特徴とする、請求項５又は６に記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
8. 配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質又はその等機能変異体。
9. イムノグロブリン結合タンパク質の単位が２個またはそれ以上連結されており、その中に請求項５から８のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質を１又は２以上含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質多量体。
10. 請求項５〜８のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸配列。
11. 請求項１０に記載の核酸配列を含むことを特徴とする遺伝子発現系。
12. アフィニティリガンドとして請求項５〜９のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質又はその多量体を含むことを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用担体。
13. 請求項１２に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を含むことを特徴とするアフィニティカラム。
14. 請求項１３に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いることを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのアフィニティ分離方法。
15. ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭを請求項１４に記載のアフィニティカラムを搭載したアフィニティクロマトグラフィに付すことを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭの分離方法。
    

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