WO2015170711A1

WO2015170711A1 - プラズモニックチップおよびそれを用いるがん疾病の蛍光画像ならびにラマン分光による診断方法

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Publication number: WO2015170711A1
Application number: PCT/JP2015/063219
Authority: WO
Inventors: 寛晃伊藤; 裕起長谷川; 長谷川　克之
Original assignee: 有限会社マイテック
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2015-11-12
Also published as: KR102232197B1; JP6492066B2; SG11201609331XA; ES2905092T3; US10215700B2; IL248760B; JP2016208959A; IL248760A0; CN106461556A; MY193573A; NZ726748A; EP3141888A1; CA2948353A1; HUE057218T2; CN106461556B; EP3141888A4; CA2948353C; AU2015256932B2; JPWO2015170711A1; KR20170007774A

Abstract

　【課題】プラズモニック基板、それを用いる関連物質または腫瘍マーカーの蛍光画像診断方法ならびにそれを用いるラマン分光分析方法の提供。　【解決手段】本発明では、血液および生体試料中のがん関連物質を選択的に検出することができるので、そのプラズモニックチップ上の結晶または凝集状態の蛍光画像診断により、がんの存否が判断できる。また、その結晶のラマンスペクトルよりヒストンテールの化学修飾状態を判定することができるので、がんの早期発見、がんの進行度に関する判定を行うことができる。また、本発明の第２は、基板上で凝集したがん関連物質の位置は目視では判別できない。そこで、顕微鏡の画像診断で結晶領域の位置を決定し、位置決定した結晶に対しレーザーを照射してヒストンテールの化学修飾、リモデリング因子を解析することを特徴とするがん疾病の診断方法を提供する。

Description

プラズモニックチップおよびそれを用いるがん疾病の蛍光画像ならびにラマン分光による診断方法

　本発明は、蛍光顕微鏡での蛍光画像診断に適する蛍光観測基板（プラズモニックチップ）および体液、特に血液中のがん関連物質を捕捉して局在表面プラズモン共鳴による自家蛍光および腫瘍マーカーの増強された蛍光画像によるならびにラマン分光によるガン疾病の診断を行う方法に関する。

　がん診断および治療学の分野において、ガン関連物質としてメチル化DNA、及びそれらを結合したヒストンとの結合蛋白（ヌクレオソームおよびクロマチン）が注目されており、それらを捕捉し、その結晶化又は凝集状態を画像診断するとともにその結晶にレーザー照射してDNAのメチル化状態及びヒストンコードの化学修飾状態を分析することは、ガンの存在の簡易診断、早期発見に重要である。

　すべての生物の細胞を作るための情報は、そのDNAに含まれている。DNAは、4種の塩基、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)およびシトシン(C)の固有の配列で構成されている。これらの塩基は、DNA二重らせんを形成する2本の鎖上のAとTおよびGとCの対合である。これらの対の鎖が、遺伝子と呼ばれる領域にグループ分けされた特定の分子を作るための情報を記憶する。各細胞内には、どの遺伝子がオンになる、すなわち発現するのかを制御して、その細胞固有の機能を規定するプロセスがある。これらの制御機構の一つは、シトシン(C)にメチル基を付加することによって提供される。メチル基で標識されたCはmCと表記できる。

　DNAメチル化は、一部の遺伝子が発現しているかどうかを決定する際に重要な役割を演
じるといわれ、必要とされない遺伝子をオフにすることにより、DNAメチル化は、生物の
正常な発達および機能にとって不可欠な制御機構である。または、異常なDNAメチル化は
、加齢および多くのがんの発生とともに認められる変化の基礎となる機構の一つでもあるといわれる。

　がんは、旧来、DNA内の染色体突然変異によって生じる遺伝子変化に関連づけられていた。突然変異は、遺伝性であるのか後天性であるのかにかかわらず、健常な状態を維持するためにきわめて重要な遺伝子の発現の損失を招くおそれがある。今や、比較的多数のがんが、多くの場合、DNA突然変異に近い不適切なDNAメチル化によって引き起こされるということを裏付けられている。多くの場合、DNAの過剰メチル化が決定的な遺伝子、たとえば腫瘍サプレッサー遺伝子またはDNA修復遺伝子を過ってオフにして、がんの発生および進行を許してしまう。遺伝子発現を制御するためのこの非突然変異プロセスは後成学といわれる。

　DNAメチル化は、メチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素によって実行されるところ
の、メチル基(m)がDNAの特定のシトシン(C)に付加されるDNAの化学的修飾である。この非突然変異(後成的)プロセス(mC)は、遺伝子発現調節における決定的要因であるといわれた（非特許文献１）。そこで、DNAメチル化に注目し、これを検出する観点から結腸がんの早期検出方法が提案されている（特許文献１）。しかし、メチル化DNAを検出することは複雑かつ困難で、時間とコストを要するので簡易迅速検出に不向きである。

　そこで、金属ナノ結晶シートを作成し、これを蛍光観測基板とすることで、特別な光学系を組むことなく、市販の蛍光顕微鏡で簡単操作で低濃度まで、精度よくマーカーの蛍光を計測できる方法の開発が望まれる。

　即ち、マーカー検出法として現在、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）及びその装置（特許文献２）及び酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が提案されている。前者ＳＰＲは操作が簡単で迅速性があるが、感度不足と装置やチップの価格に問題があり、後者ＥＬＩＳＡは高感度で装置やチップの価格は安価であるが、迅速性や操作性に問題があり、その場診断方法としては不向きである。そこで、蛍光標識マーカーの高度検出と感度と迅速性を実現するプラズモニックチップとしてピッチ３５０ｎｍの周期構造をもつ基板に銀と酸化亜鉛の薄膜を成膜してプラズモニックチップを用いる方法（特許文献３）や金属ナノ粒子を有機溶媒中に分散させ、有機溶媒を揮発させて金属ナノ粒子を二次元方向に自己組織化して粒系の揃った銀ナノ微粒子からなる局在プラズモン蛍光増強シート（特許文献４）を用いる方法が提案されている。

特表２０１０－５１７５８２号公報ＷＯ２０１１－１１４７２号公報特開２０１１－１５８３６９号公報ＷＯ２０１３－０３９１８０号公報

J.G. Herman, Seminars in Cancer Biology, 9: 359-67, 1999

発明の解決しようとする課題

　しかしながら、所定のプラズモニックチップの量産は簡単でなく、しかも量産されたプラズモニックへのがん関連物質の吸着又は蛍光標識マーカーの吸着が容易でなく、現状のプラズモニックチップを利用して所期の蛍光増強効果を発揮させることは困難である。そこで、本発明は量産容易なプラズモニックチップを提供し、プラズモニックチップへのがん関連物質、抗体等の吸着物質の吸着又は蛍光標識マーカーの吸着を実現することにより、プラズモニックチップ上でプラズモン増強により蛍光強度の発光を数倍から数十倍増強し、蛍光画像診断することができるプラズモニックチップおよびそれを用いるがん疾病の診断方法の提供を第1の目的とする。

　本発明の第１は、銀錯体量子結晶を作成した基板又はその銀錯体量子結晶をアルカリ処理して形成した過酸化銀メソ結晶基板はＵＶ、赤外光を含め、光照射により銀錯体量子結晶及び過酸化銀メソ結晶は局在表面プラズモン共鳴という物理現象を利用することができる（局在表面プラズモン共鳴効果を有する）だけでなく、第2に銀錯体量子結晶を作成するときに配位子等の一種として抗体、蛍光標識マーカーをまたは配位子に結合する蛍光標識マーカーを吸着するチップを作成することができる化学的性質を有する。他方、過酸化銀メソ結晶は血清中のＤＮＡを含むヌクレオソーム又はクロマチンを含むがん関連物質、特にDNAが巻きついたヒストンを凝集させる化学的性質を有する。したがって、本発明の第1はかかるプラズモニックチップを用いることにより腫瘍マーカー又はがん関連物質としてヌクレオソーム、又はクロマチンを選択的に捕捉して通常の蛍光顕微鏡で蛍光画像診断を行ってがんの存否を判断することができることを見出してなされたもので、本発明は銀錯体量子結晶領域を有し、腫瘍マーカーをがん関連物質とともに吸着し、局在表面プラズモン共鳴機能で増強した蛍光画像観察するためのプラズモニックチップ及び銀錯体量子結晶をアルカリ処理してなる過酸化銀を含む銀酸化物のナノ結晶からなり、がん関連物質を局在表面プラズモン共鳴機能で増強した自家蛍光画像観察するためのメソ結晶領域を有し、がん関連物質等の吸着物質を捕捉し、局在表面プラズモン共鳴機能で増強した蛍光画像観察するためのプラズモニックチップにある。

　本発明の第２は上記プラズモニックチップを使用してがん疾病の画像診断を行う方法であって、その一つは銀錯体量子結晶をアルカリ処理してなる過酸化銀を含む銀酸化物のナノ結晶からなるメソ結晶領域を有するプラズモンチップを用意し、該プラズモニックチップの結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中の蛋白分子を正電荷を有するがん関連物質を選択的に吸着し、プラズモニックチップ上に凝集する結晶領域に光照射し、がん関連物質の自家蛍光により蛍光画像診断してがんの有無を診断することを特徴とするがん疾病の蛍光画像診断方法である。他方、もう一つの方法は、銀錯体量子結晶を銀錯体の還元電位より卑なる金属基板上に作成するにあたり、蛍光機能を有する腫瘍マーカーを金属錯体量子結晶の配位子とともに又は配位子の1種として添加して結晶領域に腫瘍マーカーを配置するかまたは作成した銀錯体量子結晶に被検体試料とともに腫瘍マーカーを滴下して腫瘍マーカーを結晶領域に配置し、銀錯体量子結晶領域に光照射して局在表面プラズモン共鳴によって腫瘍マーカーの蛍光発光強度を増強させ、腫瘍マーカーの増強された蛍光画像を観測することを特徴とするがん疾病の蛍光画像診断方法にある。

また、基板上で凝集したがん関連物質の位置は目視では判別できない。そこで、顕微鏡の明視画像診断でそ結晶領域の位置を決定し、位置決定した結晶に対しレーザーを照射してヒストンテールの化学修飾、リモデリング因子を解析することを特徴とするがん診断方法でもあり（図１９）、本発明の第３はプラズモチップ上で捕捉したがん関連物質の蛍光画像を含む、画像を目印に、５１４、５３２、６３３，７８５ｎｍの各種レーザー光を照射してラマン分光分析により精密な分析をすることにある。したがって、本発明は体液、特に血液中のがん関連物質を選択的にトラップし、ヒストンまたはクロマチンの構造を解析するとともに、ヒストンテールを化学修飾する因子を解析することにより、がんの存否に始まってがんの早期診断を可能とするものである。

　本発明によれば、プラズモニックチップを用いることにより、がん関連物質を又は腫瘍マーカーを選択的に吸着することができるので、がん関連物質の自家蛍光又は腫瘍マーカーの蛍光強度を局在表面プラズモン共鳴により増強して蛍光画像判断を容易にすることができる。ところで、本発明者らは金属錯体水溶液を錯体を形成する金属より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）金属基板上で電極電位差により化学還元して量子結晶（ナノサイズの金属錯体結晶）を凝集させている。銀錯体の場合、チオ硫酸銀水溶液を銀より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）の銅または銅合金上で凝集させることにより銀錯体の量子結晶を化学還元法を採用して形成している。詳しくは、金属錯体の水溶液中の濃度は主として形成する量子結晶のサイズを考慮して決定すべきであり、分散剤を使用するときはその濃度をも考慮するのがよく、通常、１００ｐｐｍから５０００ｐｐｍの範囲で使用できるが、配位子の機能にも依存してナノクラスタというべきナノサイズを調製するには５００から２０００ｐｐｍの濃度が好ましい。

　量子結晶を形成する金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（Ｉ）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
　　　　式（Ｉ）：Ｅ゜＝（ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）
　ここで、金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する。特に、金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇβi）が８以上の銀錯化剤
とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよく、ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。銀錯体は平均直径が５～２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００～２００ｎｍとなる。

　かかる銀錯体量子結晶をアルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）すると、以下の反応により銀ハロゲン化物を核として過酸化銀を含み、銀酸化物の複合物の針状ナノ結晶群が形成されるものと思われ（図５）、しかも水中で（－）荷電を帯びる一方、ＤＮＡが巻き付いたヒストンが（＋）荷電を帯びるため（図７(a)）、この遊離ヌクレオソームに代表される正電荷を帯びたがん関連物質を選択的に吸着することが見出れた。しかも過酸化銀を含む銀酸化物の針状ナノ結晶群はレーザー光の照射により還元され、金属銀を析出するため、レーザー光照射により表面プラズモン増強効果を示し、吸着されたヒストンに代表されるがん関連物質の自家蛍光を検出することができる。
Na₂S₂O₃+４NaClO＋H₂O →Na₂SO₄+H₂SO₄ (2NaHSO₄)＋４NaCl
Ag+ + NaCl→　AgCl　＋　Na+
Ag+ ＋３NaOCl →　２AgCl　＋　NaClO3　＋　2Na+
Ag+ + OH- 　→　AgOH
２Ag^＋＋　２OH-　→　Ag₂O＋H₂O

　本発明の銀酸化物の複合針状ナノ結晶群は、過酸化銀を含む銀酸化物が自己組織化してニューロン状の三次元超構造体（メソ結晶）を形成するもので（図８及び９）、銀イオン水溶液をAg/AgCl電極を用いて定電位電析を行って、又は銀の量子結晶をアルカリ処理で酸化することにより形成することができるが、銀錯体量子結晶、例えばチオ硫酸銀量子結晶をアルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）することによって容易に形成することができる。

　また、本発明のプラズモニックチップを用いることにより、蛍光画像診断により、血中含む生体試料中の、がん関連物質の存否、クロマチンリモデリングを制御する化学修飾因子を判定することができる。すなわち、銀ハロゲン化物又はハロゲンを含む銀酸化物の複合針状ナノ結晶群、すなわち過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶領域（図８及び９）を有するプラズモニックチップを用意し、該プラズモニックチップの針状ナノ結晶群領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中の正電荷を有するがん関連物質を選択的に捕捉させる。

（プラズモニックチップ上の結晶の画像診断）
　吸着したがん関連物質に紫外、赤色、緑色レーザを照射して蛍光顕微鏡（倍率５０倍）で観測した。胃がん（図１（ａ），（ｂ）及び（ｃ））、大腸がん（図２（ａ），（ｂ）及び（ｃ））、の場合のがん関連物質の結晶の蛍光画像を示し、良性疾患については蛍光を示さなかった。この画像の結晶の形状、輝度、面積等の情報を数値化し、数値をヒストグラムにすることができる。蛍光顕微鏡で観測すると、良性疾患と胃がん、大腸がんとの間には結晶の形態に差異が見られる。したがって、過酸化銀を含むメソ結晶のプラズモニックチップを用いると、血液中のがん関連物質を選択的に捕捉してがんの存否を蛍光観察して識別することができることがわかる。

（プラズモニックチップ上の腫瘍マーカーの画像診断）　プラズモニックチップ上に吸着した腫瘍マーカーの結晶は目視では観測できないが、紫外、赤色、緑色レーザを照射して蛍光顕微鏡（５０倍）で観測すると、点状に分散した結晶塊が観測される。この結晶塊の一つに対し各種レーザー光を照射してそこからのラマンスペクトルを検知することにより、表面増強ラマン散乱（SERS）の強度によりがん疾病を判断することができる。

　（がん関連物質の選択的捕捉）
　血清中のがん関連物質としては、ＤＮＡがひと巻きされたヒストン（ヌクレオソーム）、それらが集まりひも状になった構造のクロマチン（線維）を含むと考えられる。グロブリンは正電荷を帯びるが、その増加は他のがん関連物質に比べて最大2倍以下であるので、本発明で検知される物質はがん進行に伴う増加が１００倍以上に達するのでグロブリン以外の増加（がん関連物質）が検知されていることを物語っている。また、正常細胞から出るＤＮＡ、アセチル化してヒストンから解離したＤＮＡ、そしてアルブミンは血清中の約６０％を占めるが、負荷電を帯びるため、本発明では吸着されない。したがって、がん関連物質の蛍光画像診断には好都合である。これを確認するため、以下の試験を行った。図１５は良性疾患（Benign disease）, 胃がん（Gastric cancer）,大腸がん（ Colon cancer）の１０倍希釈、１００倍希釈した場合の１００倍、３０００倍、３Ｄ画像を示す。図１６はKatoIII(胃印環細胞がん）培養し、そのがん細胞から抽出した二重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ及びプロテンを希釈して観測したものの、（a,b,c）はレーザ顕微鏡を使用したKatoIII（胃印環細胞がん）の、（d,e,f）はそこから抽出したＤＮＡの，（g,h,i）はＲＮＡの、（j,k,l）はプロテンの表面構造を示す１００倍、３０００倍（画像及びアンジュレーション）、３Ｄ画像を示し、（m,n,o）はがん細胞を物理的に粉砕した時の表面構造を示す１００倍、１０００倍（画像及びアンジュレーション）、３Ｄ画像を示す。図１７は化学的培養したがん細胞(a),そこから抽出したＤＮＡ(b)の，ＲＮＡ(c)の、プロテン(e)の、物理的に粉砕したがん細胞(e)の、胃がん患者からの血清(f)の、大腸がん患者からの血清(g)の、良性疾患の患者からの血清(h)のメソ結晶プロテオニックチップ上でのラマン散乱スペクトルを示す。なお、KatoIII（胃印環細胞がん）、MKN-45（低分化型胃線がん）、CW-2（日本人由例大腸がん細胞株）、PK45-P（ヒト膵臓がん細胞株）、NHDF-Neo（皮膚線維芽細胞）を示す。これらの結果から本発明のプロテオニックチップによりがん関連物質が選択的に捕捉され、検出されたことを示すものと考えられる。

　また、本発明の針状ナノ結晶（過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶）は、過酸化銀を含む銀酸化物が水溶液中で負電荷を帯びやすく、試料（ターゲット分子）と接触して電荷移動錯体を形成すると思われる。さらに、銀酸化物は光エネルギーを受けて還元され、金属銀を析出するので、規則的に配列する金属ナノ粒子の持つ局在表面プラズモン共鳴により増強効果を有することになる。したがって、本発明の針状ナノ結晶（メソ結晶）は非金属であるが金属性質とイオン化性質を兼ね備えるため、表面増強ラマン散乱（SERS）測定用に好適なプラズモニックチップとなり、がん診断チップとして好都合である。

　金属基板又は金属粒子上に形成された量子結晶は金属錯体結晶として水溶液中では正極性を持ちやすいものと思われ、生体試料中のタンパク質を吸着固定するためには、ハロゲンイオンの存在下でアルカリ処理、例えばｐＨ１１以上の次亜塩素酸ソーダ水溶液を滴下して極性を調整するのが好ましい。量子結晶は再結晶して水溶液中で負極性となるだけでなく、銀酸化物の複合針状ナノ結晶は過酸化物を形成するので、試料中がん関連物質が正電荷を持つヒストンの固定化を促進することができる。

プラズモニックチップ上に吸着させた胃がんのがん関連物質の結晶のUV（３８０ｎｍ）の蛍光顕微鏡写真を示す。プラズモニックチップ上に吸着させた胃がんのがん関連物質の結晶の赤色レーザの蛍光顕微鏡写真を示す。プラズモニックチップ上に吸着させた胃がんのがん関連物質の結晶の緑色レーザの蛍光顕微鏡写真を示す。プラズモニックチップ上に吸着させた大腸がんのがん関連物質の結晶の蛍光顕微鏡写真を示す。（ａ）はUV（３８０ｎｍ），（ｂ）は赤色レーザ，（ｃ）は緑色レーザの場合を示す。りん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。量子結晶をハロゲンイオンの存在下にアルカリ処理（次亜塩素酸処理）した場合のＳＥＭ像である。アルカリ処理した量子結晶中の針状結晶を示す図である。ラクビーボール状の塊を示す図である。大きい塊のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフ図である。メチル化した遊離ＤＮＡ(a)とアセチル化したＤＮＡ(b)のヒストンに対する機能説明図である。量子結晶基板をハロゲンイオンの存在下にアルカリ処理（次亜塩素酸ソーダ処理）した場合の再結晶基板のＳＥＭ像（上図）と、再結晶基板のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフ（下図）である。アルカリ処理した再結晶基板のＸＰＳ測定結果を示す。再結晶基板の表面をエッチングした後のＸＰＳ測定結果を示す。プラズモニックチップ上に吸着させたがん関連物質の結晶の顕微鏡写真を示す。（ａ）は良性疾患，（ｂ）は胃がん，（ｃ）は大腸がんの場合を示す。良性疾患患者から得られた血清を調整した試料としたレーザ顕微鏡写真で、そのＲＧＢのヒストグラムを示す。胃がん患者から得られた血清を調整した試料としたレーザ顕微鏡写真で、そのＲＧＢのヒストグラムを示す。大腸がん患者から得られた血清を調整した試料としたレーザ顕微鏡写真で、そのＲＧＢのヒストグラムを示す。患者の血清から採取した良性疾患（Benign disease ),胃がん（ Gastric cancer）,大腸がん（Colon cancer )のプラズモニック顕微鏡写真の明視画像とそこに表示される結晶の中心を狙って測定した表面ラマン散乱スペクトル（未調整）の測定方法を示す。胃がん関連物質であるヒストンテールの化学修飾の状態を示すラマンスペクトルを示す。３Ｄレーザ走査顕微鏡を用い、試料を１０倍希釈と１００倍希釈の良性疾患（Benign disease）の (a,b,c;d,e,f), 胃がん（Gastric cancer）の (g,h,i;j,k,l),大腸がん（ Colon cancer）の (m,n,o;p,q,r)の１００倍、３０００倍、３Ｄ画像を示す。また、１０倍希釈の良性疾患（Benign disease）の (s,t), 胃がん（Gastric cancer）の (u,v),大腸がん（ Colon cancer）の (w,x)は３Ｄレーザ走査顕微鏡を用いて得られる画像（３０００倍）の各対応するＲＧＢカラーヒストグラムを示す。、（a,b,c）はレーザ顕微鏡を使用したKatoIII（胃印環細胞がん）、（d,e,f）はそこから抽出したＤＮＡの，（g,h,i）はＲＮＡの、（j,k,l）はプロテンの表面構造を示す１００倍、３０００倍（画像及びアンジュレーション）、３Ｄ画像を示し、（m,n,o）はがん細胞を物理的に粉砕した時の表面構造を示す１００倍、１０００倍（画像及びアンジュレーション）、３Ｄ画像を示す。化学的培養したがん細胞(a),そこから抽出したＤＮＡ(b)の，ＲＮＡ(c)の、プロテン(e)の、物理的に粉砕したがん細胞(e)の、胃がん患者からの血清(f)の、大腸がん患者からの血清(g)の、良性疾患の患者からの血清(h)のメソ結晶プロテオニックチップ上での１２００～１６００ｎｍ領域のラマン散乱スペクトルを示す。なお、KatoIIIは（胃印環細胞がん）、MKN-45は（低分化型胃線がん）、CW-2は（日本人由例大腸がん細胞株）、PK45-Pは（ヒト膵臓がん細胞株）、NHDF-Neoは（皮膚線維芽細胞）を示す。ヒストンテールの化学修飾を識別するためのヒストン関連抗体図を示す（www.genetex.com)。本発明のプラズモニックチップ上で観測される良性疾患とがんの自家蛍光状態を示す蛍光画像である。

　以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　（実施例１）
　チオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その１滴をりん青銅板上に滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばすと、SEM像でみると、量子結晶が作成されていた。図は実施例
１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真であり、１００nm前後の薄い六角柱状結晶であって、表面に数nmオーダの凹凸が発現している。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できなかった。図６はりん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。まず、六角形の量子結晶が生成し、形状を維持しつつ成長するのが認められる。図４は量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。りん青銅板上に形成された結晶は銀及び錯体配位子由来の元素を検出したが、銅板上にチオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴を滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばした場合は、銀のみを検出したに過ぎなかった。

　（量子結晶の作成の考察）
　量子結晶は１０００ppmチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、りん青銅板上に滴下して3分間放置すると、１００nm前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数nmオーダの凹凸を持つことがSEM像から確認されたが、金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、EDS元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。本発明の銀錯体量子結晶がりん青銅板上に形成される一方、銅基板上には銀のみのナノ粒子が析出する現象を見ると、チオ硫酸銀錯体の平衡電位が０．３３で銅の電極電位（０．３４）と同等であるため、銅基板上には銀（０．８０）のみが析出し、りん青銅の場合は０．２２と電極電位がわずかに卑であるため、銀錯体の結晶が析出したものと思われる。したがって、量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が５００～２０００ppmという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。また、１０００ｐｐｍチオ尿素銀錯体水溶液を使用した場合も同様であった。

　（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その１）
　上記量子結晶基板に５％次亜塩素酸ソーダ水溶液を滴下して２分間処理して除去すると図１１に示す結晶構造が見られ、針状の結晶とラクビーボール状の塊と大きい塊が見られたので、それぞれの組成をEDSスペクトル（元素分析）で分析すると、以下の反応式から
針状の結晶はともに塩化銀と酸化銀の複合結晶からなるものと考えられるが、図７の結果は塩素は確認できず、銀と酸素が支配的であることがわかる。
Na₂S₂O₃+４NaClO＋H₂O →Na₂SO₄+H₂SO₄＋４NaCl　（１）
Ag⁺ + NaCl→　AgCl　＋　Na+ （２）
Ag⁺ ＋３NaOCl →　２AgCl　＋　NaClO₃　＋　2Na+　　（３）
Ag⁺ + OH- 　→　AgOH　　　　　　（４）
２Ag⁺＋　２OH-　→　Ag₂O　＋H₂O （５）
　したがって、本発明に係るメソ結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンが塩素イオンの存在下にアルカリ酸化反応により生ずるものと思われるが、通常の水溶液中では酸化銀が形成されるに過ぎないが、以下のＸＰＳ測定から過酸化銀が支配的に形成されていると推測される。

　（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その２）
　ＸＰＳ測定：
　上記量子結晶基板に次亜塩素酸ナトリウム水溶液25μlを2分間滴下し、再結晶基板を作り、エッチングせずそのまま（使用機種：アルバック・ファイ（株）／PHI5000 Versa Probe II（走査型Ｘ線光電子分光分析装置））でAgとOとをXPS測定した。また、比較対象
のため、酸化銀の粉と塩化銀の粉のAgを測定した。他方、再結晶基板をアルゴンガスクラスターイオン銃で5分間エッチングしてAgとOをXPS測定した。図９及び図１０のＸＰＳ測定結果を図８に基づくＥＤＳの結果から推測すると、５２９eV付近のピークは過酸化銀（AgO）に由来するＯピークで、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯ
ピークであると認められる。エッチングした場合に、酸素量は減少するが、５２９eV付近のピークの過酸化銀（AgO）に由来するＯピークが、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯピークよりも大きいことは基板近傍に過酸化銀が形成されているのを物語るものといえる。これは、メソ結晶形成時の触媒作用と基板の電極電位が影響しているものと推測される。
　なお、ＥＤＳ測定は上記再結晶基板を使用機種：日本電子株式会社／JSM-7001F（電界
放出形分析走査電子顕微鏡）を用いて行った。
　また、チオ硫酸銀の量子結晶を次亜塩素酸水溶液、０．０１規定苛性ソーダ水溶液、０．０１規定塩酸水溶液、０．１モル炭酸ナトリウム水溶液で処理しても同様の結果は得られなかった。よって、この針状結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンの存在下に上記反応により生ずるものと思われる。酸化銀は水溶液中で負電荷を帯び、光により還元されて金属銀を析出させる。過酸化銀はその傾向が顕著なので、正電荷のがん関連物質を吸着し、しかも吸着したがん関連物質と銀粒子との間の表面プラズモン増強効果が得られるものと思われる。

　また、本発明のプラズモニックチップを用いることにより、画像診断及びラマン分析により、血中含む生体試料中の、がん関連物質の存否、クロマチンリモデリングを制御する化学修飾因子を判定することができる。すなわち、銀ハロゲン化物又はハロゲンを含む銀酸化物の複合針状ナノ結晶群、すなわち過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶領域（図９及び１０）を有するプラズモニックチップを用意し、該プラズモニックチップの針状ナノ結晶群領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中の正電荷を有するがん関連物質を選択的に吸着させる。

（プラズモニックチップ上の結晶の画像診断）
　吸着したがん関連物質を反射顕微鏡（倍率５００倍）で観測した。良性疾患、胃がん、大腸がんの場合のがん関連物質の結晶画像を示す（図１（ａ），（ｂ）及び（ｃ））。この画像の結晶の面積、体積、長さ、幅等の情報を数値化し、数値をヒストグラムにすることができる。レーザー顕微鏡（キーエンス社製ＶＫ－Ｘ２５０形状解析レーザ顕微鏡　１万５千倍）で観測すると、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃに示すように、良性疾患と胃がん、大腸がんとの間には結晶の形態に差異が見られる。この画像のＲ，Ｇ、Ｂをヒストグラムでグラフ化すると、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃのグラフに示すように、良性疾患と胃がん、大腸がんとの間には明らかにピークの位置および形状に差異が認められる。したがって、過酸化銀を含むメソ結晶のプラズモニックチップを用いると、血液中のがん関連物質を選択的に捕捉してがんの存否を識別することができることがわかる。なお、共焦点レーザー顕微鏡を用いると、スライス画像が得られるため、内部の情報が得られるので、好ましい。

　（プラズモニックチップ上の結晶の自家蛍光画像診断）
また、良性疾患（食道アカラシア、胃間葉系腫瘍、十二指腸良性腫瘍）の患者から得られた血清とがん患者(胃がん)、大腸がん，膵がん）から得られた血清のプラズモニックチップ上の自家蛍光を蛍光顕微鏡で観察すると、図２０に示されるように良性疾患とがん患者との間には自家蛍光が観測されるか否かで明確な識別ができることがわかる。

（プラズモニックチップ上の結晶のラマン分析）
　プラズモニックチップ上に吸着したがん関連物質の結晶は目視では観測できないが、顕微鏡（５００倍）で観測すると、点状に分散した結晶塊が観測される（図１８）。この結晶塊の一つに対しレーザー（波長５３２nｍ）照射してそこからのラマンスペクトルを検知することにより、表面増強ラマン散乱（SERS）の強度によりがん疾病を判断することができる。図３（ａ），（ｂ），（ｃ）は良性疾患、胃がん、及び大腸がんの場合のプラズモニックチップ上の結晶に対しレーザー（波長５３２nｍ）照射してそこから得られたラマンスペクトルを示す。特に、図４は胃がんの場合のラマンスペクトルの拡大図で、これに示すように、ヒストンテールの化学修飾はラマンスペクトルの１３００ｃｍ^-1以下６２５ｃｍ^-1以上の指紋領域といわれる領域に現われるピークによって判別できることが示されている。

　血清中のがん関連物質としては、がん細胞由来のヒストンに巻きついたＤＮＡ、ＤＮＡがひと巻きされたヒストン（ヌクレオソーム）、それらが集まりひも状になった構造のクロマチン（線維）を含む。グロブリンは正電荷を帯びるが、その増加は他のがん関連物質に比べて最大2倍以下であるので、本発明で検知される物質はがん進行に伴う増加が１００倍以上に達するのでグロブリン以外の増加（がん関連物質）が検知されていることを物語っている。また、正常細胞から出るＤＮＡ、アセチル化してヒストンから解離したＤＮＡ、そしてアルブミンは血清中の約６０％を占めるが、負荷電を帯びるため、本発明では吸着されない。したがって、がん関連物質の画像診断には好都合であり、ラマン分光法によりヒストンテールの化学修飾を分析するに好都合である。

　また、本発明の針状ナノ結晶（過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶）は、過酸化銀を含む銀酸化物が水溶液中で負電荷を帯びやすく、試料（ターゲット分子）と接触して電荷移動錯体を形成すると思われる。さらに、銀酸化物は光エネルギーを受けて還元され、金属銀を析出するので、規則的に配列する金属ナノ粒子の持つ局在表面プラズモン共鳴増強効果を有することになる。したがって、本発明の針状ナノ結晶（メソ結晶）は非金属であるが金属性質とイオン化性質を兼ね備えるため、表面増強ラマン散乱（SERS）測定用に好適なプラズモニックチップとなり、がん診断チップとして好都合である。

　（ヒストンテールの画像診断）
　ヌクレオソームはクロマチンの基本的構成単位で、４種のヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ，Ｈ３、Ｈ４）からなるヒストン８量体にＤＮＡが巻きついた構造をしているが、ヒストンはＤＮＡをパケージングするという役割に加え、ＤＮＡのアクセシビリティを調節すること及び、遺伝子制御にも重要な役割を果たしている。ヒストンの翻訳後修飾により、ＤＮＡやその他の核蛋白質との相互作用が制御され、可逆的な遺伝子発現に影響を及ぼす。ヒストン修飾の種類として、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、シトルリン化、ＡＤＰリポシル化、が主として知られている。ヒストンの配列中、どの部位がこれらの修飾を受けるかによって、周囲の遺伝子発現は活性化または抑制されるが、こうしたヒストンの翻訳後修飾部位の組み合わせと遺伝子発現への影響を図１８に示す各種ヒストンコード関連抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ社抗ヒストン抗体）を使用すると、本発明のプラズモニックチップで捕捉されたヒストンコードの修飾された状態を、蛍光画像で観測するとともにラマン分光分析により、ヒストンコード仮説の検証を行うことができる。
　なお、ヒストンコード仮説では次のように説明されている。

（ヒストンコード仮説）
　ロックフェラー大学のアリス博士らのグループによりヒストンコード仮説がクロマチンリモデリングとの関係で提唱されている。即ち、クロマチンリモデリングとはクロマチン構造の変化を介して遺伝子の発現レベルを調節する分子機構、誘導に伴い，１）ヒストン修飾の変化，２）ゲノムDNAのメチル化状態の変化，それに伴う３）DNaseに対する高感受性領域の変化が起こる現象をいう。本発明者らは、ヒストンコード仮説に基づく、がん発生の機序を解明すべく、鋭意研究の結果、がん関連物質として、ヒストン及びこれと関連するヌクレオソーム並びにクロマチンを選択的に捕捉し、これを検証しようとした。ゲノムDNAのほとんどはコアヒストンに巻き取られ、クロマチンとして格納されている。そのためゲノムDNA に直接働きかける転写、複製、修復などの核内現象は何らかの形でのクロマチン構造変化を伴う。この広義のクロマチンリモデリングは逆に核内現象を制御している。例えば転写活性はクロマチン構造に依存して約2500倍の範囲で変化する。裸のDNAにおける転写因子の活性化のレンジは10倍程度なので、転写制御の大半はクロマチンリモデリングで行われていることになる。このクロマチンリモデリングに関与する因子の中で、ヒストン修飾因子はアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化やそれらの除去を行うことによって、ヒストンH3、H4のアミノ末端側のテールに特有な化学修飾パターンを形成する。これが認識コードとして働くことによってさらにリモデリングに関与する因子がリクルートされるというのが"ヒストンコード仮説"である。

　この化学修飾を受けたヒストンテールがリモデリング因子などの認識コードとして働くという"ヒストンコード仮説"の検証に対し、構造生物学の果たした役割は大きいといわれる。たとえば、HAT、ATP依存的リモデリング因子、コアクチベーター、TFDサブユニットTAF などの多くは、110 アミノ酸程度から成る相同性の低いブロモドメインを持つ。コア
クチベーターP/CAF のブロモドメインの構造がNMR により決定され、特徴的な疎水性ポケットが見つかっている。NMRを使った結合実験の結果、このポケットはアセチル化されたヒストンH3テールのペプチドと結合することが示された。また基本転写因子TFDの最大サブユニットであるTAF 250 のタンデムに並んだ２つのブロモドメインの結晶構造も得られている。これはアセチル化を受けたヒストンH4のテールに結合する活性を持つ。またheterochromatin protein １のクロモドメインがメチル化されたヒストンH3テールに結合することが示されている。マウスchromatinmodifier protein 1 のクロモドメインのNMR構造が報告されている。このクロマチンリモデリング因子はヒストンテールのコードをブロモドメインなどが認識して直接的に特定のヌクレオソーム部位にアクセスすることもあるが、DNA 結合性の転写因子によって間接的にリクルートされる場合も多い。bHLH（basic helix-loophelix）-ZipをDNA結合ドメインとして持つ転写リプレッサーMad は、ヒストン脱アセチル化酵素をサブユニットとして含むSin3複合体をクロマチンにリクルートする。Sin3のPAH2ドメインとMad の転写抑制ドメインの複合体がNMRによって解析され、脱アセチル化複合体のクロマチン部位へのリクルート機構が議論されている。

　このクロマチン構造制御にDNAメチル化が深く関与すると考えられている。DNAメチル化が高密度に見られるゲノムDNA部位では、一般にクロマチン構造が強固になり、転写抑制
やDNA変異率の低減が見られる。またゲノムDNAのメチル化パターンとゲノムインプリンティング、X 染色体不活性化や細胞の腫瘍化には明確な相関が見られるからである（非特許文献２）。したがって、ヒストンおよびクロマチンの構造解析はがんとの関連を説く鍵を握っており、ヒストンテールを化学修飾する因子を解析することは重要な意義を持っているといえる。本発明ではヒストンおよびクロマチンを選択的に捕捉することができるので、ヒストンコードの化学修飾状態を蛍光標識化するとともに、表面増強ラマン分析（SERS）を利用して解析する手段を提供する。

　（クロマチンリモデリング）
　ところで、遺伝物質の本体であるゲノムDNAは長大で、ヒトでは長さ2メートルものDNAが、細胞核というわずか体積100フェムトリットルの微小空間に収納されている。このよ
うなゲノムDNAの収納は、"クロマチン"と呼ばれる分子複合体によって成し遂げられ、ク
ロマチンの基盤構造は、ヒストンタンパク質にDNAが巻き付いた"ヌクレオソーム"で、そ
のヌクレオソームが数珠状につながったものが、タンパク質やRNAと結合してさらに高度
に折り畳まれ"高次のクロマチン"を形成しているというものである。しかし、クロマチンからDNAがほどけるためには、大きなエネルギーが必要で、クロマチンは、複製、転写、組換えなどのDNAの機能発現に阻害的である。しかし生物は、クロマチンの動的変動を介
して、いとも簡単に複製、転写、組換えをやってのける。この"動的クロマチン構造"は、ヒストンバリアントや修飾による多様なヌクレオソーム構造、その並び方の多様性、タンパク質やRNA分子複合体との相互作用などによって生み出されて、細胞核構造体、核膜、
核膜孔複合体などとの相互作用によって制御されているといわれる。上記現象を説明すると、真核生物のDNAは、体内で合成されたヒストンというタンパク質と強固に結合した、ヌクレオソーム構造を形成し、ヌクレオソームは、さらにらせんになってクロマチン構造を形成するが、このように、ヒストンとDNAとがしっかり結合した状態では、RNAポリメラーゼがDNAに結合することが難しく、他方、転写が盛んになるときは、クロマチン構造が緩んで、ヌクレオソームからヒストンが外れてDNAが裸に近くなる。転写が抑制される時には、逆に、ヌクレオソーム構造がしっかりして、クロマチンが凝集する。このようなクロマチンの構造の再構築や再構成を上述したクロマチンリモデリングというが、プロモーターやエンハンサーは転写を促進し、遺伝子発現を高める。これらの役割の一つは、ヒストンとDNAの結合を緩め、時にはヌクレオソーム構造を破壊して、RNAポリメラーゼによるRNA合成を促進する。ヌクレオソームをもう少し詳しく見ると、翻訳済みのヒストンタンパク質の末端にあるヒストンテイルの部分に、塩基性アミノ酸（プラス電荷）がたくさん存在する。これが、DNAのリン酸基（マイナス電荷）と静電的結合をする。ヒストンとDNAの結合を緩めるには、ヒストンの強い塩基性を緩めればよい。クロマチンリモデリングによる転写調節は、実際には多くの種類の酵素やタンパク質が関わる複雑な反応で、プロモーターやエンハンサーに結合する転写因子には、ヒストンアセチル化酵素(HAT:histone acetyltransferase)が結合して、この酵素がヒストンのアミノ基をアセチル化する。アセチル化したアミノ基は、塩基性が低下してDNAとの結合が弱くなり、これを契機にしてヒストンとDNAの解離が進行し、さらに周囲のヌクレオソームでヒストンのアセチル化が進行して、やがてプロモーターが露出して、RNAポリメラーゼが結合しやすくなるといわれる。したがって、ヒストンコード仮説に基づくクロマチンリモデリングの機序を解明するためにはヒストン、クロマチン等のがん関連物質を含む体液から如何にしてこれらがん関連物質をトラップし、分析することができるかは重要である。

　本発明のプラズモニックチップを用いると、がん関連物質としてヒストンおよびクロマチンをトラップすることにより、その結晶の多少によりがん症状の存否が蛍光画像診断により判断することができる。そして、そのがん症状がどの臓器のがんであり、その進行状態がどの程度であるかをヒストンテールの化学修飾、リモデリング因子を解析することにより判定することができる。そして、このクロマチンリモデリング事象を通してどのようにがんが発生し、進展していくかに関する情報は、そのようながんがどのように特定の化学療法剤に反応しそうかということを臨床医がより正確に予測することを可能にし、この方法で、腫瘍の化学感受性の知識に基づく化学療法を合理的に設計することができる。

　ここで、検出すべき対象のがん関連物質はDNAが巻きついたヒストンというタンパク質で、この単位構造はヌクレオソームと呼ばれ、ヌクレオソームが集まりひも状になった構造はクロマチン（線維）と呼ばれる。そして、細胞ががん化して***を繰り返すとき、がんが増えるのに都合の悪い遺伝子（がん抑制遺伝子）が出てこないようしっかりヒストンに巻きついて蓋をし、ヒストンへの巻き方をさらにきつくして、DNAが簡単にはほどけないようにして、メチル化という修飾が起こっているが、通常ヒストンは（＋）、DNAは（－）にチャージされていて、2つは磁石のようにくっつきあい、しかもメチル化して解けないようになっており、ヒストンに巻き付いたDNAは（＋）に帯電している（図８（a）参照）。他方、アセチル化は（－）にチャージするため、通常は（＋）のヒストンがアセチル化されれば、（－）同士となってDNAと反発する。すると、DNAという‘糸’がヒストンからほどけて遺伝子が発現するメカニズムとなっている（図８（b）参照）。したがって、がん細胞由来のがん関連物質を選択的に吸着させるには、ヒストンに巻き付いたDNAは（＋）に帯電しているので、吸着させる基板は（－）に帯電しているのが好ましいと考えられる。

　したがって、本発明を利用することにより、血液および生体試料中のがん関連物質を選択的に検出し、局在プラズモン増強効果により自家蛍光によりこれを検出できる。それだけでなく、各種蛍光標識を付けたがん関連物質を選択的に捕捉して蛍光顕微鏡により簡易にがんの存否を判定できる。また、その結晶のラマンスペクトルよりヒストンテールの化学修飾状態を標識を付け、又は付けないで判定することができるので、がんの早期発見、がんの進行度に関する判定を行うことができる。そこで、本発明の利用方法を総括すると、次の通りである。
　１．銀量子結晶を用いるプラズモニックチップ
　　　抗体滴下及び抗原滴下により自家蛍光はおきない。したがって、蛍光色素、蛍光蛋白をつけることにより蛍光観測が可能となる。エンドトキシンではエンドトキシンとの結合ピークがラマン散乱スペクトルで確認できているため、蛍光標識を付けることによってより明確に識別することができる。よって、１）抗体側に蛍光物質をつける場合、金属錯体と抗体の混合液を本発明のプラズモニックチップに滴下し、抗原が結合すると発光するのを、観測する。他方、２）抗原側に蛍光物質を付ける場合、量子結晶に抗体を滴下して固相化し、抗原側に予め蛍光物質をつけて抗原抗体反応により蛍光が発光するのでこれを測定する。
　２．銀メソ結晶を用いるプラズモニックチップ
１）抗体側に蛍光物質をつける場合、メソ結晶に抗体（標識付き）を固相化し、抗原を滴下して結合による蛍光を測定する。２）抗原側に蛍光物質を付ける場合、メソ結晶に抗体を固相化し、抗原（標識付き）を滴下して結合による蛍光を測定する。３）自家蛍光による測定する。この場合に蛍光標識を付けることもできる。
　３．プラズモニックチップ上の結晶を確認し、レーザを照射してラマン散乱スペクトルによりラマン分光分析を行う。

Claims

　蛍光顕微鏡で観測する蛍光画像観察用基板であって、プラズモン金属として銀錯体水溶液をそのプラズモン金属錯体の還元電位近傍の、より卑なる電極電位を有する金属基板上に電極電位差により形成される金属錯体量子結晶領域を有し、銀錯体水溶液中に腫瘍マーカー、抗体等の吸着物質を金属策錯体の量子結晶とともに配位させ、がん連物質、抗原等の被吸着物質を選択的に捕捉し、局在表面プラズモン共鳴機能で増強した蛍光画像観察するためのプラズモニックチップ。
　蛍光顕微鏡で観測する蛍光画像観察用基板であって、金属基板上に形成される銀錯体量子結晶をアルカリ処理してなる過酸化銀を含む銀酸化物のナノ結晶からなるメソ結晶領域を有し、該銀酸化物のメソ結晶でがん関連物質を捕捉し、メソ結晶領域に光照射による、局在表面プラズモン共鳴機能で増強したがん関連物質の自家蛍光による画像観察するためのプラズモニックチップ。
　請求項１又は２記載のプラズモンチップを用意し、該プラズモニックチップの結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中のがん関連物質、抗原等の吸着物質を選択的に吸着し、プラズモニックチップ上に凝集する結晶領域に光照射し、局在表面プラズモン共鳴によってがん関連物質の自家蛍光又はがんマーカーを蛍光顕微鏡で蛍光画像診断してがんの有無を診断することを特徴とするがん疾病の蛍光画像診断方法。
　請求項１又は２記載のプラズモンチップを用意し、該プラズモニックチップの結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中のがん関連物質、抗原等の吸着物質を選択的に吸着し、プラズモニックチップ上に凝集する結晶領域に光照射し、局在表面プラズモン共鳴によってがん関連物質の自家蛍光又はがんマーカーを蛍光顕微鏡で蛍光画像診断してがんの有無を診断した後、自家蛍光又はがんマーカーの蛍光画像を目印にレーザー光を照射してラマン分光分析することを特徴とするがん疾病のラマン分光診断方法。
　がん関連物質がDNAが巻きついたヒストンを含むヌクレオソーム又はクロマチンである請求項３記載のがん疾病の蛍光画像診断方法。
　がん関連物質がDNAが巻きついたヒストンを含むヌクレオソーム又はクロマチンである請求項４記載のがん疾病のラマン分光診断方法。