JP5544653B2 - 抗原抗体反応の検出方法 - Google Patents
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表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層と、
前記消光抑制層の上に結合された二重特異性抗体とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記消光抑制層が酸化亜鉛で形成され、
前記二重特異性抗体が、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する抗体であり、
蛍光標識されている前記抗原が前記二重特異性抗体の前記他端に結合された状態、または、蛍光標識されていない前記抗原が前記二重特異性抗体の前記他端に結合され且つ前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体が前記抗原に結合された状態で、
光が入射されて表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を、前記抗原が蛍光標識されている場合には前記抗原の励起場として、前記二次抗体が前記抗原に結合されている場合には前記二次抗体の励起場として増強蛍光が検出されることを特徴としている。
前記二重特異性抗体が、4F2−GFP4 VHHダイマーであることを特徴としている。
前記金属層が、135nm以上200nm以下の厚さに形成された銀であり、
前記消光抑制層側から前記光を入射し、前記消光抑制層側から前記増強蛍光を検出するときに使用されることを特徴としている。
前記金属層が、10nm以上50nm以下の厚さに形成された銀であり、
前記ベース基板側から前記光を入射し、前記消光抑制層側から前記増強蛍光を検出するときに使用されることを特徴としている。
表面に周期構造を有するベース基板、前記周期構造の上に形成された金属層、及び、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層を有するチップと、
一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体を含む溶液とを備え、
前記溶液が前記酸化亜鉛層の表面に接触され、前記二重特異性抗体が前記酸化亜鉛層に結合し、結合した前記二重特異性抗体に蛍光標識された前記抗原が注入された後、あるいは、結合した前記二重特異性抗体に蛍光標識されていない前記抗原が注入され、且つ前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体が注入された後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用されることを特徴としている。
前記二重特異性抗体が、4F2−GFP4 VHHダイマーであることを特徴としている。
表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第1ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第2ステップと、
前記第2ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第3ステップとを含み、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第3ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第2ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第4ステップを含み、前記第3ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用いることを特徴としている。
前記二重特異性抗体が、4F2−GFP4 VHHダイマーであることを特徴としている。
前記第2ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスすることを特徴としている。
前記第3ステップにおいて、633nmの波長の前記光を前記酸化亜鉛層側から共鳴角度Y°の入射角度で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度X°で前記増強蛍光を検出し、
前記周期構造のピッチが、300nm以上420nm以下または630nm以上800nm以下の場合、Y+6−1≦X≦Y+6+1であり、
前記周期構造のピッチが、440nm以上630nm未満の場合、Y−6−1≦X≦Y−6+1であり、
前記周期構造のピッチが、420nmより大きく440nm未満の場合、−Y+6−1≦X≦−Y+6+1、且つ、X≧0であることを特徴としている。
前記第3ステップにおいて、633nmの波長の前記光を前記ベース基板側から共鳴角度Z°の入射角度で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度X°で前記増強蛍光を検出し、
前記周期構造のピッチが、300nm以上380nm以下または660nm以上760nm以下の場合、Z+18−1≦X≦Z+18+1であり、
前記周期構造のピッチが、440nm以上560nm以下の場合、Z−18−1≦X≦Z−18+1であり、
前記周期構造のピッチが、380nmより大きく440nm未満の場合、−Z+18−1≦X≦−Z+18+1、且つ、X≧0であり、
前記周期構造のピッチが、560nmより大きく660nm未満の場合、−Z+65−6≦X≦−Z+65+6、且つ、X≧0であることを特徴としている。
抗原として、GFPを用い、GFP 2.2μM(1mg/mLを100mL+Cy5 Labeling Kitで反応後カラムを通して1.1mL×2本(2:1で)回収)(分子量26795/吸光係数18700)を10倍希釈したものを標準試料(Tween入り緩衝溶液で調製)とした。
抗体として、上記した二重特異性抗体4F2−GFP4 VHHダイマー(分子量31562/吸光係数43100)1μMを用いた。
緩衝溶液は、10mMのphospahte(pH7.5)/200mMのNaClの混合溶液を用いた。GFP注入からは、10mMのphosphate(pH7.5)/200mMのNaCl/0.05%のTween20(Polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate):界面活性剤)の混合溶液を用いた。
ステップ2:1μMの二重特異性抗体30μlを注入し、二重特異性抗体が基板に結合した後(10分から20分インキュベーション)に測定
ステップ3:10mMの緩衝溶液(二重特異性抗体Rinse)40μlを注入し、基板に結合しなかった二重特異性抗体を除去した後に測定
ステップ4:220nMのCy5標識GFP 30μlを注入し抗原抗体相互作用が十分に平衡状態になった10分経過後に測定
ステップ5:Tween入り緩衝溶液(GFP Rinse)40mlを注入し、基板に結合しなかったGFPを除去後に測定
上記の条件で作製したバイオチップを正面照射系で用い、波長633nmの光を入射して測定した。図9は、Agの厚さを139nmにしたときの、反射率R(%)を示すグラフである。Airは界面が空気での測定値であり、Bufferは界面が緩衝溶液の測定値である。
2、2’、2” ベース基板
3 第1接着層
4、4’ 金属層
5 第2接着層
6、6’ 消光抑制層
7 二重特異性抗体
8 蛍光標識タンパク質
9 溝部
10 凸部
11 周期構造が形成された領域
Lin1、Lin2 照明光
Lp プラズモン励起増強蛍光
Claims (3)
- 表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記金属層が、135nm以上200nm以下の厚さに形成された銀であり、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第1ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第2ステップと、
前記第2ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第3ステップとを含み、
前記第2ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスし、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第3ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第2ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第4ステップを含み、前記第3ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用い、
前記第3ステップにおいて、633nmの波長の前記光を前記酸化亜鉛層側から入射角度Y°で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度X°で前記増強蛍光を検出し、前記増強蛍光の強度がピークとなる際の前記入射角度Y°および前記検出角度X°の関係が、
前記周期構造のピッチが、300nm以上420nm以下または630nm以上800nm以下の場合、Y+6−1≦X≦Y+6+1であり、
前記周期構造のピッチが、440nm以上630nm未満の場合、Y−6−1≦X≦Y−6+1であり、
前記周期構造のピッチが、420nmより大きく440nm未満の場合、−Y+6−1≦X≦−Y+6+1、且つ、X≧0であることを特徴とする抗原抗体反応の検出方法。 - 表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に形成された金属層と、前記金属層の上に形成された酸化亜鉛層とを有するバイオチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記金属層が、10nm以上50nm以下の厚さに形成された銀であり、
前記バイオチップの前記酸化亜鉛層の表面に、一端が酸化亜鉛を認識し、他端が抗原を認識する二重特異性抗体の前記一端を結合させる第1ステップと、
前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させる第2ステップと、
前記第2ステップ後のバイオチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を励起場として用いて増強蛍光を検出する第3ステップとを含み、
前記第2ステップにおいて、前記二重特異性抗体の前記他端に前記抗原を結合させた後の前記バイオチップを、界面活性剤を含む燐酸緩衝液でリンスし、
前記抗原が蛍光標識されている場合には、前記第3ステップにおいて、発生した前記電場を前記抗原の励起場として用い、
前記抗原が蛍光標識されていない場合には、前記第2ステップが、前記抗原を認識する蛍光標識された二次抗体を前記抗原に結合させる第4ステップを含み、前記第3ステップにおいて、前記電場を前記二次抗体の励起場として用い、
前記第3ステップにおいて、633nmの波長の前記光を前記ベース基板側から入射角度Z°で入射し、前記酸化亜鉛層側から検出角度X°で前記増強蛍光を検出し、前記増強蛍光の強度がピークとなる際の前記入射角度Z°および前記検出角度X°の関係が、
前記周期構造のピッチが、300nm以上380nm以下または660nm以上760nm以下の場合、Z+18−1≦X≦Z+18+1であり、
前記周期構造のピッチが、440nm以上560nm以下の場合、Z−18−1≦X≦Z−18+1であり、
前記周期構造のピッチが、380nmより大きく440nm未満の場合、−Z+18−1≦X≦−Z+18+1、且つ、X≧0であり、
前記周期構造のピッチが、560nmより大きく660nm未満の場合、−Z+65−6≦X≦−Z+65+6、且つ、X≧0であることを特徴とする抗原抗体反応の検出方法。 - 前記二重特異性抗体が、4F2−GFP4 VHHダイマーであることを特徴とする請求項1または2に記載の抗原抗体反応の検出方法。
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