WO2014200161A1 - 효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 - Google Patents

효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 Download PDF

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김해원
이재호
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Definitions

  • the present invention provides a method for controlling cell behavior, a composition for inducing stem cell differentiation and a composition for promoting movement or proliferation of cells, comprising the steps of applying electrical stimulation to cells using an enzymatic biofuel cell; Cell culture vessel having an enzymatic biofuel cell that can be cultured while applying electric stimulation to the cells; Pharmaceutical compositions for the treatment of wounds, enzymatic biofuel cells, diseases caused by muscle tissue abnormalities, prevention and treatment of bone diseases and neurological diseases; And it relates to muscle cells, bone cells, neurons and cardiomyocytes differentiated using the stem cell differentiation inducing composition or cell culture vessel.
  • stem cell research As interest in stem cell research increased, pluripotent stem cells with the ability to form all organs through proliferation and differentiation were found to be able to fundamentally solve long-term damage as well as most diseases. In addition, many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to the treatment of almost all organ regeneration as well as incurable Parkinson's disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.
  • wound healing is accomplished by the movement and proliferation of cells to the wound site.
  • wound healing can be promoted by promoting cell migration and proliferation.
  • cell behavior As such, the movement and proliferation of cells for wound healing and the differentiation of stem cells into desired tissues are referred to as cell behavior, and the behavior of these cells is influenced by physical and / or chemical environment. This is because cell behavior is regulated by signaling systems, which can be regulated by a variety of physicochemical factors.
  • the application of low frequency to joint disease or direct electrical stimulation to the brain of liver disease is a representative example of treatment method using physical stimulation.
  • the present inventors have diligently researched to find an electrical stimulation source that can be formulated in a form that is highly biocompatible and applicable to various parts of the body, and thus, when using an enzymatic biofuel cell operated by the redox reaction of the enzyme, There is no concern about cytotoxicity by varying the current within the intensity range that does not induce cell death by controlling the concentration of, and can be freely molded into various formulations to be appropriately formulated in each part of the body. Confirmed that it can be applied to complete the present invention.
  • One object of the present invention to provide a cell behavior control method comprising the step of applying an electrical stimulation to the cell using an enzymatic biofuel cell.
  • Another object of the present invention to provide a composition for inducing differentiation of stem cells comprising the step of applying an electrical stimulation to the cells using an enzymatic biofuel cell.
  • Another object of the present invention to provide a composition for promoting the movement or proliferation of stem cells comprising the step of applying an electrical stimulation to the cells using an enzymatic biofuel cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell culture container having an enzymatic biofuel cell, which can be cultured while applying electric stimulation to the cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an enzymatic biofuel cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease caused by abnormal muscle tissue including an enzymatic biofuel cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases, including an enzymatic biofuel cell.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurological diseases including an enzymatic biofuel cell.
  • Still another object of the present invention is to provide muscle cells differentiated by culturing stem cells while applying electric stimulation of 2 nA / cm 2 or more to less than 230 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • Still another object of the present invention is to provide osteoblasts differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 230 nA / cm 2 or more and less than 300 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • Still another object of the present invention is to provide a neuronal cell differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • Still another object of the present invention is to provide cardiomyocytes differentiated by culturing stem cells while applying electric stimulation of 500 nA / cm 2 or more and less than 1000 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides a cell behavior control method comprising the step of applying an electrical stimulation to the cell using an enzymatic biofuel cell.
  • the present invention provides a composition for inducing differentiation of stem cells comprising an enzymatic biofuel cell.
  • the present invention provides a composition for promoting the movement or proliferation of cells including an enzymatic biofuel cell.
  • the present invention provides a cell culture container having an enzymatic biofuel cell, which can be cultured while applying electric stimulation to the cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an enzymatic biofuel cell.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by muscle tissue abnormalities, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating a disease caused by abnormal muscle tissue, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating bone disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurological diseases, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating neurological disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides muscle cells differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 2 nA / cm 2 or more and less than 230 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides muscle cells differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 2 nA / cm 2 or more and less than 230 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides a neuronal cell differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides a cardiomyocyte that is differentiated by culturing stem cells while applying an electrical stimulation of 500 nA / cm 2 or more and less than 1000 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the method for controlling cell behavior by applying electrical stimulation using an enzymatic biofuel cell uses enzymes as an electrical stimulation source, and thus has high biocompatibility, can be molded into a desired formulation, and is introduced into each electrode. By controlling the concentration of can generate a wide range of currents, and even if not including both electrodes can be used as a pharmaceutical composition in that the electrical stimulation can be generated.
  • a different level of electrical stimulation is applied at a level that does not induce cell death, stem cells can be induced to differentiate into different tissues, and thus various formulations can be usefully used for tissue regeneration.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a representative example of an enzymatic biofuel cell based on the redox reaction of an enzyme at an electrode.
  • FIG. 2 is a view showing the electrode configuration of the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the reaction of the cells according to the electrical stimulation intensity by the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the cell migration promoting effect of the electrical stimulation by the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the stem cell division promoting effect of the electrical stimulation by the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing the myocardial and muscle cell differentiation induction effect of the electrical stimulation by the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the differentiation direction according to the degree of electrical stimulation by the enzymatic biofuel cell according to the present invention. Relatively low electrical stimulation induces differentiation into myocytes, moderate electrical stimulation into osteoblasts, and high levels of electrical stimulation within a range not causing cell death induce differentiation into neurons.
  • the present invention provides a cell behavior control method comprising the step of applying an electrical stimulation to the cell using an enzymatic biofuel cell.
  • the term "enzymatic fuel cell” is a device for converting chemical energy of biofuel into electrical energy, which is a special type of fuel cell using an enzyme as a catalyst for oxidizing fuel.
  • enzyme as a catalyst for oxidizing fuel.
  • Enzymatic biofuel cells according to the present invention can regulate cell behavior such as cell migration, division or differentiation.
  • the control cells include stem cells or cardiomyocytes, muscle precursor cells and nerves, including adult stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Somatic cells, including progenitor cells, are not bound to the type of cell.
  • the enzymatic biofuel cell according to the present invention can generate electric stimulation even if it includes only one electrode of an anode or a cathode
  • the anode, cathode or anode and cathode of the enzymatic biofuel cell Cell stimulation can be controlled by electrical stimulation by all.
  • the positive electrode of the enzymatic biofuel cell is a glucose oxidase (Gox), a glucose dehydrogenase, a lactate oxidase, a lactate dehydrogenase, and a galactose oxidase.
  • galactose oxidase cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, formic acid dehydrogenase , Oxalate oxidase, pyruvate dehydrogenase or membrane-bound hydrogenase, and the negative electrode is bilirubin oxidase (BOD), laccase ( Laccase, horseradish peroxidase (HRP), catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase ase), microperoxidase or horseradish peroxidase, but is not limited thereto.
  • BOD bilirubin oxidase
  • laccase Laccase, horseradish peroxidase (HRP), catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase ase
  • microperoxidase or horseradish peroxidase but is not limited thereto
  • the positive electrode may further include co-factors such as FAD (flavin adenine dinucleotide), PQQ (Pyrrolo quinoline quinone), heme (heme), NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) or Mn.
  • co-factors such as FAD (flavin adenine dinucleotide), PQQ (Pyrrolo quinoline quinone), heme (heme), NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) or Mn.
  • the anode of the enzymatic biofuel cell emits electrons by oxidizing the fuel to the anode, and the cathode consumes electrons to the cathode to reduce the oxidant.
  • the fuel of the enzymatic biofuel cell various sugars and low aliphatic alcohols may be used without limitation. Specific examples include glucose, fructose, cellobiose, lactose, methanol, ethanol, glycerol, pyruvate, hydrogen, and the like.
  • the oxidant may include hydrogen peroxide or cumene peroxide in addition to oxygen molecules.
  • the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell are preferably positioned to be isolated from each other in order to prevent a short circuit.
  • each electrode may further include a redox mediator and a crosslinking agent to prevent the incorporation of the electrode enzyme into the medium and to allow the redox reaction to be efficiently performed.
  • the isolation simply means a physical distance, which is to be positioned at a predetermined interval. Therefore, a separator which is an essential component of a general fuel cell is not required. Accordingly, enzymatic biofuel cells are easy to miniaturize and are suitable for implantation into the body because they do not contain foreign substances such as polymer membranes.
  • the positive electrode includes glucose oxidase to oxidize glucose to gluconolactone
  • the negative electrode includes bilirubin oxidase to generate electric stimulation while reducing oxygen molecules to water (FIG. 1).
  • Enzymatic biofuel cell according to the present invention can control the intensity of the current generated by adjusting the concentration of the enzyme.
  • the inventors of the present invention have identified the minimum current intensity and effective current intensity inducing cell death by applying electric stimulation of various intensities to cells while controlling the enzyme concentration, and changing the current within the above range.
  • the differentiation of the cells was observed to initially identify the current range suitable for inducing differentiation into specific tissues.
  • differentiation into muscle cells can be induced by applying an electrical stimulation of 2 nA / cm 2 or more to less than 230 nA / cm 2 to stem cells using an enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • differentiation into bone cells may be induced by applying an electrical stimulation of 230 nA / cm 2 or more and less than 300 nA / cm 2 to stem cells using an enzymatic biofuel cell.
  • differentiation into neurons may be induced by applying an electrical stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 to stem cells using an enzymatic biofuel cell.
  • differentiation into cardiomyocytes can be induced by applying an electrical stimulation of 500 nA / cm 2 or more to less than 1000 nA / cm 2 to stem cells using an enzymatic biofuel cell according to the present invention.
  • Induction of differentiation of stem cells into the various tissue cells does not require differentiation medium containing growth factors, cytokines, proteins and / or other additives specific for each tissue cell.
  • differentiation medium containing growth factors, cytokines, proteins and / or other additives specific for each tissue cell.
  • the control of the electrical stimulation can be achieved by adjusting the amount of enzyme of the electrode.
  • the present invention provides a composition for inducing differentiation of stem cells comprising an enzymatic biofuel cell.
  • the intensity of the electrical stimulation may be controlled to induce differentiation into specific tissue cells.
  • the range of stimulation suitable for differentiation into each tissue cell is as described above.
  • the present invention provides a composition for promoting the movement or proliferation of cells including an enzymatic biofuel cell.
  • the electrical stimulation may be applied to promote stem cell migration or proliferation to the wound site, thereby inducing the effect of wound healing.
  • the cells may be stem cells or somatic cells.
  • the enzymatic biofuel cell according to the present invention can be usefully used for wound healing and regeneration of damaged tissue. More specific details will be described later.
  • the present invention provides a cell culture container having an enzymatic biofuel cell, which can be cultured while applying electric stimulation to the cells.
  • the cell culture vessel may include the positive electrode, the negative electrode, or both the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell.
  • various enzymes may be used for the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell without limitation.
  • the enzymatic biofuel cell according to the present invention is a system for generating or consuming electrons while oxidizing or reducing a substrate by enzymatic action, so that electric stimulation is continuously performed without supplying power from the outside as long as the substrate for enzymatic action is supplied. Can be generated.
  • the substrate may be supplied in the form of adding a fuel material or an oxidant to the cell culture solution.
  • the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell are preferably positioned so as to be isolated from each other in order to prevent a short circuit.
  • the cathode and the anode are placed farthest at the edge of the culture container. It can be arranged to be spaced apart.
  • each electrode was impregnated with a positive electrode and a negative electrode, respectively, on a carbon electrode screen-printed on a solid substrate such as an OHP film.
  • each electrode may further include a redox mediator and a crosslinking agent to prevent the incorporation of the electrode enzyme into the medium and to allow the redox reaction to be efficiently performed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an enzymatic biofuel cell.
  • the pharmaceutical composition for wound treatment may include an anode, a cathode, or both an anode and a cathode as an enzymatic biofuel cell.
  • anode a cathode
  • various enzymes may be used for the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell without limitation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a transdermal formulation.
  • the "transdermal dosage form” is a formulation that is effective by administering a drug through the skin and is formulated in the form of a drug applied to the skin, a drug applied to the skin, and the like.
  • skin permeation of the active ingredient is achieved through the intracellular, intercellular or perforated organs such as pores and hair pores by simple diffusion according to chemical potential, that is, concentration gradient.
  • the active ingredient may be further formulated to include a skin administration accelerator.
  • the transdermal dosage form of the present invention can be used without limitation as long as it is a formulation capable of directly administering the active ingredient to the surface of the diseased part of the skin.
  • ointments, creams, gels, lotions, liquids, emulsions, suspensions, warnings (sticks), pasta, linen, pape, tape, aerosol or external acid It can be prepared and used. To this end it may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of conventional transdermal formulations.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be absorbed into a sterile gauze or the like and fixed to an adhesive band and applied directly to the affected area in the same manner as a band directly attached to the wound site.
  • Such components include, in the case of ointments, creams, gels, lotions, white petrolatum, yellow petrolatum, lanolin, bleached beeswax, cetanol, stearyl alcohol, stearic acid, hardened oils, gelled hydrocarbons, polyethylene glycols, liquid paraffin, Bases such as squalane; Solvents and dissolving aids such as oleic acid, isopropyl myristate, glycerin triisooctanoate, crotamiton, diethyl sebacate, diisopropyl adipropyl, hexyl laurate, fatty acids, fatty acid esters, aliphatic alcohols and vegetable oils; Antioxidants such as tocopherol derivatives, L-ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene and butylhydroxyanisole; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid ester; Moisturizing agents such as
  • the carrier components include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or fatty acid esters of sorbitan. Solvents, solvating agents or emulsifying agents such as these may be used.
  • a suspending agent as a carrier component, a liquid diluent such as water ethanol or propylene glycol; Suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters; Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • warning agent lead monoxide, olive oil and lard are used, and in case of pasta agent, zincated semal, salicylic acid semal, starch and petrolatum are used.
  • lining agent camphor oil, olive oil, methyl salicylate, traga It can be formulated using canta, sodium carboxymethylcellulose, glycerin and zinc oxide.
  • Tackifiers such as a polyacrylic acid and a polyacrylic acid copolymer
  • Crosslinking agents such as aluminum sulfate, potassium aluminum sulfate, aluminum chloride, magnesium aluminate silicate and dihydroxyaluminum acetate
  • Thickeners such as sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, gelatin, sodium alginate, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium salts, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose
  • Polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol (macrogol), propylene glycol and 1,3-butanediol
  • Surfactants such as polyoxyethylene derivatives
  • Fragrances such as 1-menthol
  • Preservatives such as parahydroxybenzoic acid ester
  • Purified water and the like are examples of stabilizers, preservatives, absorption accelerators, pH adjusters, and other suitable additives
  • adhesives such as styrene, isoprene, a styrene block copolymer (SIS block copolymer), an acrylic resin; Tackifying resins such as cycloaliphatic saturated hydrocarbon resins, rosin resins, and terpene resins; Softeners such as liquid rubber and liquid paraffin; Antioxidants such as dibutyl hydroxytoluene; Polyhydric alcohols such as propylene glycol; Absorption accelerators such as oleic acid; Surfactants, such as a polyoxyethylene derivative, and other suitable additives can be mix
  • SIS block copolymer styrene block copolymer
  • acrylic resin such as cycloaliphatic saturated hydrocarbon resins, rosin resins, and terpene resins
  • Softeners such as liquid rubber and liquid paraffin
  • Antioxidants such as dibutyl hydroxytoluene
  • Polyhydric alcohols such as propylene glycol
  • a water-soluble polymer such as sodium polyacrylate or polyvinyl alcohol and a small amount of purified water may be added to form a water-containing tape.
  • a stabilizer, a preservative, an absorption accelerator, a pH adjuster, and other suitable additives can be added as desired.
  • excipients such as potato starch, rice starch, corn starch, talc, zinc oxide, or other suitable additives can be mix
  • blended in the case of an external acid agent, excipients, such as potato starch, rice starch, corn starch, talc, zinc oxide, or other suitable additives can be mix
  • blended in the case of an external acid agent, excipients, such as potato starch, rice starch, corn starch, talc, zinc oxide, or other suitable additives can be mix
  • blended such as desired, various stabilizers, preservatives, absorption accelerators, and other suitable additives can be blended.
  • the means for preparing the transdermal formulation provided by the present invention is not particularly limited, and a method for preparing a conventional transdermal formulation such as sufficiently kneading each component and the base component as necessary according to a desired dosage form is used. Are manufactured. Moreover, in preparation of a paping agent and a tape agent, the kneaded mixture can be prepared by extending
  • the transdermal dosage form provided by the present invention can be applied directly to the affected area by applying, for example, ointments, liquids (suspensions, emulsions, lotions, etc.), aerosols and external acids, or by applying a cloth or the like. It is used by the usual use method, such as apply
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention are well known to those skilled in the art according to the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, response sensitivity and other well known factors in the medical field. Can be easily determined.
  • the application amount may be set in consideration of transdermal penetration rate, cell absorption capacity, and the like.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by muscle tissue abnormalities, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating a disease caused by abnormal muscle tissue, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating bone disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurological diseases, including enzymatic biofuel cells.
  • the present invention also provides a method for treating neurological disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • Non-limiting examples of diseases caused by muscle abnormalities include myocardial infarction (MI), Lou Gehrig's disease (or amyotrophic lateral sclerosis (ALS), focal, multifocal, segmental). (segmental), hemidystonia or generalized Dystonia and muscular dystrophy (MD).
  • MI myocardial infarction
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • MD muscular dystrophy
  • Non-limiting examples of such bone diseases are osteoporosis, osteomalacia, Paget disease, periodontal disease, rheumatoid arthritis and fracture.
  • Non-limiting examples of such neurological diseases include epilepsy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, Huntington's disease, and Creutzfeldt-Jakob disease. )to be.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays a disease, bone disease or neurological disease caused by abnormal muscle tissue by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment refers to the pharmaceutical composition Means any action that improves or beneficially changes the symptoms caused by diseases, bone diseases or neurological diseases caused by abnormal muscle tissue.
  • the term "individual” means any animal, including a human, who may or may have a disease, bone disease or neurological disease caused by abnormal muscle tissue, and the muscle composition by administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual. Diseases, bone diseases or neurological diseases caused by the above can be effectively prevented or treated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in parallel with a therapeutic agent for diseases, bone diseases or neurological diseases caused by known muscle tissue abnormalities.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to the medical treatment and not causing side effects.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is controlled according to the type of electrode configuration (for example, containing only the positive enzyme, containing only the negative enzyme or both positive and negative enzyme) and the level of electrical stimulation generated according to the content of the electrode enzyme Differentiation into different tissues is induced for different current ranges of stimuli, so the effective amount can be determined in consideration of the type of tissue in which the disease occurs.
  • the term "administration" means introducing a certain substance into a patient in a suitable manner and the route of administration of the composition can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the method of administration is not limited thereto, but parenteral administration is preferred, and more preferably, it can be administered topically to the lesion.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated into a variety of formulations that are free to mold and further include a pharmaceutically acceptable carrier as described above, so that the pharmaceutical composition is administered in an appropriate formulation in consideration of the position and form of the tissue to be applied. can do.
  • the muscle may be administered transdermally or directly to the affected area in the form of an injection, as described above, depending on the affected area. If it is intended to be administered to bone tissue, it may be administered directly to the affected area in the form of an injection, or loaded into a known biodegradable material used for tissue regeneration known in the art, and implanted into the affected area. In addition, in the case of neurological diseases, it is preferable to administer directly to the affected part by injection, but is not limited thereto.
  • the present invention provides muscle cells differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 2 nA / cm 2 or more and less than 230 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides bone cells differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 230 nA / cm 2 or more and less than 300 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides a neuronal cell differentiated by culturing stem cells while applying an electric stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the present invention provides a cardiomyocyte that is differentiated by culturing stem cells while applying an electrical stimulation of 500 nA / cm 2 or more and less than 1000 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture vessel. .
  • the method of differentiating stem cells using the composition for inducing differentiation or the cell culture vessel of the present invention does not require growth factors, cytokines, proteins and / or other additives specifically required for differentiation of tissues. Incubate in a normal culture medium without controlling the concentration of the enzyme to induce differentiation by applying an electric stimulation in the appropriate range. Therefore, the possibility of contamination by the use of foreign substances or serum is significantly low, thus the differentiated myocytes, bone cells, nerve cells and cardiomyocytes are suitable for use as cell therapy.
  • Mouse myoblast cell line (mouse myoblast cell line) C2C12 was prepared and dispensed at 2 ⁇ 10 3 cells / cm 2 concentration in each culture dish.
  • DMEM Disbecco's modified eagle medium, LM 001-05, WelGENE, Daegu, Korea
  • FBS fetal bovine serum
  • Ibco penicillin / streptomycin
  • Poly (ethylene glycol) (400) diglycidyl ether (PEGDGE, Polysciences Inc.) was used as a cross-linker.
  • the loading solution for the positive and negative electrodes was configured to include enzymes, redox mediators and crosslinkers.
  • the positive catalyst is 0.04 mg / ml GOx, 0.04 mg / ml PVI- [Os (4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2Cl] + / 2 + (PVI- [Os (4, 4'-51-22dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2Cl] + / 2 + ; PVI- [Os (dmo-bpy) 2Cl] + / 2 + ) and 10 mg / ml PEGDGE 4: 4: 1
  • the mixture was composed of cross-linked adducts by mixing at a volume ratio of.
  • the cathodic catalyst contains 0.04 mg / ml BOD, 0.04 mg / ml PVI- [Os (4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2Cl] + / 2 + and 10 mg / ml PEGDGE.
  • the mixture was composed of crosslinked adducts by mixing in a volume ratio of 4: 4: 1. 10 ⁇ l of the mixture was applied on SPCE and dried at room temperature (25 ° C. ⁇ 1) for 24 hours in a desiccator.
  • FIG. 2 In order to confirm the electrochemical characteristics of the prepared enzymatic biofuel cell, two SPCEs were attached to the edge of the culture dish (35 mm in diameter) (FIG. 2).
  • an electrode having a total active area of 30 mm 2 having a length of 15 mm and a width of 2 mm was used as the positive or negative electrode.
  • Dual electrode electrochemical cells in combination with CHI 600B potentiostat (Austin, TX, USA) were used for open circuit potential (OCP) and it technology.
  • OCP open circuit potential
  • the electrochemical properties of the modified PVI- [Os (dmo-bpy) 2Cl] + / 2 + were studied using a 3.5 mm diameter working electrode on a flexible polyester film.
  • Simple EBFCs were prepared by the method described above to generate electrical signals from EBFCs.
  • EBFC was categorized into an anode alone, an anode alone, and an anode / cathode condition, and the flow of electrons to cells under each electrode condition is schematically shown (FIG. 2).
  • a container containing no electrode was used as a control.
  • GOX oxidizes glucose into gluconolactone and releases electrons, so the vicinity of the anode becomes an electron-rich condition that affects living cells.
  • BOD consumes electrons while reducing oxygen molecules to water, and the vicinity of the cathode changes to an electron-deficient state that affects the surrounding cells.
  • an electrode system anode / cathode system including both an anode and a cathode
  • a flow of electrons is generated due to a reaction at each electrode, thereby forming a gradient.
  • the present inventors established the conditions rich in electrons and the lack of electrons in the culture dish, respectively.
  • EBFC experiment was performed by applying a voltage of -38.5 mV to Ag / AgCl to obtain an electric current output.
  • Current density versus enzyme concentration in the anode / cathode system is shown in Table 1 below.
  • Live imaging was performed by co-transient transfection of C2C12 with paxillin-RFP and Green-actin simultaneously.
  • the paxillin-RFP plasmid was provided by Dr. Xiong (Georgia Health Science University).
  • Green FP vector-actin 558721, BD Pharmingen TM, USA was used commercially available.
  • Neon transfection system Invitrogen life science, USA was used to optimize the electroporation conditions (1100 V, 30 ms 1 pulse) for suspended C2C12 cells according to the manufacturer's instructions.
  • the cells were stimulated with current densities of 14 nA / cm 2 and 10867 nA / cm 2 , respectively, and the results are shown in FIG. 3.
  • the application of more than 1000 nA current showed a noticeable change in cell morphology compared to the control and low current cells, indicating that cell death was caused by excessive electrical stimulation (FIG. 3).
  • the cytoskeletal network was completely destroyed by 1000 nA of strong electrical stimulation (bottom right in FIG. 3).
  • low currents at the 2 nA level significantly altered the actin-cytoskeletal tendency, such as strong transverse arc and dorsal stress fibers, in the cells (bottom 3, bottom left).
  • 2 nA which is a low level current that induces a change in cell morphology
  • 1000 nA which starts cell death
  • C2C12 cell suspension solutions were prepared at a concentration of 3 to 7 ⁇ 10 5 / ml. 75 ⁇ l of cell solution was applied to each well.
  • a well-defined cell seeding system (80206, ibiTreat, ibidi, Germany) was used to prepare a cell-free gap using a culture-insertion apparatus. The width of the gap containing no cells in each well was 500 ⁇ m ⁇ 50 ⁇ m. After cell division, culture-insertions were carefully removed from the petri dishes. Wash several times to remove unattached cells. After washing, 5 ml of fresh medium was charged for the enzymatic reaction of EBFC. A 60 mm diameter culture dish was used as the EBFC current system.
  • Electrodes were attached to the cross edges of the cell-cell gaps. After removal of the culture-insertion instrument, the cells were observed at 16 and 24 hours and counted as cells moved into the gap. For each EBFC condition, the number of cells in the gap that did not contain cells was counted and compared.
  • An electrical stimulation system was installed in the cell-cell gap: a culture plate containing only the positive electrode, a culture plate containing only the negative electrode and a culture plate containing both the positive electrode and the negative electrode and a culture plate without the electrode as a control.
  • Cells were aliquoted into the culture dish with a gap that did not contain 500 ⁇ m of cells and cultured under each electrical stimulation to calculate the number of cells that migrate into the gap and to measure wound healing. Migration to the cell-cell gap was recorded in photographs before and after 16 and 24 hours of stimulation using a digital camera mounted on a microscope (Nikon Instruments) in three different areas, respectively. To determine cell-cell gap closure rates, the best microscopic images were used to determine the average cell number for each migration.
  • FIG. 4 shows that the migration rate of the cells in the electrical stimulation group significantly increased compared to the control group to which the electrical stimulation was not applied.
  • cell migration was found to be more than doubled in 16 hours compared to the control.
  • the electrical stimulation in the culture plate containing only the negative electrode showed a significant increase in the number of cells moved from the edge to the center compared to the other electrical stimulation group after 24 hours (Fig. 4; third column from the left).
  • Statistical analysis was performed using Student's t-test over time. In the present invention, it was confirmed for the first time that the stimulation of C2C12 myoblasts by only the positive and negative poles improved the cell migration rate more than two times compared to the control group.
  • C2C12 cells were aliquoted onto a culture dish containing an electrode (35 mm diameter) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 / ml.
  • a control and three electrode conditions were used (FIG. 2): control (electrodeless; electrodeless), anode only (anodic only), cathode alone (full); Anode / cathode.
  • the response of adherent cells to electrical stimulation was confirmed for the control group and the experimental group. Therefore, a culture plate having a 3 mm gap between the electrode and the culture plate was prepared.
  • Initial culture conditions were to cover the cells using a culture medium of 2 ml but not to touch the electrical node (electrical node). After 16 hours, 3 ml of culture medium was added to completely cover the electrical junction for the enzyme reaction. Cells were then harvested and counted for cell proliferation analysis on days 2, 4 and 6.
  • Cell proliferation assays were performed for different conditions of EBFC. Cells were aliquoted at a density of 1 ⁇ 10 4 / ml onto the petri dishes and cells were incubated with different electric fields of different intensities and cell numbers were checked every 2 days until 6 days. The electric field in enzyme-based biofuel cell conditions showed a significant increase in cell proliferation compared to the control (FIG. 5).
  • C2C12 cell differentiation was specific such as mouse monoclonal anti-myogenin antibody (1: 100, Santa Cruz Ins., USA) and rabbit polyclonal anti-alpha actinine antibody (1: 100, Santa Cruz Ins., USA) Staining with a specific mature muscle marker was performed by co-fluorescence immunocytochemistry. Cells placed on PCL nanofiber membranes were fixed with 4% paraformaldehyde and treated with 0.5% Triton X-100 for 10 minutes to ensure permeability.
  • RNA samples (1 ⁇ g) were reverse transcribed into cDNA in 40 ⁇ l reaction using the Quantitect RT kit (# 205311, Qiagen, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes.
  • PCR amplification was performed with 1 ⁇ l cDNA using pre-mixed PCR kits (pre-mixed PCR kit, Bioneer, Daejeon, Korea) using specific gene primers, respectively.
  • the PCR reaction was carried out for 35 cycles at 95 ° C. for 30 seconds, at 60 ° C. for 30 seconds, then at 75 ° C. for 60 seconds, and was repeated three times for each cDNA.
  • PCR products were electrophoresed for 25 minutes at 100V on 2% agarose gel. Quantify the band intensity of the sample using the software program Gene tools and check for endogenous Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) transcript (transcript, GU214026.1). Normalized.
  • GPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the transferred membrane was blocked with 5% fat free milk tris buffer with 0.5% tween-20 (TBST) for 1 hour at room temperature.
  • Primary antibodies were diluted with 2% skim milk TBST solution and incubated overnight in a cold room with transfer membrane.
  • the blotted membranes were washed with 0.5% TBST and incubated with horseradish peroxidase-binding anti mouse secondary IgG and the immunoreactive bands were subjected to ECL detection reagents (Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop). , CA).
  • ECL detection reagents Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop). , CA).
  • Band imaging and intensity analysis were performed using ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare, USA). Western blot analysis was performed three times, and the measured intensities were expressed as mean ⁇ standard deviation (mean ⁇ S.D.).
  • RT-PCR and Western blots were performed to analyze mature muscle specific genes and proteins on the electric field by EBFC.
  • mature root canal formation and mature muscle specific protein expression were analyzed after 5 days of culture.
  • Cells were immunostained simultaneously with anti-myogenin and alpha-actinin antibodies to visualize protein localization and canalization by fluorescence imaging and are shown in FIG. 6. Electrostimulation by the cathode alone and electrostimulation by the anode / cathode system resulted in strong expression of myogenin and alpha actinin as muscle maturation marker proteins.
  • the electrical stimulation by both the anode and the cathode showed complete root canal formation on the PCL-gel nanofibrous membrane.
  • all markers of mature muscle differentiation MyoD and alpha actinine
  • FIG. 6A When cultured under the same conditions without electric stimulation, no positive staining cells were present on the membrane. Fluorescence intensity levels for all markers were quantified to confirm that the fluorescence intensity was significantly stronger in the cells on the membrane to which only the cathode stimulation was applied than the cells cultured by the anode stimulation alone (FIG. 6A).
  • the cells that combined the positive and negative stimuli showed complete root canal formation.
  • the root canal formation was significantly increased compared with the group which added the negative electrode only and the control group.
  • the present inventors quantitatively analyzed the differentiation by electric stimulation using EFBC.
  • Gene expression of mature skeletal muscle specific markers such as myogenin, myoD, skeletal muscle actinin and alpha-actinine by EBFC was analyzed.
  • MRNA levels of C2C12 cultured on scaffolds for 5 days were analyzed using RT-PCR. Normalized to GAPDH control, all gene expressions were significantly increased in the negative stimulus only and the negative / positive positive stimulus compared to the control (FIG. 6B).
  • skeletal alpha actinin gene expression was significantly higher (about 3 fold) than the other groups. Strong expression of skeletal muscle actinin was observed in the samples that were subjected to cathodic stimulation only.
  • EBFC electrostimulation was assessed at protein level by incubation of C2C12 cultured on PCL-nanogum membranes for 5 days. Quantification of muscle cells for angiogenesis and alpha-actinin protein was reconfirmed by Western blot. Cells cultured on PCL nanofibrous membranes containing electrical stimulation showed significantly higher protein expression compared to cultures without electrical stimulation. A statistically significant difference was observed for MyoD and alpha-actinin with the application of a comprehensive electrostimulation of the anode / cathode. Negative stimulation showed slightly increased muscle protein expression levels compared to the control. The alpha-actinin protein did not show any difference between the control group and the control group in which only positive and negative poles were applied.
  • Electrostimulation was applied with changes (0.01 EF, 0.02 EF and 0.05 EF) at 1000 nA levels that did not induce apoptosis as described above.
  • the expression of myocyte-specific myogenin and myo D was significantly improved
  • the expression of bone cell-specific OPN and ALP was significantly improved.
  • the electrical stimulation of 0.02 to 0.05 EF the expression of neuron-specific neurofibers was significantly improved. From this, consistent with the foregoing, relatively low electrical stimulation differentiates into muscle cells, moderate electrical stimulation differentiates into bone cells, and moderate to high levels of electrical stimulation within a range not causing cell death. was found to induce differentiation into neurons.
  • the present invention relates to a cell behavior control method and the like comprising the step of applying an electrical stimulation to the cell using an enzymatic biofuel cell.
  • the present invention uses an enzyme as an electrical stimulation source, and therefore has high biocompatibility, can be molded into a desired formulation, and can generate a wide range of electric currents by controlling the concentration of enzyme introduced into each electrode, and do not include both electrodes. It is highly possible to use as a pharmaceutical composition in that it can generate electric stimulation even if not.
  • stem cells can be induced to differentiate into different tissues, and thus various formulations can be usefully used for tissue regeneration. There is availability.

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Abstract

본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법등에 관한 것이다. 본 발명은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한, 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법
본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물; 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기; 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용, 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 및 신경질환의 예방 및 치료용 약학 조성물; 및 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.
한편 상처와 같은 외상의 치유는 세포가 상처 부위로 이동하고 증식함으로써 달성된다. 따라서, 세포의 이동 및 증식을 촉진시킴으로써 상처치유를 촉진할 수 있다.
이와 같이 상처치유를 위한 세포의 이동 및 증식, 원하는 조직으로의 줄기세포의 분화를 통틀어 세포 거동이라 하며, 이러한 세포의 거동은 물리적 및/또는 화학적 환경에 의해 영향을 받는다. 이는 세포의 거동이 신호전달 체계에 의해 조절되며, 이러한 신호전달 체계는 다양한 물리 화학적 인자에 의해 조절될 수 있기 때문이다.
상기 물리적 인자 중의 하나는 전기자극으로 이는 골격근의 유지 및 근과형성에 매우 중요한 요소이며, 운동뉴런으로부터의 전기자극의 부재가 탈신경근위축(denervated muscle atrophy) 등을 유발함이 보고되었다.
관절질환에 저주파를 적용한다던지 간질환자의 뇌에 직접 전기자극을 가한다던지 하는 것은 물리적 자극을 이용한 치료방법의 대표적인 예이다.
이에 본 발명자들은 생체적합성이 높고 신체 여러 부위에 적용가능한 형태로 제형화될 수 있는 전기자극원을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 효소의 산화환원 반응에 의해 작동하는 효소적 생물연료전지를 이용하는 경우 효소의 농도를 조절하는 방법으로 세포의 사멸을 유도하지 않는 세기 범위 내에서 전류를 다양하게 변화시킬 수 있어 세포 독성에 대한 우려가 없으며, 다양한 제형으로 자유롭게 성형될 수 있어 신체 각 부위에 적절하게 제형화하여 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2이상 300 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2이상 500 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2이상 500 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공한다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지를 이용하여 전기자극을 가함으로써 세포거동을 조절하는 방법은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때, 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 전극에서의 효소의 산화환원 반응에 기반한 효소적 생물연료전지의 대표적인 예를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지의 전극 구성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 세기에 따른 세포의 반응을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 세포 이동 촉진효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 줄기세포 분열촉진효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 심근 및 근육세포 분화 유도효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 정도에 따른 분화방향을 나타낸 도이다. 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간 정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "효소적 생물연료전지(enzymatic fuel cell)"는 생물연료의 화학적 에너지를 전기적 에너지로 전환시키는 장치로서, 연료를 산화시키기 위한 촉매로서 효소를 이용하는 특별한 형태의 연료전지이다. 따라서, 종래의 연료전지와는 달리 값비싼 금속촉매를 필요로 하지 않는다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 세포의 이동, 분열 또는 분화와 같은 세포 거동을 조절할 수 있다. 이때, 조절 가능한 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 세포의 종류에 구애되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 양극(anode)이나 음극(cathode) 중 하나의 전극만을 포함하더라도 전기자극을 발생시킬 수 있으므로, 효소적 생물연료전지의 양극, 음극 또는 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극에 의해 세포 거동을 조절할 수 있다. 바람직하게 상기 효소적 생물연료전지의 양극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 또는 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)일 수 있으며, 음극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 또는 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 양극은 FAD(flavin adenine dinucleotide), PQQ(Pyrrolo quinoline quinone), 헴(heme), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 또는 Mn 등의 보조인자(co-factor)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 효소적 생물연료전지의 양극은 산화전극으로 연료를 산화시켜 전자를 방출하며, 음극은 환원전극으로 전자를 소모하여 산화제(oxidant)를 환원시킨다. 상기 효소적 생물연료전지의 연료로는 다양한 당류(sugars) 및 저분자량의 지방족 알콜(low aliphatic alcohols)를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 글루코스, 프락토스, 셀로비오스, 락토즈, 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 파이루베이트, 수소 등을 포함한다. 상기 산화제로는 산소분자 이외에도 과산화수소 또는 큐멘 과산화물(cumene peroxide)을 포함할 수 있다.
일반적인 연료전지와 마찬가지로, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다. 단, 상기 격리는 단순히 물리적인 거리를 의미하는 것으로 일정 간격 이격되도록 위치시키기만 하면 된다. 따라서, 일반적인 연료전지의 필수적인 구성요소인 분리막을 필요로 하지 않는다. 이에 따라 효소적 생물연료전지는 소형화가 용이하며 고분자막과 같은 이물질을 포함하지 않으므로 체내에 이식하기에 적합하다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에서는 양극은 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키고, 음극은 빌리루빈 산화효소를 포함하여 산소분자를 물로 환원시키면서 전기자극을 발생시킨다(도 1).
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소의 농도를 조절함으로써 발생하는 전류의 세기를 조절할 수 있다.
본 발명자들은 효소 농도를 조절하면서 다양한 세기의 전기자극을 세포에 가함으로써 세포 거동에 유효한 효과를 나타내는 최소의 전류세기 및 세포사멸을 유도하는 전류세기를 동정하였으며, 상기 범위 이내에서 전류를 변화시키면서 줄기세포의 분화를 관찰하여, 특정 조직으로의 분화를 유도하기에 적합한 전류 범위를 최초로 동정하였다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 근육세포로의 분화를 유도할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 230 nA/cm2이상 300 nA/cm2미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 골세포로의 분화를 유도할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 300 nA/cm2이상 500 nA/cm2미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 신경세포로의 분화를 유도할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 심근세포로의 분화를 유도할 수 있다.
상기 다양한 조직세포로의 줄기세포의 분화 유도는 각 조직세포에 대해 특이적인 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 포함하는 분화배지를 필요로 하지 않는다. 일반적인 배양배지를 이용하되 상기 범위의 전기자극을 가함으로써 해당 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 이때, 상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 효소의 양을 조절하면서 발생하는 전류세기를 측정하였으며(표 1), 이를 이용하여 다양한 세기의 전기자극을 줄기세포에 가하여 각기 다른 범위의 전기자극에 의해 각기 다른 조직세포로의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 7).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 전기자극의 세기를 조절하여 특정 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 각 조직세포로의 분화에 적절한 자극의 범위는 전술한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상처 부위 주변에 상기 효소적 생물연료전지를 포함하는 조성물을 적용함으로써 상기 전기자극을 가하여 상처 부위로의 줄기세포 이동 또는 증식을 촉진시켜 상처치유의 효과를 유도할 수 있다. 바람직하게 상기 세포는 줄기세포 또는 체세포일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 상처치유 및 손상된 조직의 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 보다 구체적인 사항은 후술할 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공한다.
상기 세포배양용기는 효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한 없이 이용할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소작용에 의해 기질을 산화 또는 환원시키면서 전자를 발생하거나 소모하는 시스템이므로 효소작용을 위한 기질이 공급되는 한 외부로부터의 전력공급이 없이도 지속적으로 전기자극을 생성할 수 있다. 상기 기질은 연료물질 또는 산화제를 세포배양액에 첨가하는 등의 형식으로 공급될 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 예컨대, 일반적인 세포배양용기 내에 양쪽 전극 모두를 포함하는 효소적 생물연료전지를 설치하여 액체 배지를 이용하여 배양하는 세포에 전기자극을 가하고자 하는 경우, 배양용기의 가장자리에 음극과 양극을 각각 가장 멀리 이격되도록 배치할 수 있다. 이때, 전극으로부터 효소가 배지로 확산되어 혼입되는 것을 방지하기 위하여, 각 전극은 OHP 필름과 같은 고체 기재 상에 스크린-프린트된 탄소전극에 양극 및 음극 효소를 각각 함침시켰다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 상처 치료용 약학 조성물은 효소적 생물연료전지로서 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한 없이 이용할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 약학 조성물은 경피투여형 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 "경피투여형 제제"는 피부를 통해 약물을 투여하여 효과를 나타내는 제형으로 피부에 바르는 약, 피부에 붙이는 약 등의 형태로 제형화된다. 경피투여시 활성성분의 피부 투과는 화학포텐셜 즉, 농도기울기에 따른 단순확산에 의해 세포 내, 세포간 또는 땀구멍, 털구멍 등의 부속기관을 통과하여 이루어진다. 손상되지 않은 피부를 통과하는 것이 용이하지는 않다는 단점이 있으나, 약물의 효율, 투여속도의 제어, 환부에 직접 적용 가능성 등의 사용상 용이점이 있으며 비교적 일정한 혈중농도 유지, 위장관 독성을 나타내는 물질의 부작용 최소화, 간의 부담 감소 등의 장점이 있다. 활성성분의 피부 투과를 용이하게 하기 위해서는 피부 투여 촉진제를 추가적으로 포함하여 제형화 할 수 있다.
본 발명의 경피투여형 제제는 피부의 질환부 표면에 유효 성분을 직접 투여할 수 있는 제형이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 연고제, 크림제, 겔제, 로션제, 액제, 유제, 현탁제, 경고제(스틱제), 파스타제, 리니멘트제, 파프제, 테이프제, 에어로졸제 또는 외용산제 등의 제제로 조제하여 사용할 수 있다. 이를 위해 통상의 경피투여형 제제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또는 멸균된 거즈 등에 본 발명의 약학 조성물을 흡수시키고 이를 접착성 밴드에 고정시켜 상처부위에 직접 부착하는 밴드와 같은 방식으로 환부에 직접 적용할 수 있다.
그러한 성분으로는 연고제, 크림제, 겔제, 로션제의 경우에 있어서는, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 아디프산디이소프로필, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제 등을 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
액제 또는 유제인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등의 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다.
현탁제인 경우에는 담체 성분으로서 물 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제; 에톡실화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
경고제인 경우에는 일산화납, 올리브유 및 돈지(lard)를 이용하여, 파스타제인 경우에는 아연화 세말, 살리실산 세말, 전분 및 바셀린을 이용하여, 리니멘트제인 경우에는 장뇌유, 올리브유, 메틸 살리실리레이트, 트라가칸타, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 글리세린 및 산화아연을 이용하여 제제화할 수 있다.
파프제의 경우에 있어서는, 폴리아크릴산, 폴리아크릴산 공중합체 등의 점착부여제; 황산알루미늄, 황산칼륨알루미늄, 염화알루미늄, 메타규산알루민산마그네슘, 디하이드록시알루미늄아세테이트 등의 가교제; 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 (마크로골), 프로필렌글리콜, 1,3-부탄디올 등의 다가 알코올류; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제; 1-멘톨 등의 향료; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 정제수 등을 들 수있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
테이프제의 경우에 있어서는, 스티렌, 이소프렌, 스티렌 블록 공중합체 (SIS 블록 공중합체)나 아크릴 수지 등의 점착제; 지환족 포화 탄화수소계 수지, 로진계수지, 테르펜계 수지 등의 점착 부여 수지; 액상 고무, 유동 파라핀 등의 연화제; 디부틸하이드록시톨루엔 등의 산화 방지제; 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 올레산 등의 흡수 촉진제; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 또, 폴리아크릴산나트륨이나 폴리비닐알코올과 같은 함수 가능한 고분자와 소량의 정제수를 첨가하여 함수 테이프제로 할 수도 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
에어로졸제의 경우에 있어서는, 연고제, 크림제, 겔제, 현탁제, 유제, 액제 및 로션제 등의 조제에 사용되는 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 아디프산디이소프로필, 세바크산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 추가로 각종 안정제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 보존제, 용해 보조제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 특히, 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 추가적으로 포함할 수 있다.
외용산제의 경우에 있어서는, 감자 전분, 쌀 전분, 옥수수 전분, 탤크, 산화 아연 등의 부형제 또는 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 각종 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
본 발명이 제공하는 경피투여형 제제를 조제하는 수단은 특별히 한정되지 않고, 원하는 제형에 따라 각 성분 및 필요에 따라 기제 성분을 충분히 혼련하는 등의 통상의 경피투여형 제제를 제조하는 방법을 사용하여 제조된다. 또, 파프제 및 테이프제의 조제에 있어서는, 혼련한 혼합물을 이형지 상에 전연(展延), 건조시키고, 추가로 유연한 지지체와 첩합(貼合)시키고, 원하는 크기로 재단함으로써 조제할 수 있다.
본 발명이 제공하는 경피투여형 제제는, 예를 들어 연고제, 액제 (현탁제, 유제, 로션제 등), 에어로졸제 및 외용산제의 경우에는, 피부 환부에 도포 등에 의해 직접 적용하거나, 혹은 천 등의 지지체에 도포 또는 함침시켜 적용하거나 하는 등의 통상의 사용 방법에 의해 사용된다. 또, 파프제 혹은 테이프제의 경우에는, 이들 제제를 피부 환부에 직접 첩부하는 방법에 의해 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 반응 감응성 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 경피투여형 제제로 사용되는 경우 경피투과속도, 세포 흡수력 등을 고려하여 적용량을 설정할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법을 제공한다.
상기 근육조직 이상으로 인한 질환의 비제한적인 예는 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)이다.
상기 골질환의 비제한적인 예는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)이다.
상기 신경질환의 비제한적인 예는 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)이다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "개체"란 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 공지의 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 전극 구성의 형태(예컨대, 양극효소만을 포함, 음극효소만을 포함 또는 양극 및 음극 효소를 모두 포함) 및 전극 효소의 함유량에 따라 발생하는 전기자극의 수준이 조절되고 각기 다른 전류 범위의 자극에 대해서 각기 다른 조직으로의 분화가 유도되므로, 질환이 발생한 조직의 형태를 고려하여 유효량을 결정할 수 있다. 또한 이외에도 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소를 고려하여 유효 용량 수준을 결정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "투여"란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하며, 보다 바람직하게는 병변에 국소 투여할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 성형이 자유롭고 상기한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 다양한 제형으로 제제화될 수 있으므로, 적용하고자 하는 조직의 위치 및 형태를 고려하여 적절한 제형으로 투여할 수 있다. 예컨대, 근육에 투여하고자 하는 경우 환부에 따라 상기한 바와 같이 경피투여하거나 주사제의 형태로 환부에 직접 투여할 수 있다. 골조직에 투여하고자 하는 경우 주사제의 형태로 환부에 직접 투여하거나, 당업계에 알려진 조직 재생에 사용되는 공지의 생분해성 물질에 로딩하여 환부에 이식할 수 있다. 또한 신경질환의 경우 주사제로 환부에 직접 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2이상 300 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2이상 500 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공한다.
전술한 바와 같이 본 발명의 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 줄기세포를 분화시키는 방법은 각 조직 분화에 특이적으로 요구되는 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 필요로 하지 않고 일반 배양배지에 배양하되 효소의 농도를 조절하여 적절한 범위의 전기자극을 가하면서 배양하는 방법으로 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 외부물질 또는 혈청 사용에 의한 오염가능성이 현저히 낮으므로, 이렇게 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포는 세포치료제로 사용되기에 적합하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포주의 준비
마우스 근모세포 세포주(mouse myoblast cell line) C2C12를 준비하여 각 배양접시에 2X103세포/cm2농도로 분주하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone, Thermo), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Gibco)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium, LM 001-05, WelGENE, Daegu, Korea) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃의 습식배양기에서 배양하면서 세포를 유지하였다.
실시예 2: 효소적 생물연료전지(enzymatic biofuel cell; EBFC)의 제조, 상기 전지의 전기화학적 특성 및 성능
반자동식의 스크린 프린팅 기기(semi-automatic screen printing machine)를 사용하여 OHP 필름 상에 Electrodag®423SS(Acheson,PortHurton,USA)로 스크린-프린트된 탄소전극(screen-printed carbon electrodes; SPCEs)을 준비하였다. 양극효소(anodic enzyme)로는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOx, 219 U/mg, Amano Enzyme Inc., Japan)를 사용하였다. 음극효소(cathodic enzyme)로는 마이로테시움 베루카리아(Myrothecium verrucaria) 유래의 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD, 10.5 U/mg, Sigma enzyme)을 사용하였다. 상기 양극 및 음극에서의 산화환원 반응을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 폴리에틸렌글리콜(400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol)(400) diglycidyl ether; PEGDGE, Polysciences Inc.)를 가교제(cross-linker)로 사용하였다. 양극 및 음극 전극을 위한 로딩 용액은 효소, 산화환원 매개체(redox mediator) 및 가교제를 포함하도록 구성하였다. 양극 촉매는 0.04 mg/ml의 GOx, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+(PVI-[Os(4,4'-51-22dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+;PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+)및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물(cross-linked adduct)로 구성하였다. 음극 촉매는 0.04 mg/ml의 BOD, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물로 구성하였다. 혼합물 10 μl를 SPCE 상에 도포하고 데시케이터 내에서 24시간 동안 실온(25℃±1)에서 건조하였다.
상기 제조한 효소적 생물연료전지의 전기화학적 특성을 확인하기 위하여, 두 개의 SPCE를 배양접시(직경 35 mm)의 가장자리에 부착하였다(도 2). 본 발명에서는 양극 또는 음극 전극으로서 길이 15 mm, 너비 2 mm의 총 30 mm2 활성면적을 갖는 전극을 사용하였다. 개방회로전위(open circuit potential; OCP) 및 i-t 기법(technique)을 위하여 CHI 600B potentiostat(Austin, TX, USA)과 결합된 이중전극 전기화학 전지를 사용하였다. 유연한 폴리에스테르 필름 상의 3.5 mm 직경의 작업전극을 이용하여 개질된 PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+의 전기화학적 특성을 연구하였다. 0.5 mm 직경의 백금선 상대전극 및 Ag/AgCl 마이크로-기준전극(AgCl로 포화된 3.0 M KCl, Cypress, Lawrence, KS, USA)을 이용하였다. 각 배양접시에 전기적 흐름을 위한 전도체로서 배양배지를 채웠다. 실험 하루 전에 동일한 수의 세포를 배양접시에 분주하였다.
EBFC로부터 전기적 신호를 생성하기 위하여 전술한 방법으로 단순한 EBFC를 제조하였다. 전류 흐름 방향에 따라, EBFC를 양극단독, 음극단독 및 양극/음극 조건으로 분류하였으며, 각 전극 조건에서 세포에 대한 전자의 흐름을 개략적으로 나타내었다(도 2). 대조군으로는 전극을 포함하지 않는 용기를 사용하였다. GOX는 글루코스를 글루코노락토(gluconolactone)으로 산화시켜 전자를 방출하며, 따라서 양극 부근은 살아있는 세포에 영향을 주는 전자가 풍부한 조건이 된다. BOD는 산소분자를 물로 환원시키면서 전자를 소모하여 음극 부근은 주변 세포에 영향을 주는 전자-부족 상태로 변한다. 양극 및 음극을 모두 포함하는 전극 시스템(양극/음극 시스템)에서는 각 전극에서의 반응으로 인해 전자의 흐름이 발생하며 이에 따른 구배가 형성되었다. 본 발명자들은 배양접시에 각각 전자가 풍부한 조건과 전자가 부족한 조건을 확립하였다. 각 전극은 40 μl GOX 또는 BOD 및 40 μl 폴리(N-비닐이미다졸)-[Os(4,4-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl])+/2+(poly(N-vinylimidazole)-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl])+/2+;PVI-dmo-Os,E0'=-38.5mVvs.Ag/AgCl),10μl폴리에틸렌글리콜 (400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) (400) diglycidyl ether; PEGDGE)의 가교결합 부산물(cross-linked adduct)로 구성되었다. 배양접시 내부에 전극을 위치시킨 후, Ag/AgCl에 대해 -38.5 mV의 전압을 가하여 EBFC 실험을 수행하고 전기 전류 출력을 얻었다. 본 발명자들은 효소 및 산화환원 매개체의 농도를 조절함으로써 EBFC의 최상의 전기 자극을 성취하였다. 양극/음극 시스템 생물연료전지에 고농도로 효소를 로딩한 산화환원 매개체에서 한계 전류밀도는 10867ㅁ549 nA/cm2(N=3)이었다. 양극단독, 음극단독 및 낮은 농도로 효소를 로딩한 양극/음극 시스템 EBFC의 산화환원 매개체에서 한계 전류는 각각 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3),8.676±1.17nA/cm2(N=3)및 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)이었다. 양극/음극 시스템에서 효소농도에 대한 전류 밀도를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
효소의 농도(Gox, BOD) 효소 전극의 전류밀도 (unit=nA/cm2)
1.00 mg/mL If=4210±208
0.10 mg/mL If=2090±101
0.05 mg/mL If=375±16.2
0.025 mg/mL If=246±11.5
0.01 mg/mL If=204±10.2
Control If=56±2.351
If=fullsystemcurrent
실시예 3: 세포거동연구를 위한 EBFC의 최적조건 탐색
본 발명자들은 C2C12 세포거동연구를 위한 최적의 EBFC 조건을 먼저 탐색하였다. 효소농도를 조절함으로써 EBFC의 전류와 전압을 조절하였다. 세포배양배지에서 각 효소농도에 대한 전력용량(electric power capacity)을 계산하였다. 구체적으로 효소농도를 조절하여 C2C12 세포에 2 nA, 40 nA 및 120 nA의 3가지 EBFC 조건을 적용하여 배양하였다. 이후, 항-병소부착단백질 항체(anti-focal adhesion protein antibody) 및 세포골격 염색 염료를 포함하는 면역세포화학 및 팍실린-RFP 및 그린-액틴(paxillin-RFP Green-actin)을 함께 전달감염(co-transfection)하여 공초점 라이브 이미지로 세포거동을 관찰하였다.
C2C12에 팍실린-RFP 및 그린-액틴을 동시에 일시 전달감염(co-transient transfection)시켜 라이브 이미징하였다. 팍실린-RFP 플라스미드는 Xiong 박사(Georgia Health Science University)로부터 제공되었다. 그린-액틴 플라스미드(Green FP vector-actin: 558721, BD Pharmingen™, USA)는 상용화된 것을 구입하여 사용하였다. 네온 전달감염 시스템(Neon transfection system, Invitrogen life science, USA)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 부유시킨 C2C12 세포에 대한 전기천공조건(electroporation condition)을 최적화(1100 V, 30 ms 1 펄스)하였다. 배양 3일 후, 팍실린-RFP/GFP-액틴을 동시에 전달감염시킨 세포를 트립신으로 처리하여 단일 부유 세포 용액(single suspended cell solution, 1X104세포/ml)을 준비하였다. 라이브 이미징을 위하여 부유 C2C12를 공초점 배양접시(SPL Korea)에 분주하여 배양하였다. 적색 및 녹색 양성 세포를 선택하여 매 2.5분 마다 20사이클 반복하여 총 50분간 라이브 이미지를 기록하였다.
C2C12 세포의 생존을 위한 최적의 전하 및 전기 전류 조건을 연구하였다. 낮은 농도의 GOX를 로딩한 경우 한계 양극 전류 밀도는 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 BOD 로딩의 경우 한계 음극 전류 밀도는 8.676±1.17 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 효소를 로딩한 경우 양극/음극 시스템 EBFC조건의 한계 음극 전류 밀도는 배양접시 상에서 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 높은 농도의 효소 로딩의 경우 음극 전류 밀도는 최대 10867±549 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 각각 14 nA/cm2및 10867 nA/cm2의 전류밀도로 세포를 자극하고 그 결과를 비교하여 도 3에 나타내었다. 그 결과 1000 nA를 초과하는 전류를 적용한 경우 대조군 및 낮은 전류를 적용한 세포와 비교하여 눈에 띠는 세포 형태 변화를 나타내었으며, 이는 과도한 전기자극으로 인해 세포사멸에 이르렀음을 나타내었다(도 3). 즉, 1000 nA의 강한 전기 자극에 의해 세포골격 네트워크가 완전히 파괴되었다(도 3 하단 우측). 그러나, 2 nA 수준의 낮은 전류는 세포에서 강한 횡단 호(transverse arc) 및 등쪽 응력 섬유(dorsal stress fiber)와 같은 액틴-세포골격 경향을 현저하게 변화시켰다(도 3 하단 좌측). 따라서, 세포 형태의 변화를 유도하는 낮은 수준의 전류인 2 nA와 세포 사멸이 시작되는 1000 nA를 세포사멸을 유도하지 않으면서 세포거동에 유효한 영향을 나타내는 C2C12 세포에 적용 가능한 전류 범위로 결정하였다.
실시예 4: EBFC에 의한 전기장 상에서 시험관 내 세포이동
시험관 내 세포이동 연구를 위하여, 3 내지 7X105/ml농도의 C2C12 세포 부유 용액을 준비하였다. 세포 용액 75 μl를 각 웰에 적용하였다. Well-defined 세포 분주 시스템(cell seeding system), 80206, ibiTreat, ibidi, Germany)인 배양-삽입 기구를 이용하여 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 제조하였다. 각 웰에서 세포를 포함하지 않는 간극의 폭은 500 μm±50 μm로 하였다. 세포 분주 후 배양-삽입을 배양접시로부터 조심스럽게 제거하였다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 수회 세척하였다. 세척 후 EBFC의 효소 반응을 위하여 5 ml의 신선한 배지를 채웠다. EBFC 전류 시스템으로는 직경 60 mm의 배양접시를 사용하였다. 세포-세포 간극의 서로 가장 먼 가장자리(cross edge)에 전극을 부착하였다. 배양-삽입 기구를 제거한 후, 16시간 및 24시간 째에 관찰하고 간극 내로 이동한 세포를 계수하였다. 각각의 EBFC 조건에 대해 세포를 포함하지 않았던 간극에서 세포의 수를 계수하여 비교하였다.
세포-세포 간극에 전기 자극 시스템을 장치하였다: 양극만을 포함하는 배양접시, 음극만을 포함하는 배양접시 및 양극, 음극을 모두 포함하는 배양접시 및 대조군으로서 전극 미포함 배양접시. 500 μm의 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 배양접시에 세포를 분주하고 각각의 전기 자극 하에서 배양하여 상기 간극으로 이동하는 세포의 수를 계산하고 상처 치료율을 측정하였다. 세포-세포 간극으로의 이동을 3개 다른 영역에서 현미경(Nikon Instruments)에 장착된 디지털 카메라를 이용하여 자극을 가하기 전과, 자극을 가하면서 각각 16시간 및 24시간이 지난 후에 사진으로 기록하였다. 세포-세포 간극 폐쇄율을 결정하기 위하여 최상의 현미경 이미지를 이용하여 각각의 이동에 대한 평균 세포 수를 측정하였다. 도 4는 전기 자극을 적용하지 않은 대조군에 비해 전기 자극군에서 세포의 이동률이 현저히 증가함을 나타내었다. EBFC에 의한 모든 형태의 전기 자극에 대해 세포 이동 수는 대조군에 비해 16시간에서 2배 이상인 것을 확인하였다. 특히 음극만을 포함하는 배양접시에서의 전기 자극은 24시간 후 다른 전기 자극군과 비교하여 가장자리로부터 중심으로 이동한 세포의 수가 현저히 증가되었음을 나타내었다(도 4; 좌측으로부터 3번째 컬럼). 시간에 대해 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 본 발명에서는 양극 및 음극만에 의한 C2C12 근모세포에 대한 자극이 대조군에 비해 세포 이동률을 2배 이상 향상시켰음을 최초로 확인하였다.
실시예 5: EBFC 시스템 상에서 C2C12 세포 증식
C2C12 세포를 1X105/ml농도로 전극을 포함하는 배양접시(직경 35 mm) 상에 분주하였다. 본 발명에서는 대조군과 3가지 전극조건을 이용하였다(도 2): 대조군(control, electrodeless; 무전극), 양극단독(anodic only), 음극단독(cathodic only) 및 전체 시스템(full set); 양극/음극. 상기 대조군 및 실험군에 대하여 전기자극에 대한 부착성 세포의 반응을 확인하였다. 따라서, 전극과 배양접시 간에 3mm 간격을 갖는 배양접시를 제작하였다. 초기 배양조건은 2 ml의 배양배지를 이용하여 세포를 덮되 전기적 교점(electrical node)에 닿지 않도록 하였다. 16시간 후, 3 ml의 배양배지를 첨가하여 효소 반응을 위한 전기적 교점을 완전히 덮도록 하였다. 이후 2일, 4일 및 6일에 세포 증식률 분석을 위해 세포를 회수하고 계수하였다.
EBFC의 다른 조건에 대한 세포 증식 분석을 수행하였다. 배양접시 상에 세포를 1X104/ml밀도로 분주하고 각기 다른 세기의 전기장을 가하면서 세포를 배양하고 6일까지 매 2일마다 세포 수를 확인하였다. 효소 기반 생물연료 전지 조건의 전기장은 대조군과 비교하여 현저한 세포증식률의 증가를 나타내었다(도 5).
실시예 6: EBFC 시스템 상에서 다양한 조직세포로의 분화
정상 배양배지를 분화배지로 교환하였다. 배지 중의 글루코스를 이용한 전기화학적 반응을 위하여 분화배지로서 AIM/무혈청 DMEM 2:1 혼합물을 전기적 교점까지 채웠다. 5 내지 6일 후, 배양된 세포를 회수하여 세포 증식 및 분화를 분석하였다. C2C12 세포 분화를 마우스 단클론 항-마이오게닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA) 및 래빗 다클론 항-알파 액티닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA)와 같은 특이적 성숙 근육마커(specific mature muscle marker)로 염색하여 공-형광면역세포화학으로 분석하였다. PCL 나노섬유막 상에 위치한 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.5% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 이후 시료를 일차 항체로 4℃에서 밤새도록 표지한 후 10% 고트 혈청으로 30분간 차단하였다. 시료를 PBS로 3회 세척하고 항-알파 액티닌 항체에 대해 알렉사플루오르 555가 결합된 동키(donkey) 항-래빗 이차 항체(A31572, Alexa Fluor, 1:5000, Invitrogen Biotechnology, USA)와 항-마이오게닌 항체에 대해 FITC가 결합된 고트 항-마우스 이차 항체(SC2012, 1:500, Santa Cruz biotechnology, USA)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 형광 발색하도록 하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 공초점 현미경(M700 ZESS, Germany)을 사용하여 염색된 세포의 세포 형태를 이미징하였다.
마우스 마이오게닌, 마이오D(myoD), sarcomeric actin 및 알파 액틴을 이용한 qRT-PCR를 수행하였다. 하기 유전자 번호에 기초하여 각 프라이머를 고안하였다: 마이오게닌(NM_031189.2), 마이오D(NM_010866.2), 골격근(skeletal muscle; NM_009606.2) 및 알파 액틴(NM_033268.4). 각각의 세포 펠렛으로부터 RNA 분리 키트(RNeasy mini kit 74104, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 토탈 RNA를 분리하였다. Quantitect RT kit(#205311, Qiagen, CA, USA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 40 μl 반응에서 RNA 시료(1 μg)을 cDNA로 역전사하였다. 반응은 95℃에서 5분간 수행하였다. 역전사효소를 포함하지 않는 유사 반응 혼합물을 준비하여 유전체 DNA(genomic DNA) 오염의 부재를 나타내기 위한 주형(template)으로 사용하였다. 선-혼합 PCR 키트(pre-mixed PCR kit, Bioneer, Daejeon, Korea)와 함께각각 특이적 유전자 프라이머를 사용하여 1 μl cDNA로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 이후 75℃에서 60초간 35 사이클 수행하였으며, 각 cDNA에 대해 3회 반복하여 수행하였다. PCR 생산물을 2% 아가로스젤 상에 100V로 25분간 전기영동하였다. 소프트웨어 프로그램 Gene tools를 사용하여 시료의 띠세기(band intensity)를 정량하고 내인성 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(endogenous Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 전사물(transcript, GU214026.1)에 대해 정상화하였다.
항-마이오게닌(5FD; SC52903, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 알파-액티닌 항체(SC-15335, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 성숙 골격근마커로서 마이오게닌 및 액티닌 단백질에 대해 웨스턴블롯을 수행하였다. 각기 다른 조건에서 배양한 세포를 회수하고 상용화되는 용해 완충액(lysis buffer, iNtron Biotechnology)로 용해시켰다. 시료 용액을 20 μl 5X 로딩 완충액과 5분간 비등시켰다. 3개의 5 μl 비등시킨 시료를 8% SDS PAGE 젤의 각 웰에 전개시키고, 350 mA에서 2시간 반 동안 니트로셀룰로스(nitrocellulose; NC) 막에 옮겼다. 옮겨진 막을 5% 탈지유(fat free milk) TBST(tris buffer with 0.5% tween-20)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 일차항체를 2% 탈지유 TBST 용액으로 희석하고 이동막(transfer membrane)과 함께 냉장실에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 블롯된 막은 0.5% TBST로 세척하고 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합 항 마우스 이차 IgG와 함께 인큐베이션하고 면역반응성 띠(immunoreactive band)는 ECL 검출 시약(Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop, CA)을 이용하여 검출하였다. 띠 이미징 및 세기 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare, USA)를 이용하여 수행하였다. 웨스턴블롯 분석은 3회 수행하였으며, 측정된 세기는 평균±표준편차(mean±S.D.)로 표기하였다.
EBFC에 의한 전기장 상에서 성숙 근육 특이적 유전자 및 단백질을 분석하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, EBFC의 전기자극 상에서 C2C12의 근육분화를 확인하기 위하여 5일 배양 후 성숙 근관형성 및 성숙 근육 특이적 단백질 발현을 분석하였다. 세포를 항-마이오게닌과 알파-액티닌 항체로 동시에 면역염색하여 단백질 국부화 및 근관형성을 형광이미징으로 가시화하여 도 6에 나타내었다. 음극만에 의한 전기자극 및 양극/음극 시스템에 의한 전기자극은 근육성숙 마커 단백질로서 마이오게닌 및 알파 액티닌의 강한 발현을 유발하였다. 특히 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극은 PCL-겔 나노섬유막 상에서 완전한 근관형성을 나타내었다. 배양 5일에 성숙 근육분화의 모든 마커(MyoD 및 알파 액티닌)은 전기자극 없이 배양한 경우와 비교하여 전기자극을 적용한 경우 PCL-나노섬유막 상에서 보다 강하게 표지되었다(도 6a). 전기자극 없이 동일한 조건 하에서 배양한 경우 막 상에는 양성 염색 세포가 전혀 존재하지 않았다. 모든 마커에 대한 형광세기 수준을 정량하여 양극 자극만을 가하여 배양한 세포에서 보다 음극 자극만을 가한 막상의 세포에서 현저히 더 강한 형광신호를 나타냄을 확인하였다(도 6a). 나아가 양극 및 음극 자극을 종합적으로 가한 세포는 완전한 근관형성을 나타내었다. 음극만을 가한 그룹은 양극만을 가한 그룹과 대조군에 비해 근관형성이 현저히 증가하였다. 이에 본 발명자들은 EFBC을 이용한 전기자극에 의한 분화를 정량적으로 분석하였다. EBFC를 이용한 전기자극에 의한 마이오게닌, myoD, 골격근육 액티닌 및 알파-액티닌과 같은 성숙 골격근육 특이적 마커의 유전자 발현을 분석하였다. 5일간 스캐폴드 상에서 배양한 C2C12의 mRNA 수준을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. GAPDH 콘트롤에 대해 정규화하여, 음극자극만 및 음극/양극 종합자극에서 모든 유전자 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하였다(도 6b). 특히, 골격 알파 액티닌 유전자 발현은 다른 군에 비해 현저히 더 높았다(약 3배). 음극자극만을 가한 시료에서 골격 근육 액티닌의 강한 발현이 나타났다.
EBFC 전기자극은 PCL-나노검유막 상에서 배양된 C2C12의 유도를 5일간 배양하여 단백질 수준으로 평가하였다. 근육생성 및 알파-액티닌 단백질에 대한 근육세포의 정량을 웨스턴 블롯으로 재확인하였다. 전기자극을 포함하는 PCL 나노섬유막상에서 배양한 세포는 전기자극 없이 배양한 경우에 비해 현저히 더 높은 단백질 발현을 나타내었다. 양극/음극의 종합적인 전기자극을 가한 경우 MyoD 및 알파-액티닌에 대해 통계적으로 현저한 차이가 관찰되었다. 음극만의 자극은 대조군에 비해 약간의 증가된 근육생성단백질 발현수준을 나타내었다. 알파-액티닌 단백질은 양극자극만 및 음극자극만을 가한 그룹과 대조군 간의 차이가 나타나지 않았다.
마지막으로, 실시간 PCR을 이용하여 각 조직세포 특이적 유전자의 발현정도를 상대정량하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 전기자극은 전술한 바와 같이 세포사멸을 유도하지 않는 1000 nA 수준에서 변화(0.01 EF, 0.02 EF 및 0.05 EF)시키면서 가하였다. 0.01 EF의 낮은 전기자극에서는 근육세포 특이적인 마이오게닌 및 마이오 D의 발현이 현저하게 향상되었으며, 0.02 EF의 전기자극에서는 골세포 특이적인 OPN 및 ALP의 발현이 현저하게 향상되었다. 한편, 0.02 내지 0.05 EF의 전기자극에서는 신경세포 특이적인 신경미세섬유의 발현이 현저하게 향상되었다. 이로부터, 전술한 바와 일치하게, 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 중간 내지 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 확인하였다.
본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법등에 관한 것이다. 본 발명은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한, 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (30)

  1. 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 거동은 세포의 이동, 분열 또는 분화인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    효소적 생물연료전지의 양극(anode), 음극(cathode), 또는 양극 및 음극 모두를 포함하는 것인 방법으로서, 상기 양극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화 효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고, 상기 음극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 및 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하여 근육세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    230 nA/cm2이상 300 nA/cm2미만의 전기자극을 가하여 골세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    300 nA/cm2이상 nA/cm2미만의 전기자극을 가하여 신경세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 가하여 심근세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성되는 것인 방법.
  10. 효소적 생물연료전지를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함하는 것인 조성물로서,
    상기 양극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 음극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 조성물.
  12. 효소적 생물연료전지를 포함하는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상처 부위 주변에 적용하여 상처 부위로의 세포 이동 또는 증식을 촉진시키는 것이 특징인 조성물.
  14. 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기.
  15. 제14항에 있어서,
    효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함하는 것인 세포배양용기로서,
    상기 양극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 음극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 세포배양용기.
  16. 제14항에 있어서,
    외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 세포배양용기.
  17. 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함하는 것인 약학 조성물로서,
    상기 양극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 음극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 경피투여형 제제로 제형화되는 것인 약학 조성물.
  21. 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 근육조직 이상으로 인한 질환은 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  23. 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  25. 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 신경질환은 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  27. 제10항에 따른 분화 유도용 조성물 또는 제 14항에 따른 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2이상 230 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포.
  28. 제10항에 따른 분화 유도용 조성물 또는 제 14항에 따른 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2이상 300 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포.
  29. 제10항에 따른 분화 유도용 조성물 또는 제 14항에 따른 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2이상 500 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포.
  30. 제10항에 따른 분화 유도용 조성물 또는 제 14항에 따른 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2이상 1000 nA/cm2미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포.
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