KR20120048726A

KR20120048726A - 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20120048726A
Application number: KR1020100106667A
Authority: KR
Inventors: 임군일
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-05-16
Also published as: KR101284484B1

Abstract

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 골세포는 골 결손부 시술에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법 {Osteogenesis Differentiations of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells}

본 발명은, 지방유래 중간엽 줄기세포에 전기천공법으로 전사인자 유전자를 도입하여 이를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 방법들이 개발되고 있는데, 그 중 제일 각광을 받고 있는 것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 의한 세포치료이다.

줄기세포(Stem cell)는 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기가 성장하는 일종의 모세포로, 간세포라 불리기도 한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 중간엽 줄기세포와 조혈 줄기세포로 존재한다.

성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다.

이미 인간과 동물을 대상으로 한 연구에서 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein A.J. et al., Transplantation., 6:230-247, 1968), 최근 연구에서는 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48:913-927, 1999). 최근에는 중간엽 줄기세포로부터 골세포를 분화시키는 방법이 주도적으로 연구되고 있는 실정이다.

그러나, 자가 골이식은 기본적인 신체의 체력 및 면역력이 저하된 환자로부터 골채취를 하여야 하는바 골채취 부위의 감염, 동통, 혈종과 같은 합병증이 발생할 수 있는 문제점이 있었고, 이를 극복하기 위해 이식거부반응이 없는 공여자로부터 골채취를 하는 것을 고려한다 하더라도 이러한 골수 공여자의 수는 제한적일 수밖에 없는 문제점이 존재한다. 따라서 환자의 다른 신체부위로부터 취한 줄기세포를 골세포로 분화시키기는 방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공하고자 한다.

따라서 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 방법을 통해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하는 인공 뼈의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 뼈를 제공한다.

지방세포는 골수와 달리 환자에게 침습적 요소를 줄이며 줄기세포의 채취가 가능한 부위이고, 환자의 신체 전 범위에 막대한 양이 존재한다. 따라서 지방에서 채취한 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 본 발명은 종래 골수로부터 채취한 줄기세포를 골세포로 분화 시키는 방법에 따른 문제들을 해결할 수 있다. 또한 전기천공법으로 유전자를 도입하는 바, 종래의 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 이식시 면역 거부반응 및 돌연변이 유발을 현저히 감소시킬 수 있다.

도 1은 제조예 2에 따른 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 제조예 3에 따른 실험 결과 사진이다.
도 3은 제조예 3에 따른 실험 결과 그래프이다.
도 4는 시험예 1에 따른 Runx2 의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 1에 따른 Osterix의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 Runx2 및 Osterix에 대한 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 7은 시험예 2에 따른 ALP의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 시험예 2에 따른 OCN의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9은 시험예 2에 따른 COL1A1의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 시험예 2에 따른 BSP의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 시험예 3에 따른 OCN, COL1A1, BSP 단백질 발현량에 대한 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 12는 시험예 3에 따른 ALP 효소 활성을 측정을 위한 알칼리 포스파타아제 염색 결과 사진이다.
도 13은 실험예 4에 따른 알라자린 적색 염색 결과 사진이다.
도 14는 실험예 6에 따른 본 코사 염색 사진이다.
도 15는 실험예 8에 따른 이식 6주 후, 재수거한 이식물에 대한 사진이다.
도 16은 실험예 8에 따른 CT 사진이다.
도 17은 실험예 8에 따른 조직 분석 사진이다.

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 지방흡입술 등을 이용해 얻은 지방조직에서, 지방세포, 적혈구, 세포 파쇄물 등을 세척, 여과 등의 방법을 이용하여 분리한 후, 줄기세포 배양용 배지에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 분리한 후 2 내지 5 회, 2 내지 4회, 또는 2 내지 3회 계대배양한것을 골형성에 사용하는 것이 분화가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 전기천공법으로 유전자를 도입하는 단계에서는, Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자가 도입된 재조합 플라스미드 벡터를 사용하여 이를 마이크로포레이터(Invitrogen)로 1300 내지 1500 볼트, 또는 1350 내지 1430 볼트의 전압을 10 내지 30ms, 또는 15 내지 25ms 로 1 내지 3번, 또는 2번 인가하여 지방유래 중간엽 줄기세포에 원하는 유전자를 도입할 수 있다.

상기 플라스미드 벡터는 형광물질로 표지되어 이후 유전자 도입 여부를 확인할 수 있도록 하는 것이 좋다.

Runx2(Runx Domain transcription factor)는 골분화와 깊은 관련이 있으며, 조골세포 분화의 초기 표현형질인 알칼라인포스파테이즈(ALP)와 후기 표현형질인 오스테오칼신(OC)의 발현을 조절하는 중요한 전사인자이다.

Osterix는 Sp7 유전자에 의해 코딩되는 아연집게(zinc finger)구조를 포함하는 전사인자로 이 또한 조골세포 분화에 있어 필수적인 역할을 수행하며, Runx2의 하부 신호전달계에 존재한다.

이후 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한다. 본 발명에서 상기 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다.

이때 배양 배지로는 FBS, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 글리세로포스페이트 및 항생물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 알파-MEM 용액을 사용할 수 있으며, 각각의 양은 FBS 7 내지 12%, 덱사메타손 50 내지 150 nM, 아스코르베이트-2-포스페이트 10 내지 100 mM, 글리세로포스페이트(glycerophosphate) 5 내지 20 mM, 항생물질 0.5 내지 3%가 적당하다.

이러한 배지는 2~4일 주기로 교체되는 것이 바람직하며, 이때 온도는 36 내지 38℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양하는 것이 좋다. 이러한 조건으로 2주간 배양 후 임의의 형태의 스캐폴드 등에 분주하여 추가 배양을 실시할 수 있다.

본 발명은 또한 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 방법으로 생산되는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 골세포는 골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 생산된 골세포를 이용하여 치료할 수 있는 골손상 질환으로는 골절, 골관절염, 골괴사, 외상으로 인한 골 결손 등이 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 따른 방법으로 생산된 골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 환부 내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 인공 뼈를 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공 뼈를 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인공 뼈 또는 골 손상부위나 결손부의 성형에 사용되는 인공 뼈를 제조할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 제조예 1> 지방기원 중간엽 줄기세포의 분리

지방흡입술을 이용해 32세에서 48세 사이의 환자에게서 지방조직을 얻고, 이를 PBS 완충액으로 세척한 후, 1.5 ㎎/㎖ 콜라게나제로 처리하여 눈금 100㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 적혈구 용혈 완충액을 사용하여 적혈구를 제거하였다.

이를 10% 우태혈청과 1% 항생물질(100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 0.25mg/ml 암포테리신 B; Gibco BRL, Green Island, NY)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F-12 배지(Invitrogen/Gibco, Green Island, NY)에서 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후 비접착물질을 제거하기 위해 세포를 PBS로 세척하였다.

배양기간 동안, 배지는 한주에 두번 교체되었고, 세포들이 바닥의 80%를 덮을 때 (80% confluence), 1mM EDTA를 포함하는 0.25% 트립신을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였고, PBS로 세척 후 다시 배양하였다.

2회 계대배양한 후 세포는 90% FBS와 10% DMSO를 포함하는 냉동 보존 배지에서 보관되었다.

< 제조예 2> 플라스미드 및 분자 클로닝

사람 Runx2 및 Osterix의 코딩 부위는 TrueORF cDNA Clones(Origene, Rockville, MD) PCR로 각각 증폭되었다. 증폭된 절편은 pECFP(enhanced green fluorescent protein, 녹색형광단백질)-C1 백터(Clontech, Palo Alto, CA)로 클로닝되었다.

Runx2 의 구조를 만들기 위해, PCR 산물은 pGEM-T 이지 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클로닝되었고, 그 후 pECFP-C1 벡터의 BglⅡ-Pstl 부위에 클로닝되었다.

증폭된 Osterix 부위 또한 pGEM-T 이지 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클로닝되었고, 그 후 pECFP-C1 벡터의 Xhol-Xbal 위치에 클로닝되었다.

그 후 DNA 서열분석을 통해 제조된 플라스미드를 검증하였다.

제조된 플라스미드의 모식도는 도 1과 같다.

< 제조예 3> 마이크로포레이터 ( Microporator ) 이용 지방기원 중간엽줄기세포에 비 바이러스성 형질 주입

제조된 지방기원 중간엽줄기세포를 회수하고 이를 PBS로 세척하였다. 상기 세포를 3*10⁵ 세포/ml로 재분주 버퍼 R(Invitrogen)에 분주하고 각 유전자 0.5μg와 혼합하였다. 그 후 마이크로포레이터(Invitrogen)를 사용하여 전기천공법을 실시하였다(1400voltage, 20ms, 두번 인가). 전기천공법 실시 후, 상기 세포는 12-웰 플레이트에 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양되었다.

EGFP-C1의 녹색 형광은 leica DMI 6000B 현미경(Leica Microsystem, Wetzlar, Germany)을 사용하여 시각화되었다.

형질주입 효율을 정량화하기 위해, 형질 주입 48시간 후 상기 세포는 0.2% 트립신에 회수되고, PBS로 세번 세척되었다. 세척 후, 세포는 차가운 PBS에 재분주되었고, 형질 주입된 세포의 비율이 유동세포계수법(Cytomics FC 500; Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)으로 측정되었다. 네개의 실험군은 다음과 같다.

실험군 1) 전사인자가 도입되지 않은 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예).

실험군 2) Runx2 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 1).

실험군 3) Osterix 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 2).

실험군 4) Runx2 및 Osterix 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 3).

이의 실험 결과를 아래 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2는 유전자 도입의 표지인 녹색 형광을 나타내는 사진이고 도 3은 유전자 도입 비율을 정량화한 그래프이다.

< 제조예 4> 골세포 분화

골세포로의 분화를 촉진시키기 위해 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포는 특이 유도 배지(10% FBS, 100nM 덱사메타손, 50μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 10mM 글리세로포스페이트 및 1% 항생물질을 포함하는 알파-MEM 용액으로 구성된 골형성 배지, osteogenic medium(OM)) 에서 배양되었다. 상기 세포는 OM에서 최대 2주간 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 12-웰 플레이트에 웰당 3*10⁵ 밀도로 배양되었다. 배지는 3일마다 교체되었고, 7일 및 14일 후에 골분화 분석이 수행되었다.

< 실험예 1> RT - PCR

RNA는 RNeasy 키트(Qiagen, Dusseldorf, Germany)를 사용하여 분리되었고, 분리된 RNA 샘플은 cRNA로 역전사 효소와 올리고(dT)프라이머를 사용하여 전환되었다. 모든 PCR은 LightCycler 480 system®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 및 LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster Mix (Roche Diagnostics)로 수행되었고, 3번씩 반복하였다.

사용된 프라이머 세트는 다음과 같다.

RUNX2 forward, 5'-TTA CTT ACA CCC CGC CAGTC-3'; reverse, 5'-TAT GGA GTG CTG CTG GTC TG-3'; Osterix forward, 5'-CCC ACC TCA GGC TAT GCT AA-3'; reverse, 5'-CAC TGG GCA GAC AGT CAG AA-3'; BSP forward, 5'-AGA ACC ACT TCC CCA CCT TT-3'; reverse, 5'-AGG TTC CCC GTT CTC ACT TT-3'; ALP forward, 5'-GAC AAG AAG CCC TTC ACT GC-3'; reverse, 5'-AGA CTG CGC CTG GTA GTT GT-3'; OCN forward, 5'-GGC GCT ACC TGT ATC AAT GG-3'; reverse, 5'-TCA GCC AAC TCG TCA CAG TC-3'; COL1A1 forward, 5'-CCC CTG GAA AGA ATG GAG ATG-3'; reverse, 5'-TCC AAA CCA CTG AAA CCT CTG-3'; GAPDH forward, 5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT G-3'; reverse, 5'-TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG G-3'.

< 실험예 2> 웨스턴 블랏

총 단백질을 추출하기 위해서, 세포를 차가운 인산염 완충용액으로 세 번 세척하고, 단백질 분해효소 억제제(Pierce, Rockford, IL)를 포함하는 RIPA(radioimmuno precipitation assay) 완충용액에 용해시켰다.

용해물은 15,000g로 10분간 4℃에서 원심분리되고, 그 후 상등액을 0.5M 베타-머캅토에탄올을 포함하는 소듐 도데실 설페이트(SDS) 샘플 완충용액에서 끓였다. 상기 샘플은 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동로 분리되고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨졌으며, 이는 상온에서 5% 무지방 가루우유(BioRad, Hercules, CA)를 함유하고 있는 TBS-T로 처리되었다.

상기 막은 Runx2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Osterix(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), BSP(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), OCN(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 1형 콜라겐(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 항체와 함께 0.05% TBS-T(tween-20)를 함유하고 있는 트리스 완충 용액(TBS)에서 하룻밤 동안 배양되었다. GAPDH가 검출 마커로 사용되었다.

2차 항체로, 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)결합된 쥐 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 토끼 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 염소 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)가 사용되었다. 막을 TBST로 두번 씻고 2시간동안 적합한 HRP-결합된 이차 항체와 함께 배양하였다. 마지막으로 씻은 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블롯 분석 검출시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 시각화하였다.

단백질 띠는 LAS-3000 (version2.1; Fujifilm, Tokyo)을 사용하여 분석하였다.

결과를 도 6 및 11에 나타내었고, 시험예 1 및 3에서 분석하였다.

< 실험예 3> 알칼리 포스파타아제 염색

ALP 효소 활성을 정량화하기 위해, 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포는 12-웰 조직배양 플레이트에 분주되고 7일동안 배양된 후, PBS로 두 번 세척되고 10% 포르말린 용액에 10분동안 고정되었다. PBS로 세 번 세척한 후 분화된 세포는 30분 동안 0.1% TritonX-100를 포함하는 PBS에서 투과율이 조절되었다. 그 후 세포는 니트로 블루 테트라졸리움(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트(Sigma Aldrich)로 염색되었다. 결과를 도 12에 나타내었고, 이를 시험예 3에서 분석하였다.

< 실험예 4> 알리자린 적색 염색

세포외부 기질의 칼슘 적층량을 조사하기 위해, 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포가 12-웰 세포 배양 플레이트에 분주되고 14일 동안 OM에서 배양되었다. 분화된 세포는 PBS로 두번 세척한 후 10% 포르말린 용액에 10분동안 고정되었다. PBS로 세 번 세척한 후 세포는 2% 알리자린 레드 용액 (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)으로 10분간 염색되었다. 결과를 도 13에 나타내었다. 이를 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3 모두 비교예보다 칼슘 적층량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5> PLGA 스캐폴드 제조 및 인 비트로 배양

다공성의 폴리-락틱-코-글리콜릭산(PLGA) 스캐폴드를 제조하기 위해, PLGA(1g)을 메틸렌 클로라이드에 10%(w/v) 농도로 용해시킨 후, 염화나트륨 입자 (19g, 직경= 150 내지 300 μm; Sigma Aldrich)를 폴리머 용액에 가하였다. 상기 혼합액을 테플론 몰드에 가하여 스캐폴드를 제조하였다.

형질 도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포는 알파-MEM에 1*10⁶ 세포의 농도로 분주되고 1ml 시린지를 사용하여 상기 PLGA 스캐폴드(5mm 내부 직경, 2mm 높이)에 도입되었다. 상기 세포는 4시간 동안 37℃에서 배양되어 스캐폴드에의 접착이 유도되었고, 스캐폴드에 접착된 세포는 14일동안 OM에서 배양되었다.

14일 후, 샘플은 4% 파라포름알데하이드로 고정되었고, 칼슘 손실 없이 4μm 두께로 가로 분획된 파라핀에 끼워 본 코사(von Kossa) 염색으로 분석하였다.

< 실험예 6> 본 코사 ( von Kossa ) 염색

상기 분획은 증류수로 파라핀이 제거되고, 수화되고, 헹궈졌다. 그 후 분획은 1% 은 니트레이트 용액(SigmaeAldrich)에 배양되었고, 이에 20분간 자외선을 조사하였다.

증류수로 수 회 씻은 후, 고정화되지 않은 은은 5% 소듐 티오설페이트(SigmaeAldrich)로 5분간 제거되었다. 헹군 후, 상기 분획은 5분간 nuclear fast red로 대조염색되었다.

결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3 모두 비교예보다 무기물화(mineralization)가 증가된 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 7> ASC - PLGA 스캐폴드 접합 In vivo 이식

Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix로 형질도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포는 1*10-⁶밀도로 PLGA 스캐폴드에 분주되었다. 세가지 대조군이 사용되었는데, 이는 다음과 같다.

1) 분주된 세포 없는 PLGA 스캐폴드

2) 지방세포 유래 중간엽줄기세포 분주된 PLGA

3) EGFP-C1 형질도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포 분주된 PLGA

따라서 총 3개의 실시예[Runx2(실시예 1), Osterix(실시예 2), 또는 Runx2 및 Osterix(실시예 3)]과 상기 3개의 대조군을 대상으로 실험이 수행되었다.

30마리의 누드 마우스(7주령, 암컷, 오리엔트바이오, 한국), 120-150g가 zoletile(50 mg/kg)과 xylazine (4.5 mg/kg)로 마취되었고 상기 지방세포 유래 간엽줄기세포가 분주된 스캐폴드가 등 피하조직에 이식되었다.

< 실험예 8> 뼈 형성 분석

이식 6주 후, 이식물이 재수거되었고, 이를 10% 포스페이트-완충용액- 포름알데하이드 용액에 고정하였다. 뼈 형성은 CT(computed tomography) 및 조직 분석법으로 분석되었다.

CT 영상은 마이크로 CT시스템(SkyScan-1172; Skyscan, Kontich, Belgium)으로 획득되었고, 뼈 형성 면적은 광학 현미경과 이미지 분석 시스템(KS400; Zeiss, Munich, Germany) 을 사용하여 측정하였다.

상기 영상 획득 후, 샘플은 포르말린에 고정되었고, 4μm 두께로 가로 분획된 파라핀에 끼워 헤마토자일린 및 에오신(HE) 및 Masson's trichrome 염색으로 조직 분석을 수행하였다.

결과를 도 15 내지 17에 나타내었다.

도 15는 이식 6주 후, 재수거한 이식물에 대한 사진이며, 도 16은 이의 CT 사진, 도 17은 조직 분석 사진이다.

도 16을 참조하면, 대조군 1은 무기물 침적을 거의 관측할 수 없었으며, 대조군 2 및 대조군 3도 단지 산발적인 무기물 침적을 보였다. 그러나 실시예 1 내지 실시예 3에서는 다량의 무기물 침적을 관측할 수 있었다.

도 17을 참조하면, 대조군 1에서는 염증 세포와 혈관의 침입을 관측할 수 있었고, 대조군 2 및 대조군 3에서는 부분적인 뼈 형성을 관측할 수 있었다. 그러나 실시예 1 내지 3에서는 뼈 기질이 형성된 것을 뚜렷하게 관측할 수 있었다.

< 시험예 1> Runx2 및 Osterix 유전자 발현량 및 단백질 발현량 조사

RT-PCR을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포(비교예, 실시예 1 내지 실시예 3)의 배양시작 7일 14일 후 Runx2 및 Osterix 유전자 발현량을 조사한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4를 참조하면, Runx2의 mRNA는 배양 7일 후에 Runx2 유전자 도입에 의해 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 Runx2 유전자만을 도입한 실시예 1에서 대조군의 660 배 이상으로 현저한 효과가 나타났다. 이러한 효과는 배양 14일 후까지 지속되었으며, Osterix 만을 도입한 군에서도 Runx2 의 유전자 발현 증가가 관찰되었다.

도 5를 참조하면, Osterix의 mRNA는 배양 7일 후에 Osterix 유전자 도입에 의해 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 Osterix 유전자만을 도입한 실시예 2에서 대조군의 7500 배 이상으로 현저한 효과가 나타났다.

웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현량을 조사한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6을 참조하면, 배양 후 7일째에 Runx2 와 Osterix 단백질 발현은 Runx2, Osterix 유전자 도입에 의해 현저하게 증가한 것을 알 수 있었다. 특히, Osterix 단백질은 Runx2 유전자만을 도입한 경우에도 현저히 발현이 증가하는 것을 볼 수 있었다.

< 시험예 2> 골형성 표지자인 ALP , OCN , COL1A1 , BSP 유전자 발현량 조사

RT-PCR을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포(비교예, 실시예 1 내지 실시예 3)의 배양시작 7일 14일 후 골형성 표지자인 ALP, OCN, COL1A1 및 BSP 유전자 발현량을 조사한 결과를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.

도 7은 ALP에 대한 배양 7일, 배양 14일 후의 mRNA 발현량 조사 결과이다. 배양 7일에는 유전자 도입에 따라 ALP유전자 발현이 증가되는 것으로 나타났으나, 이러한 효과는 배양 14일 후까지 유지되지 않았다.

도 8은 OCN, 도 9는 COL1A1, 도 10은 BSP에 대한 배양 7일, 배양 14일 후의 mRNA 발현량 조사 결과이다. 각각 배양 7일에는 유전자 도입에 따라 유전자 발현이 증가되었고, 이러한 효과는 배양 14일 후까지 유지되는 것으로 나타났다.

< 시험예 3> ALP , OCN , COL1A1 , BSP 의 단백질 발현량 조사

OCN, COL1A1, BSP의 단백질 발현량 조사를 위해 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11을 참조하면, 배양 7일 후 실시예 1 내지 실시예 3의 지방유래 중간엽 줄기세포의 OCN, COL1A1, BSP 단백질 발현량은 대조군에 비해 증가되었고, 이러한 현상이 배양 14일 후까지 유지됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 3의 경우 OCN 단백질 발현량이 배양 14일 후 현저히 증가됨을 알 수 있었다.

ALP 효소 활성을 측정을 위해 배양후 7일 경과한 세포에 대해 알칼리 포스파타아제 염색을 수행하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12를 참조하면, 실시예 1 내지 3 모두 비교예보다 ALP활성이 증가되었고, 특히 실시예 1 및 실시예 3의 경우 더 우수하게 나타남을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전기천공법으로 도입하는 단계는,
1300 내지 1500 볼트의 전압을 10 내지 30ms 로 1 내지 3번 인가하는 단계를 포함하는 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 배양 배지는 FBS, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 글리세로포스페이트 및 항생물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 알파-MEM 용액인 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
제1항 내지 제3항의 방법 중 어느 하나의 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 골손상 질환 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항의 방법 중 어느 하나의 방법을 통해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하는 인공 뼈의 제조방법.
제5항의 방법으로 제조된 인공 뼈.