KR101772727B1 - 효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 - Google Patents

효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물; 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기; 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용, 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 및 신경질환의 예방 및 치료용 약학 조성물; 및 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지를 이용하여 전기자극을 가함으로써 세포거동을 조절하는 방법은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때, 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법{A method for regulation of cellular behaviors by applying electric stimulus based on enzymatic biofuel cell}
본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물; 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기; 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용, 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 및 신경질환의 예방 및 치료용 약학 조성물; 및 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.
한편 상처와 같은 외상의 치유는 세포가 상처 부위로 이동하고 증식함으로써 달성된다. 따라서, 세포의 이동 및 증식을 촉진시킴으로써 상처치유를 촉진할 수 있다.
이와 같이 상처치유를 위한 세포의 이동 및 증식, 원하는 조직으로의 줄기세포의 분화를 통틀어 세포 거동이라 하며, 이러한 세포의 거동은 물리적 및/또는 화학적 환경에 의해 영향을 받는다. 이는 세포의 거동이 신호전달 체계에 의해 조절되며, 이러한 신호전달 체계는 다양한 물리 화학적 인자에 의해 조절될 수 있기 때문이다.
상기 물리적 인자 중의 하나는 전기자극으로 이는 골격근의 유지 및 근과형성에 매우 중요한 요소이며, 운동뉴런으로부터의 전기자극의 부재가 탈신경근위축(denervated muscle atrophy) 등을 유발함이 보고되었다.
관절질환에 저주파를 적용한다던지 간질환자의 뇌에 직접 전기자극을 가한다던지 하는 것은 물리적 자극을 이용한 치료방법의 대표적인 예이다.
이에 본 발명자들은 생체적합성이 높고 신체 여러 부위에 적용가능한 형태로 제형화될 수 있는 전기자극원을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 효소의 산화환원 반응에 의해 작동하는 효소적 생물연료전지를 이용하는 경우 효소의 농도를 조절하는 방법으로 세포의 사멸을 유도하지 않는 세기 범위 내에서 전류를 다양하게 변화시킬 수 있어 세포 독성에 대한 우려가 없으며, 다양한 제형으로 자유롭게 성형될 수 있어 신체 각 부위에 적절하게 제형화하여 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 “효소적 생물연료전지(enzymatic fuel cell)"는 생물연료의 화학적 에너지를 전기적 에너지로 전환시키는 장치로서, 연료를 산화시키기 위한 촉매로서 효소를 이용하는 특별한 형태의 연료전지이다. 따라서, 종래의 연료전지와는 달리 값비싼 금속촉매를 필요로 하지 않는다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 세포의 이동, 분열 또는 분화와 같은 세포 거동을 조절할 수 있다. 이때, 조절 가능한 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 세포의 종류에 구애되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 양극(anode)이나 음극(cathode) 중 하나의 전극만을 포함하더라도 전기자극을 발생시킬 수 있으므로, 효소적 생물연료전지의 양극, 음극 또는 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극에 의해 세포 거동을 조절할 수 있다. 바람직하게 상기 효소적 생물연료전지의 양극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 또는 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)일 수 있으며, 음극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 또는 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 양극은 FAD(flavin adenine dinucleotide), PQQ(Pyrrolo quinoline quinone), 헴(heme), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 또는 Mn 등의 보조인자(co-factor)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 효소적 생물연료전지의 양극은 산화전극으로 연료를 산화시켜 전자를 방출하며, 음극은 환원전극으로 전자를 소모하여 산화제(oxidant)를 환원시킨다. 상기 효소적 생물연료전지의 연료로는 다양한 당류(sugars) 및 저분자량의 지방족 알콜(low aliphatic alcohols)를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 글루코스, 프락토스, 셀로비오스, 락토즈, 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 파이루베이트, 수소 등을 포함한다. 상기 산화제로는 산소분자 이외에도 과산화수소 또는 큐멘 과산화물(cumene peroxide)을 포함할 수 있다.
일반적인 연료전지와 마찬가지로, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다. 단, 상기 격리는 단순히 물리적인 거리를 의미하는 것으로 일정 간격 이격되도록 위치시키기만 하면 된다. 따라서, 일반적인 연료전지의 필수적인 구성요소인 분리막을 필요로 하지 않는다. 이에 따라 효소적 생물연료전지는 소형화가 용이하며 고분자막과 같은 이물질을 포함하지 않으므로 체내에 이식하기에 적합하다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에서는 양극은 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키고, 음극은 빌리루빈 산화효소를 포함하여 산소분자를 물로 환원시키면서 전기자극을 발생시킨다(도 1).
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소의 농도를 조절함으로써 발생하는 전류의 세기를 조절할 수 있다.
본 발명자들은 효소 농도를 조절하면서 다양한 세기의 전기자극을 세포에 가함으로써 세포 거동에 유효한 효과를 나타내는 최소의 전류세기 및 세포사멸을 유도하는 전류세기를 동정하였으며, 상기 범위 이내에서 전류를 변화시키면서 줄기세포의 분화를 관찰하여, 특정 조직으로의 분화를 유도하기에 적합한 전류 범위를 최초로 동정하였다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 근육세포로의 분화를 유도할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 골세포로의 분화를 유도할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 신경세포로의 분화를 유도할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 심근세포로의 분화를 유도할 수 있다.
상기 다양한 조직세포로의 줄기세포의 분화 유도는 각 조직세포에 대해 특이적인 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 포함하는 분화배지를 필요로 하지 않는다. 일반적인 배양배지를 이용하되 상기 범위의 전기자극을 가함으로써 해당 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 이때, 상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 효소의 양을 조절하면서 발생하는 전류세기를 측정하였으며(표 1), 이를 이용하여 다양한 세기의 전기자극을 줄기세포에 가하여 각기 다른 범위의 전기자극에 의해 각기 다른 조직세포로의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 7).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 전기자극의 세기를 조절하여 특정 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 각 조직세포로의 분화에 적절한 자극의 범위는 전술한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상처 부위 주변에 상기 효소적 생물연료전지를 포함하는 조성물을 적용함으로써 상기 전기자극을 가하여 상처 부위로의 줄기세포 이동 또는 증식을 촉진시켜 상처치유의 효과를 유도할 수 있다. 바람직하게 상기 세포는 줄기세포 또는 체세포일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 상처치유 및 손상된 조직의 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 보다 구체적인 사항은 후술할 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공한다.
상기 세포배양용기는 효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한없이 이용할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소작용에 의해 기질을 산화 또는 환원시키면서 전자를 발생하거나 소모하는 시스템이므로 효소작용을 위한 기질이 공급되는 한 외부로부터의 전력공급이 없이도 지속적으로 전기자극을 생성할 수 있다. 상기 기질은 연료물질 또는 산화제를 세포배양액에 첨가하는 등의 형식으로 공급될 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 예컨대, 일반적인 세포배양용기 내에 양쪽 전극 모두를 포함하는 효소적 생물연료전지를 설치하여 액체 배지를 이용하여 배양하는 세포에 전기자극을 가하고자 하는 경우, 배양용기의 가장자리에 음극과 양극을 각각 가장 멀리 이격되도록 배치할 수 있다. 이때, 전극으로부터 효소가 배지로 확산되어 혼입되는 것을 방지하기 위하여, 각 전극은 OHP 필름과 같은 고체 기재 상에 스크린-프린트된 탄소전극에 양극 및 음극 효소를 각각 함침시켰다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 상처 치료용 약학 조성물은 효소적 생물연료전지로서 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한없이 이용할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 약학 조성물은 경피투여형 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 “경피투여형 제제”는 피부를 통해 약물을 투여하여 효과를 나타내는 제형으로 피부에 바르는 약, 피부에 붙이는 약 등의 형태로 제형화된다. 경피투여시 활성성분의 피부 투과는 화학포텐셜 즉, 농도기울기에 따른 단순확산에 의해 세포 내, 세포간 또는 땀구멍, 털구멍 등의 부속기관을 통과하여 이루어진다. 손상되지 않은 피부를 통과하는 것이 용이하지는 않다는 단점이 있으나, 약물의 효율, 투여속도의 제어, 환부에 직접 적용 가능성 등의 사용상 용이점이 있으며 비교적 일정한 혈중농도 유지, 위장관 독성을 나타내는 물질의 부작용 최소화, 간의 부담 감소 등의 장점이 있다. 활성성분의 피부 투과를 용이하게 하기 위해서는 피부 투여 촉진제를 추가적으로 포함하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 경피투여형 제제는 피부의 질환부 표면에 유효 성분을 직접 투여할 수 있는 제형이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 연고제, 크림제, 겔제, 로션제, 액제, 유제, 현탁제, 경고제(스틱제), 파스타제, 리니멘트제, 파프제, 테이프제, 에어로졸제 또는 외용산제 등의 제제로 조제하여 사용할 수 있다. 이를 위해 통상의 경피투여형 제제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또는 멸균된 거즈 등에 본 발명의 약학 조성물을 흡수시키고 이를 접착성 밴드에 고정시켜 상처부위에 직접 부착하는 밴드와 같은 방식으로 환부에 직접 적용할 수 있다.
그러한 성분으로는 연고제, 크림제, 겔제, 로션제의 경우에 있어서는, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 아디프산디이소프로필, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제 등을 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
액제 또는 유제인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등의 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다.
현탁제인 경우에는 담체 성분으로서 물 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제; 에톡실화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
경고제인 경우에는 일산화납, 올리브유 및 돈지(lard)를 이용하여, 파스타제인 경우에는 아연화 세말, 살리실산 세말, 전분 및 바셀린을 이용하여, 리니멘트제인 경우에는 장뇌유, 올리브유, 메틸 살리실리레이트, 트라가칸타, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 글리세린 및 산화아연을 이용하여 제제화할 수 있다.
파프제의 경우에 있어서는, 폴리아크릴산, 폴리아크릴산 공중합체 등의 점착부여제; 황산알루미늄, 황산칼륨알루미늄, 염화알루미늄, 메타규산알루민산마그네슘, 디하이드록시알루미늄아세테이트 등의 가교제; 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 (마크로골), 프로필렌글리콜, 1,3-부탄디올 등의 다가 알코올류; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제; 1-멘톨 등의 향료; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 정제수 등을 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
테이프제의 경우에 있어서는, 스티렌, 이소프렌, 스티렌 블록 공중합체 (SIS 블록 공중합체)나 아크릴 수지 등의 점착제; 지환족 포화 탄화수소계 수지, 로진계 수지, 테르펜계 수지 등의 점착 부여 수지; 액상 고무, 유동 파라핀 등의 연화제; 디부틸하이드록시톨루엔 등의 산화 방지제; 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 올레산 등의 흡수 촉진제; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 또, 폴리아크릴산나트륨이나 폴리비닐알코올과 같은 함수 가능한 고분자와 소량의 정제수를 첨가하여 함수 테이프제로 할 수도 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
에어로졸제의 경우에 있어서는, 연고제, 크림제, 겔제, 현탁제, 유제, 액제 및 로션제 등의 조제에 사용되는 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 아디프산디이소프로필, 세바크산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 추가로 각종 안정제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 보존제, 용해 보조제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 특히, 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 추가적으로 포함할 수 있다.
외용산제의 경우에 있어서는, 감자 전분, 쌀 전분, 옥수수 전분, 탤크, 산화아연 등의 부형제 또는 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 각종 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.
본 발명이 제공하는 경피투여형 제제를 조제하는 수단은 특별히 한정되지 않고, 원하는 제형에 따라 각 성분 및 필요에 따라 기제 성분을 충분히 혼련하는 등의 통상의 경피투여형 제제를 제조하는 방법을 사용하여 제조된다. 또, 파프제 및 테이프제의 조제에 있어서는, 혼련한 혼합물을 이형지 상에 전연(展延), 건조시키고, 추가로 유연한 지지체와 첩합(貼合)시키고, 원하는 크기로 재단함으로써 조제할 수 있다.
본 발명이 제공하는 경피투여형 제제는, 예를 들어 연고제, 액제 (현탁제, 유제, 로션제 등), 에어로졸제 및 외용산제의 경우에는, 피부 환부에 도포 등에 의해 직접 적용하거나, 혹은 천 등의 지지체에 도포 또는 함침시켜 적용하거나 하는 등의 통상의 사용 방법에 의해 사용된다. 또, 파프제 혹은 테이프제의 경우에는, 이들 제제를 피부 환부에 직접 첩부하는 방법에 의해 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 반응 감응성 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 경피투여형 제제로 사용되는 경우 경피투과속도, 세포 흡수력 등을 고려하여 적용량을 설정할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법을 제공한다.
상기 근육조직 이상으로 인한 질환의 비제한적인 예는 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)이다.
상기 골질환의 비제한적인 예는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)이다.
상기 신경질환의 비제한적인 예는 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)이다.
본 발명에서, 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “개체”란 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 공지의 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 “약학적으로 유효한 양”이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 전극 구성의 형태(예컨대, 양극효소만을 포함, 음극효소만을 포함 또는 양극 및 음극 효소를 모두 포함) 및 전극 효소의 함유량에 따라 발생하는 전기자극의 수준이 조절되고 각기 다른 전류 범위의 자극에 대해서 각기 다른 조직으로의 분화가 유도되므로, 질환이 발생한 조직의 형태를 고려하여 유효량을 결정할 수 있다. 또한 이외에도 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소를 고려하여 유효 용량 수준을 결정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “투여”란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하며, 보다 바람직하게는 병변에 국소 투여할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 성형이 자유롭고 상기한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 다양한 제형으로 제제화될 수 있으므로, 적용하고자 하는 조직의 위치 및 형태를 고려하여 적절한 제형으로 투여할 수 있다. 예컨대, 근육에 투여하고자 하는 경우 환부에 따라 상기한 바와 같이 경피투여하거나 주사제의 형태로 환부에 직접 투여할 수 있다. 골조직에 투여하고자 하는 경우 주사제의 형태로 환부에 직접 투여하거나, 당업계에 알려진 조직 재생에 사용되는 공지의 생분해성 물질에 로딩하여 환부에 이식할 수 있다. 또한 신경질환의 경우 주사제로 환부에 직접 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공한다.
전술한 바와 같이 본 발명의 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 줄기세포를 분화시키는 방법은 각 조직 분화에 특이적으로 요구되는 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 필요로 하지 않고 일반 배양배지에 배양하되 효소의 농도를 조절하여 적절한 범위의 전기자극을 가하면서 배양하는 방법으로 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 외부물질 또는 혈청 사용에 의한 오염가능성이 현저히 낮으므로, 이렇게 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포는 세포치료제로 사용되기에 적합하다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지를 이용하여 전기자극을 가함으로써 세포거동을 조절하는 방법은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때, 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 전극에서의 효소의 산화환원 반응에 기반한 효소적 생물연료전지의 대표적인 예를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지의 전극 구성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 세기에 따른 세포의 반응을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 세포 이동 촉진효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 줄기세포 분열촉진효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 심근 및 근육세포 분화 유도효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 정도에 따른 분화방향을 나타낸 도이다. 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포주의 준비
마우스 근모세포 세포주(mouse myoblast cell line) C2C12를 준비하여 각 배양접시에 2×103 세포/cm2 농도로 분주하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone, Thermo), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Gibco)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium, LM 001-05, WelGENE, Daegu, Korea) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃의 습식배양기에서 배양하면서 세포를 유지하였다.
실시예 2: 효소적 생물연료전지( enzymatic biofuel cell ; EBFC )의 제조, 상기 전지의 전기화학적 특성 및 성능
반자동식의 스크린 프린팅 기기(semi-automatic screen printing machine)를 사용하여 OHP 필름 상에 Electrodag® 423SS(Acheson, Port Hurton, USA)로 스크린-프린트된 탄소전극(screen-printed carbon electrodes; SPCEs)을 준비하였다. 양극효소(anodic enzyme)로는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOx, 219 U/mg, Amano Enzyme Inc., Japan)를 사용하였다. 음극효소(cathodic enzyme)로는 마이로테시움 베루카리아(Myrothecium verrucaria) 유래의 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD, 10.5 U/mg, Sigma enzyme)을 사용하였다. 상기 양극 및 음극에서의 산화환원 반응을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 폴리에틸렌글리콜 (400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) (400) diglycidyl ether; PEGDGE, Polysciences Inc.)를 가교제(cross-linker)로 사용하였다. 양극 및 음극 전극을 위한 로딩 용액은 효소, 산화환원 매개체(redox mediator) 및 가교제를 포함하도록 구성하였다. 양극 촉매는 0.04 mg/ml의 GOx, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+(PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+; PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+) 및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물(cross-linked adduct)로 구성하였다. 음극 촉매는 0.04 mg/ml의 BOD, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+ 및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물로 구성하였다. 혼합물 10 μl를 SPCE 상에 도포하고 데시케이터 내에서 24시간 동안 실온(25℃±1)에서 건조하였다.
상기 제조한 효소적 생물연료전지의 전기화학적 특성을 확인하기 위하여, 두 개의 SPCE를 배양접시(직경 35 mm)의 가장자리에 부착하였다(도 2). 본 발명에서는 양극 또는 음극 전극으로서 길이 15 mm, 너비 2 mm의 총 30 mm2 활성면적을 갖는 전극을 사용하였다. 개방회로전위(open circuit potential; OCP) 및 i-t 기법(technique)을 위하여 CHI 600B potentiostat(Austin, TX, USA)과 결합된 이중전극 전기화학 전지를 사용하였다. 유연한 폴리에스테르 필름 상의 3.5 mm 직경의 작업전극을 이용하여 개질된 PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+의 전기화학적 특성을 연구하였다. 0.5 mm 직경의 백금선 상대전극 및 Ag/AgCl 마이크로-기준전극(AgCl로 포화된 3.0 M KCl, Cypress, Lawrence, KS, USA)을 이용하였다. 각 배양접시에 전기적 흐름을 위한 전도체로서 배양배지를 채웠다. 실험 하루 전에 동일한 수의 세포를 배양접시에 분주하였다.
EBFC로부터 전기적 신호를 생성하기 위하여 전술한 방법으로 단순한 EBFC를 제조하였다. 전류 흐름 방향에 따라, EBFC를 양극단독, 음극단독 및 양극/음극 조건으로 분류하였으며, 각 전극 조건에서 세포에 대한 전자의 흐름을 개략적으로 나타내었다(도 2). 대조군으로는 전극을 포함하지 않는 용기를 사용하였다. GOX는 글루코스를 글루코노락토(gluconolactone)으로 산화시켜 전자를 방출하며, 따라서 양극 부근은 살아있는 세포에 영향을 주는 전자가 풍부한 조건이 된다. BOD는 산소분자를 물로 환원시키면서 전자를 소모하여 음극 부근은 주변 세포에 영향을 주는 전자-부족 상태로 변한다. 양극 및 음극을 모두 포함하는 전극 시스템(양극/음극 시스템)에서는 각 전극에서의 반응으로 인해 전자의 흐름이 발생하며 이에 따른 구배가 형성되었다. 본 발명자들은 배양접시에 각각 전자가 풍부한 조건과 전자가 부족한 조건을 확립하였다. 각 전극은 40 μl GOX 또는 BOD 및 40 μl 폴리(N-비닐이미다졸)-[Os(4,4-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl])+/2+(poly(N-vinylimidazole)-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl])+/2+; PVI-dmo-Os, E0'=-38.5 mV vs. Ag/AgCl), 10 μl 폴리에틸렌글리콜 (400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) (400) diglycidyl ether; PEGDGE)의 가교결합 부산물(cross-linked adduct)로 구성되었다. 배양접시 내부에 전극을 위치시킨 후, Ag/AgCl에 대해 -38.5 mV의 전압을 가하여 EBFC 실험을 수행하고 전기 전류 출력을 얻었다. 본 발명자들은 효소 및 산화환원 매개체의 농도를 조절함으로써 EBFC의 최상의 전기 자극을 성취하였다. 양극/음극 시스템 생물연료전지에 고농도로 효소를 로딩한 산화환원 매개체에서 한계 전류 밀도는 10867±549 nA/cm2(N=3)이었다. 양극단독, 음극단독 및 낮은 농도로 효소를 로딩한 양극/음극 시스템 EBFC의 산화환원 매개체에서 한계 전류는 각각 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3), 8.676±1.17 nA/cm2(N=3) 및 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)이었다. 양극/음극 시스템에서 효소농도에 대한 전류 밀도를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112013051404934-pat00001
실시예 3: 세포거동연구를 위한 EBFC 의 최적조건 탐색
본 발명자들은 C2C12 세포거동연구를 위한 최적의 EBFC 조건을 먼저 탐색하였다. 효소농도를 조절함으로써 EBFC의 전류와 전압을 조절하였다. 세포배양배지에서 각 효소농도에 대한 전력용량(electric power capacity)을 계산하였다. 구체적으로 효소농도를 조절하여 C2C12 세포에 2 nA, 40 nA 및 120 nA의 3가지 EBFC 조건을 적용하여 배양하였다. 이후, 항-병소부착단백질 항체(anti-focal adhesion protein antibody) 및 세포골격 염색 염료를 포함하는 면역세포화학 및 팍실린-RFP 및 그린-액틴(paxillin-RFP Green-actin)을 함께 전달감염(co-transfection)하여 공초점 라이브 이미지로 세포거동을 관찰하였다.
C2C12에 팍실린-RFP 및 그린-액틴을 동시에 일시 전달감염(co-transient transfection)시켜 라이브 이미징하였다. 팍실린-RFP 플라스미드는 Xiong 박사(Georgia Health Science University)로부터 제공되었다. 그린-액틴 플라스미드(Green FP vector-actin: 558721, BD Pharmingen™, USA)는 상용화된 것을 구입하여 사용하였다. 네온 전달감염 시스템(Neon transfection system, Invitrogen life science, USA)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 부유시킨 C2C12 세포에 대한 전기천공조건(electroporation condition)을 최적화(1100 V, 30 ms 1 펄스)하였다. 배양 3일 후, 팍실린-RFP/GFP-액틴을 동시에 전달감염시킨 세포를 트립신으로 처리하여 단일 부유 세포 용액(single suspended cell solution, 1×104 세포/ml)을 준비하였다. 라이브 이미징을 위하여 부유 C2C12를 공초점 배양접시(SPL Korea)에 분주하여 배양하였다. 적색 및 녹색 양성 세포를 선택하여 매 2.5분 마다 20사이클 반복하여 총 50분간 라이브 이미지를 기록하였다.
C2C12 세포의 생존을 위한 최적의 전하 및 전기 전류 조건을 연구하였다. 낮은 농도의 GOX를 로딩한 경우 한계 양극 전류 밀도는 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 BOD 로딩의 경우 한계 음극 전류 밀도는 8.676±1.17 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 효소를 로딩한 경우 양극/음극 시스템 EBFC 조건의 한계 음극 전류 밀도는 배양접시 상에서 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 높은 농도의 효소 로딩의 경우 음극 전류 밀도는 최대 10867±549 nA/cm2(N=3) 을 나타내었다. 각각 14 nA/cm2 및 10867 nA/cm2의 전류밀도로 세포를 자극하고 그 결과를 비교하여 도 3에 나타내었다. 그 결과 1000 nA를 초과하는 전류를 적용한 경우 대조군 및 낮은 전류를 적용한 세포와 비교하여 눈에 띠는 세포 형태 변화를 나타내었으며, 이는 과도한 전기자극으로 인해 세포사멸에 이르렀음을 나타내었다(도 3). 즉, 1000 nA의 강한 전기 자극에 의해 세포골격 네트워크가 완전히 파괴되었다(도 3 하단 우측). 그러나, 2 nA 수준의 낮은 전류는 세포에서 강한 횡단 호(transverse arc) 및 등쪽 응력 섬유(dorsal stress fiber)와 같은 액틴-세포골격 경향을 현저하게 변화시켰다(도 3 하단 좌측). 따라서, 세포 형태의 변화를 유도하는 낮은 수준의 전류인 2 nA와 세포 사멸이 시작되는 1000 nA를 세포사멸을 유도하지 않으면서 세포거동에 유효한 영향을 나타내는 C2C12 세포에 적용가능한 전류 범위로 결정하였다.
실시예 4: EBFC 에 의한 전기장 상에서 시험관 내 세포이동
시험관 내 세포이동 연구를 위하여, 3 내지 7×105/ml 농도의 C2C12 세포 부유 용액을 준비하였다. 세포 용액 75 μl를 각 웰에 적용하였다. Well-defined 세포 분주 시스템(cell seeding system), 80206, ibiTreat, ibidi, Germany)인 배양-삽입 기구를 이용하여 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 제조하였다. 각 웰에서 세포를 포함하지 않는 간극의 폭은 500 μm±50 μm로 하였다. 세포 분주 후 배양-삽입을 배양접시로부터 조심스럽게 제거하였다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 수회 세척하였다. 세척 후 EBFC의 효소 반응을 위하여 5 ml의 신선한 배지를 채웠다. EBFC 전류 시스템으로는 직경 60 mm의 배양접시를 사용하였다. 세포-세포 간극의 서로 가장 먼 가장자리(cross edge)에 전극을 부착하였다. 배양-삽입 기구를 제거한 후, 16시간 및 24시간 째에 관찰하고 간극 내로 이동한 세포를 계수하였다. 각각의 EBFC 조건에 대해 세포를 포함하지 않았던 간극에서 세포의 수를 계수하여 비교하였다.
세포-세포 간극에 전기 자극 시스템을 장치하였다: 양극만을 포함하는 배양접시, 음극만을 포함하는 배양접시 및 양극, 음극을 모두 포함하는 배양접시 및 대조군으로서 전극 미포함 배양접시. 500 μm의 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 배양접시에 세포를 분주하고 각각의 전기 자극 하에서 배양하여 상기 간극으로 이동하는 세포의 수를 계산하고 상처 치료율을 측정하였다. 세포-세포 간극으로의 이동을 3개 다른 영역에서 현미경(Nikon Instruments)에 장착된 디지털 카메라를 이용하여 자극을 가하기 전과, 자극을 가하면서 각각 16시간 및 24시간이 지난 후에 사진으로 기록하였다. 세포-세포 간극 폐쇄율을 결정하기 위하여 최상의 현미경 이미지를 이용하여 각각의 이동에 대한 평균 세포 수를 측정하였다. 도 4는 전기 자극을 적용하지 않은 대조군에 비해 전기 자극군에서 세포의 이동률이 현저히 증가함을 나타내었다. EBFC에 의한 모든 형태의 전기 자극에 대해 세포 이동 수는 대조군에 비해 16시간에서 2배 이상인 것을 확인하였다. 특히 음극만을 포함하는 배양접시에서의 전기 자극은 24시간 후 다른 전기 자극군과 비교하여 가장자리로부터 중심으로 이동한 세포의 수가 현저히 증가되었음을 나타내었다(도 4; 좌측으로부터 3번째 컬럼). 시간에 대해 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 본 발명에서는 양극 및 음극만에 의한 C2C12 근모세포에 대한 자극이 대조군에 비해 세포 이동률을 2배 이상 향상시켰음을 최초로 확인하였다.
실시예 5: EBFC 시스템 상에서 C2C12 세포 증식
C2C12 세포를 1×105/ml 농도로 전극을 포함하는 배양접시(직경 35 mm) 상에 분주하였다. 본 발명에서는 대조군과 3가지 전극조건을 이용하였다(도 2): 대조군(control, electrodeless; 무전극), 양극단독(anodic only), 음극단독(cathodic only) 및 전체 시스템(full set); 양극/음극. 상기 대조군 및 실험군에 대하여 전기자극에 대한 부착성 세포의 반응을 확인하였다. 따라서, 전극과 배양접시 간에 3 mm 간격을 갖는 배양접시를 제작하였다. 초기 배양조건은 2 ml의 배양배지를 이용하여 세포를 덮되 전기적 교점(electrical node)에 닿지 않도록 하였다. 16시간 후, 3 ml의 배양배지를 첨가하여 효소 반응을 위한 전기적 교점을 완전히 덮도록 하였다. 이후 2일, 4일 및 6일에 세포 증식률 분석을 위해 세포를 회수하고 계수하였다.
EBFC의 다른 조건에 대한 세포 증식 분석을 수행하였다. 배양접시 상에 세포를 1×104/ml 밀도로 분주하고 각기 다른 세기의 전기장을 가하면서 세포를 배양하고 6일까지 매 2일마다 세포 수를 확인하였다. 효소 기반 생물연료 전지 조건의 전기장은 대조군과 비교하여 현저한 세포증식률의 증가를 나타내었다(도 5).
실시예 6: EBFC 시스템 상에서 다양한 조직세포로의 분화
정상 배양배지를 분화배지로 교환하였다. 배지 중의 글루코스를 이용한 전기 화학적 반응을 위하여 분화배지로서 AIM/무혈청 DMEM 2:1 혼합물을 전기적 교점까지 채웠다. 5 내지 6일 후, 배양된 세포를 회수하여 세포 증식 및 분화를 분석하였다. C2C12 세포 분화를 마우스 단클론 항-마이오게닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA) 및 래빗 다클론 항-알파 액티닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA)와 같은 특이적 성숙 근육마커(specific mature muscle marker)로 염색하여 공-형광 면역세포화학으로 분석하였다. PCL 나노섬유막 상에 위치한 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.5% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 이후 시료를 일차 항체로 4℃에서 밤새도록 표지한 후 10% 고트 혈청으로 30분간 차단하였다. 시료를 PBS로 3회 세척하고 항-알파 액티닌 항체에 대해 알렉사 플루오르 555가 결합된 동키(donkey) 항-래빗 이차 항체(A31572, Alexa Fluor, 1:5000, Invitrogen Biotechnology, USA)와 항-마이오게닌 항체에 대해 FITC가 결합된 고트 항-마우스 이차 항체(SC2012, 1:500, Santa Cruz biotechnology, USA)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 형광 발색하도록 하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 공초점 현미경(M700 ZESS, Germany)을 사용하여 염색된 세포의 세포 형태를 이미징하였다.
마우스 마이오게닌, 마이오D(myoD), sarcomeric actin 및 알파 액틴을 이용한 qRT-PCR를 수행하였다. 하기 유전자 번호에 기초하여 각 프라이머를 고안하였다: 마이오게닌(NM_031189.2), 마이오D(NM_010866.2), 골격근(skeletal muscle; NM_009606.2) 및 알파 액틴(NM_033268.4). 각각의 세포 펠렛으로부터 RNA 분리 키트(RNeasy mini kit 74104, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 토탈 RNA를 분리하였다. Quantitect RT kit(#205311, Qiagen, CA, USA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 40 μl 반응에서 RNA 시료(1 μg)을 cDNA로 역전사하였다. 반응은 95℃에서 5분간 수행하였다. 역전사효소를 포함하지 않는 유사 반응 혼합물을 준비하여 유전체 DNA(genomic DNA) 오염의 부재를 나타내기 위한 주형(template)으로 사용하였다. 선-혼합 PCR 키트(pre-mixed PCR kit, Bioneer, Daejeon, Korea)와 함께 각각 특이적 유전자 프라이머를 사용하여 1 μl cDNA로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 이후 75℃에서 60초간 35 사이클 수행하였으며, 각 cDNA에 대해 3회 반복하여 수행하였다. PCR 생산물을 2% 아가로스젤 상에 100V로 25분간 전기영동하였다. 소프트웨어 프로그램 Gene tools를 사용하여 시료의 띠세기(band intensity)를 정량하고 내인성 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(endogenous Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 전사물(transcript, GU214026.1)에 대해 정상화하였다.
항-마이오게닌(5FD; SC52903, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 알파-액티닌 항체(SC-15335, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 성숙 골격근마커로서 마이오게닌 및 액티닌 단백질에 대해 웨스턴블롯을 수행하였다. 각기 다른 조건에서 배양한 세포를 회수하고 상용화되는 용해 완충액(lysis buffer, iNtron Biotechnology)로 용해시켰다. 시료 용액을 20 μl 5× 로딩 완충액과 5분간 비등시켰다. 3개의 5 μl 비등시킨 시료를 8% SDS PAGE 젤의 각 웰에 전개시키고, 350 mA에서 2시간 반 동안 니트로셀룰로스(nitrocellulose; NC) 막에 옮겼다. 옮겨진 막을 5% 탈지유(fat free milk) TBST(tris buffer with 0.5% tween-20)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 일차항체를 2% 탈지유 TBST 용액으로 희석하고 이동막(transfer membrane)과 함께 냉장실에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 블롯된 막은 0.5% TBST로 세척하고 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합 항 마우스 이차 IgG와 함께 인큐베이션하고 면역반응성 띠(immunoreactive band)는 ECL 검출 시약(Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop, CA)을 이용하여 검출하였다. 띠 이미징 및 세기 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare, USA)를 이용하여 수행하였다. 웨스턴블롯 분석은 3회 수행하였으며, 측정된 세기는 평균±표준편차(mean±S.D.)로 표기하였다.
EBFC에 의한 전기장 상에서 성숙 근육 특이적 유전자 및 단백질을 분석하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, EBFC의 전기자극 상에서 C2C12의 근육분화를 확인하기 위하여 5일 배양 후 성숙 근관형성 및 성숙 근육 특이적 단백질 발현을 분석하였다. 세포를 항-마이오게닌과 알파-액티닌 항체로 동시에 면역염색하여 단백질 국부화 및 근관형성을 형광이미징으로 가시화하여 도 6에 나타내었다. 음극만에 의한 전기자극 및 양극/음극 시스템에 의한 전기자극은 근육성숙마커 단백질로서 마이오게닌 및 알파 액티닌의 강한 발현을 유발하였다. 특히 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극은 PCL-겔 나노섬유막 상에서 완전한 근관형성을 나타내었다. 배양 5일에 성숙 근육분화의 모든 마커(MyoD 및 알파 액티닌)은 전기자극 없이 배양한 경우와 비교하여 전기자극을 적용한 경우 PCL-나노섬유막 상에서 보다 강하게 표지되었다(도 6a). 전기자극 없이 동일한 조건 하에서 배양한 경우 막 상에는 양성 염색 세포가 전혀 존재하지 않았다. 모든 마커에 대한 형광세기 수준을 정량하여 양극 자극만을 가하여 배양한 세포에서 보다 음극 자극만을 가한 막 상의 세포에서 현저히 더 강한 형광신호를 나타냄을 확인하였다(도 6a). 나아가 양극 및 음극 자극을 종합적으로 가한 세포는 완전한 근관형성을 나타내었다. 음극만을 가한 그룹은 양극만을 가한 그룹과 대조군에 비해 근관형성이 현저히 증가하였다. 이에 본 발명자들은 EFBC을 이용한 전기자극에 의한 분화를 정량적으로 분석하였다. EBFC를 이용한 전기자극에 의한 마이오게닌, myoD, 골격근육 액티닌 및 알파-액티닌과 같은 성숙 골격근육 특이적 마커의 유전자 발현을 분석하였다. 5일간 스캐폴드 상에서 배양한 C2C12의 mRNA 수준을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. GAPDH 콘트롤에 대해 정규화하여, 음극자극만 및 음극/양극 종합자극에서 모든 유전자 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하였다(도 6b). 특히, 골격 알파 액티닌 유전자 발현은 다른 군에 비해 현저히 더 높았다(약 3배). 음극자극만을 가한 시료에서 골격근육 액티닌의 강한 발현이 나타났다.
EBFC 전기자극은 PCL-나노검유막 상에서 배양된 C2C12의 유도를 5일간 배양하여 단백질 수준으로 평가하였다. 근육생성 및 알파-액티닌 단백질에 대한 근육세포의 정량을 웨스턴 블롯으로 재확인하였다. 전기자극을 포함하는 PCL 나노섬유막 상에서 배양한 세포는 전기자극 없이 배양한 경우에 비해 현저히 더 높은 단백질 발현을 나타내었다. 양극/음극의 종합적인 전기자극을 가한 경우 MyoD 및 알파-액티닌에 대해 통계적으로 현저한 차이가 관찰되었다. 음극만의 자극은 대조군에 비해 약간의 증가된 근육생성단백질 발현수준을 나타내었다. 알파-액티닌 단백질은 양극자극만 및 음극자극만을 가한 그룹과 대조군 간의 차이가 나타나지 않았다.
마지막으로, 실시간 PCR을 이용하여 각 조직세포 특이적 유전자의 발현정도를 상대정량하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 전기자극은 전술한 바와 같이 세포사멸을 유도하지 않는 1000 nA 수준에서 변화(0.01 EF, 0.02 EF 및 0.05 EF)시키면서 가하였다. 0.01 EF의 낮은 전기자극에서는 근육세포 특이적인 마이오게닌 및 마이오 D의 발현이 현저하게 향상되었으며, 0.02 EF의 전기자극에서는 골세포 특이적인 OPN 및 ALP의 발현이 현저하게 향상되었다. 한편, 0.02 내지 0.05 EF의 전기자극에서는 신경세포 특이적인 신경미세섬유의 발현이 현저하게 향상되었다. 이로부터, 전술한 바와 일치하게, 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 중간 내지 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 확인하였다.

Claims (30)

  1. 효소적 생물연료전지의 양극(산화전극, anode), 음극(환원전극, cathode), 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 이용하여 외부로부터 전력공급 없이 세포에 2 nA/cm2 내지 1000 nA/cm2의 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포의 이동, 분열 또는 분화 조절 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 및 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 근육세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 골세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 신경세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 심근세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성되는 것인 방법.
  10. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 조성물.
  12. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는, 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상처 부위 주변에 적용하여 상처 부위로의 세포 이동 또는 증식을 촉진시키는 것이 특징인 조성물.
  14. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는, 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 세포배양용기.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 세포배양용기.
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  17. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
    상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 경피투여형 제제로 제형화되는 것인 약학 조성물.
  21. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 근육조직 이상으로 인한 질환은 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  23. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  25. 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 신경질환은 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
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