WO2014091146A2 - Utilisation cosmetique d'un extrait de germe de caroube en tant qu'agent actif amincissant - Google Patents

Utilisation cosmetique d'un extrait de germe de caroube en tant qu'agent actif amincissant Download PDF

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WO2014091146A2
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Definitions

  • the present invention is in the field of cosmetics and more particularly in the field of cosmetic slimming methods. It relates to the cosmetic use of a carob germ extract (Cemtonia siliqua L.) as a slimming agent. The invention also relates to the cosmetic use of a locust bean extract to increase the expression of aquaglyceroporins and promote the destocking of triglycerides contained in the adipocytes.
  • a carob germ extract Cemtonia siliqua L.
  • the invention also relates to a cosmetic care method comprising the topical application, on at least part of the skin of the body or face, of a carob germ extract (Cemtonia siliqua L.), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, to obtain a slimming effect, and more particularly to reduce localized fat overload.
  • a cosmetic care method comprising the topical application, on at least part of the skin of the body or face, of a carob germ extract (Cemtonia siliqua L.), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, to obtain a slimming effect, and more particularly to reduce localized fat overload.
  • the subcutaneous adipose tissue is located at the level of the hypodermis. It is a variety of connective tissue in which adipocytes predominate, organized into lobules about 5mm in diameter, separated by fine connective bays. Each adipocyte contains a large lipid vacuole containing essentially triglycerides and whose diameter can vary from 40 to 120 ⁇ .
  • Adipose tissue must be considered as a dynamic reservoir, in constant renewal, ensuring a relay between food intake and the energy needs of the body.
  • adipocytes provide synthesis, storage and release of lipids.
  • Lipid synthesis, or lipogenesis is carried out from triglycerides of food origin and glucose.
  • the triglycerides stored in the adipocytes can be hydrolysed, during lipolysis, to release fatty acids, glycerol and mono- and di-esters of glycerol.
  • the non-esterified fatty acids thus released can either diffuse into the blood and then be available for the energy needs of other cells of the body, or be reused quickly by the adipocyte to generate triglycerides again by lipogenesis.
  • xanthine bases derived from xanthine
  • xanthine such as theophylline, caffeine, theobromine (described in patents FR 2609395, FR 267401), used for their action thus promoting the lipolytic activity of the fat cells.
  • the synthetic peptides such as the Arg-Gly-Ser-NH 2 sequence peptide (described in patent FR 2,858,769), or the sequence peptide Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val- Arg-Leu-Gln (described in patent FR 2 879 924) used for its action in the decoupling between the reoxidation of coenzymes and the phosphorylation of ADP in ATP at the level of mitochondria.
  • the synthetic peptides such as the Arg-Gly-Ser-NH 2 sequence peptide (described in patent FR 2,858,769), or the sequence peptide Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val- Arg-Leu-Gln (described in patent FR 2 879 924) used for its action in the decoupling between the reoxidation of coenzymes and the phosphorylation of ADP in ATP at the level of mitochondria.
  • Plant extracts such as marine algae extracts of the genus Palmaria or Rhodymenia (described in patent FR 2 887 447), extracts of ginkco biloba (see patent FR 2 669 537), or the flavones or isoflavones of soya (described in WO 01/64177).
  • the solution of the technical problem lies in the cosmetic use of a carob germ extract.
  • the inventors have indeed demonstrated that a carob germ extract acts on the aquaglycéroporines, thus promoting the transport of glycerol released during lipolysis, out of the adipocyte.
  • Aquaporins are a class of transmembrane proteins carrying water and small molecules in solution, between cells and the internal environment. Aquaporins can be classified into two distinct subgroups: aquaporins allowing only the transport of water, and aquaglycéroporines which allow, in addition to the transport of water, the transport of glycerol.
  • aquaglyceroporin 7 has been identified in the membrane of human adipocytes and plays an important role in the metabolism of reserve fats (Mariko Hara-Chikuma et al., Progressive adipocyte hypertrophy in aquaporin-7 deficient mice, J. Biol Chem, vol.280, No. 16, April 22, 2005).
  • aquaglyceroporines therefore make them interesting biological targets for promoting the destocking of lipids contained in adipocytes.
  • the present invention firstly relates to the cosmetic use of a carob germ extract (Ceratonia siliqua L.) as a slimming active agent.
  • active slimming agent in the sense of the present invention, a carob germ extract used to reduce localized fat overload, considered unsightly and often associated with a padded appearance of the skin.
  • the carob seed (plant of the genus Ceratonia), and more particularly the endosperm fraction of this seed, is widely used for its richness in galactomannans, in the food industry under the name "locust bean gum".
  • the seed is the most protein-rich part of the seed and can be easily isolated.
  • peptide extract is intended to mean a mixture of compounds predominantly represented by compounds of a peptide nature, in solution in a large volume of water or other polar solvents or a mixture of these solvents.
  • peptide-like compounds means the protein fragments and the peptides present in the peptide extract according to the invention.
  • topical application is meant the application or spreading of the active agent according to the invention, or a composition containing it, on the surface of the skin or mucosa.
  • physiologically acceptable means that the active agent according to the invention, or a composition containing it, is suitable for coming into contact with the skin or a mucosa without causing toxicity or intolerance reactions.
  • physiologically acceptable any compound suitable for contact with the skin or mucosa without causing toxicity or intolerance reactions.
  • localized adipose overload means an enlarged area of the subcutaneous adipose tissue, which may have an orange peel appearance.
  • active agent and "carob germ extract” will be used interchangeably.
  • the active agent according to the invention can be obtained by extraction of proteins of vegetable origin, followed by controlled hydrolysis which releases the biologically active peptide compounds.
  • peptide extracts and in particular peptide extracts of low molecular weight, has many advantages in cosmetics.
  • hydrolysis and purification make it possible to obtain more stable mixtures, compositions that are more easily reproducible and that do not cause allergic reactions in cosmetics. .
  • locust bean seeds plant of the genus Ceratonia
  • Any method of extraction or purification known to those skilled in the art can be used to prepare the extract according to the invention.
  • the controlled hydrolysis makes it possible to release compounds of peptide nature. It is possible, but not necessary to carry out the invention, either to extract the proteins concerned and then to hydrolyze them, or to perform the hydrolysis on a crude extract and then to purify the compounds of peptidic nature afterwards.
  • the seeds contained in the seeds are crushed in order to obtain a powder or flour.
  • the powder thus obtained can be previously treated with a cellulase to promote the elimination of sugars, and in particular insoluble polysaccharides.
  • the proteins of the seed are then extracted according to the conventional method (modified Osborne, T. B., The Vegetable Proteins, 2nd Edition, Longmans, Green and Co., London, 1924); the locust bean sprout is suspended in an alkaline solution containing an insoluble polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) adsorbent product (0.01 - 20%); in fact, it is known that the hydrolyses and the subsequent purifications are facilitated by this means. In particular, the concentration of phenolic-type substances, interacting with proteins, is significantly reduced.
  • the proteins can then be precipitated by varying the ionic strength or acidifying the medium, thereby eliminating soluble components and nucleic acids.
  • the precipitate is then washed with an organic solvent such as, for example, ethanol or methanol, and the solvent is evaporated by drying in vacuo.
  • the protein-rich precipitate is redissolved in water or other solvent and then constitutes a more purified form of the extract.
  • the extraction can also be carried out in neutral or acidic medium always in the presence of polyvinylpolypyrrolidone.
  • the precipitation step is then carried out using a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • the precipitate obtained can be separated from the precipitating agents by dialysis after redissolving in water or another solvent.
  • the soluble fraction containing proteins, carbohydrates and possibly lipids, is collected after centrifugation and filtration steps. This crude solution is then hydrolyzed under mild conditions to generate soluble peptides. Hydrolysis is defined as a chemical reaction involving the cleavage of a molecule by water, this reaction being possible in a neutral, acidic or basic medium. According to the invention, the hydrolysis is carried out chemically and / or advantageously by proteolytic enzymes among which we can then mention endoproteases of plant origin (papain, bromelain, ficin).
  • the hydrolysed carob seed extract obtained at this stage is used.
  • an amount of polyvinylpolypyrrolidone can be added to the reaction medium during this mild hydrolysis step.
  • the resulting extract can be further purified to select low molecular weight peptide compounds.
  • the fractionation can advantageously be carried out by ultrafiltration and / or by a chromatographic type method.
  • a dilution phase is then carried out in water or in any solvent mixture containing water.
  • the active agent according to the invention is advantageously diluted in one or more physiologically acceptable solvents, such as water, glycerol, ethanol, propanediol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols. , cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • the diluted active agent is then sterilized by ultrafiltration.
  • the locust bean extract is diluted in one or more physiologically acceptable solvents, such as water, glycerol, ethanol, propanediol, butylene glycol or dipropylene glycol. , ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • physiologically acceptable solvents such as water, glycerol, ethanol, propanediol, butylene glycol or dipropylene glycol.
  • ethoxylated or propoxylated diglycols cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • a peptide extract is obtained, characterized by a dry weight of 2 to 5 g / kg, a concentration of peptide-like compounds of 1 to 10 g / l, preferably of 1.5 to 3.5 g / l, a concentration of sugars of 0.05 to 1 g / l, preferably of 0.1 to 0.3 g / l and a concentration of polyphenols of less than 1% relative to the dry weight.
  • the carob germ extract has a dry weight of 2.5 g / kg and contains between 1.5 and 3.5 g / l of peptide-like compounds.
  • the extract obtained is composed of peptides with a molecular weight of less than 5 kDa and is characterized by a concentration of sugars of less than 15% and a concentration of polyphenols of less than 1% relative to the dry weight.
  • the locust bean extract is a peptide extract in which the compounds of peptide nature have a molecular weight of less than 5 kDa.
  • the present invention also relates to the use of a locust bean extract to increase the expression of aquaglyceroporins and more particularly of aquaglyceroporin 7.
  • the characteristic molecular activity of the invention is defined in vitro by the ability of the active agent to increase the expression of aquaglyceroporins, either by increasing the protein synthesis of aquaglyceroporines (by direct or indirect modulation of the expression Aquaglyceroporin gene), or by other biological processes such as the stabilization of the aquaglyceroporin protein or the stabilization of messenger RNA transcripts.
  • ⁇ aquaglyceroporin is ⁇ aquaglyceroporin 7.
  • the present invention also relates to the use of a carob germ extract to promote lipolysis, destocking of lipids and the release of glycerol from adipocytes.
  • the biological activity characteristic of the invention is defined in vitro by the ability of the active agent to reduce the size and the number of lipid droplets in the adipocytes.
  • the present invention also relates to a cosmetic care method comprising the topical application on at least part of the skin of the body or face, a carob seed extract (Ceratonia siliqua L.), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, to obtain a slimming effect, and more particularly to reduce localized fat overload.
  • a cosmetic care method comprising the topical application on at least part of the skin of the body or face, a carob seed extract (Ceratonia siliqua L.), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, to obtain a slimming effect, and more particularly to reduce localized fat overload.
  • the locust bean extract is present at a concentration of between 0.0001% and 20% of the total weight of the composition, and preferably at a concentration of between 0.05% and 5% of the total weight of the composition. in a physiologically acceptable medium.
  • the active agent can be encapsulated or included in a cosmetic vector such as liposomes or any other microcapsule used in the field of cosmetics or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports like talcs and bentonites.
  • compositions for the implementation of the invention may in particular be in the form of an aqueous solution, hydro-alcoholic or oily; an oil-in-water, water-in-oil emulsion or multiple emulsions; they too can be in the form of suspensions, or powders, adapted for application to the skin, mucous membranes, lips and / or hair.
  • compositions may be more or less fluid and have the appearance of a cream, lotion, milk, serum, ointment, gel, paste or paste. a foam. They can also be in solid form, as a stick or be applied to the skin in aerosol form.
  • compositions may furthermore comprise any additive commonly used in the field of application envisaged as well as the adjuvants necessary for their formulation, such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • adjuvants necessary for their formulation such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they can be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • composition that can be used to carry out the invention may comprise, in addition to the active agent according to the invention, at least one other active agent having cosmetic effects similar to and / or complementary to those of the invention.
  • this active agent will be defined as an "additional active agent”.
  • the additional active agent (s) may be chosen from: anti-aging, firming, lightening, moisturizing, draining, microcirculation promoting agents, pharmaceutical agents, exfoliants, desquamants, extracellular matrix stimulating, activating energy metabolism, antibacterials, antifungals , soothing, anti-radical, anti-UV, anti-acne, anti-inflammatory, anesthetic, providing a feeling of warmth, providing a feeling of freshness, slimming.
  • Such additional agents may be chosen from the groups comprising: vitamin A and especially retinoic acid, retinol, retinolpropionate, retinol palmitate,
  • vitamin B3 and more particularly niacinamide, tocopherol niconitate,
  • vitamin B5 vitamin B6, vitamin B12, panthenol
  • vitamin C especially ascorbic acid, ascorbyl glucoside, ascorbyl tetrapalmitate, magnesium and sodium ascorbyl phosphate,
  • amino acids such as arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, methionine and its derivatives, N-acyl amino acid compounds,
  • the natural or synthetic peptides including di-, tri-, tetra-, penta- and hexapeptides and their lipophilic derivatives, isomers and complexed with other species such as a metal ion (eg copper, zinc, manganese) , magnesium, and others).
  • a metal ion eg copper, zinc, manganese
  • MATRKYL ®, ARGIRELINE ®, TM Collaxyl, PEPTIDE VINCI 02 TM, Chronogen TM, LAMINIXYL IS TM, Peptide Q10 TM commercially known as the peptides MATRKYL ®, ARGIRELINE ®, TM Collaxyl, PEPTIDE VINCI 02 TM, Chronogen TM, LAMINIXYL IS TM, Peptide Q10 TM,
  • plant peptide extracts such as extracts of soya, spelled, vine, rapeseed, flax, rice, maize, pea,
  • DHA dehydroacetic acid
  • salicylic acid and its derivatives alpha- and beta-hydroxy acids, silanols,
  • glucosamine D-glucosamine
  • N-acetylglucosamine N-acetyl-D-glucosamine
  • mannosamine N-acetyl mannosamine
  • galactosamine N-acetylgalactosamine
  • extracts of polyphenols such as isoflavones, flavonoids, such as grape extracts, pine extracts, olive extracts,
  • lipids such as ceramides or phospholipids, oils of animal origin, such as squalene or squalane; vegetable oils, such as sweet almond oil, coconut oil, castor oil, jojoba oil, olive oil, rapeseed oil, peanut oil, sunflower oil, wheat germ oil, corn germ oil, soya bean oil, of cotton, alfalfa, poppy, pumpkin, evening primrose, millet, barley, rye, safflower, passionflower, hazelnut, palm, apricot kernel, avocado, calendula ; ethoxylated vegetable oils, shea butter,
  • the invention may comprise at least one additional active agent known for its slimming action, inhibiting lipogenesis or stimulating lipolysis, such as: cyclic and its derivatives, the activating agents of the enzyme adenylate cyclase and the inhibitors of the phosphodiesterase enzyme, centella asiatica extract, asiaticoside and asiatic acid, methyls xanthines, theine, caffeine and its derivatives, theophylline, theobromine, forskolin, esculin and esculoside, ACE inhibitors, Val-Trp peptide, neuropeptide Y inhibitors, enkephalin, gingko biloba extract, dioscorea extract, rutin, yerba mate extract, guarana extract, oligosaccharides, polysaccharides, carnitine, ivy extract, fucus extract, hydrolysed extract of Prunella vulgaris, hydrolysed extract
  • compositions that can be used according to the invention can be applied by any appropriate route, in particular oral or external topical, and the formulation of the compositions will be adapted by those skilled in the art.
  • compositions according to the invention are in a form suitable for topical application.
  • These compositions must therefore contain a physiologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin and superficial body growths, and cover all cosmetic forms.
  • the invention is directed to mammals in general, and more particularly to humans.
  • FIG. 1 Immuno-detection of aquaglyceroporin 7 in 3T3-L1 cells.
  • Figure 2 Quantification of the size of the lipid droplets in 3T3-L1 cells.
  • Example 1 Preparation of a Carob Peptide Extract (Ceratonia siliqua L.)
  • the carob germ (Ceratonia siliqua L.) in powder form is dissolved in 70 volumes of water and the pH is adjusted to a value between 4.5 and 5.5.
  • the latter is characterized by a protein content of between 45 and 50% and a sugar content of between 20 and 30%.
  • the dry residue thus obtained is dissolved in 100 volumes of water in the presence of 2% of POLYCLAR® 10.
  • the mixture is adjusted to a pH of between 8.0 and 8.5 with a 2M aqueous sodium hydroxide solution. .
  • a first hydrolysis is carried out using 2% Alcalase® (novozym).
  • the hydrolysis is obtained after 2 hours, with stirring, at 55 ° C.
  • the enzyme is inactivated by heating the solution at 80 ° C for 2 hours. After quenching, the reaction mixture is filtered and the filtrate is collected. It is the intermediate protein extract of locust bean.
  • the peptide and protein compounds of this filtrate are characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast, Invitrogen gels).
  • the filtrate is heated at 70 ° C for 10 minutes under denaturing reducing conditions in NuPAGE® LDS sample preparation buffer.
  • a solution of antioxidant NuPAGE® is added to the inner vessel (cathode) to prevent the reduced proteins from reoxidizing during electrophoresis.
  • the protein migration is performed in NuPAGE® MES migration buffer in the presence of a molecular weight standard (SeeBlue Plus2). Protein staining is performed using Coomassie® Blue R-250.
  • the protein profile thus obtained shows that the peptide and protein compounds of the filtrate have molecular weights of between 50 and 10 kDa.
  • the carob germ intermediate protein extract is then dissolved in 100 volumes of water in the presence of 2% of POLYCLAR® 10.
  • the mixture is adjusted to a pH of between 4 and 5 with an aqueous solution of hydrochloric acid. 1 Mr.
  • a step of hydrolysis of the proteins is then carried out using an endoprotease.
  • 2% bromelain is added to the reaction medium.
  • Hydrolysis is obtained after 2 hours of stirring at 50 ° C.
  • the enzyme is inactivated by heating the solution at 80 ° C for 2 hours.
  • the carob germ extract is characterized by a dry weight of between 20 and 25 g / kg, a protein content of between 10 and 15 g / l, a sugar content of between 5 and 6 g / 1, an amino acid level of between 1 and 2 g / l and a total polyphenol content of between 0.5 and 1 g / l. Proteins are assayed by a specific colorimetric method (Lowry method)
  • the protein profile of this extract is analyzed by electrophoresis gel. Under the same conditions as previously described, two large families of proteins are observed: the first family, which is a minority, corresponds to proteins of molecular weight of 25 to 20 kDa and the second family, which is very predominant, corresponds to proteins of lower molecular weight. at 5kDa.
  • This extract is then purified by removing proteins of molecular weight greater than 5 kDa by tangential flow filtration steps.
  • the carob germ extract is pumped under pressure through a Pellicon® support equipped with Pellicon® 2 Biomax 30 kDa cassette.
  • the first filtrate obtained is recovered to be filtered again through another Pellicon® 2 Biomax 5 kDa cassette.
  • an orange-yellow carob seed extract brilliant and limpid. It is characterized by a dry weight of between 8 and 9 g / kg, a protein content of between 6 and 7 g / l, a sugar content between 0.3 and 0.5 g / l and a polyphenol content. totals less than 0.1 g / 1.
  • a dilution phase in a water-glycerol mixture in order to obtain a peptide extract characterized by a dry weight of 2 to 5 g / kg, and preferably of 2.5 g / kg, a concentration of compounds of a nature peptide of 1.5 to 3.5 g / l, a sugar concentration of 0.1 to 0.3 g / l (ie less than 15%) and a polyphenol concentration of less than 1%.
  • This purified and diluted extract corresponds to the peptide extract of locust bean germ according to the invention. It is characterized in that the compounds of peptide nature have a molecular weight of less than 5 kDa, that the polyphenol content is less than 1%.
  • the purpose of this study is to determine the influence of the carob extract according to Example 1 on the expression of aquaglyceroporin 7 in differentiated adipocyte cells 3T3-L1.
  • the adipocyte cells 3T3-L1 are cultured in DMEM medium 4.5 g / 1 glucose, 2 mM Glutamine and 10% fetal calf serum.
  • 3T3 cells into adipocytes 2 days after entering the cell confluence phase, the differentiation of 3T3 cells into adipocytes is induced by the addition of a 0.5 mM solution of IBMX, 1 ⁇ l of dexamethasone and 10 ⁇ l of insulin. (Sigma, St. Louis, MO, USA) in the culture medium for 3 days. Then, only the insulin is maintained for 3 to 4 days of additional culture. The cells are then maintained in culture, in standard medium, for a further 3 days.
  • IBMX 0.5 mM solution of IBMX, 1 ⁇ l of dexamethasone and 10 ⁇ l of insulin.
  • the treatment is carried out from the beginning of the induction phase of the differentiation by a daily application for 12 days, either of IX PBS (Lonza, Rockland USA) for the untreated control, or of locust bean extract. dry weight 2.5 g / kg, as obtained in Example 1, diluted to 1% in PBS.
  • a positive control is achieved by a 5-hour treatment with isoproterenol at 10 ⁇ , which is an adrenergic receptor agonist, causing very rapid lipolysis.
  • the cells are washed 3 times with IX PBS (Lonza, Rockland, USA) and fixed with 3.7% formaldehyde (Sigma Aldrich, USA) for 10 min at room temperature.
  • the cell membranes are permeabilized with acetone for 4 min at -20 ° C.
  • Non-specific sites are saturated with 3% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) for 15 min.
  • the primary antibody (anti-aquaglyceroporin polyclonal rabbit 7, Santa Cruz Biotechnology) diluted at 1/100) is applied for 1.5 hour.
  • Alexa Fluor 488 probe Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit (Invitrogen, Fisher) diluted 1/1000
  • the slides are then mounted in Fluoromount G (Electron Microscopy Science, Hatfield, UK).
  • the cells are examined under the Nikon Eclipse 80i microscope, the 40X objective, and the photos are taken using a Nikon Digital DXM1200C.
  • the carob extract according to Example 1 at 1% causes a significant increase in the expression of aquaglyceroporin 7 in differentiated adipocyte cells 3T3-L1.
  • the purpose of this study is to determine the influence of the carob extract according to Example 1 on the size and the number of lipid droplets contained in differentiated adipocyte cells 3T3-L1.
  • the culture, the differentiation of the 3T3-L1 cells and then the treatment with the test compounds are carried out as in Example 2.
  • Lipid detection is performed using Nile Red fluorescent dye, a phenoxazone that strongly labels intracellular lipids
  • the color of the fluorescence observed is directly dependent on the hydrophobicity of the surrounding medium. This specific property of the Red Nile makes it possible to differentiate the neutral lipids, marked in golden yellow, phospholipids, marked in red.
  • the cells are examined under a fluorescent microscope. Quantification and statistical analysis are performed in the same manner as in Example 2.
  • the intensity of Nile Red labeling, the size and number of the droplets in the differentiated 3T3-L1 cells treated with locust bean extract according to Example 1 at 1% is decreased compared to untreated cells.
  • Quantitative analyzes showed a 35.6% decrease in labeling intensity, a 21.7% decrease in droplet size, and a 29% drop in the number of untreated cells. This is illustrated in Figure 2.
  • the carob extract according to Example 1 at 1% causes a significant decrease in the size and number of lipid droplets in 3T3-L1 differentiated adipocyte cells.
  • phase A The components of phase A are melted at 75 ° C and the components of phase B heated to 75 ° C. Phase A is emulsified at B, then the mixture is cooled below 40 ° C. Phases C and D are then added with constant stirring.
  • phase A and phase B are heated separately at 65 ° C; phase B is incorporated in phase A with stirring.
  • the temperature of the mixture is raised to 83 ° C. and is then cooled to the phase inversion temperature.
  • Phase C is then added.
  • Phase D is incorporated when the temperature reaches less than 40 ° C.
  • the carbopol is dispersed in the water until perfect hydration.
  • the ingredients are then added in the order listed above, with stirring.
  • the mixture is then neutralized with the TEA.
  • the perfume and the dyes are added if necessary.

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube (Cemtonia siliqua L.), en tant qu'agent amincissant, pour augmenter l'expression des aquaglycéroporines et le déstockage des triglycérides contenus dans les adipocytes. L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'un extrait de germe de caroube (Cemtonia siliqua L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, pour obtenir un effet amincissant, et plus particulièrement pour diminuer les surcharges adipeuses localisées.

Description

UTILISATION COSMETIQUE D'UN EXTRAIT DE GERME DE CAROUBE EN
TANT QU'AGENT ACTIF AMINCISSANT
Domaine de l'invention
La présente invention se situe dans le domaine de la cosmétique et plus particulièrement dans le domaine des méthodes cosmétiques amincissantes. Elle se rapporte à l'utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube (Cemtonia siliqua L.), en tant qu'agent amincissant. L'invention se rapporte encore à l'utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube pour augmenter l'expression des aquaglycéroporines et favoriser le déstockage des triglycérides contenus dans les adipocytes.
L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'un extrait de germe de caroube (Cemtonia siliqua L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, pour obtenir un effet amincissant, et plus particulièrement pour diminuer les surcharges adipeuses localisées.
Arrière plan de l'invention
Le tissu adipeux sous-cutané est situé au niveau de l'hypoderme. C'est une variété de tissu conjonctif où prédominent les adipocytes, organisés en lobules d'environ 5mm de diamètre, séparés par de fines travées conjonctives. Chaque adipocytes contient une volumineuse vacuole lipidique contenant essentiellement des triglycérides et dont le diamètre peut varier de 40 à 120 μιη.
Le tissu adipeux doit être considéré comme un réservoir dynamique, en constant renouvellement, assurant un relai entre les apports alimentaires et les besoins énergétiques de l'organisme. Ainsi, les adipocytes assurent la synthèse, le stockage et la libération des lipides.
La synthèse des lipides, ou lipogénèse, s'effectue à partir des triglycérides d'origine alimentaire et du glucose. A l'inverse, les triglycérides stockés dans les adipocytes peuvent être hydrolysés, lors de la lipolyse, pour libérer des acides gras, du glycérol et des mono- et di- esters de glycérol.
Les acides gras non estérifiés ainsi libérés peuvent soit diffuser dans le sang et être alors disponibles pour les besoins énergétiques d'autres cellules de l'organisme, soit être réutilisés rapidement par l'adipocyte pour générer à nouveau des triglycérides par lipogénèse.
Si un déséquilibre durable s'installe dans l'organisme au profit de la lipogénèse, la quantité de lipides stockés dans les adipocytes augmente, conduisant à l'hyperplasie de la masse adipeuse corporelle et plus particulièrement à l'apparition de surcharges adipeuses localisées. En effet, chez l'être humain adulte, sous l'effet des hormones sexuelles, le tissu adipeux se répartit de manière différente selon le sexe et modèle la silhouette. Le tissu adipeux s'accumule sur la poitrine, les hanches et les fesses chez la femme, et sur la nuque et les épaules chez l'homme. D'autre part, les surcharges adipeuses localisées sont souvent associées à des modifications de la peau, qui prend un aspect capitonné, dit en « peau d'orange ». Ces surcharges adipeuses localisées sont considérées de nos jours comme inesthétiques, et les personnes concernées peuvent souhaiter améliorer l'aspect de leur peau et de leur silhouette par des méthodes cosmétiques.
De nombreux agents actifs ayant une action sur la lipolyse ou la lipogénèse, avec une visée amincissante ont ainsi été identifiés. Parmi ceux-ci, on peut citer :
Les bases xanthiques (dérivées de la xanthine), telles que la théophylline, la caféine, la théobromine (décrit dans les brevets FR 2609395, FR 267401 ), utilisées pour leur action favorisant ainsi l'activité lipolytique des cellules graisseuses.
Les peptides de synthèse, tels que le peptide de séquence Arg-Gly-Ser-NH2 (décrit dans le brevet FR 2 858 769), ou encore le peptide de séquence Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys- Val-Arg-Leu-Gln (décrit dans le brevet FR 2 879 924 ) utilisées pour son action dans le découplage entre la réoxydation des coenzymes et la phosphorylation de l'ADP en ATP au niveau des mitochondries.
Les extraits végétaux, tels que les extraits d'algues marines du genre Palmaria ou Rhodymenia (décrit dans le brevet FR 2 887 447), les extraits de ginkco biloba (voir brevet FR 2 669 537), ou encore les flavones ou isoflavones de soja (décrit dans le brevet WO 01/64177).
Cependant, ces produits présentent généralement une efficacité modérée ou limitée dans le temps. Il est donc important de proposer de nouveaux agents cosmétiques actifs ayant une efficacité remarquable en tant qu'agent amincissant.
La solution du problème technique posé réside dans l'utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube. Les inventeurs ont en effet mis en évidence qu'un extrait de germe de caroube agit sur les aquaglycéroporines, favorisant ainsi le transport du glycérol libéré lors de la lipolyse, hors de l'adipocyte.
Les aquaporines sont une classe de protéines transmembranaires transporteuses d'eau et de petites molécules en solution, entre les cellules et le milieu intérieur. Les aquaporines peuvent être classées en deux sous-groupes distincts : les aquaporines permettant uniquement le transport de l'eau, et les aquaglycéroporines qui permettent, outre le transport de l'eau, le transport du glycérol.
Dans ce deuxième sous-groupe, l'aquaglycéroporine 7 a été identifiée dans la membrane des adipocytes humains et joue un rôle important dans le métabolisme des graisses de réserve (Mariko Hara-Chikuma et al. Progressive adipocyte hypertrophiy in aquaporin-7 deficent mice, J. Biol. Chem, vol.280, n°16, April 22, 2005).
Les propriétés particulières des aquaglycéroporines en font donc des cibles biologiques intéressantes pour favoriser le déstockage des lipides contenus dans les adipocytes.
On entend par déstockage des lipides, le phénomène de lipolyse aboutissant à la sortie du glycérol de la cellule adipocytaire.
L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description.
Exposé de l'invention
La présente invention a pour premier objet l'utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube (Ceratonia siliqua L.), en tant qu'agent actif amincissant.
L'extrait de germe de caroube utilisé selon l'invention offre notamment les avantages suivants :
- il augmente l'expression des aquaglycéroporines ;
- il favorise la lipolyse, le déstockage des lipides et la sortie du glycérol des adipocytes.
- il diminue les surcharges adipeuses localisées.
Ainsi, on entend par «agent actif amincissant » au sens de la présente invention, un extrait de germe de caroube utilisé pour diminuer les surcharges adipeuses localisées, considérées comme inesthétiques et souvent associées à un aspect capitonné de la peau.
La graine de caroube (plante du genre Ceratonia), et plus particulièrement la fraction endosperme de cette graine, est largement utilisée pour sa richesse en galactomannanes, dans l'industrie alimentaire sous la dénomination "gomme de caroube". Le germe est la partie la plus riche en protéines de la graine et peut être aisément isolé.
Un extrait protéique de germe de caroube, obtenu par hydrolyse enzymatique, a déjà été décrit (J. Parrado et al., Bioresource Technology 99, 2008). Néanmoins cet extrait est trop concentré en phytohormones, des perturbateurs endocriniens, pour être utiliser en cosmétique. Pour réaliser l'invention, toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée, tel que par exemple le procédé décrit dans la demande de brevet européen EP0689771.
On entend par « extrait peptidique », un mélange de composés majoritairement représentés par des composés de nature peptidique, en solution dans un large volume d'eau ou d'autres solvants, polaires ou un mélange de ces solvants.
On entend par « composés de nature peptidique », les fragments de protéines et les peptides présents dans l'extrait peptidique selon l'invention.
On entend par « application topique », le fait d'appliquer ou d'étaler l'agent actif selon l'invention, ou une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse.
On entend par « physiologiquement acceptable », que l'agent actif selon l'invention, ou une composition le contenant, est approprié pour entrer en contact avec la peau ou une muqueuse sans provoquer de réactions de toxicité ou d'intolérance.
On entend par « physiologiquement acceptable », tout composé approprié pour entrer en contact avec la peau ou une muqueuse sans provoquer de réactions de toxicité ou d'intolérance.
On entend par « surcharge adipeuse localisée » une zone hypertrophiée du tissu adipeux sous cutané, qui peut avoir un aspect en peau d'orange.
Dans la suite de l'exposé, on utilisera indifféremment les termes « agent actif » et « extrait de germe de caroube ».
L'agent actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère les composés de nature peptidique biologiquement actifs.
L'utilisation d'extraits peptidiques, et en particulier d'extraits peptidiques de bas poids moléculaires, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés de nature peptidique qui ne préexistaient pas dans le mélange protéique de départ, l'hydrolyse et la purification permettent d'obtenir des mélanges plus stables, des compositions plus facilement reproductibles et ne provoquant pas de réactions allergiques en cosmétique.
Pour réaliser l'extraction, on utilise les germes de graines de caroube (plante du genre Ceratonia). Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'extrait selon l'invention. Par exemple, l'hydrolyse ménagée permet de dégager des composés de nature peptidique. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, soit d'extraire les protéines concernées puis de les hydrolyser, soit d'effectuer l'hydrolyse sur un extrait brut puis de purifier les composés de nature peptidique ensuite.
Dans une première étape, les germes contenus dans les graines sont broyés afin d'obtenir une poudre ou farine. La poudre ainsi obtenue peut être préalablement traitée par une cellulase afin de favoriser l'élimination des sucres, et en particulier des polysaccharides insolubles.
On réalise ensuite l'extraction des protéines du germe suivant le procédé classique (Osborne, T. B., The Vegetable Proteins, 2nd Edition. Longmans, Green and Co., London, 1924) modifié ; le broyât de germe de caroube est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 - 20 %) ; en effet, il est connu que les hydrolyses et les purifications ultérieures sont facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénoliques, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite. Les protéines peuvent ensuite être précipitées en faisant varier la force ionique ou en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant organique tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol, puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme plus purifiée de l'extrait.
L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide toujours en présence de polyvinylpolypyrrolidone. Après une étape de filtration, l'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium) ou un solvant organique (alcool, acétone). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant.
La fraction soluble, contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques parmi lesquelles on peut alors citer les endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine).
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on utilise l'extrait de germe de caroube hydrolysé obtenu à cette étape. Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone peut être additionnée au milieu réactionnel lors de cette étape d'hydrolyse ménagée. L'extrait obtenu peut être encore purifié afin de sélectionner les composés de nature peptidiques de bas poids moléculaires. Le fractionnement peut s'effectuer avantageusement par ultrafiltration et/ ou par une méthode de type chromatographique.
On procède ensuite à une phase de dilution dans de l'eau ou dans tout mélange de solvants contenant de l'eau. Ainsi, l'agent actif selon l'invention est avantageusement dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, tels que l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. L'agent actif dilué est ensuite stérilisé par ultrafiltration.
Ainsi, selon une forme avantageuse de l'invention, l'extrait de germe de caroube est dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.
Après cette dilution, on obtient un extrait peptidique caractérisé par un poids sec de 2 à 5 g/Kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1 à 10 g/1, préférentiellement de 1,5 à 3,5 g/1, une concentration en sucres de 0,05 à 1 g/1, préférentiellement de 0,1 à 0,3 g/1 et une concentration en polyphénols inférieure à 1 % par rapport au poids sec.
Ainsi, selon une forme avantageuse de l'invention, l'extrait de germe de caroube a un poids sec de 2,5 g/kg et contient entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés de nature peptidique.
Les caractéristiques physico-chimiques et la teneur en composés de nature protéique et peptidique de l'extrait obtenu selon l'invention sont analysées qualitativement et quantitativement, selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier.
L'extrait obtenu est composé de peptides de poids moléculaire inférieur à 5 kDa et est caractérisé par une concentration en sucres inférieure à 15 % et une concentration en polyphénols inférieure à 1 % par rapport au poids sec.
Ainsi, selon une forme avantageuse de l'invention, l'extrait de germe de caroube est un extrait peptidique dans lequel les composés de nature peptidique ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait de germe de caroube pour augmenter l'expression des aquaglycéroporines et plus particulièrement de aquaglycéroporine 7. L'activité moléculaire caractéristique de l'invention est définie in vitro par la capacité de l'agent actif à augmenter l'expression des aquaglycéroporines, soit par l'augmentation de la synthèse protéique des aquaglycéroporines (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique des aquaglycéroporines), soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine aquaglycéroporine ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager.
Préférentiellement, selon la présente invention, Γ aquaglycéroporine est Γ aquaglycéroporine 7.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait de germe de caroube pour favoriser la lipolyse, le déstockage des lipides et la sortie du glycérol des adipocytes.
L'activité biologique caractéristique de l'invention est définie in vitro par la capacité de l'agent actif à diminuer la taille et le nombre de gouttelettes lipidiques dans les adipocytes.
La présente invention a encore pour objet une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'un extrait de germe de caroube (Ceratonia siliqua L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, pour obtenir un effet amincissant, et plus particulièrement pour diminuer les surcharges adipeuses localisées.
Avantageusement, l'extrait de germe de caroube est présent à une concentration comprise entre 0,0001 % et 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % du poids total de la composition, dans un milieu physiologiquement acceptable.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention L'agent actif peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.
Les compositions pour la mise en œuvre de l'invention pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydro-alcoolique ou huileuse; d'une émulsion huile-dans- eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles aussi peuvent se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.
Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol.
Ces compositions peuvent comprendre, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition utilisable pour réaliser l'invention peut comprendre, outre l'agent actif selon l'invention, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention. Selon l'invention, cet agent actif sera défini comme un « agent actif additionnel ».
Par exemple, le ou les agents actifs additionnels peuvent être choisi parmi : les agents antiâges, raffermissants, éclaircissants, hydratants, drainants, favorisant la microcirculation, agents pharmaceutiques, exfoliants, desquamants, stimulant la matrice extracellulaire, activant le métabolisme énergétique, antibactériens, antifongiques, apaisants, anti-radicalaires, anti-UV, anti-acnés, anti-inflammatoires, anesthésiques, procurant une sensation de chaleur, procurant une sensation de fraîcheur, amincissants. De tels agents additionnels peuvent être choisis dans les groupes comprenant : -la vitamine A et notamment l'acide rétinoïque, le rétinol, le rétinol proprionate, le rétinol palmitate,
- la vitamine B3 et plus particulièrement le niacinamide, le niconitate de tocophérol,
- la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, le panthénol,
- la vitamine C, notamment l'acide ascorbique, l'ascorbyl glucoside, l'ascorbyl tetrapalmitate, magnésium et sodium ascorbyl phosphate,
- les vitamines E, F, H, K, PP, le coenzyme Q10,
- les inhibiteurs de métalloproteinase, ou un activateur des TIMP,
- la DHEA, ses précurseurs et dérivés,
- les acides aminés tels que l'arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, méthionine et ses dérivés, composés acides aminés N-acyl,
- les peptides naturels ou de synthèse, incluant les, di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés lipophiles, isomères et complexés avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (e.g. cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres). Par exemple les peptides commercialement connus sous le nom MATRKYL®, ARGIRELINE®, COLLAXYL™, PEPTIDE VINCI 02™, CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™,
- les extraits peptidiques végétaux tels que extraits de soja, d'épeautre, de vigne, de colza, de lin, de riz, de maïs, de pois,
- les extraits de levures, les extraits d'Artemia Salina,
- l'acide déhydroacétique (DHA),
- les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle,
- l'acide salicylique et ses dérivés, les alpha- et bêta-hydroxyacides, les silanols,
- les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl- glucosamine, N-acetyl-D- glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acetyl galactosamine,
- les extraits de polyphénols, isoflavones, flavonoïdes, tels que les extraits de raisin, les extraits de pin, les extraits d'olives,
- les lipides tels que les céramides ou les phospholipides, les huiles d'origine animale, telles que le squalène ou le squalane ; les huiles végétales, telles que l'huile d'amandes douces, de coprah, de ricin, de jojoba, d'olive, de colza, d'arachide, de tournesol, de germes de blé, de germes de maïs, de soja, de coton, de luzerne, de pavot, de potiron, d'onagre, de millet, d'orge, de seigle, de carthame, de passiflore, de noisette, de palme, de noyau d'abricot, d'avocat, de calendula ; les huiles végétales éthoxylées, le beurre de karité,
- Tous écrans UV et filtres solaires, De façon particulièrement avantageuse, l'invention peut comprendre au moins un agent actif additionnel connus pour son action amincissante, inhibant la lipogénèse ou stimulant la lipolyse, tels que : ΓΑΜΡ cyclique et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase, l'extrait de centella asiatica, l'asiaticoside et l'acide asiatique, les méthyls xanthines, la théine, la caféine et ses dérivés, la théophylline, la théobromine, la forskoline, l'esculine et l'esculoside, les inhibiteurs d'ACE, le peptide Val-Trp, Γ inhibiteurs du neuropeptide Y, l'enkephaline, l'extrait de gingko biloba, l'extrait de dioscorea, la rutine, l'extrait de yerba mate, l'extrait de guarana, les oligosaccharides, les polysaccharides, la carnitine, l'extrait de lierre, l'extrait de fucus, l'extrait hydrolysé de Prunella vulgaris, l'extrait hydrolysé de Celosia cristata, l'extrait d'Anogeissus leiocarpus, l'extrait de feuilles de Manihot utilissima, la palmitoylcarnitine, la carnosine, la taurine, l'extrait de sureau, les extraits d'algue tel que l'extrait de Palmaria Palmata, le peptide de synthèse de séquence Arg-Gly-Ser-NH2> commercialisé sous le nom ATPeptide™, le peptide de synthèse de séquence Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln commercialisé sous le nom ATPeptide™.
La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.
Avantageusement, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques.
Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général, et plus particulièrement aux êtres humains.
Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif.
Figure 1 : Immuno -détection de l'aquaglycéroporine 7 dans les cellules 3T3-L1.
Figure 2 : Quantification de la taille des gouttelettes lipidiques dans des cellules 3T3-L1. Exemple 1 : Préparation d'un extrait peptidique de caroube (Ceratonia siliqua L.)
Le germe de caroube {Ceratonia siliqua L.) sous forme de poudre est mis en solution dans 70 volumes d'eau et le pH est ajusté à une valeur comprise entre 4,5 et 5,5.
Afin d'éliminer les sucres insolubles, une hydrolyse à l'aide d'une cellulase est réalisée. Pour cela, 2 % de celluclast CL® (Novozym) et 2 % de POLYCLAR® 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble) sont ajoutés dans le milieu réactionnel. Le milieu réactionnel est ensuite chauffé deux heures à 50°C puis désactivé une heure à 80°C. Une étape de filtration permet d'écarter le filtrat riche en carbohydrates pour ne conserver que le résidu solide.
Ce dernier est caractérisé par une teneur en protéines comprise entre 45 et 50 % et un taux de sucres compris entre 20 et 30 %.
Le résidu sec ainsi obtenu est mis en solution dans 100 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR® 10. Le mélange est ajusté à un pH compris entre 8,0 et 8,5 avec une solution aqueuse de soude à 2 M.
Afin d'améliorer l'extraction des protéines, une première hydrolyse est réalisée à l'aide de 2 % d'Alcalase® (novozym). L'hydrolyse est obtenue après 2 heures, sous agitation, à 55°C. On procède à l'inactivation de l'enzyme en chauffant la solution à 80°C pendant 2 heures. Après désactivation, le mélange réactionnel est filtré et le filtrat est recueilli. Il s'agit de l'extrait protéique intermédiaire de germe de caroube.
A ce stade de la préparation, les composés de nature peptidique et protéique de ce filtrat sont caractérisés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gels NuPAGE® Bis-Tris Pre- cast, Invitrogen). Pour cela, le filtrat est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE® LDS. Une solution de NuPAGE® antioxydante est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant Γ électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES en présence d'un standard de poids moléculaire (SeeBlue Plus2). La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie® R-250. Le profil protéique ainsi obtenu montre que les composés de nature peptidique et protéique du filtrat ont des poids moléculaires compris entre 50 et 10 kDa.
L'extrait protéique intermédiaire de germe de caroube est ensuite mis en solution dans 100 volumes d'eau en présence de 2 % de POLYCLAR® 10. Le mélange est ajusté à un pH compris entre 4 et 5 avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M.
Une étape d'hydrolyse des protéines est alors réalisée à l'aide d'une endoprotéase. Pour cela, de la bromélaïne à 2 % est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède à l'inactivation de l'enzyme en chauffant la solution à 80°C pendant 2 heures.
La purification de l'extrait ainsi obtenu se poursuit par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 μιη) afin d'obtenir une solution brillante et limpide. Après cette série de filtration, l'extrait de germe de caroube est caractérisé par un poids sec compris entre 20 et 25 g/kg, un taux de protéines compris entre 10 et 15 g/1, un taux de sucres compris entre 5 et 6 g/1, un taux d'acides aminés compris entre 1 et 2 g/1 et un taux de polyphénols totaux compris entre 0,5 et 1 g/1. Les protéines sont dosées par une méthode colorimétrique spécifique (méthode de Lowry)
Le profil protéique de cet extrait est analysé par gel d'électrophorèse. Dans les mêmes conditions que décrites précédemment, on observe 2 grandes familles de protéines : la 1ère famille, minoritaire, correspond à des protéines de poids moléculaire de 25 à 20 kDa et la 2ème famille, très majoritaire, correspond à des protéines de poids moléculaire inférieur à 5kDa.
Cet extrait est alors purifié en éliminant les protéines de poids moléculaire supérieur à 5 kDa par des étapes de filtrations à flux tangentiel. Pour cela, l'extrait de germe de caroube est pompé sous pression à travers un support Pellicon® équipée de cassette Pellicon® 2 Biomax 30 kDa. Le premier filtrat obtenu est récupéré pour être de nouveau filtré à travers une autre cassette Pellicon® 2 Biomax 5 kDa.
En fin de purification, on obtient un extrait de germe de caroube jaune-orangé, brillant et limpide. Il est caractérisé par un poids sec de compris entre 8 et 9 g/kg, une teneur en protéines comprise entre 6 et 7 g/1, un taux de sucres entre 0,3 et 0,5 g/1 et un taux de polyphénols totaux inférieur à 0,1 g/1.
On procède alors à une phase de dilution dans un mélange eau-glycérol afin d'obtenir un extrait peptidique caractérisé par un poids sec de 2 à 5 g/kg, et préférentiellement de 2,5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1,5 à 3,5 g/1, une concentration en sucres de 0,1 à 0,3 g/1 (soit inférieure à 15 %) et une concentration en polyphénols inférieure à 1 %.
Cet extrait purifié et dilué correspond à l'extrait peptidique de germe de caroube selon l'invention. Il est caractérisé par le fait que les composés de nature peptidique ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa, que la teneur en polyphénols est inférieure à 1 %.
Cette solution est alors analysée en chromatographie liquide haute pression à l'aide d'un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l'élution de l'extrait de caroube est une Nucleosil® 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn). Cette colonne permet d'analyser en chromatographie des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 25 kDa (selon un gradient de solvants approprié). Dans ces conditions chromatographiques, il a été isolé plusieurs fractions peptidiques. Ces diverses fractions ont été analysées par spectrométrie de masse afin d'identifier leurs pics moléculaires. La détermination de la composition en acides aminés a également été réalisée. Celle-ci est obtenue après hydrolyse acide et identification par chromatographie liquide haute pression à l'aide d'une pré-dérivation au PICT (phényl- isothiocyanate).
Exemple 2 : Evaluation de l'expression de l'aquaglycéroporine 7
Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait de caroube selon l'exemple 1 sur l'expression de l'aquaglycéroporine 7 dans des cellules adipocytaires différenciées 3T3-L1.
Protocole :
Culture et différenciation des cellules 3T3-L1 :
Les cellules adipocytaires 3T3-L1 sont cultivées en milieu DMEM 4,5 g/1 glucose, 2 mM Glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal.
2 jours après l'entrée en phase de confluence cellulaire, la différenciation des cellules 3T3 en adipocytes est induite par l'addition d'une solution de 0,5 mM d'IBMX, 1 μΜ de dexaméthasone et 10 \aglra\ d'insuline (Sigma, St Louis, MO, USA) dans le milieu de culture pendant 3 jours. Ensuite, seule l'insuline est maintenue pendant 3 à 4 jours de culture supplémentaire. Les cellules sont ensuite maintenues en culture, en milieu standard, pendant encore 3 jours.
Traitement :
Le traitement est réalisé dès le début de la phase d'induction de la différenciation par une application quotidienne, pendant 12 jours, soit de IX PBS (Lonza, Rockland USA) pour le contrôle non traité, soit d'extrait de germe de caroube de poids sec 2,5 g/kg, tel qu'obtenu à l'exemple 1, dilué à 1 % dans du PBS. Un contrôle positif est réalisé par un traitement de 5 heures avec de l'isoprotérénol à 10 μΜ, qui est un agoniste des récepteurs adrénergiques., provoquant une lipolyse très rapide.
Immuno-marquage de l'aquaglycéroporine 7 :
Les cellules sont lavées 3 fois par du IX PBS (Lonza, Rockland, USA) et fixées par 3,7 % de formaldéhyde (Sigma Aldrich, USA) pendant 10 min à température ambiante. Les membranes cellulaires sont perméabilisées par de l'acétone pendant 4 min à -20°C. Les sites non spécifiques sont saturés par de la sérum albumine bovine à 3 % (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), pendant 15 min. L'anticorps primaire (rabbit polyclonal anti- aquaglycéroporine 7, Santa Cruz Biotechnology) diluted at 1/100) est appliqué pendant 1,5 heure. Après plusieurs rinçages, un second anticorps, couplé à la sonde Alexa Fluor 488 (Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit (Invitrogen, Fisher) diluée au 1/1000) est appliqué pendant 1 heure. Les lames sont ensuite montées dans du Fluoromount G (Electron Microscopy Science, Hatfield, UK).
Les cellules sont examinées au microscope Nikon Eclipse 80i, à l'objectif 40X, et les photos sont réalisées à l'aide d'un appareil Nikon Digital DXM1200C.
3 images par condition sont analysées à l'aide du logiciel Image-Pro Analyzer 6.3. La somme des intensités lumineuses est ajustée par rapport au nombre de cellules (Me Mullen and coll., 2010).
L'analyse statistique utilise un Student t-test pour données non appariées, dans lequel P<0,05 est considéré comme significatif; P<0,01 comme très significatif, et P<0,005 comme hautement significatif.
Résultats :
Les observations microscopiques montrent une fluorescence plus forte dans les cellules 3T3-L1 différenciées traitées par l'extrait de germe de caroube à 1 %. Les analyses quantitatives montrent une augmentation de 18,7 % par rapport au contrôle non traité, comme cela est illustré par la figure 1.
Conclusion :
L'extrait de caroube selon l'exemple 1 à 1 % provoque une augmentation significative de l'expression de l'aquaglycéroporine 7 dans des cellules adipocytaires différenciées 3T3-L1.
Exemple 3 : Evaluation des gouttelettes lipidiques contenues dans les adipocytes
Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait de caroube selon l'exemple 1 sur la taille et le nombre de gouttelettes lipidiques contenues dans les cellules adipocytaires différenciées 3T3-L1.
Protocole :
La culture, la différenciation des cellules 3T3-L1, puis le traitement par les composés à tester sont réalisés comme dans l'exemple 2.
Détection des lipides par le Rouge du Nil
La détection des lipides est réalisée à l'aide du colorant fluorescent Rouge du Nil, une phénoxazone qui marque intensément les lipides intracellulaires La couleur de la fluorescence observée est directement dépendante de l'hydrophobicité du milieu environnant. Cette propriété spécifique du Rouge du Nil permet de différencier les lipides neutres, marqués en jaune doré, des phospholipides, marqués en rouge.
Les cellules sont fixées par une solution de formaldéhyde à 3,7 % pendant 10 minutes, puis marquées par une solution de Rouge du Nil à 100 nM dans du PBS pendant 10 minutes, et enfin rincées dans du PBS.
Les cellules sont examinées au microscope à fluorescence. La quantification et l'analyse statistique sont réalisées de la même manière qu'à l'exemple 2.
Résultats :
L'intensité du marquage au Rouge du Nil, la taille et le nombre des gouttelettes dans les cellules 3T3-L1 différenciées traitées par l'extrait de caroube selon l'exemple 1 à 1 % est diminuée par rapport aux cellules non traitées.
Les analyses quantitatives montrent une diminution de 35,6 % de l'intensité du marquage, une diminution de 21,7 % de la taille de gouttelettes et de 29 % du nombre de gouttelettes par rapport aux cellules non traitées. Ceci est illustré par la figure 2.
Conclusion :
L'extrait de caroube selon l'exemple 1 à 1 % provoque une diminution significative de la taille et du nombre de gouttelettes lipidiques dans des cellules adipocytaires différenciées 3T3- Ll.
Exemple 4 : Préparation de compositions
1 Crème amincissante
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Colorant Qsp
Mode opératoire
Les constituants de la phase A sont fondus à 75°C et les constituants de la phase B chauffés à 75°C. La phase A est émulsionnée à B, puis le mélange est refroidi en dessous de 40°C. Les phases C et D sont ensuite additionnées sous agitation constante.
2 Spray Raffermissant - Amincissant
Figure imgf000018_0002
Noms commerciaux Noms INCI % massique
Parfum Parfum (Fragrance) qsp
Colorant qsp
Mode opératoire
Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément à 65°C ; la phase B est incorporée à la phase A sous agitation. La température du mélange est montée à 83°C puis il est refroidi jusqu'à la température d'inversion de phase. La phase C est ensuite additionnée. La phase D est incorporée lorsque la température atteint moins de 40°C.
3 Gel Raffermissant - Amincissant - Anti-cellulite
Figure imgf000019_0001
Mode opératoire
Le carbopol est dispersé dans l'eau jusqu'à parfaite hydratation. Les ingrédients sont ensuite ajoutés dans l'ordre énuméré ci-dessus, sous agitation. Le mélange est ensuite neutralisé avec la TEA. Le parfum et les colorants sont ajoutés si nécessaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation cosmétique d'un extrait de germe de caroube (Ceratonia siliqua L.) en tant qu'agent amincissant.
2. Utilisation cosmétique selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait de germe de caroube est dilué dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, choisi parmi l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.
3. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle l'extrait de germe de caroube contient entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés de nature peptidique.
4. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'extrait de germe de caroube est extrait peptidique dans lequel les composés de nature peptidique ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa.
5. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle que l'extrait de germe de caroube provoque une augmentation de l'expression des aquaglycéroporines et plus particulièrement de l'aquaglycéroporine 7.
6. Utilisation cosmétique selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle que l'extrait de germe de caroube favorise la lipolyse, le déstockage des lipides et la sortie du glycérol des adipocytes.
7. Méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'un extrait de germe de caroube (Ceratonia siliqua L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, pour obtenir un effet amincissant, et plus particulièrement pour diminuer les surcharges adipeuses localisées.
8. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 7 dans laquelle l'extrait de germe de caroube, tel que décrit dans l'une des revendications 1 à 4, est présent à une concentration comprise entre 0,0001 % et 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % du poids total de la composition.
9. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications 7 ou 8 dans laquelle la composition comprend, en outre, au moins un agent actif additionnel choisi parmi la vitamine A, l'acide rétinoïque, le rétinol, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, la vitamine C, la vitamine E, la vitamine F, la vitamine H, la vitamine K, la vitamine PP, le coenzyme Q10, les inhibiteurs de métalloproteinase, les acides aminés, la carnitine, la carnosine, la taurine, les peptides naturels ou de synthèse, les extraits peptidiques végétaux, les extraits de levures, les extraits d'Artemia Salina, les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle, l'acide salicylique, les oligosaccharides, les polysaccharides, les sucres aminés, les polyphénols, les flavonoïdes, les lipides, les phospholipides, ΑΜΡ cyclique et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase, les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase, la théine, la théophylline, la théobromine, la forskoline, l'esculine, les inhibiteurs d'ACE, l'extrait de dioscorea, l'extrait de guarana, l'extrait de lierre, l'extrait de fucus, les extraits d'algues tels que Palmata Palmaria, l'extrait hydrolysé de Prunella vulgaris ou l'extrait de sureau.
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