FR3054132A1

FR3054132A1 - Utilisation d’une combinaison d’hydrolysat peptidique de mais, de derive de vitamine c, de carnitine et d’adenosine pour augmenter la densite capillaire

Info

Publication number: FR3054132A1
Application number: FR1670396A
Authority: FR
Inventors: Catherine Gondran; Corinne Coquet; Armelle Perrin
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: FR3054132B1

Abstract

L'invention concerne l'utilisation cosmétique d'une combinaison d'agents actifs comprenant un hydrolysat peptidique de maïs, de la vitamine C ou un de ses dérivés, de la carnitine et de l'adénosine pour stimuler ou restaurer la densité capillaire, stimuler la pousse du cheveu et des cils et ralentir la chute du cheveu et des cils. L'invention porte encore sur un procédé de soin cosmétique destiné à lutter contre le vieillissement du cheveu et protéger le cheveu des agressions extérieures. L'invention concerne également la combinaison d'agents actifs pour son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu, dans le cadre d'un traitement préventif ou curatif de la perte de cheveux liée à un état pathologique.

Description

Titulaire(s) : ISP INVESTMENTS INC.

Demande(s) d’extension

Mandataire(s) : CABINET ASHLAND SPECIALTIES FRANCE.

UTILISATION D'UNE COMBINAISON D'HYDROLYSAT PEPTIDIQUE DE MAIS, DE DERIVE DE VITAMINE C, DE CARNITINE ET D'ADENOSINE POUR AUGMENTER LA DENSITE CAPILLAIRE.

FR 3 054 132 - A1 (5/) L'invention concerne l'utilisation cosmétique d'une intensité de l'immunomarquage du Versican dans des sphères de cellules de papilles combinaison d'agents actifs comprenant un hydrolysat peptidique de maïs, de la vitamine C ou un de ses dérivés, de la carnitine et de l'adénosine pour stimuler ou restaurer la densité capillaire, stimuler la pousse du cheveu et des cils et ralentir la chute du cheveu et des cils. L'invention porte encore sur un procédé de soin cosmétique destiné à lutter contre le vieillissement du cheveu et protéger le cheveu des agressions extérieures. L'invention concerne également la combinaison d'agents actifs pour son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu, dans le cadre d'un traitement préventif ou curatif de la perte de cheveux liée à un état pathologique.

* significatif, *** hautement significatif après test de Student n=5-6

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UTILISATION D’UNE COMBINAISON D’HYDROLYSAT PEPTIDIQUE DE MAÏS, DE DERIVE DE VITAMINE C, DE CARNITINE ET D’ADENOSINE POUR

AUGMENTER LA DENSITE CAPILLAIRE

Domaine de l’invention

La présente invention concerne un nouvel agent actif cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment dermatologique, se présentant sous la forme d’une combinaison d’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine et son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu.

Arrière plan de l’invention

La croissance des cheveux et leur renouvellement sont principalement déterminés par l'activité des follicules de cheveu et de leur environnement matriciel.

Le follicule de cheveu est une annexe cutanée autonome complexe qui comporte six grands compartiments, les uns d’origine dermique (gaine conjonctive et papille dermique), les autres de nature épithéliale (gaines épithéliales interne et externe, tige pilaire et sébacée). A la base du follicule se trouve la matrice, siège d’une activité mitotique intense, à l’origine des 3 couches concentriques du cheveu constitué essentiellement de kératine.

Le follicule de cheveu se renouvelle in situ de façon cyclique et asynchrone à partir d'un double réservoir de cellules souches, selon un cycle d’activité qui comprend trois phases : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène.

La phase anagène (phase de croissance) dure de un à dix ans et se caractérise par l’allongement constant du cheveu. Cette phase est contrôlée par la papille dermique qui exprime fortement le versican, un protéoglycane qui intervient dans la maintenance de la phase anagène (Soma T. et al. Hair cycle-specific expression of versican in human hair follicles. Journal of Dermatological Science (2005) 39, 147—154) ainsi que la protéine noggin qui joue un rôle dans l’initiation de cette phase (Botchkarev VA et al. Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin. FASEB J. 2001 Oct;15(12):2205-14). Durant cette phase, les cellules de la papille dermique envoient des signaux aux cellules de la matrice qui correspond à la zone proliférative du follicule pileux. Ces dernières se multiplient alors pour donner les cellules des différents compartiments épithéliaux et expriment à ce moment là des marqueurs de prolifération tel que la protéine Ki67 (Miyauchi S. et al. The innermost cell layer of the outer root sheath is positive with

Ki-67. J Invest Dermatol. 1990; 95(4):393-6) ou de communication cellulaire tel que l’intégrine βΐ (Kloepper JE et al. Functional rôle of βΐ integrin-mediated signalling in the human hair follicle. Experimental Cell Research. 2008; 3 1 4:49 8-5 0 8).

La phase catagène qui succède est très transitoire et dure quelques semaines. Elle semble initiée par certains facteurs tels l’EGF, le TGF bêta (Foitzik et al. 2000, FASEB J. 14(5):752-60), ou encore la protéine p53 qui est transitoirement surexprimée (Botchkarev et al., 2001, Am. J. Pathol. 158(6): 1913-1919). Au cours de cette phase, les cellules du follicule subissent un processus actif d’apoptose, le follicule s'atrophie et se rétracte vers la surface, à l’exception notoire de la papille dermique qui sera l’élément-clé de la future régénération.

La phase terminale ou phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une phase de repos du follicule à la fin de laquelle le cheveu finit par tomber. A la fin de cette période de repos, un nouveau follicule est régénéré et un nouveau cycle démarre.

Il est par ailleurs bien décrit que les mécanismes de différenciation des kératinocytes de l'épiderme et du follicule de cheveu sont sensiblement différents. Ainsi, il est connu que les kératines de la tige pilaire représentent une famille de kératines distincte de celle exprimée dans l'épiderme (Langbein et al., 2001, J. Biol. Chem. 276), ainsi la kératine K71 (Porter et al., 2001, Br. J. Dermatol. 145: 558-568) est exprimée dans la gaine interne du follicule pileux mais pas dans l'épiderme, alors que les marqueurs de différenciation épidermiques tels que les kératines Kl et K10 ne sont pas exprimés dans le follicule pileux (Lenoir et al., 1988, Dev. Biol. 130: 610-620).

La chute ou perte naturelle des cheveux peut être estimée, en moyenne, à une centaine de cheveux par jour pour un état physiologique normal. Ce processus de renouvellement permanent peut être perturbé par de nombreux facteurs extrinsèques et intrinsèques, entraînant une perte importante, temporaire ou définitive, des cheveux que Ton regroupe sous le terme générique d’alopécie.

Comme le reste de l’organisme, le processus de renouvellement physiologique permanent des cheveux est soumis au vieillissement. Si le signe le plus visible du vieillissement du cheveu est le blanchiment, la qualité de l’environnement biologique du follicule du cheveu est également affectée. Parmi les manifestations du vieillissement du derme environnant, on observe une moindre synthèse des protéines de la matrice extracellulaire (collagène, laminine, fibronectine), provoquant une perte d'élasticité et de tonicité du tissu sous-cutané. Il y a également une diminution de la densité capillaire associée à une diminution progressive du diamètre des follicules, une diminution de la durée de la phase anagène et un allongement de la durée de la phase télogène (Courtois et al., 1995, Br. J. dermatol., 132 : 86-93). Le follicule pileux produit une fibre capillaire de plus en plus fine et donc plus fragile. Au niveau de l’ensemble du cuir chevelu, le vieillissement se manifeste par une chevelure ayant un aspect plus pauvre, plus clairsemé (Pelfini, C. et al., J. Méd. Esth. Et Chir. Derm.1987 ; Birch MP et al. Br. J. Dermatol 2001;144:297-304).

Indépendamment du vieillissement intrinsèque, des altérations du cheveu ou du follicule de cheveu peuvent se produire lors d’agressions extérieures. En effet, si le cheveu est d'une remarquable stabilité, certains facteurs extérieurs, tels que la lumière solaire, responsable du photo-vieillissement, les radicaux libres, la pollution ou encore certains traitements inappropriés peuvent aboutir à une détérioration prématurée de la structure des cheveux et à un épuisement des follicules.

L'industrie cosmétique ou pharmaceutique recherche toujours des compositions permettant de supprimer ou de réduire la perte ou de stimuler la croissance des cheveux. Comme molécule connue, on peut citer le 2,4-diamino 6-piperidinopyrimidine 3-oxyde ou minoxidil (brevets US 4 139 619 et US 4 596 812). Un autre document brevet de Shiseido (JP 07316023) décrit également l'utilisation de l'arginine et de ses dérivés dans le traitement de l'alopécie. Enfin, le document EP 1885323 décrit l'utilisation d'un peptide de synthèse pour stimuler la pousse des cheveux.

Toutefois, certains produits disponibles présentent des effets secondaires, comme c’est le cas pour le minoxidil, ou ont une efficacité relative et circonscrite à la durée du traitement. Aussi, il subsiste le besoin d'une nouvelle composition physiologiquement adaptée pour favoriser la croissance des cheveux et/ou réduire leur chute, présentant une action rapide et durable dans le temps.

Il est connu du document de brevet WO 2011055033 que des extraits peptidiques de maïs ont des effets bénéfiques sur la peau (FR 2904543, FR2915382, FR2925326) et sur la chute des cheveux.

D’autre part, il est connu que l’adénosine, utilisée à des concentrations de 100 μΜ à 400 pM stimule l’activité de la papille dermique (Hwang et al, Adenosine stimulâtes growth of dermal papilla and lengthens the anagen phase by increasing the cysteine level via fibroblast growth factors 2 and 7 in an organ culture of mouse vibrissae hair follicles, International Journal of Molecular Medecine 29: 195-201, 2012).

Il est également connu que des dérivés de camitine, tels que la L-carnitine-L-tartrate peuvent avoir un effet activateur de la pousse du cheveu (Kerstin Foitzik, Indications that topical L-carnitin-L-tartrate promûtes human haïr growth, Journal of Dermatological Science (2007) 48, 141—144).

De plus, il est connu qu’un dérivé de vitamine C utilisé à la concentration de 50 μΜ stimule la pousse du cheveu en stimulant l’activité de la papille dermique (Kim SR et al. Induction of versican by ascorbic acid 2-phosphate in dermal papilla cells. J Dermatol Sci. 2006 Jul;43(l):60-2 ; Kwack MH et al. 1-Ascorbic acid 2-phosphate promûtes élongation of hair shafts via the sécrétion of insulin-like growth factor-1 from dermal papilla cells through phosphatidylinositol 3-kinase. Br J Dermatol. 2009 Jun;160(6):l 157-62 ; Sung YK et al. Transcriptional activation of CCN1 and CCN2, targets of canonical Wnt signal, by ascorbic acid 2-phosphate in human dermal papilla cells. J Dermatol Sci. 2008 Mar;49(3):256-9).

Néanmoins, il existe un besoin constant dans les domaines de la cosmétique et de la dermato-cosmétique de mettre à disposition de nouveaux ingrédients actifs.

A la connaissance de la demanderesse aucune combinaison relative à l’invention n’avait encore été décrite, en particulier aux concentrations respectives de chaque ingrédient entrant dans la combinaison. En effet, les inventeurs ont maintenant mis en évidence qu’une combinaison d’agents actifs constituée d’un hydrolysat peptidique de maïs (Zea maysL.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine a une activité sur le follicule de cheveu.

Le but de la présente invention est de fournir un nouvel agent actif cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment dermatologique, se présentant sous la forme d’une combinaison d’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine et son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu.

En effet, les inventeurs ont mis en évidence que la combinaison selon l’invention permettait de stimuler le follicule de cheveu, en particulier d’augmenter la phase anagène de croissance du follicule, ce qui se manifeste par l’élongation du cheveu dans un système de culture ex vivo. Au niveau moléculaire la combinaison selon l’invention provoque l’augmentation de l’expression des molécules de la papille dermique telles que le versican et noggin, l’augmentation de l’expression des protéines membranaires impliquées dans les interactions entre les kératinocytes (interactions cellules-cellules) et entre les kératinocytes et la matrice extracellulaire (interactions cellule-matrice), telle que l’intégrine βΐ, et par l’augmentation de l’expression de marqueurs intracellulaires de la phase anagène, tels que le marqueur de prolifération Ki67.

Cette combinaison présente une activité synergique inattendue, ainsi les concentrations respectives de chaque ingrédient entrant dans la combinaison sont très inférieures aux concentrations actives décrites dans l’art antérieur ;

Un autre avantage de la combinaison est qu’elle est facilement formulable dans des préparations pour application topique ou administration orales et peut être facilement produite à l’échelle industrielle.

Exposé de l’invention

Ue premier objet de la présente invention est une combinaison d’un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays Lf de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine, dans laquelle l’hydrolysat peptidique de maïs est obtenu par hydrolyse enzymatique, comprend des composés de nature peptidique de poids moléculaire inférieur à 5 kDa, a un poids sec de 2 à 5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1 à 5 g/kg, et préférentiellement de 1,5 à 3,0 g/kg et une concentration en sucres de 0,05 à 1 g/kg et préférentiellement de 0,1 à 0,3 g/kg.

Dans le cours de l’exposé de l’invention, on entend par « hydrolysat peptidique », un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des oligopeptides.

On entend par « combinaison » au sens de l’invention, l’association synergique de plusieurs ingrédients actifs pour renforcer l’action biologique, cosmétique ou pharmaceutique.

Au sens de l’invention, on entend par dérivé de vitamine C, tous les sels de l’acide ascorbique et notamment le U-ascorbate de sodium (CAS number 134-03-2), le U-ascorbate de calcium (CAS number 5743-28-2), le U-ascorbate de fer (CAS number 24808-52-4), l’ascorbate de magnésium (CAS number 15431-40-0) mais également d’autres dérivés d’ions métalliques de la vitamine C tels que l’ascorbyl-phosphate de sodium (CAS number : 66170-10-3) ou l’ascorbyl-phosphate de magnésium (CAS number 113170-55-1).

Dans le cours de l’exposé de l’invention, on entend par « combinaison d’agents actifs pour « augmenter et/ou restaurer la densité capillaire, la pousse du cheveu, ou limiter la chute du cheveu», que la combinaison constituée d’un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine est capable de stimuler le follicule de cheveu, c'est-à-dire d’augmenter l’expression des principales molécules de la papille dermique telles que le versican ou noggin, et des principaux marqueurs membranaires de la phase anagène du follicule de cheveu, tels que l’intégrine βΐ et le marqueur de prolifération Ki67, permettant ainsi une prolongation et/ou une stimulation de la phase anagène du cycle de croissance du cheveu.

Les tests comparatifs réalisés entre un hydrolysat peptidique de maïs seul et la combinaison de l’invention montrent une efficacité très sensiblement supérieure de la combinaison selon l’invention, démontrant ainsi l’efficacité synergique des constituants de ladite combinaison.

Selon un mode de réalisation préférée, l’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) est obtenu selon le procédé décrit dans les documents de brevet publiés sous les numéros WO2011055033 etFR2951948.

Ainsi, selon le procédé décrit dans le document de brevet FR2951948, l’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) est obtenu par extraction de protéines, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des composés de nature peptidique.

On entend par « composés de nature peptidique », les fragments de protéines et les peptides présents dans l’hydrolysat peptidique de maïs après hydrolyse.

Selon un mode de réalisation préférée, le matériel végétal utilisé sera le grain et préférentiellement le grain débarrassé de son enveloppe par une étape de décorticage, sans fermentation préalable.

Dans une première étape, les graines sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être délipidée à l'aide d'un solvant organique classique, comme par exemple un alcool, de l’hexane ou de l'acétone.

Le broyât de plante peut ensuite être mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant polymérique de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 % - 20%), ce dernier favorisant les opérations d’hydrolyses et de purifications ultérieures et réduisant la concentration en substances de type phénoliques qui interagissent avec les protéines.

La fraction soluble, contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des peptides. L’hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d’une molécule par de l’eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l’invention, l’hydrolyse est réalisée de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques choisies parmi les endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) ou de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, alcalase® de Novozym, etc.).

Après cette étape d’hydrolyse ménagée, au moins une filtration est réalisée pour permettre d’éliminer les enzymes ; Le filtrat (solution) obtenu est encore purifié afin de sélectionner les composés de nature peptidique de poids moléculaire inférieur à 10 kDa. Le fractionnement peut s’effectuer avantageusement par des étapes d’ultrafiltrations successives à travers des filtres de porosité décroissante, en conservant les filtrats à chaque étape. Après cette étape, la majorité des composés de nature peptidique contenus dans l’hydrolysat, et préférentiellement 100 % d’entre eux, ont un poids moléculaire inférieur à 5 kDa.

L’hydrolysat peptidique de maïs ainsi obtenu est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés de nature peptidique. Les peptides et les fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l’homme du métier.

On procède à une phase de dilution dans de l'eau ou dans tout mélange de solvants contenant de l'eau, afin d’obtenir un hydrolysat peptidique de maïs caractérisé par un poids sec de 2 à 5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1 à 5 g/kg, et préférentiellement de 1,5 à 3,0 g/kg et une concentration en sucres de 0,05 à 1 g/kg et préférentiellement de 0,1 à 0,3 g/kg. Les solvants utilisés sont physiologiquement adaptés et classiquement utilisés par l’homme du métier, choisis parmi le glycérol, l’éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.

Préférentiellement l’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) de la combinaison est en solution dans un mélange eau - glycérol.

Encore plus préférentiellement l’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) de la combinaison est en solution dans un mélange 30 % glycérol dans l’eau.

Préférentiellement la combinaison de l’invention comprend de 0,2 % à 0,5 % et préférentiellement 0,5 % d’hydrolysat de maïs.

Les autres composants de la combinaison selon l’invention sont utilisés préférentiellement sous forme de poudre et sont incorporés par simple solubilisation dans l’hydrolysat peptidique de maïs, pour préparer la combinaison.

La vitamine C ou ses dérivés peuvent être choisis parmi la vitamine C ou un de ses sels et notamment le L-ascorbate de sodium (CAS number 134-03-2), le L-ascorbate de calcium (CAS number 5743-28-2), le L-ascorbate de fer (24808-52-4), le L-ascorbate de magnésium (CAS number 15431-40-0) mais également d’autres dérivés d’ions métalliques de la vitamine C tels que le L-ascorbyl phosphate de sodium (CAS number : 66170-10-3) ou le L-ascorbyl-2-phosphate de magnésium (CAS number 113170-55-1).

Préférentiellement le dérivé de vitamine C est le L-ascorbyl-2-phosphate de magnésium, qui est une forme particulièrement stable de dérivé de vitamine C. Il est ajouté en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale comprise entre 0,50 % et 1,5 %, préférentiellement une concentration de 0,58 %.

La camitine est préférentiellement sous la forme L-carnitine. Elle est ajoutée en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale comprise entre 0,0001 % et 0,01 %, préférentiellement une concentration de 0,00081 %.

L’adénosine est ajoutée en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale comprise entre 0,05 % et 0,30 %; préférentiellement une concentration de 0,13 %.

Avantageusement, des conservateurs peuvent être ajoutés, comme par exemple 0,5 % de sodium benzoate.

Selon un mode préféré de l’invention la combinaison comprend 0,5 % d’hydrolysat peptidique de maïs, 0,13 % d’adénosine, 0,58 % de L-ascorbyl-2-phosphate de magnésium, 0,00081 % de L-camitine, dans un mélange glycérol-eau ayant un ratio de respectivement 30 % de glycérol pour 70 % d’eau.

La combinaison d’un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.J de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine, selon l'invention est une combinaison cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment dermatologique. Elle peut être administrée par voie orale, notamment sous forme de gélules, ou sous forme topique. Elle est oralement et/ou topiquement acceptable.

La combinaison d’agents actifs peut être encapsulée ou incluse dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique tels que les liposomes ou toute autre microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbée sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.

Le 2eme objet de l’invention est une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant la combinaison et un milieu physiologiquement adapté.

Selon un mode de réalisation avantageux, la combinaison est présente dans les compositions de l'invention à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 %, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 % et 2,5 % par rapport au poids total de la composition finale et encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,5 % et 1,5 %.

Les compositions utilisables selon l'invention peuvent se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-danshuile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l’aspect d’une crème, d’une lotion, d’un lait, d’un sérum, d’une pommade, d’un gel, d’une pâte ou d’une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la zone à traiter sous forme d’aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau.

L’ensemble de ces compositions comprend, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des co-solvants (éthanol, glycérol, alcool benzylique, humectants...), des épaississants, des diluants, des émulsionnants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, des huiles essentielles, des oligo-éléments, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales etc. On peut par exemple citer des polymères hydrosolubles de type polymère naturel, tels que les polysaccharides, ou polypeptides, des dérivés cellulosiques de type méthylcellulose ou hydroxypropylcellulose, ou encore des polymères synthétiques, polaxamères, carbomères, PVA ou PVP et notamment les polymères vendus par la société Ashland.

Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l’invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à une concentration allant de 0,01 % à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l’invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 % à 80 % en poids et de préférence de 5 % à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.

Les compositions utilisables selon l'invention peuvent en particulier consister en un shampooing, un après-shampooing, une lotion traitante pré- ou post- traitement agressif pour les cheveux, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, ίο un masque, etc. La composition peut également se présenter sous forme de mascara pour une application sur les cils, les sourcils ou les cheveux.

Avantageusement, la composition selon l'invention peut contenir, outre la combinaison selon l’invention, au moins un autre agent actif ayant des propriétés protectrices ou améliorant la pousse et/ou la santé des cheveux. On peut citer, de manière non limitative, les ingrédients suivants : des vitamines, des agents anti-radicalaires, anti-UV, d’autres extraits peptidiques végétaux, le minoxidil, des esters de l'acide nicotinique, des agents antiinflammatoires, de l'acide rétinoïque ou ses dérivés, du rétinol, des inhibiteurs de la 5 alpharéductase ou encore des composés peptidiques de synthèse.

La composition selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale ou topique, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques.

Au sens de la présente invention, on entend par « physiologiquement adapté, oralement et/ou topiquement acceptable », une combinaison adaptée à une application par voie orale et/ou topique, non toxique, non irritante pour la peau et/ou les muqueuses et/ou le cuir chevelu, n'induisant pas de réponse allergique, et qui n'est pas instable sur le plan chimique. Au sens de la présente invention, on entend par « application par voie topique » de la combinaison ou d’une composition la comprenant, l'application locale directe et/ou la vaporisation à la surface de la peau et/ou des muqueuses et/ou le cuir chevelu et/ou les zones de peau pourvues de pilosité.

Avantageusement, les compositions selon l'invention sont destinées à une administration par voie topique.

Le troisième objet de l’invention est Tutilisation cosmétique de la combinaison selon l’invention.

Au sens de cette forme de l’invention on entend par « utilisation cosmétique », une utilisation non thérapeutique, c'est-à-dire qui n’est pas destinée à un usage thérapeutique pour traitement.

L'utilisation selon la présente invention vise donc des parties du corps et/ou des cellules saines. On entend par « des parties du corps saines » des parties de corps « normales », c'est-à-dire qualifiées de non pathologiques par un médecin, qui ne nécessitent pas de traitement thérapeutique, qui ne présentent pas d'infection, de maladie ou d’affection cutanée telle que candidose, impétigo, psoriasis, eczéma, acné ou dermatite. On entend par « cellule saine » une cellule « normale », c'est-à-dire non pathologique, notamment non cancéreuse et qui ne nécessite pas de traitement thérapeutique.

Ainsi, l’invention a pour objet l’utilisation cosmétique de la combinaison selon l’invention ou d’une composition la comprenant pour stimuler le follicule pileux, augmenter l’expression du versican, de noggin, de l’intégrine βΐ et de Ki67.

Ainsi l’invention a encore pour objet l’utilisation cosmétique de la combinaison ou d’une composition la comprenant pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu, ou encore limiter, ralentir ou prévenir la chute du cheveu.

Selon cette forme de l’invention, le terme « cheveu » inclut toutes les fibres kératiniques humaines et notamment les cheveux, mais inclut également les sourcils, les cils, les poils de barbe, de moustache, les poils pubiens d’individus sains. Plus spécialement, l'invention s'applique aux cheveux et/ou aux cils d’êtres humains sains.

Ainsi un mode particulier de réalisation de l’invention est l’utilisation de la combinaison selon l’invention pour stimuler la pousse des cils, ou lutter contre la chute des cils, d’individus sains.

On entend par augmenter la densité capillaire, une augmentation du diamètre de la tige pilaire qui est proportionnel au diamètre du follicule ainsi qu’une augmentation du nombre de tiges pilaires présentes sur le cuir chevelu ou tout autre zone de peau pourvue de pilosité par unité de surface (c'est-à-dire un ratio élevé du nombre de cheveux en phase anagène par rapport au nombre de cheveu en phase télogène)

On entend par follicule pileux, tout follicule qui donne une tige pilaire, quelque soit sa taille. Ceci comprend les cheveux et les poils présents sur différentes zones du corps, que ce soit le duvet, les cils, les sourcils, la barbe, la moustache, les poils pubiens, les poils axillaires,...

Par ailleurs l’invention a pour objet l’utilisation cosmétique de la combinaison ou d’une composition la comprenant pour renforcer les ongles ou stimuler leur croissance.

Le quatrième objet de l’invention concerne un procédé de soin cosmétique destiné à protéger le cheveu des agressions extérieures et à lutter contre les signes de vieillissement du cheveu et du cuir chevelu, caractérisé en ce que l’on applique topiquement sur la zone à traiter la composition selon l’invention.

Au sens de cette forme de l’invention on entend par « procédé de soin cosmétique », un procédé non thérapeutique. Autrement dit que la présente invention vise des parties du corps et/ou des cellules saines. Selon cette forme de l’invention, les zones à traiter sont notamment le cuir chevelu, les sourcils, les cils, les poils de barbe, de moustache, les poils pubiens d’individus sains.

Comme le reste de l’organisme, le processus de renouvellement physiologique permanent des cheveux est soumis au vieillissement. Parmi les signes de vieillissement particulièrement ciblés par la composition selon l’invention, on peut citer : l’amélioration de l’environnement biologique du follicule pileux, l’augmentation de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire, l’augmentation de la densité capillaire et de la pousse du cheveu.

On entend par l’expression « agression extérieure », les agressions que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer la pollution, la lumière solaire, les rayons ultraviolets ou encore les produits à caractère irritant tels que les produits chlorés, les tensioactifs trop détergents, ou encore les traitements tels que les colorations et décolorations, permanentes ou défrisages trop fréquents ou encore les agressions mécaniques telles que le frottement des vêtements, les coiffures provoquant des étirements répétés, le brossage trop intense, les brushings, le séchage à l’air trop chaud. Par pollution, on entend aussi bien la pollution « extérieure » due par exemple aux particules de diesel, à l’ozone ou aux métaux lourds, que la pollution « intérieure » qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldéhyde), ou bien encore la fumée de cigarette. Ces agressions extérieures aboutissent à une altération de la structure externe du cheveu et de ses propriétés mécaniques, mais peuvent aussi affecter le follicule de cheveu et provoquer un vieillissement prématuré.

Les effets des agressions extérieures sur le cheveu ou le follicule pileux incluent, sans y être limités, les dommages oxydatifs ou nitrosatifs, la modification des lipides, hydrates de carbone, peptides, protéines, acides nucléiques et vitamines. Les effets des agressions extérieures incluent aussi la diminution de la viabilité cellulaire ou la modification des fonctions cellulaires et les modifications géniques ou de l’expression des protéines.

Le cinquième objet de l’invention est une combinaison d’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de camitine et d’adénosine pour la réalisation d’une composition pour son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu, dans le cadre d’un traitement préventif ou curatif de la perte de cheveux liée à un état pathologique.

Parmi les états pathologiques fréquemment responsables de la perte de cheveux, on peut citer la pelade, les effets secondaires de traitements médicamenteux, certaines infections ou inflammations du cuir chevelu (le psoriasis, la dermatite séborrhéique, etc.).

La perte de cheveux de diverse origine peut également être qualifiée d’alopécie.

Ainsi, une forme particulière de l’invention concerne une combinaison d’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de carnitine et d’adénosine pour la réalisation d’une composition pour son utilisation pour lutter contre l’alopécie.

L’alopécie recouvre un ensemble d'atteintes du follicule pileux ayant pour conséquence finale la perte transitoire ou définitive, partielle ou générale des cheveux. La forme d’alopécie la plus répandue est l’alopécie androgénique qui affecte le plus souvent des individus sains, sans lien avec une quelconque pathologie. Les hommes comme les femmes peuvent être atteints d’alopécie, mais les zones préférentiellement touchées chez les hommes sont les golfes temporaux ou frontaux, alors que chez les femmes, on constate une alopécie diffuse du vertex. L’alopécie de traction se rencontre principalement chez les personnes d'origine africaine et sont liées aux habitudes de coiffure qui provoquent des tractions répétées sur le follicule. On peut encore citer l'alopécie cicatricielle centrale centrifuge, atteignant les personnes d'origine africaine, et ayant une origine inflammatoire.

Selon cette forme de l’invention, le terme « cheveu » inclut toutes les fibres kératiniques humaines et notamment les cheveux, mais également les sourcils, les cils, les poils de barbe, de moustache, les poils pubiens, d’individus atteints de pathologies provoquant ou pouvant provoquer la chute des cheveux ou encore atteints d’alopécie.

Selon cette forme de l’invention, de préférence, la combinaison d’agents actifs comprend un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), du magnésium L-ascorbyl-2phosphate, de la L-carnitine et de l’adénosine et est caractérisée en ce que l’hydrolysat peptidique de maïs est obtenu par hydrolyse enzymatique, comprend 90 % de composés de nature peptidique ayant un poids moléculaire inférieur à 5 kDa, a un poids sec de 2 à 5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1 à 5 g/kg, et préférentiellement de

1,5 à 3,0 g/kg et une concentration en sucres de 0,05 à 1 g/kg et préférentiellement de 0,1 à 0,3 g/kg.

Préférentiellement la combinaison comprend 0,5 % d’hydrolysat de maïs, 0,58 %.de Lascorbyl-2-phosphate de magnésium, 0,00081 % de L-camitine et 0,13 % d’adénosine, dans un mélange glycérol-eau ayant un ratio de respectivement 30 % de glycérol pour 70 % d’eau.

Dans ce mode de réalisation, la combinaison est présente dans les compositions pharmaceutiques à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 %, préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 % et 2,5 % par rapport au poids total de la composition finale et encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,5 % et 1,5 %.

Selon cette forme de l’invention, les compositions seront appropriées à une administration orale ou topique pour un usage pharmaceutique. Ainsi, les compositions pourront notamment se présenter sous forme de solutions, comprimés, capsules, gélules, pâtes à mâcher, poudres à consommer telles quelles ou à mélanger extemporanément avec un liquide, sirop, gels, et toute autre forme connue de l'homme du métier. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des conservateurs, d’autres agents actifs pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, etc.

Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de soin cosmétique résultent également de la description précédente. D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif.

Liste des figures

Figure 1 : Intensité de l’immunomarquage de Ki67 dans des kératinocytes humains normaux Figure 2 : Intensité de l’immunomarquage du Versican dans des sphères de cellules de papilles dermiques (culture en 3D)

Figure 3 : Intensité de l’immunomarquage de Noggin dans des sphères de cellules de papilles dermiques (culture en 3D)

Figure 4 : Follicule pileux micro-disséqué et immunomarqué par anticorps anti intégrine βΐ Figure 5 : Intensité de l’immunomarquage de l’intégrine βΐ dans le bulbe du follicule pileux Figure 6 : Intensité de l’immunomarquage de l’intégrine βΐ dans le compartiment de la matrice du follicule pileux

Figure 7 : Exemple d’élongation de la tige pilaire après 16 jours de culture

Figure 8 : Mesure de l’élongation de cheveux isolés

Exemple 1 : Préparation d’un hydrolysat peptidique à partir d’extraits protéiques de maïs (Zea mays L.)

Un extrait protéique de maïs de type gluten de maïs (Zea mays L.) est mis en solution dans 10 volumes d’eau. Le mélange est ajusté à un pH compris entre 4 et 5 avec une solution aqueuse de soude 1 M.

La solubilisation est obtenue après 2 heures d’agitation à 50°C. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un hydrolysat brut de maïs est récupérée.

Le procédé de purification de l’hydrolysat brut commence par des filtrations successives à l’aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu’à 0,2 pm) afin d’obtenir une solution jaune, brillante et limpide, qualifié d’hydrolysat 1.

A cette étape, l’hydrolysat 1 de maïs est caractérisé par un extrait sec titrant à 10 g/kg, un taux de protéines de 7g/kg et un taux de sucres de 3 g/kg.

La nature protéique de l’hydrolysat 1 est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L’hydrolysat peptidique de maïs est chauffé à 70°C pendant 10 minutes, dans des conditions réductrices dénaturantes (tampon de préparation d’échantillon NuPAGE® LDS). Une solution de NuPAGE® Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se ré-oxydent durant l’électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES avec le standard

SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l’aide de Bleu de Coomassie® R-250. Dans ces conditions, on observe que 100 % des composés de nature peptidique ont un poids moléculaire inférieur à 10 kDa.

On procède alors à une phase de dilution dans un mélange eau-glycérol afin d’obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par un poids sec de 5,0 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 2,7 g/kg et une concentration en sucres de 2,3 g/kg. Cet hydrolysat peptidique de maïs correspond à l’agent actif selon l’invention. A cet hydrolysat on rajoute 0,5 % de benzoate de sodium, en tant que conservateur.

Cet hydrolysat peptidique est alors analysé en chromatographie liquide haute pression (HPLC) à l’aide d’un appareil HP1100 piloté par le logiciel ChemStation. La colonne utilisée lors de l’élution de l’hydrolysat 2 est une Nucleosil® 300-5 C4 MPN (125 x 4 mn) permettant de chromatographier des protéines ayant des poids moléculaires de 0,2 à 5 kDa (selon un gradient de solvants approprié).

Exemple 2 : Préparation d’une combinaison d’hydrolysat de maïs, d’un dérivé de vitamine C, de L-carnitine et d’adénosine

L’hydrolysat de maïs de l’exemple 1 est utilisé.

Les autres composants de la combinaison, sous forme de poudre, sont ensuite incorporés par simple solubilisation dans l’hydrolysat de maïs.

L’adénosine poudre est ajoutée en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 0,13 % (Sigma Aldrich, CAS 58-61-7)

Le L-ascorbyl-2-phosphate de magnésium (Sigma Aldrich, CAS 113170-55-1) est ajouté en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 0,58 %.

La L-carnitine (Sigma Aldrich, CAS 14992-62-2) est ajoutée en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 0,0008 %.

Les poudres sont ensuite solubilisées sous agitation modérée et à température ambiante.

La combinaison finale a un pH de 4.5, un poids sec de 12,1 g/kg, une couleur jaune foncée.

Exemple 3 : Effet de la combinaison de l’exemple 2 sur l’expression du marqueur Ki67 sur des cultures de kératinocytes humains normaux

Le but de cette étude est de déterminer l’expression de Ki67, un marqueur de prolifération cellulaire, sur des cultures de kératinocytes humains normaux isolés à partir d’épiderme. Ces cellules sont traitées avec un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) ou avec la combinaison de l’exemple 2 à 1 % (volume/volume), c’est-à-dire dilué au l/100^eme.

Protocole: Des kératinocytes humains normaux en culture sont traités avec un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) de l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2 à 1% dans un milieu spécifique, une fois par jour, tandis que des cultures contrôles sont maintenues en condition non-traitée. 2 jours après le début du traitement, une détection de l’expression du marqueur Ki67 est réalisée par une technique d’immunofluorescence indirecte.

Pour se faire, les cellules sont rincées, fixées avec du méthanol froid pendant 10 min à 4°C et perméabilisées au Triton à 0,2 %, pendant 30 minutes. Les cellules sont ensuite incubées avec une solution d’anticorps dirigés contre le Ki67 pendant une heure, puis avec une solution d’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pendant une heure. Les cellules sont alors examinées au microscope à Epifluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). Une quantification de la fluorescence, à l’aide du logiciel Volocity® image analysis software (PerkinElmer, Inc.) est réalisée à partir des photographies obtenues.

Résultats : Dans la condition où les cellules ont été traitées, l’intensité de marquage de Ki67 est augmentée par rapport aux cellules non-traitées : +18 % avec l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 et +41 % avec la combinaison de l’exemple 2. Les résultats sont présentés sur la figure 1.

Conclusion : L’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) selon l’exemple 1 à 1 % provoque une augmentation de l’activité proliférative des kératinocytes humains normaux en culture, avec une meilleure efficacité lorsque cet hydrolysat est combiné avec un dérivé de vitamine C, de la carnitine et de l’adénosine.

Exemple 4 : Effet de la combinaison de l’exemple 2 sur l’expression de versican et de noggin sur des cultures en 3 dimensions de cellules de papille dermique :

Le cycle de croissance du follicule pileux est contrôlé par la papille dermique située au niveau du bulbe. Ce compartiment envoie des signaux aux cellules de la matrice pour enclencher le démarrage ainsi que le maintien de la phase anagène (phase de croissance) jusqu’à l’entrée en phase catagène (phase de régression). Il a été démontré que les cellules de la papille dermique, lorsqu’elles étaient isolées et mises en culture 2 dimensions (2D) exprimaient de façon différente certaines protéines, et que leur comportement redevenait pratiquement identique lorsque ces cellules étaient mises en culture 3 dimensions (3D) (C.A. Higgins et al. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Dec 3;110(49): 19679-88). Ainsi, les cultures en 3D permettent de reproduire l’environnement des cellules de papille dermique et d’obtenir un comportement cellulaire proche de celui rencontré in vivo. L’expression continue de versican dans la papille dermique tout au long de la phase anagène montre l’importance de ce protéoglycane pour la maintenance de la croissance du cheveu (Soma T. et al. Haïr cycle-specific expression of versican in human haïr follicles. Journal of Dermatological Science (2005) 39, 147—154). La protéine noggin est quant à elle exprimée par les cellules de la papille dermique et dirigée vers les cellules de la matrice pour initier l’entrée en phase anagène du follicule (Botchkarev VA et al. Noggin is required for induction of the haïr follicle growth phase in postnatal skin. LASEB J. 2001 Oct;15(12):2205-14).

Le but de cette étude est de déterminer l’expression de versican et noggin dans des cellules de la papille dermique, isolées de follicules pileux humains, et cultivées en 3D. Les sphères obtenues en culture 3D sont traitées avec un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) obtenu selon l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2, à la concentration de 1 % (volume/volume), c’est-à-dire dilué au 1/100^eme.

Protocole : Des cellules de la papille dermique sont mises en culture selon la méthode de « la goutte suspendue » (Higgins C. et al, Modelling the haïr follicle dermal papilla using spheroid cell cultures. Experimental Dermatology. 2010 ; 19, 546-548) dans un milieu spécifique. Après 5 jours de culture, une sphère de cellules est formée dans chaque goutte. Ces sphères sont alors traitées avec un hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2 à 1 % dans ce même milieu spécifique, une fois par jour, tandis que des cultures contrôles sont maintenues en condition non-traitée. 2 jours après le début du traitement, une détection de l’expression de versican ou noggin est réalisée par une technique d’immunofluorescence indirecte.

Pour se faire, les sphères sont fixées en cytoblock (Shandon ThermoScientific) et incluses en paraffine. Des coupes histologiques de 4 pm d’épaisseur sont ensuite réalisées. Ces coupes sont déparaffmées par des bains de xylène et d’éthanol puis rincées. Pour démasquer les sites spécifiques de liaison aux antigènes, les coupes sont chauffées dans un bain de tampon citrate au four à micro-onde. Après une saturation avec de la BSA à 5 % pendant 30 minutes pour bloquer les sites non spécifiques, les coupes sont ensuite incubées avec une solution d’anticorps dirigés contre le versican ou noggin toute la nuit à 4°C, puis avec une solution d’anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pendant une heure à température ambiante. Les coupes sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). Une quantification de la fluorescence, à l’aide du logiciel Volocity® image analysis software (PerkinElmer, Inc.) est réalisée à partir des photographies obtenues.

Résultats : La quantification de la fluorescence, telle que représentée sur la figure 2, montre que l’intensité de marquage du versican est augmentée de 15 % lorsque les sphères ont été traitées par l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 à 1 % et augmentée de 72 % après traitement par la combinaison de l’exemple 2 à 1 %, par rapport au contrôle non traité. L’intensité de marquage de la protéine noggin, telle que représentée sur la figure 3, est augmentée de 61 % lorsque les sphères ont été traitées par l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 à 1 % et augmentée de 75 % après traitement par la combinaison de l’exemple 2 à 1 %, par rapport au contrôle non traité.

Conclusion : L’hydrolysat peptidique de maïs selon l’exemple 1 permet une augmentation de l’activité des cellules de la papille dermique lorsque celles-ci sont mises en culture en 3 dimensions. On observe une efficacité très supérieure lorsque l’hydrolysat peptidique de maïs est utilisé en combinaison avec de la vitamine C ou un de ses dérivés, de la carnitine et de l’adénosine.

Exemple 5 : Effet de la combinaison de l’exemple 2 sur l’expression de l’intégrine βΐ sur des cultures ex vivo de follicules pileux micro-disséqués

L’intégrine βΐ est une protéine connue pour jouer un rôle important dans le cycle de croissance du follicule pileux. Elle est présente dans de nombreux compartiments du follicule, y compris dans la matrice, à l’endroit où les cellules s’amplifient pour donner, entre autre, les cellules qui formeront la tige pilaire (Kloepper JE et al. Functional rôle of βΐ integrin-mediated signalling in the human hair follicle. Experimental Cell Research. 2008; 3 1 4: 4 9 8-5 0 8).

Le but de cette étude est de déterminer l’expression de l’intégrine βΐ sur des cultures ex vivo de follicules pileux micro-disséqués isolés à partir de prélèvement de lifting humain.

Ces follicules pileux sont traités par un hydrolysat peptidique de maïs obtenu selon l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2, à la concentration de 1 %.

Protocole : Des follicules pileux micro-disséqués en culture sont traités avec un hydrolysat peptidique de maïs obtenu selon l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2, à 1 % dans un milieu spécifique, une fois par jour, tandis que des cultures contrôles sont maintenues en condition non-traitée. 2 jours après le début du traitement, une détection de l’expression de l’intégrine βΐ est réalisée par une technique d’immunofluorescence indirecte.

Pour se faire, les follicules pileux micro-disséqués sont fixés dans une matrice d’enrobage OCT et congelés dans de l’azote liquide. Des coupes histologiques de 6 pm d’épaisseur sont ensuite réalisées. Ces coupes sont chauffées pendant 30 min à 37°C puis fixées par un bain d’acétone froid pendant 10 minutes. Après une saturation avec de la BSA à 5 % pendant 30 minutes pour bloquer les sites non spécifiques, les coupes sont ensuite incubées avec une solution d’anticorps dirigée contre l’intégrine βΐ pendant 1 heure, puis avec une solution d’anticorps secondaire anti-rat couplé à un fluorochrome (Alexa Fluor® 488, Invitrogen) pendant 1 heure. Les coupes sont alors examinées au microscope à Epifluorescence (Zeiss Axiovert 200M microscope). Une quantification de la fluorescence, dans le bulbe entier du follicule d’une part et plus précisément dans le compartiment de la matrice d’autre part, à l’aide du logiciel Volocity® image analysis software (PerkinElmer, Inc.) est réalisée à partir des photographies obtenues. Un exemple de vue au microscope est représentée en figure 4.

Résultats : Ua quantification de la fluorescence, telle que représentée sur la figure 5, montre que l’intensité de marquage de l’intégrine βΐ dans le bulbe augmente de 17 % après traitement des follicules pileux par l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 à 1 %, comparé au contrôle non traité et augmente de 28 % après traitement par la combinaison de l’exemple 2 à 1 %, par rapport au contrôle non traité.

De même, la quantification de la fluorescence au niveau du compartiment de la matrice, telle que représentée sur la figure 6, montre que l’intensité de marquage de l’intégrine βΐ augmente de 15 % après traitement des follicules pileux par l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 à 1 %, comparé au contrôle non traité et augmente de 24 % après traitement par la combinaison de l’exemple 2 à 1 %, par rapport au contrôle non traité.

Conclusion : L’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) obtenu selon l’exemple 1 induit une augmentation de l’activité des cellules de la matrice dans des follicules pileux ex vivo. On observe une efficacité supérieure lorsque l’hydrolysat peptidique de maïs est utilisé en combinaison avec de la vitamine C ou un de ses dérivés, de la camitine et de l’adénosine (combinaison selon exemple 2 à 1 %).

Exemple 6 : Effet de la combinaison de l’exemple 2 sur l’élongation de la tige pilaire sur des cultures ex vivo de follicules pileux micro-disséqués

Lors de la phase anagène du cycle de croissance du follicule pileux, les cellules de la matrice se multiplient pour fournir les cellules qui vont constituer les différents compartiments épithéliaux du follicule. Au niveau de la tige pilaire, ces cellules vont se différencier et s’accumuler pour donner la partie visible de la tige.

Le but de cette étude est de déterminer l’élongation de la tige pilaire sur des cultures ex vivo de follicules pileux micro-disséqués isolés à partir de prélèvement de lifting humain. Ces follicules pileux sont traités avec un hydrolysat peptidique de maïs obtenu selon l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2, à la concentration de 1 %, (volume/volume), c’est-à-dire dilué au l/100^eme.

Protocole : Des follicules pileux micro-disséqués sont mis en culture dans des plaques 24 puits et sont traités avec un hydrolysat peptidique de maïs obtenu selon l’exemple 1 ou la combinaison de l’exemple 2, à 1 % dans un milieu spécifique, une fois par jour, tandis que des cultures contrôles sont maintenues en condition non-traitée. Après différents temps de culture, l’élongation de la tige pilaire est déterminée.

Pour ce faire, les puits sont vidés du milieu, et des photos des follicules pileux sont prises à 0, 5, 7, 10 et 16 jours de culture. La longueur du follicule et de la tige pilaire associée est mesurée sur une photo grâce au logiciel Image J. Les différences de pousse entre Jx et J0 sont ensuite comparées entre une condition traitée et le contrôle. Un exemple à 16 jours est représenté en figure 7.

Résultats : Une augmentation non significative de l’élongation est observée après 10 et 16 jours de traitement par l’hydrolysat peptidique de maïs de l’exemple 1 à 1 %, alors qu’une augmentation significative de l’élongation est observée après 10 et 16 jours de traitement par la combinaison de l’exemple 2 à 1 %, de respectivement 22 % après 10 jours et 23 % après 16 jours. L’analyse par le test de Student montre que les résultats sont statistiquement significatifs (*) pour n=4-10. Les résultats sont représentés sur la figure 8.

Conclusion : L’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.) induit une stimulation non significative de la croissance de la tige pilaire de follicules pileux micro-disséqués en culture ex vivo. Seule la combinaison d’un hydrolysat peptidique de maïs utilisé en combinaison avec de la vitamine C ou un de ses dérivés, de la carnitine et de l’adénosine, selon l’exemple 2, à 1 % provoque une augmentation significative de la croissance de la tige pilaire.

Claims

REVENDICATIONS

1. Combinaison d’un hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de camitine et d’adénosine, dans laquelle ledit hydrolysat peptidique de maïs est obtenu par hydrolyse enzymatique, comprend des composés de nature peptidique de poids moléculaire inférieur à 5 kDa, a un poids sec de 2 à 5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1 à 5 g/kg, et préférentiellement de 1,5 à 3,0 g/kg et une concentration en sucres de 0,05 à 1 g/kg et préférentiellement de 0,1 à 0,3 g/kg.
2. Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que le dérivé de vitamine C est le L-ascorbyl-2-phosphate de magnésium et que la camitine est sous forme de L-camitine.
3. Combinaison selon l’une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que l’hydrolysat peptidique de maïs est présent à une concentration comprise entre 0,2 % et 0,5 % et préférentiellement à une concentration de 0,5 %, que la vitamine C ou son dérivé est présent à une concentration comprise entre 0,5 % et 1,5 % et préférentiellement à une concentration de 0,58 %, que la camitine est présente à une concentration comprise entre 0,0001 % et 0,01 % et préférentiellement à une concentration de 0,00081 % et que l’adénosine est présente à une concentration comprise entre 0,05 % et 0,30 % et préférentiellement à une concentration de 0,13 %.
4. Combinaison selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que les composants sont dissouts dans un mélange de solvants, choisis parmi le glycérol, l’éthanol, le propanediol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants, et préférentiellement dans un mélange 30 % glycérol dans l’eau.
5. Composition cosmétique comprenant la combinaison de l’une quelconque des revendications 1 à 4 et un milieu physiologiquement adapté.
6. Composition cosmétique selon la revendication 5 dans laquelle la combinaison est présente à une concentration comprise entre 0,001 % et 5 % du poids total de la composition finale, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 % et 2,5 % du poids total de la composition.
7. Composition cosmétique selon l’une des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que la composition comprend en outre au moins un autre agent actif protecteur ou améliorant la pousse et/ou la santé des cheveux.
8. Composition cosmétique selon l’une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l’application topique.
9. Utilisation cosmétique de la composition selon l’une des revendications 5 à 8 pour stimuler le follicule pileux et augmenter l’expression du versican, de noggin, de l’intégrine βΐ et de Ki67.
10. Utilisation cosmétique de la composition selon l’une des revendications 5 à 8 pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu, ou ralentir la chute du cheveu.
11. Utilisation cosmétique de la composition selon l’une des revendications 5 à 8 pour stimuler la pousse des cils, ou lutter contre la chute du cil.
12. Procédé de soin cosmétique destiné à lutter contre les signes de vieillissement du cheveu et du cuir chevelu, caractérisé en ce que l’on applique topiquement sur la zone à traiter une composition telle que définie dans l’une des revendications 5 à 8.
13. Procédé de soin cosmétique destiné à protéger le cheveu des agressions extérieures, caractérisé en ce que l’on applique topiquement sur la zone à traiter une composition telle que définie dans l’une des revendications 5 à 8.
14. Combinaison d’hydrolysat peptidique de maïs (Zea mays L.), de vitamine C ou un de ses dérivés, de camitine et d’adénosine ou d’une composition pharmaceutique la comprenant, dans laquelle l’hydrolysat peptidique de maïs est obtenu par hydrolyse enzymatique et comprend des composés de nature peptidique de poids moléculaire inférieur à 5 kDa, a un

5 poids sec de 2 à 5 g/kg, une concentration en composés de nature peptidique de 1,5 à 3,0 g/kg et une concentration en sucres de 0,1 à 0,3 g/kg, pour son utilisation pour stimuler et/ou restaurer la densité capillaire, augmenter la pousse du cheveu ou limiter la chute du cheveu, dans le cadre d’un traitement préventif ou curatif de la perte de cheveux liée à un état pathologique.
15. Combinaison selon la revendication 14, caractérisée en ce que les états pathologiques sont la pelade, les effets secondaires de traitements médicamenteux, certaines infections ou inflammations du cuir chevelu ou toute forme d’alopécie.

1/4

Intensité de l'immunomarquage de Ki67 dans des kératinocytes humains normaux