WO2014038822A1 - 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 ｇｐｐ１１０１ｂ 균주 및 이를 이용한 제제 - Google Patents

페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 ｇｐｐ１１０１ｂ 균주 및 이를 이용한 제제 Download PDF

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이왕휴
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/79—Paecilomyces

Definitions

  • the present invention relates to a Pesylomyces varioti Bariati Bruneorus GPP1101B strain and a preparation using the same, more specifically, it is added to ginseng extract or red ginseng extract to provide excellent anti-cancer and immunomodulatory efficacy and mutation inhibition and antimicrobial activity.
  • the present invention relates to a Pecillomyces variiti Variety Brunneus GPP1101B strain and a preparation using the same.
  • ginseng is a medicinal plant that is favorably used in herbal medicine for the purpose of anti-fatigue, antistress, immune function enhancement, and blood sugar lowering, and recognizes saponin as a main component of its efficacy.
  • Korean Patent Publication No. 10-0144130 which is composed of glucose and galactose hexasaccharide 40.0-50.0%, acidic sugars galacturonic acid 41.0-44.8% and lysine, histidine, arginine, aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, hisstein And 3.7% to 5.2% of a protein composed of phenylalanine and a molecular weight of 50,000 to 150,000.
  • the present invention relates to a ginseng polysaccharide having an immune enhancing effect.
  • Korean Patent Publication No. 10-0361187 "Ginseng polysaccharide excellent in hematopoietic promoting action, bone marrow defense action, cancer cell killing immune cell production action and radiation sensitivity action” has been disclosed, which extracts the ginseng root powder with methanol After drying the insoluble residue, the water-soluble fraction obtained by extracting with distilled water was lyophilized, and ethanol was added to the obtained product to obtain an ethanol insoluble fraction, which was then dialyzed with a cellulose dialysis membrane to obtain a polysaccharide, followed by Sephacryl S.
  • the present invention is intended to have excellent anti-cancer and immunomodulatory effect and mutation inhibition and antimicrobial activity by being added to ginseng extract or red ginseng extract.
  • the Pesylomyces varioti varieti Braneorus (Pecilomyces variotii var. Brunneolus) GPP1101B (microbial accession No. KCTC119938BP) isolated during the fermentation process of ginseng Strains are provided.
  • a strain of Pecilomomyces variotivaria Brunneol (Paecilomyces variotii var. Brunneolus) GPP1101B (microbial Accession No. KCTC119938BP) is added to the extract of ginseng or red ginseng to contain a culture cultured
  • An immunoactive agent is provided.
  • the culture solution may be a culture filtrate filtering the strain grown in hypertrophy.
  • the culture solution may be freeze dried.
  • the culture of cultured by injecting the strain of Pecilomyces variotivaria varieti (Paecilomyces variotii var. Brunneolus) GPP1101B (microbial accession number KCTC119938BP) to the extract of ginseng or red ginseng
  • An antimicrobial active agent is provided.
  • the culture solution may be a culture filtrate filtering the strain grown in hypertrophy.
  • the culture solution may be freeze dried.
  • An anticancer agent is provided.
  • the culture solution may be a culture filtrate filtering the strain grown in hypertrophy.
  • the culture solution may be freeze dried.
  • a culture filtrate cultured by injecting a strain of Pascilomyces variotii var.brunnneolus GPP1101B (microbial accession number KCTC119938BP) into the extract of ginseng or red ginseng An antimutagenic containing is provided.
  • the culture solution may be a culture filtrate filtering the strain grown in hypertrophy.
  • the culture solution may be contained by freeze drying.
  • the production of a culture medium in which the strain of Pecilomyces varioti Bariati brünolus (Pecilomyces variotii var. Brunneolus) GPP1101B (microbial accession number KCTC119938BP) is added to the extract of ginseng or red ginseng and cultured A method is provided.
  • the extract of ginseng or red ginseng may be a solution that filtered ginseng or red ginseng by heating ginseng or red ginseng in water for 12 to 72 hours at a temperature of 60 ⁇ 100 °C.
  • the culture may be performed for 10 to 60 days at a temperature of 15 ⁇ 35 °C using an incubator the extract of the ginseng or red ginseng in which the strain is added.
  • the culture solution after the completion of the cultivation, it can be prepared as a culture filtrate by filtering out the strain grown in hypertrophy.
  • the Pesylomyces varioti Variety Brunneus GPP1101B strain and a preparation using the same have a good anti-cancer and immunomodulatory effect and mutation inhibition and antimicrobial activity by adding to ginseng extract or red ginseng extract.
  • Figure 2 is an image showing the form of the conidia observed in the electron microscope of the strain according to the present invention.
  • 3 to 6 are graphs showing the experimental results for the anticancer properties of the preparations according to the present invention.
  • 9 and 10 are evaluation images of the antimicrobial activity of the preparations according to the present invention.
  • the strain of Pecilomyces varioti variety Bruneorus (Pecilomyces variotii var. Brunneolus) GPP1101B (microbial accession number KCTC119938BP), characterized in that it exhibits antimicrobial and immune activity according to the present invention is isolated during the fermentation process of ginseng , Antibacterial activity and immune activity.
  • the isolates were isolated from the ginseng fermenter by collecting yellow specific fungi and incubated in a suitable medium. The isolates were identified by measuring homology with other previously reported bacteria. As a result, the isolated strain GPP1101B was identified as a Pesylomyces varioiti varieties Bruneorus strain.
  • an immunoactive agent such as a food composition to contain a strain of GPP1101B as an active ingredient
  • an immunoactive agent can be prepared by culturing the strain of GPP1101B in ginseng fermentation broth to extract the culture filtrate and freeze-dried. , Cultivation of these strains can be made in an aerobic state of 10 ⁇ 30 °C.
  • GPP1101B a strain of GPP1101B, ie, a strain of Pecilomomyces variotii var. Brunneolus GPP1101B (microbial accession number KCTC119938BP), was added to the extract of ginseng or red ginseng, and the culture containing the culture medium was immunized.
  • Agents such as active agents, antimicrobial agents, anticancer agents and antimutagenics can be prepared.
  • Such preparations may be contained as a part or all or as an active ingredient, as well as the culture medium itself by introducing a strain of GPP1101B into the extract of ginseng or red ginseng, the immune activity, antimicrobial activity, anti-cancer and antimutagenic action, It may also include food as well as pharmaceuticals.
  • the culture solution may be a culture filtrate obtained by filtering strains of GPP1101B grown after culturing, and may be freeze-dried in the preparation.
  • the culture solution contained in preparations such as immunoactive, antimicrobial, anticancer and antimutagenic is prepared by incubating the strain of GPP1101B into the extract of ginseng or red ginseng, where the extract of ginseng or red ginseng is ginseng or red ginseng It may be a solution that filtered ginseng or red ginseng by heating it in a water bath at a temperature of 60-100 ° C. for 12 to 72 hours, and culturing the extract of ginseng or red ginseng into which the strain of GPP1101B was added using a water bath of the incubator. It can carry out for 10 to 60 days at the temperature of 15-35 degreeC. Meanwhile, the culture solution may be prepared as a culture filtrate by filtering out strains of GPP1101B that have grown after culturing.
  • Ginseng fermentation tanks used by farmers were collected by yellow microorganisms and identified by optical microscopy, and placed on potato agar medium (PDA) to which 200 ppm of streptomycin was added and incubated in a 25 ° C. incubator for 5 days.
  • PDA potato agar medium
  • the isolated strains were cultured in potato agar cotton medium (potato 200g, agar 15g, dextrose 15g, distilled water 1L), which is most used in the laboratory, and used for experiments while keeping in a refrigerator when they were sufficiently grown.
  • potato agar cotton medium potato 200g, agar 15g, dextrose 15g, distilled water 1L
  • GPP1101B has the property of growing well in any medium and has been found to grow well in by-products.
  • conidia disease as can be seen in the optical microscope image of Figure 1, has a simple shape and non-branching characteristics.
  • the spores are single grains of rice grains, and the spores are very small, several micrometers, and form conidia as a connecting ring.
  • GPP1101B grows well in the aerobic state of 10-30 ° C., especially 20-26 ° C. is the optimal temperature for mycelial growth, and the amount of mycelia and spore formation increased more rapidly during shaking culture in liquid medium than in flat medium. Sporulation was well done at 10 ⁇ 30 °C but particularly excellent at 15 ⁇ 26 °C.
  • GPP1101B has a long morphology and rapid growth unlike other penicilliums. Therefore, GPP1101B was identified as a genus of Paecilomyces by PCR. It was identified by 99% similarity by request from Knicks. This genus is non-pathogenic to various plants and is a fungus that sometimes causes disease for insects. In addition, these strains were cultured in the extract of ginseng or red ginseng to extract the culture filtrate, lyophilized and added to the medium, and then inoculated with Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, apparently low support Was formed and showed no effect on E. coli and Salmonella. In addition, the antimicrobial activity was lost by autoclave treatment (autoclave, 121 ° C, 15 minutes). In addition, it showed low antibacterial activity against fungi and actinomycetes.
  • GPP1101B was deposited on August 4, 2011, with the accession number KCTC11993BP to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC).
  • KCTC Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
  • Korean Food Research Institute KFRI, Ref. No. AO2012-02-01-028
  • GPP1101B culture solution of the existing ginseng extract solution No. 102
  • ginseng extract solution January 26, 2012
  • Table 1 The results of requesting component analysis for the sample of No. 105) are shown in Table 1 below.
  • PPT Protopanaxatriol.
  • K Compound K.
  • PPD Protopanaxadiol.
  • GPP1101B culture solution (105) of ginseng extract exhibited the effects of Rf, which exhibits effects such as pain inhibition and lipid peroxidation inhibition, Rh1, which exhibits experimental liver injury inhibitory effects, platelet aggregation inhibition, memory deterioration improvement, and the like.
  • Rf which exhibits effects such as pain inhibition and lipid peroxidation inhibition
  • Rh1 which exhibits experimental liver injury inhibitory effects, platelet aggregation inhibition, memory deterioration improvement, and the like.
  • Rg2, Rb2 which promotes sugar and fat metabolism, antidiabetic action
  • Rd2 which exhibits cortical stimulating hormone, corticosteroid secretion promoting effect
  • Rg3 which inhibits cancer cell metastasis and experimental liver injury, etc. It can be seen that the ginseng extract (102) contains a large amount of components.
  • MTT assay was used to measure cell viability, and the sample was 1 ⁇ 100 ⁇ g / ml of Ginseng culture solution (KJS), and the passaged cell lines were THP-1 (human acute monocytic leukemia cell line) and Molt-4 (human lymphocytic leukemia). Cell lines), U-937 (human histoblastic leukemia cell line), and HL-60 (human acute promyelocytic leukemia cell line).
  • the sample is made by putting water, ginseng or red ginseng in a steamer and boiling at a temperature of 60-100 ° C. for 12-72 hours and incubating the sample solution with the GPP1101B strain incubator at 15-35 ° C. for 10-60 days. The same applies to the samples of the other examples (Examples 3 to 5) hereinafter.
  • a sample of each concentration (0.1-10 ⁇ g / ml) was added to a leukemia cell culture system such as THP-1 by MTT method, and a CO 2 incubator (5% -CO 2 , 95) at 37 ° C for 48 hours. culture in% -air).
  • 20 ⁇ l of MTT solution diluted in DPBS-A (pH 7.4) at 5 mg / ml at 4 mg before the end of the culture was added to each well, and dissolved in 100 ⁇ l of 10% SDS dissolved in 0.1 N HCL for 18 hours. While blocking the light with tinfoil.
  • the absorbance of each color well was measured at 570 nm using an ELISA reader, and compared with the absorbance of the control group, cell viability was shown in FIG. 3 to FIG. 6.
  • THP-1 human acute monocytic leukemia cell line
  • Molt-4 human lymphocytic leukemia cell line
  • U-937 human histoblastic leukemia cell line
  • HL-60 human acute promyelocytic leukemia cell line
  • lymphocyte (T, B cell) subpopulation samples were orally administered (250 or 500 mg / kg BW) for 4 weeks to BALB / c mice, followed by spleen and thymus extraction, followed by spleen and thymus Cell suspensions were prepared and double stained with PE conjugated-anti mouse B220 antibody and FITC conjugated-anti mouse Thy-1 antibody and PE-anti CD4 / FITC-anti CD8 (Sigma) on 1 ⁇ 10 6 cells / well. Reaction was performed at 4 ° C. for 30 minutes and a subset of lymphocytes was measured using a flow cytometer (excitaion: 488 nm, emission: 525 nm / FITC, 575 nm / PE).
  • IFN- ⁇ blood cytokine
  • IL-2 blood cytokine
  • IL-4 blood cytokine
  • Purified anti-mouse IFN- [gamma] antibody was coated on a microplate (96well) (100 [mu] l / well) and adsorbed while shielding (over night) at 4 ° C. Each well was aspirate, washed three times with wash buffer (300 ⁇ l / well), diluted with assay diluent buffer, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • KJS samples were orally administered to BALB / c mice for 4 weeks, and splenic and thymic lymphocyte subpopulations were measured, and significantly increased the number (activity) of B lymphocytes and T lymphocytes, especially at 200 mg / kg B.W dose. In this way, it is interpreted that the result of ginseng culture liquid up-regulation of immune capacity.
  • KJS sample 250 mg / kg BW was orally administered to BALB / c mice for 4 weeks, and blood lymphokine production was measured by ELISA method. The increase was about 53%. This result suggests that as a result of lymphocyte subpopulations, the activity of T lymphocytes is increased, in particular the production of lymphokines such as IFN- ⁇ and IL-2, which are isolated from Th1 cells. The above results suggest that KJS has an effect of up-regulating immune system activity.
  • the sample was filtered (whatman No. 2) and then lyophilized to obtain a powder, which was dissolved in sterile water and used as an experimental material.
  • Antimicrobial evaluation was performed on 200 ⁇ l of Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Eschericahia coli (E. coli), Salmonella typhimurium (Salmonella), and FK 918 (S. aureus). After 2 minutes, leave for 2 hours. A sterilized paper disk (6 mm) was placed, and 25 ⁇ l of 0.4 mg / ml, 2 mg / ml, and 4 mg / ml of the sample dissolved in distilled water were dispensed. And actinomycetes were incubated at 30 ° C. for 48-60 hours to determine the clear zone.
  • Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
  • the antimicrobial activity of the sample was performed against Staphylococcus aureus, Gram-negative bacteria, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, Fungi (Asp. Awamori), Actinomycetes (lab isolated strains). .
  • P. aeruginosa is 20.79 mm, 23.26 mm, and 25.41 mm, respectively.
  • Staphylococcus S.aureus
  • E. coli and Salmonella S. typhimurium
  • the fungus formed 9.34 mm, 10.52 mm, 13.94 mm
  • actinomycetes FK918, formed clear zones of 10.67 mm, 9.08 mm, and 9.37 mm.
  • the samples showed strong antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus and low antibacterial activity against fungi and actinomycetes.
  • E. coli and Salmonella did not show antimicrobial activity, and when the sample was auto cleave (121 °C, 15 minutes) was found to disappear.
  • Gram-negative bacteria showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Staphylococcus aureus.
  • the sample was filtered (whatman No. 2) and then lyophilized to obtain a powder, which was dissolved in sterile water and used as an experimental material.
  • the antimutagenicity of the sample was observed to inhibit mutations using 1-nitropyrene, Trp-P-1, and aflatoxin B1 as S. typhimurium TA98 strain and mutagen.
  • 100 ⁇ l of bacterial culture medium (1-2 ⁇ 10 9 CFU / mL) incubated for 12 hours in 550 ⁇ l of 0.1M sodium phosphate buffer, 50 ⁇ l of sample for each concentration, and Oxoid nutrient broth No. 2 (25 g / l) in a sterile test tube. The mixture was shaken and incubated at 37 ° C. at 210 rpm for 20 minutes.
  • Samples were prepared at concentrations of 0.1 mg / plate, 0.5 mg / plate and 1.0 mg / plate to evaluate antimutagenicity. As shown in Table 5, when mutagen was 1-nitropyrene (1-NP), 7%, 19%, and 54% mutagenicity was suppressed at each concentration, and 1% when Trp-p-1 was the mutagen. , 5%, 9% of the mutation inhibition effect, aflatoxin B1 (AFB1) as a mutagen showed 10%, 16%, 53% mutation inhibition effect, respectively.
  • ARB1 aflatoxin B1
  • the anti-mutagenicity showed high antimutagenicity of 50% or more at a concentration of 1.0 mg / plate for 1-NP and AFB1.
  • the antimicrobial activity against Salmonella was not shown in the antimicrobial activity evaluation. This sample is considered to exhibit antimutagenicity against 1-NP and AFB1.

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Abstract

본 발명은 인삼발효과정에서 분리되는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주 및 이를 이용한 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 인삼 추출액이나 홍삼 추출액에 투입됨으로써 우수한 항암 및 면역조절 효능과 돌연변이 억제 및 항균활성 효능을 가지도록 한다.

Description

페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 ＧＰＰ１１０１Ｂ 균주 및 이를 이용한 제제
본 발명은 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 GPP1101B 균주 및 이를 이용한 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼 추출액이나 홍삼 추출액에 투입됨으로써 우수한 항암 및 면역조절 효능과 돌연변이 억제 및 항균활성 효능을 가지도록 하는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 GPP1101B 균주 및 이를 이용한 제제에 관한 것이다.
일반적으로, 인삼은 항피로, 항스트레스, 면역기능 향상, 혈당 강하의 목적으로 한방에서 즐겨 사용하는 약용 식물로서, 그 효능의 주요 성분으로 사포닌을 인정하고 있다.
이와 같은 인삼의 사포닌 성분 중에서 그 효능을 더욱 향상시키기 위한 인삼의 가공 기술에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이로 인해 홍삼 및 흑삼을 개발하여 일반 수삼 및 건삼에서 발견할 수 없는 종류의 사포닌 성분을 찾아내고, 이를 통해 그 효능의 우수함을 입증하려는 시도가 전개되고 있다.
종래의 인삼에 대한 효능을 개선하기 위한 기술로는 한국등록특허공보 제10-0144130호의 "면역증강 효과를 나타내는 인삼단백다당체("진산")"가 개시된 바 있는데, 이는 글루코스 및 갈락토스로 구성된 6탄당 40.0 ~ 50.0%, 산성당인 갈락투론산 41.0 ~ 44.8% 및 리진, 히스티딘, 아르기닌, 아사파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린, 메티오닌, 이소로이신, 로이신, 티로신, 히스테인 및 페닐알라닌으로 구성된 단백질 3.7 ~ 5.2%를 함유하며, 분자량이 50,000 ~ 150,000인 물질로서, 면역증강 효과를 나타내는 인삼다당체에 관한 것이다.
또한, 한국등록특허공보 제10-0361187호의 "조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포생성작용 및 방사선 민감작용이 우수한 인삼 다당체"가 개시된 바 있는데, 이는 인삼 뿌리 분말을 메탄올로 추출하여 메탄올 불용성 잔사를 음건한 후, 증류수로 추출하여 얻은 수 가용성 분획을 동결 건조시키고, 상기 수득물에 에탄올을 가해 에탄올 불용성 분획을 수득한 후, 이를 셀룰로오스 투석막으로 투석시켜 다당체를 획득한 후, 세파크릴 S-500 컬럼 크로마토그래피하여 6개의 분획을 얻고, 이들을 각각 DEAE-셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피하여 순수히 분리정제한 인삼 다당체로, 조혈 촉진작용, 골수 방어작용, 암세포 살해 면역세포 생성작용 및 방사선 민감작용을 갖는 인삼 다당체에 관한 것이다.
그러나, 이러한 종래의 기술들은 그 이용 범위가 제한적이고, 그 정제효율이 높지 않아 원하는 효능을 발휘하는데 한계를 가지고 있다. 따라서, 인삼을 이용하되, 우수한 효능을 가지면서도 전혀 새로운 개념의 면역활성제 개발이 필요하게 되었다
상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 인삼 추출액이나 홍삼 추출액에 투입됨으로써 우수한 항암 및 면역조절 효능과 돌연변이 억제 및 항균활성 효능을 가지도록 하는데 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적들은 이하의 실시예에 대한 설명을 통해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 인삼의 발효과정에서 분리되는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액을 함유하는 면역활성제가 제공된다.
상기 면역활성제에 있어서, 상기 배양액은 비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액일 수 있다.
상기 면역활성제에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액을 함유하는 항균활성제가 제공된다.
상기 항균활성제에 있어서, 상기 배양액은 비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액일 수 있다.
상기 항균활성제에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양여액을 함유하는 항암제가 제공된다.
상기 항암제에 있어서, 상기 배양액은 비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액일 수 있다.
상기 항암제에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양여액을 함유하는 항돌연변이제가 제공된다.
상기 항돌연변이제에 있어서, 상기 배양액은 비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액일 수 있다.
상기 항돌연변이제에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양하는 배양액의 제조방법이 제공된다.
상기 배양액의 제조방법에 있어서, 상기 인삼 또는 홍삼의 추출액은 인삼이나 홍삼을 물에 넣고 60~100℃의 온도로 12~72시간 가열하여 인삼이나 홍삼을 걸러낸 용액일 수 있다.
상기 배양액의 제조방법에 있어서, 상기 배양은 상기 균주를 투입한 상기 인삼 또는 홍삼의 추출액을 배양기를 이용하여 15~35℃의 온도에서 10~60일간 실시할 수 있다.
상기 배양액의 제조방법에 있어서, 상기 배양을 마친 다음, 비대 성장한 상기 균주를 걸러내어 배양여액으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 GPP1101B 균주 및 이를 이용한 제제에 의하면, 인삼 추출액이나 홍삼 추출액에 투입됨으로써 우수한 항암 및 면역조절 효능과 돌연변이 억제 및 항균활성 효능을 가지도록 한다.
도 1은 본 발명에 따른 균주의 광학현미경으로 관찰한 분생자경 및 분생포자를 나타낸 이미지이고,
도 2는 본 발명에 따른 균주의 전자현미경으로 관찰한 분생포자의 형태를 나타낸 이미지이고,
도 3 내지 도 6은 본 발명에 따른 제제의 항암 특성에 대한 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 제제의 면역조절 특성에 대한 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 9 및 도 10은 본 발명에 따른 제제의 항균활성 평가 이미지이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고, 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니고, 본 발명의 기술 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 식으로 이해 되어야 하고, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예를 상세히 설명하며, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성요소에 대해서는 동일한 참조 번호를 부여하고, 이에 대해 중복되는 설명을 생략하기로 한다.
본 발명에 따른 항균활성 및 면역활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주는 인삼의 발효과정에서 분리되고, 항균활성 및 면역활성을 나타낸다.
인삼의 발효조에서 노란색의 특이한 곰팡이를 채집하여 분리한 균주를 적당한 배지에서 배양한 후, 이를 분리하여 기존에 보고된 다른 균과의 상동성을 측정하여 분리 균주를 동정하였다. 그 결과, 분리 균주인 GPP1101B는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 균주로 확인되었다.
GPP1101B의 균주를 유효성분으로 함유하도록 하는 식품 조성물 등의 면역활성제로서 제조할 수 있는데, 이러한 면역활성제는 GPP1101B의 균주를 인삼발효액에서 배양하여 배양여액을 추출하여 동결 건조시키는 과정에 의하여 제조될 수 있으며, 이러한 균주의 배양이 10~30℃의 호기성 상태에서 이루어질 수 있다.
또한, GPP1101B의 균주, 즉 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액을 함유한 면역활성제, 항균활성제, 항암제 및 항돌연변이제 등의 제제를 제조할 수 있다. 이러한 제제는 GPP1101B의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액 자체가 면역활성, 항균활성, 항암 및 항돌연변이 작용을 하게 되게 될 뿐만 아니라, 일부나 전부 또는 유효 성분으로 함유될 수 있고, 약제를 포함함은 물론 식품도 포함될 수 있다. 여기서, 배양액은 배양 후, 비대 성장한 GPP1101B의 균주를 걸러낸 배양여액일 수 있으며, 제제에 동결 건조되어 함유될 수도 있다.
한편, 면역활성제, 항균활성제, 항암제 및 항돌연변이제 등의 제제에 함유되는 배양액은 GPP1101B의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양함으로써 제조되는데, 여기서, 인삼 또는 홍삼의 추출액은 인삼이나 홍삼을 물에 넣고 중탕기에서 60~100℃의 온도로 12~72시간 가열하여 인삼이나 홍삼을 걸러낸 용액일 수 있고, 그 배양은 GPP1101B의 균주를 투입한 인삼 또는 홍삼의 추출액을 배양기의 중탕을 이용하여 15~35℃의 온도에서 10~60일간 실시할 수 있다. 한편, 배양액은 배양을 마친 다음, 비대 성장한 GPP1101B의 균주를 걸러내어 배양여액으로 제조될 수 있다.
<실시예 1> 균주의 분리 및 동정
농민이 이용하는 인삼발효조에 노란색의 특이한 곰팡이를 채집하여 광학현미경으로 확인하여, 스트렙토마이신 200ppm을 첨가한 감자한천배지(PDA)에 올려놓아 25℃ 배양기에서 5일간 배양하였다.
배지에 형성된 균총 가운데 노란색의 포자를 많이 형성하여, 단일포자를 취하여 GPP1101B 균주로서 순수 분리하였다.
그 후 분리 균주는 실험실에서 제일 많이 사용하는 감자한천사면배지(감자 200g, 한천 15g, 덱스트로즈 15g, 증류수 1ℓ)에 배양하여, 충분히 생장하였을 때 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
GPP1101B는 어떤 배지에서도 잘 자라는 특성을 가지고 있어, 부산물에서도 잘 자랄 수 있음이 확인되었다. 또한 분생자병은 도 1의 광학현미경 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 모양이 단순하고 분지되지 않는 특성을 지니고 있다. 또한, 포자는 도 2의 전자현미경 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 쌀알모양의 단세포로, 포자의 크기는 매우 작아서 수㎛이고, 연결고리처럼 분생자를 형성하고 있다.
GPP1101B의 생육은 10~30℃의 호기성 상태에서 잘 자라며, 특히 20~26℃가 균사생육의 최적 온도이며, 평판 배지에서보다 액체 배지에서 진탕 배양시에 균사 및 포자 형성량이 더 빠르게 증가하였다. 포자형성은 10~30℃에서 잘 이루어지나 특히 15~26℃에서 우수하였다.
GPP1101B는 여러 형태학적 특성이 기존의 페니실리움(Penicillium)과 달리 긴 체인을 형성하고 빠른 생육을 보여, 형태적으로는 페실로마이세스 속(Paecilomyces 속)으로 동정하였는데, PCR을 통한 동정을 바이닉스에 의뢰하여 99% 유사도에 의해 동정하였다. 이 속에는 다양한 식물에 비병원성인 균이며, 간혹 곤충에 대해서 병을 일으키는 곰팡이이다. 또한, 이러한 균주는 인삼 또는 홍삼의 추출액에서 배양하여 배양여액을 추출하여, 동결 건조 후 일정량을 배지에 첨가한 후, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 황색포도상균(Staphylococcus aureus)을 접종한 결과 뚜렷한 저지원을 형성하였고, 대장균과 살모넬라균에는 효과를 보이지 않았다. 또한 이러한 배양여액에 대한 시료를 고압멸균(autoclave, 121℃, 15분) 처리로 항균활성이 소실되는 것으로 보아 이 물질은 열에 약한 것으로 추정하였다. 또 곰팡이와 방선균에 대해서는 낮은 항균활성을 나타내었다.
GPP1101B는 2011년 8월 4일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC11993BP로 기탁되었다. 또한, 2012년 1월 26일자로 한국식품연구원(KFRI, 참고번호 AO2012-02-01-028)에 2012년 1월 26일자로 기존의 인삼추출용액(102호)과 인삼추출용액의 GPP1101B 배양액(105호)에 대한 시료에 대하여 성분 분석을 의뢰한 결과는 아래의 표 1과 같다.
표 1
Figure PCTKR2013007897-appb-T000001
1) PPT : Protopanaxatriol. 2) K : Compound K. 3) PPD : Protopanaxadiol.
표 1에 따르면, 인삼추출액의 GPP1101B 배양액(105호)은 통증 억제 및 지질과산화 억제 등의 작용을 나타내는 Rf, 실험적 간 상해 억제 작용 등을 나타내는 Rh1, 혈소판 응집 억제, 기억 감퇴 개선 등의 효능을 나타내는 Rg2, 당 및 지방대사 촉진, 항당뇨 작용 등을 나타내는 Rb2, 부식피질 자극 호르몬, 코티코스테론 분비 촉진 작용을 나타내는 Rd, 암세포전이 억제 작용, 실험적 간 상해 억제 등의 작용을 나타내는 Rg3 등에 있어서, 기존의 인삼추출액(102호)에 비하여 다량의 성분을 포함하고 있음을 알 수 있다.
<실시예 2> 항암 특성
GPP1101B를 이용한 시료에 대한 항암 특성에 대하여 실험하였다.
세포생존율의 측정하기 위하여 MTT assay를 사용하였는데, 시료는 인삼배양액(KJS) 1~100㎍/㎖이고, 계대세포주는 THP-1(인간 급성 단구성 백혈병세포주), Molt-4(인간 림프구성 백혈병세포주), U-937(인간 조직구성 백혈병세포주), HL-60(인간 급성 전골수성 백혈병세포주)이다. 또한, 시료는 증탕기에 물과 인삼 또는 홍삼을 넣고 60~100℃의 온도로 12~72시간 동안 끓여서 만든 시료용액을 GPP1101B 균주와 함께 배양기에 넣고서 15~35℃로 10~60일 동안 배양하여 만들어지며, 이는 이후의 다른 실시예들(실시예 3 내지 실시예 5)의 시료에서도 마찬가지로 적용된다.
실험방법으로는, MTT법에 의해 THP-1 등 백혈병세포 배양계에 각 농도(0.1~10㎍/㎖)의 시료를 첨가하여 48시간 동안 37℃의 CO2배양기(5%-CO2, 95%-air)내에서 배양한다. 배양 종료 4시간 전에 5㎎/㎖ 농도로 DPBS-A(pH 7.4)에 희석한 MTT 용액 20㎕를 각 웰(well)에 첨가하고, 0.1N HCL에 녹인 10% SDS 100㎕로 용해시켜 18시간 동안 은박지로 빛을 차단한다. 발색된 각 웰(well)의 흡광도를 ELISA 리더(reader)를 이용하여 570㎚에서 측정하고, 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하여 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
THP-1(인간 급성 단구성 백혈병세포주), Molt-4(인간 림프구성 백혈병세포주), U-937(인간 조직구성 백혈병세포주), 및 HL-60(인간 급성 전골수성 백혈병세포주) 세포를 계대배양하면서 각 농도(0.1 ~10㎍/㎖)의 인삼배양액(KJS)을 첨가하여 백혈병세포의 세포생존율을 살펴본 결과, 도 3 내지 도 6에서와 같이, 실험에 사용한 모든 백혈병세포주에서 농도의존적으로 세포생존율을 억제하는 항암활성이 관찰되었으며, 특히 THP-1세포와 Molt-4세포에서 생존율 억제효과가 현저하였다.
<실시예 3> 면역조절 특성
GPP1101B를 이용한 시료에 대한 면역조절 특성에 대하여 실험하였다.
림프구(T,B세포) 아집단(subpopulation) 측정을 위하여, BALB/c계 생쥐에 시료를 4주간 경구 투여(250 또는 500㎎/㎏ B.W.)하고, 비장 및 흉선을 적출한 후, 비장 및 흉선세포 부유액을 조제하고, 1×106세포/well에 PE conjugated-anti mouse B220 항체 및 FITC conjugated-anti mouse Thy-1항체와 PE-anti CD4/FITC-anti CD8(항체(Sigma)로 이중 염색하여 4℃에서 30분간 반응시키고 flow cytometer(excitaion: 488nm, emission: 525nm/FITC, 575nm/PE)를 이용하여 림프구의 아집단을 측정하였다.
또한, 혈중 cytokine(IFN-γ,IL-2, IL-4) 측정을 위하여, IFN-γ의 측정은 mouse IFN-γ ELISA Ready-Set-Go(eBioscience사) kit로 혈청 내 IFN-γ의 농도를 측정하였다.
마이크로플레이트(Microplate)(96well)에 purified anti-mouse IFN-γ항체를 코팅(100㎕/well)하여 4℃에서 차광(over night)하면서 흡착시켰다. 각 웰(well)을 aspirate하고, wash buffer(300㎕/well)로 3회 세척하고, assay diluent buffer로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰(well)을 aspirate하고 검체 및 표준용액(recombinant mouse IFN-γ, 1㎍/㎖)을 웰(well)당 100㎕씩 가하여 실온에서 2시간 동안 반응시키고, 3회 세척한 후 assay dilunet(1×)로 희석한 detection antibody를 웰(well)당 100㎕씩 주입하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash buffer(300㎕/well)로 3회 세척하고, Avidin-HRP antibody를 각 웰(well)당 100㎕씩 넣어 실온에서 30분 동안 반응시킨 다음, 3회 세척한 후 기질용액을 각 웰(well)당 100㎕씩 가하여 차광하에 15분간 발색시켰다. 50㎕의 스톱 솔루션(stop solution)을 가하여 반응을 정지시키고, ELISA 리더(reader)로 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, IL-2와 IL-4의 측정은 IFN-γ의 측정방법에 준하였다.
이러한 실험에 따른 비장 및 흉선림프구 아집단에 미치는 효과는 아래의 표 2와 도 7과 같다.
표 2
Figure PCTKR2013007897-appb-T000002
BALB/c 생쥐에 KJS 시료를 4주간 경구 투여하고, 비장 및 흉선림프구 아집단을 측정한 결과, 특히 200㎎/㎏ B.W 투여농도에서 B림프구 및 T림프구의 수(활성)를 유의성 있게 증가시켰다. 이와 같이, 인삼배양액이 면역능을 up-regulation하고 있음을 나타낸 결과라고 해석된다.
또한, 이러한 실험에 따른 혈중 림포카인(IFN-γ, IL-2, IL-4) 생성에 미치는 효과는 아래의 표 3과 첨부된 도 8과 같다.
표 3
Figure PCTKR2013007897-appb-T000003
BALB/c 생쥐에 KJS 시료(250 ㎎/㎏ B.W)를 4주간 경구 투여하고, 혈중 림포카인 생성을 ELISA 방법으로 측정한 결과, interferon-γ가 2배 이상 증가되었으며, IL-2는 대조군에 비하여 약 53%가 증가되었다. 이 결과는 림프구아집단 결과에서 나타난 바와 같이, T림프구의 활성이 증가된 결과, 특히 Th1세포에서 분리되는 IFN-γ와 IL-2와 같은 림포카인의 생성이 증가된 것으로 생각된다. 이상의 결과에서 KJS는 면역계활성을 up-regulation하는 효능을 가지고 있는 것으로 해석된다.
<실시예 4> 항균활성 특성
GPP1101B를 이용한 시료에 대한 항균활성 특성에 대하여 실험하였다.
시료를 여과(whatman No.2)한 후 동결건조를 실시하여 분말을 얻었으며, 이를 멸균수에 용해시켜 실험용 재료로 사용하였다.
항균성 평가는 Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Staphylococcus aureus(황색포도상구균+), Eschericahia coli(대장균), Salmonella typhimurium(살모넬라), Aspergillus awamori(흑국균), FK 918(자체 분리 방선균)을 생육배지에 200㎕씩 도말한 후 2시간 동안 방치한다. 멸균된 페이퍼 디스크(paper disk)(6mm)를 놓고, 여기에 증류수에 용해시킨 시료 0.4mg/㎖, 2mg/㎖, 4mg/㎖을 각각 25㎕씩 분주하여 일반세균은 37℃에서 24시간, 곰팡이와 방선균은 30℃에서 48~60시간 동안 배양하여 클리어 존(clear zone)을 측정하였다.
시료에 대한 항균활성은 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 그람양성균으로 황색포도상구균, 그람음성균으로 녹농균, 대장균, 살모넬라와, 곰팡이(Asp. awamori), 방선균(실험실 분리균주)에 대하여 실시하였다.
시료농도를 0.1mg/25㎕, 0.5mg/25㎕, 1.0mg/25㎕로 할 경우, 아래의 표 4에 나타낸 바와 같이, 녹농균(P.aeruginosa)은 각 20.79㎜, 23.26㎜, 25.41㎜와 포도상구균(S.aureus)는 각 19.73㎜, 19.45㎜, 23.49㎜로 클리어 존(clear zone)이 형성되었으나, 대장균(E. coli)과 살모넬라(S.typhimurium)은 형성되지 않았다. 곰팡이(Asp. awamori)는 9.34㎜, 10.52㎜, 13.94㎜를, 방선균(FK918)은 10.67㎜, 9.08㎜, 9.37㎜의 클리어 존(clear zone)을 형성하였다.
표 4
Figure PCTKR2013007897-appb-T000004
시료는 항균활성평가에 있어서 녹농균, 포도상구균에서 강한 항균활성을 나타내었으며, 곰팡이와 방선균에서 낮은 항균활성을 나타내었다. 그러나 대장균과 살모넬라에서는 항균활성을 나타내지 않았으며, 시료를 auto cleave(121℃, 15분)하였을 경우 항균활성이 사라지는 것을 알 수 있었다. 그람음성이 녹농균과 그람양성인 포도상구균에 항균활성을 나타내는 것으로 보아 특정 균주에 특이적으로 항균활성을 나타내는 것으로 판단되었다.
<실시예 5> 항돌연변이원성
GPP1101B를 이용한 시료에 대한 항돌연변이원성 특성에 대하여 실험하였다.
시료를 여과(whatman No.2)한 후 동결건조를 실시하여 분말을 얻었으며, 이를 멸균수에 용해시켜 실험용 재료로 사용하였다.
시료의 항돌연변이원성 평가는 S.typhimurium TA98 균주와 돌연변이원으로 1-nitropyrene, Trp-P-1, aflatoxin B1을 이용한 돌연변이 억제효과를 관찰하였다. 즉 멸균 시험관에 0.1M sodium phosphate buffer 550㎕, 각 농도별 시료 50㎕, Oxoid nutrient broth No.2(25g/ℓ)에서 12시간 배양한 균 배양액(1∼2×109CFU/㎖) 100㎕를 혼합하여 37℃에서 210rpm으로 20분간 진탕 배양하였다. 이 배양액을 1/15M phosphate buffer(pH 7.0)로 희석하여 5×103 CFU/㎖의 농도로 맞춘 다음, 이 균 희석액 100㎕에 top agar[agar 6g, NaCl 5g per liter (45℃)] 2㎖를 첨가하여 혼합하고, VBNM[agar 15g, 증류수 920㎖, 50×VB salt 20 ㎖, 40% glucose 10㎖, Oxoid nutrient broth No.2(25g/ℓ) 50㎖] 평판배지 상에 도포하여 37℃에서 12시간 배양하였다.
시료를 0.1mg/plate, 0.5mg/plate, 1.0mg/plate 농도로 각각 제조하여 항돌연변이원성을 평가하였다. 표 5에서와 같이, 돌연변이원을 1-nitropyrene(1-NP)로 하였을 경우 각 농도에서 7%, 19%, 54%의 돌연변이 억제효과를, Trp-p-1을 돌연변이원으로 하였을 경우 1%, 5%, 9%의 돌연변이 억제효과를, aflatoxin B1(AFB1)을 돌연변이원으로 하였을 경우 10%, 16%, 53%의 돌연변이 억제효과를 각각 나타내었다.
표 5
Figure PCTKR2013007897-appb-T000005
항돌연변이원성 평가에 있어서 1-NP 및 AFB1에 대해 1.0mg/plate의 농도에서 50% 이상의 높은 항돌연변이원성을 나타내었다. 항균활성평가에 있어서 살모넬라에 대한 항균활성을 나타내지 않은 것으로 보아 본 시료는 1-NP 및 AFB1에 대해 항돌연변이원성을 나타내는 것으로 판단된다.
이와 같이 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이러한 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (17)

  1. 인삼의 발효과정에서 분리되는 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주.
  2. 제 1 항의 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역활성제.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 배양액은,
    비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액인 것을 특징으로 하는 면역활성제.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 면역활성제.
  5. 제 1 항의 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 항균활성제.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 배양액은,
    비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액인 것을 특징으로 하는 항균활성제.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 항균활성제.
  8. 제 1 항의 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양여액을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 배양액은,
    비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액인 것을 특징으로 하는 항암제.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제.
  11. 제 1 항의 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양된 배양여액을 함유하는 것을 특징으로 하는 항돌연변이제.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 배양액은,
    비대 성장한 상기 균주를 걸러낸 배양여액인 것을 특징으로 하는 항돌연변이제.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 배양액을 동결 건조하여 함유하는 것을 특징으로 하는 항돌연변이제.
  14. 제 1 항의 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스(Paecilomyces variotii var. brunneolus) GPP1101B(미생물 기탁번호 KCTC119938BP)의 균주를 인삼 또는 홍삼의 추출액에 투입하여 배양하는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 인삼 또는 홍삼의 추출액은,
    인삼이나 홍삼을 물에 넣고 60~100℃의 온도로 12~72시간 가열하여 인삼이나 홍삼을 걸러낸 용액인 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 배양은,
    상기 균주를 투입한 상기 인삼 또는 홍삼의 추출액을 배양기를 이용하여 15~35℃의 온도에서 10~60일간 실시하는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양을 마친 다음, 비대 성장한 상기 균주를 걸러내어 배양여액으로 제조하는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
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