CN117683697B - 一株贝莱斯芽孢杆菌y01及其在抑菌和提高动物生长性能中的应用 - Google Patents
一株贝莱斯芽孢杆菌y01及其在抑菌和提高动物生长性能中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌Y01及其在抑菌和提高动物生长性能中的应用，涉及该菌在抑菌和促进动物生长方面的筛选技术领域，所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Y01于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.60195，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis；所述贝莱斯芽孢杆菌可以拮抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，且对肉鸡的生长性能有显著的促进作用，可作为抑菌剂应用于饲料中，代替抗生素，且减少抗药性的产生。
Description
技术领域
本发明涉及抑菌和促进动物生长的贝莱斯芽孢杆菌的筛选技术领域，更具体的说是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌Y01及其在抑菌和提高动物生长性能中的应用。
背景技术
由于抗生素的大量及不当使用，对养禽业造成了严重的负面影响，如禽产品中抗生素残留、肠道微生物改变、菌株耐药性及多重耐药性的出现等，也对公共卫生安全造成了威胁。随着2020年饲料端全面“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”政策的实施，“替抗”产品迅速发展。其中以酶制剂、抗菌肽、中草药提取物为主要代表。但是，这些“替抗”产品在具体使用过程中存在局限性，如酶制剂达不到抗生素的使用效果；抗菌肽分子质量小、自然界含量低、分离纯化难、化学合成成本高；而有些中草药提取物资源比较短缺、药效和质量不稳定。因此，寻找有效的“替抗”产品变得尤为重要。
益生菌被认为是最佳的“替抗”产品之一，能够维持动物肠道的菌群平衡、增殖有益细菌、减少肠道病原微生物且成功地用于畜禽和鱼类的生长促进剂，主要包括乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌（Bacillus）等。其中，芽孢杆菌抗逆性好、稳定性强、生长速度快、分泌多种酶类（如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等）、能有效抑制病原菌生长，且保存期长、易于加工和生产，是理想的动物益生菌制剂生产菌。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为芽孢杆菌属的一个新型菌种，在2008年被确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的后期异型体，是革兰氏阳性好氧细菌，菌体呈杆状，大小为0.5×(1.5-3.5)µm，内生孢子，普遍存在于自然界中，如空气、土壤、河水、海洋、植物根系、植物表面和动物肠道等。贝莱斯芽孢杆菌最早是由Ruiz-García等从西班牙南部城市-马加拉市的一条名为贝莱斯河（Velez）的河口中分离的，因此，被命名为贝莱斯芽孢杆菌。
近年来，国内外关于贝莱斯芽孢杆菌的研究主要集中在植物病害防控方面，比如：促进植物生长、抑制病原菌的侵染、诱导植物***抗性、抑菌物质及基因簇鉴定、拮抗作用机制等。但是，在动物病害防控方面，关于贝莱斯芽孢杆菌的研究相对较少。
因此，如何筛选到一株可以抑菌和促进动物生长的贝莱斯芽孢杆菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌Y01及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株贝莱斯芽孢杆菌Y01，所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Y01于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1.60195，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌Y01的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01在抑制病原菌中的应用。
在上述技术方案中，所述病原菌为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01在提高动物生长性能中的应用。
在上述应用中，所述贝莱斯芽孢杆菌Y01提高动物的平均日增重和料肉比。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种抑菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌Y01的菌悬液或发酵液；所述发酵液中有效成分包括淀粉酶和蛋白酶。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种提高动物生长性能的饲料，包括贝莱斯芽孢杆菌Y01的菌悬液或发酵液；所述发酵液中有效成分包括淀粉酶和蛋白酶。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一株贝莱斯芽孢杆菌Y01的发酵液的制备方法，过程包括：将贝莱斯芽孢杆菌Y01接种于LB液体培养基中于37℃180r/min震荡培养20h，4℃ 5000g离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即得到贝莱斯芽孢杆菌Y01的无菌发酵液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Y01对21种常用的抗生素敏感，不会产生耐药性，对葡萄球菌具有良好的拮抗作用，具有产淀粉酶和蛋白酶的能力，用于水解饲料中的淀粉和蛋白成分，促进消化吸收，无溶血现象、且对肉鸡具有安全性。该贝莱斯芽孢杆菌菌悬液促进肉鸡试验末平均体重增重6.57%（p＜0.05），对肉鸡生长具有一定的促生作用，是一株性能优良的新型益生菌株，具有良好的开发应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实例1提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01在LB固体培养基上37℃培养16-24h菌落形态；
图2为本发明实例1提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01在1000倍光学显微镜下的革兰氏染色照片；
图3为本发明实例1提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01全基因组图谱；
图4为本发明实例1提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01基于16S rDNA***进化树；
图5为本发明实例3提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01菌悬液对葡萄球菌的抑菌活性图；
图6为本发明实例3提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01发酵液对葡萄球菌的抑菌活性图；
图7为本发明实例4提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01产蛋白酶的能力；
图8为本发明实例5提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01产淀粉酶的能力；
图9为本发明实例6提供的贝莱斯芽孢杆菌Y01无溶血现象照片；
图10为本发明实例7提供的不同浓度贝莱斯芽孢杆菌Y01连续饲喂7天肉鸡的存活曲线；
图11为本发明实例7提供的1×1010CFU/mL贝莱斯芽孢杆菌Y01连续饲喂7天肉鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的石蜡切片；A为对照组肉鸡心脏的石蜡切片、B为对照组肉鸡肝脏的石蜡切片、C为对照组肉鸡脾脏的石蜡切片、D为对照组肉鸡肺脏的石蜡切片、E为对照组肉鸡肾脏的石蜡切片、F为试验组肉鸡心脏的石蜡切片、G为试验组肉鸡肝脏的石蜡切片、H为试验组肉鸡脾脏的石蜡切片、I为试验组肉鸡肺脏的石蜡切片、J为试验组肉鸡肾脏的石蜡切片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例 1 菌株Y01的分离培养及鉴定
1、菌株Y01的分离培养
称取鸡盲肠0.5g，置于LB液体培养基（蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，pH=7.0，121℃高压灭菌15min）中，37℃ 180rpm震荡培养16-24h。用无菌生理盐水将菌液梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，每个浓度梯度取100μL均匀涂布在LB固体培养基（蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，pH=7.0，121℃高压灭菌15min）上，37℃倒置培养16-24h，根据菌落大小、颜色、透明度、边缘等形态学特征对细菌进行分离、纯化。然后以金黄色葡萄球菌为指示菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌效果强的细菌菌株，将其命名为Y01。
2、菌株Y01的鉴定
综合菌株Y01的菌落特征、生理生化特性、分子生物学检测结果，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。具体技术方案如下：
（1）菌落特征及菌体细胞形态特征
菌株Y01在LB固体培养基上37℃培养24h后，菌落粗糙、略黄、不透明、边缘不规则、直径在2-4mm左右（如图1）。挑取LB固体培养基上生长的单菌落制备玻片，革兰氏染色，镜检。光学显微镜下的革兰氏染色照片如图2所示，Y01菌体呈杆状，直或近直，为革兰氏阳性菌。
（2）生理生化特性鉴定
挑取单菌落接种于细菌微量检定管进行生理生化指标的测定。参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》和《常见细菌***鉴定手册》进行归类判定，结果如表1所示，初步判断菌株Y01属于芽孢杆菌属（Bacillus）。
表1菌株Y01的生理生化检测结果
注：+表示阳性,–表示阴性。
（3）菌株Y01全基因组测序
将菌株Y01在LB液体培养基中于37℃ 180r/min震荡培养6h后，8000g离心5min收集菌体，提取基因组DNA，DNA质量检测合格后，委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行测序分析。采用全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun，WGS）策略，构建不同***片段的文库，利用第二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina NovaSeq测序平台，同时利用第三代单分子测序技术，基于Oxford Nanopore ONT 测序平台对这些文库分别进行测序分析。在Y01全基因组中选取16S rDNA进行BLAST分析，并选取同源性较高的标准菌株用MEGA7.0以Neighbor-Joining法构建***发育树。
菌株Y01基因组大小为3929778bp，其全基因组图谱如图3，G+C含量为46.50%，共有3868个基因，编码区占基因组88.57%，包括9个核糖体RNA（rRNA）操纵子，86个转运RNA（tRNA）（如表2）。
表2菌株Y01的基因组信息
将基因组序列与核酸序列数据库（Nucleotide Sequence Database，NT）进行比对，得到基因组的物种信息比对结果TOP5如表3。
表3 菌株Y01的NT库物种信息比对结果TOP5
菌株Y01的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据基因组物种信息比对结果，结合16S rDNA的***进化树和生理生化特性分析结果，将菌株Y01鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），结果如图4；所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Y01于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 1.60195，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
实施例 2 菌株Y01抗生素敏感性检测
利用无菌棉拭子蘸取浓度为1×108CFU/mL的Y01菌悬液涂于MH固体培养基（MH肉汤粉末21g/L，琼脂粉20g/L，121℃高压灭菌15min），放置5min后，将24种药敏纸片紧贴于平板表面，于37℃静置培养18h后观察结果并测量抑菌圈直径。根据美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性实验标准进行敏感性判定。实验重复3次。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌对麦迪霉素、克拉霉素、克林霉素、青霉素、诺氟沙星、氨苄西林、妥布霉素、红霉素、复方新诺明、卡那霉素、多粘菌素B、环丙沙星、链霉素、苯唑西林、米诺环素、氧氟沙星、头孢曲松、氯霉素、大观霉素、头疱喹肟、庆大霉素等21种抗生素敏感，对头孢他啶、四环素、氨曲南耐药。结果如表4。
表4 菌株Y01抗生素敏感性检测结果
注：S：敏感；R：耐药。
实施例 3 菌株Y01对病原细菌的抑制
以主要病原菌大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌为指示菌。使用无菌生理盐水将上述病原菌均调整为1×108CFU/mL，然后用无菌棉拭子蘸取上述菌液分别涂布于LB固体培养基上，放置10min后打孔。同时，使用无菌生理盐水将Y01调整为1×106CFU/mL，取100μL滴加于上述固体培养基的孔中。10min后，正置放于37℃培养16-24h。观察Y01周围是否出现明显的抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。结果显示，Y01对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有显著抑菌作用，而对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌无显著抑菌作用，其对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌直径分别是25±1.07mm和20±0.69mm（如图5）。
将菌株Y01在LB液体培养基中于37℃ 180r/min震荡培养20h后，于4℃5000g离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即得到贝莱斯芽孢杆菌Y01的无菌发酵液。然后取100μL发酵液滴加于上述固体培养基的孔中。10min后，正置放于37℃培养16-24h。观察Y01周围是否出现明显的抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。结果显示，Y01对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有显著抑菌作用，而对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌无显著抑菌作用，其对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌直径分别是23±1.25mm和19±0.78mm（如图6），表明菌株Y01在葡萄球菌的防治中具有很大的应用潜力。
实施例 4 菌株Y01产蛋白酶能力检测
将菌株Y01在LB液体培养基中于37℃ 180r/min震荡培养20h后，使用无菌生理盐水将其调整为1×106CFU/mL，然后取10μL垂直滴于蛋白培养基（琼脂20g/L，pH=7.0，121℃高压灭菌15min，降至60℃，取20mL已巴氏消毒的100g/L脱脂牛奶，混匀，倒板）上，10min后，于37℃静置培养24h，观察Y01菌株周围是否出现明显的蛋白水解圈，并测量水解圈的直径以此评估Y01菌株产蛋白酶能力。结果显示，Y01具有很好的溶解蛋白的能力，其溶解圈直径（D）达到23.50±0.58mm，菌落直径（d）为12.25±0.96mm（如图7）。
实施例 5 菌株Y01产淀粉酶能力检测
将菌株Y01在LB液体培养基中于37℃ 180r/min震荡培养20h后，使用无菌生理盐水将其调整为1×106CFU/mL，然后取10μL垂直滴于淀粉培养基（蛋白胨10g/L，可溶性淀粉20g/L，琼脂粉20g/L，pH=7.0，121℃高压灭菌15min）上，10min后，于37℃静置培养24 h，观察Y01菌株周围是否出现明显的淀粉水解圈（该淀粉水解圈需要在平板上滴加碘液后观察），并测量水解圈的直径以此评估Y01菌株产淀粉酶能力。结果显示，Y01具有很好的溶解淀粉的能力，其溶解圈直径（D）达到26.50±3.00mm，菌落直径（d）为13.50±1.91mm（如图8）。
实施例 6 菌株Y01溶血性检测
将菌株Y01在LB液体培养基中于37℃ 180r/min震荡培养20h后，用接种环蘸取Y01于血琼脂培养基上“Z”形划线，然后置于37℃静置培养24h，观察Y01周围是否出现溶血圈，用金黄色葡萄球菌作阳性对照。结果如图9所示，金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上出现明显的溶血圈，而Y01无溶血圈，表明菌株Y01具有一定的安全性。
实施例 7 菌株Y01安全性评价
将7日龄肉鸡任意分为5组，分别为A组、B组、C组、D组和E组，每组10只。其中，A组为空白对照组，每天拌料饲喂1mL无菌生理盐水；B组、C组、D组和E组为试验组，每天分别拌料饲喂1mL 1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL、1×108CFU/mL和1×107CFU/mL的Y01，连续饲喂7天，观察肉鸡是否发病或死亡。结果显示，试验组和空白对照组肉鸡均能正常饮食饮水，精神状态良好，未出现不良反应，无任何发病或死亡现象（如图10）。
连续饲喂7天后，试验组B和D组以及空白对照组A组分别选取3只肉鸡，静脉取血，血液静置凝结后，4℃ 2000g离心10min，取血清测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）等生理生化指标。并静脉取1mL血样，收集于EDTA抗凝管中，用血细胞分析仪测定白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）和血红蛋白（HGB）等血项指标。结果显示，连续饲喂7天后，肉鸡的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）等生理生化指标及白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）和血红蛋白（HGB）等血项指标均无明显变化，与对照组相比无显著差异（如表5和表6）。
表5不同浓度菌株Y01饲喂7天后肉鸡的生理生化指标
表6不同浓度菌株Y01饲喂7天后肉鸡的血项指标
同时，立即解剖肉鸡，观察其内脏器官颜色和形态，检查其是否发生病变，并摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等器官，用4%甲醛溶液浸泡固定24h，石蜡包埋，制作切片，苏木精-伊红染色，在400倍光学显微镜下观察病理改变并拍照。结果如图11所示，试验组（如图11中的F-J）肉鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织结构与对照组（如图11中的A-E）相比无明显差异：试验组肉鸡心肌无炎症细胞浸润，无水肿、充血和出血现象；肝细胞无变性坏死，但局部肝细胞与对照组一致，均出现轻度颗粒变性；脾脏淋巴细胞无坏死，无炎症细胞浸润；肺小动脉及毛细血管无充血，副支气管内无炎性渗出物，间质无水肿增宽；肾小管上皮细胞无变性坏死，间质无充血，但局部肾小管上皮细胞与对照组一致，均出现轻度颗粒变性。这些结果表明菌株Y01对肉鸡具有安全性。
实施例 8 菌株Y01对肉鸡生长性能的影响
将120只1日龄肉鸡（公母各半）任意分为3组，分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，每组6个重复，每个重复10只。其中，对照组：每天使用矿泉水拌料饲喂；试验Ⅰ组：每天使用1´108CFU/mL Y01菌悬液拌料饲喂；试验Ⅱ组：每天使用1´107CFU/mL Y01菌悬液拌料饲喂。试验连续进行25天，每天每只鸡日用饲料克数为：10日龄前，每只鸡日用饲料克数为日龄+2；11-20日龄，每只鸡日用饲料克数为日龄+1；21-25日龄，每只鸡日用饲料克数和雏鸡日龄相等。每天称量和记录25天试验中雏鸡的体重并计算料肉比。
计算公式如下：平均日采食量（g/只）=（总投料重-总回收料重）/饲养天数；试验末平均体重（g/只）=试验末整群体重/试验末存活鸡数；试验初平均体重（g/只）=试验初整群体重/试验初存活鸡数；试验末平均增重（g/只）=试验末平均体重-试验初平均体重；平均日增重（g/只）=试验末平均增重/饲养天数；料肉比=平均日采食量/平均日增重。
结果如表7所示，试验Ⅰ组肉鸡试验末平均体重增重6.57%（p＜0.05），与对照组相比具有显著差异；且试验Ⅰ组料肉比显著低于对照组（p＜0.05）。
表7菌株Y01对肉鸡生长性能的影响（1-25天）
注: 同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05），无字母标注表示差异不显著（p＞0.05）。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌Y01，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Y01于2024年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.60195，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01在制备抑制病原菌制剂中的应用；所述病原菌为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01在提高动物生长性能中的应用；所述生长性能为动物的平均日增重和料肉比。
4.一种抑菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01的菌悬液或发酵液；所述发酵液中有效成分包括淀粉酶和蛋白酶；所述发酵液的制过程包括：将贝莱斯芽孢杆菌Y01接种于LB液体培养基中于37℃180r/min震荡培养20h，4℃5000g离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即得到贝莱斯芽孢杆菌Y01的无菌发酵液。
5.一种提高动物生长性能的饲料，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Y01的菌悬液或发酵液；所述发酵液中有效成分包括淀粉酶和蛋白酶；所述发酵液的制过程包括：将贝莱斯芽孢杆菌Y01接种于LB液体培养基中于37℃180r/min震荡培养20h，4℃5000g离心10min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，即得到贝莱斯芽孢杆菌Y01的无菌发酵液。
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