CN117070413B - 一株副干酪乳杆菌by5及其应用 - Google Patents

一株副干酪乳杆菌by5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌BY5及其应用，属于微生物技术领域。该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63639。本发明使用的益生菌制剂中不含抗生素，无药物残留，无耐药性，提高奶牛养殖的生物安全性，符合目前绿色生态养殖的理念。本发明是专门针对奶牛***炎问题开发的功能性益生菌，具有较高的适口性，能有效提高奶牛的采食率。本发明可以有效防治奶牛隐性***炎的发生，减少***炎的发病率，提高牛奶品质。

Description

一株副干酪乳杆菌BY5及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株副干酪乳杆菌BY5及其应用。
背景技术
奶牛***炎是奶牛的三大疾病之首，奶牛***炎是一种复杂的疾病，是致病微生物、环境因素、管理因素、奶牛自身及遗传因素等共同作用的结果。该病不仅对养殖业造成严重损失，而且对食品安全也带来很大威胁。***炎的防治难度非常大，全世界奶牛存栏量为2.2亿头，国外***炎发病率平均约为25％-60％，国内奶牛的临床型***炎发病率约为33.41％。全世界每年因***炎造成的损失高达350亿美元，我国每年因***炎造成泌乳量下降及医药费支出的损失约为1200-3600元/头。
随着抗生素的长期使用和不科学利用，细菌耐药性问题越来越严重，给人类的生产、生活、以及人和动物健康带来了巨大隐患。为解决这一问题和探寻“减抗替抗”策略，益生菌产品作为“减抗替抗”产品的研究正在快速发展。益生菌是指在给予足够的量时，对宿主健康产生有益影响的活的微生物。目前，益生菌制剂作为无毒、无污染、无副作用的绿色环保产品，越来越受到养殖行业的重视。益生菌制剂不仅是生产无公害畜产品的需要，也是增强我国畜产品突破国际贸易中“绿色壁垒”能力，促进饲料工业和畜牧养殖业可持续发展的必要条件之一。然而，益生菌制剂作为安全高效环保的新型产品，在奶牛隐性***炎和亚临床***炎防治的报道较少。因此，筛选具有防治奶牛隐性***炎和亚临床***炎的益生菌菌株及研发相关益生菌产品具有重要现实意义，并助力我国奶牛产业的健康发展。
发明内容
本发明的目的是提供一株副干酪乳杆菌BY5及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株副干酪乳杆菌BY5(Lacticaseibacillus paracasei)，该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63639。
本发明还提供一种微生物菌剂，包括所述副干酪乳杆菌BY5。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备防治奶牛***炎的药物中的应用。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备抑制致病菌粘附性的产品中的应用。
优选的是，所述致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
优选的是，所述产品包括试剂或者药物。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的应用。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的应用。
本发明还提供所述副干酪乳杆菌BY5或所述微生物菌剂在制备治疗普通变形杆菌引起的疾病的药物中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
1、本发明使用的益生菌制剂中不含抗生素，无药物残留，无耐药性，提高奶牛养殖的生物安全性，符合目前绿色生态养殖的理念。
2、本发明是专门针对奶牛***炎问题开发的功能性益生菌，具有较高的适口性，能有效提高奶牛的采食率。
3、本发明可以有效防治奶牛隐性***炎的发生，减少***炎的发病率，提高牛奶品质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为副干酪乳杆菌BY5的菌落形态图；
图2为副干酪乳杆菌BY5的革兰氏染色镜检图；
图3为副干酪乳杆菌BY5的PCR扩增图，其中，M泳道为2000bp的DNA Marker，泳道1为本发明菌株BY5；
图4为副干酪乳杆菌BY5抑制牛支原体的抑菌图；
图5为副干酪乳杆菌BY5抑制金黄葡萄球菌ATCC6538的抑菌图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
本发明实施例使用的培养基包括：
无菌PBS：称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g加入到800mL去离子水中，充分搅拌溶解后，加去离子水定容至1L，滴加盐酸调节pH至7.4后，121℃高压灭菌20min，室温保存备用。
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，K2HPO4·3H2O 2.0g，无水乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO4·7H2O0.29g，MnSO4·H2O 0.058g，将上述各成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH至7.2，于121℃高压灭菌20min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上中加入1.5％琼脂粉。
实施例1菌株的分离和鉴定
1.1菌株的分离
本发明副干酪乳杆菌BY5(Lacticaseibacillus paracasei BY5)分离并筛选自青海省门源县牧民的自酿酸奶。具体分离纯化方法为：称取酸奶1g，用9mL无菌PBS加入4颗无菌玻璃珠，涡旋充分混匀后，取1mL滤液，用PBS连续稀释至10-4，10-5，吸取0.1mL涂布于MRS平板上，分别于37℃厌氧培养24h，挑取不同形态大小的单菌落在MRS平板上连续纯化。
从MRS平板上挑取乳酸菌并依此编号，分别在MRS平板上划线纯化；待各分离株纯化后，各挑一单菌落于MRS中37℃厌氧培养24h后保存菌液，备用。
1.2菌株的形态观察
菌株BY5在MRS平板上呈灰白色色，菌落成圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，***(图1)。油镜下观察菌株BY5为革兰氏阳性杆菌，无芽孢，菌体呈蓝紫色(图2)。
1.3菌株的分子生物学鉴定
采用细菌鉴定16S rDNA通用引物27F及1492R进行PCR扩增，挑取1/4纯化后的单菌落作为PCR扩增模板，反应体系为25μL。PCR扩增程序如下：95℃，5min；95℃，45s；55℃，45s；72℃，70s；重复30个循环；72℃，8min；扩增产物由1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，产物大小约为1500bp(图3)。PCR产物送擎科泽西生物有限公司测序，测序结果提交NCBI进行Blast比对分析。其中分离株BY5序列与Lacticaseibacillus paracasei的序列同源性为100％。该菌株于2023年7月12日提交并保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63639。
实施例2副干酪乳杆菌BY5的安全性评价
2.1溶血性试验
将副干酪乳杆菌BY5在MRS液体培养基中连续三次传代，接种环蘸取少量培养液在哥伦比亚血琼脂培养基上划线，37℃厌氧培养24h后观察菌落周围是否出现溶血环，以溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus，为本实验室分离得到)作为阳性对照。细菌产生细胞溶血素在血平板上有三种表现方式：若出现草绿色圈，则为α-溶血；若菌落周围形成透明圆环，为β-溶血；若无溶血环，则为γ-溶血，也称无溶血。结果表明，副干酪乳杆菌BY5在血平板上均未出现α-溶血和β-溶血，初步认为表现出γ-溶血的菌株为安全性菌株。
2.2耐药基因检测试验
DNA提取：将连续三次传代、过夜培养的菌悬液离心，收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒提供的方法提取细菌DNA。
以提取的DNA为模板，PCR扩增BY5的卡那霉素耐药基因、庆大霉素耐药基因、四环素耐药基因和万古霉素耐药基因，合成引物(表1)。PCR反应体系(25μL)：LATaq预混酶12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
表1耐药基因引物序列
试验结果表明，BY5对4种耐药基因均为阴性，说明BY5耐药基因转移的可能性较低。
2.3药敏试验
采用纸片琼脂扩散法(Kirby–Bauer test，K-B法)检测BY5的药物敏感性。用无菌棉棒将菌悬液分别均匀涂布于MRS平板表面，室温下放置10-20min，用无菌镊子将药敏片贴于平板琼脂表面，分别在37℃厌氧培养24h后，用游标卡尺测量药敏片的抑菌圈，以大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli，ATCC25922)作为质控菌株，药敏结果参照美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute,CLSI)标准判定结果为：敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)。试验所用的抗生素共8类11种，包括β-内酰胺类氨苄西林(Ampicillin，10μg/片)、阿莫西林(Amoxicillin，20μg/片)、头孢噻肟(CefotaximeSodium，30μg/片)；氨基糖苷类卡那霉素(Kanamycin，30μg/片)、链霉素(Streptomycin，10μg/片)；喹诺酮类诺氟沙星(Norfloxacin，10μg/片)；大环内酯类红霉素(Erythromycin，15μg/片)；四环素类四环素(Tetracycline，30μg/片)；糖肽类万古霉素(Vancomycin，30μg/片)；氯霉素类氯霉素(Chloramphenicol，30μg/片)；林可胺类克林霉素(Clindamycin，2μg/片)。
表2BY5对抗生素敏感性结果
结果表明，副干酪乳杆菌BY5对氨基糖苷类卡那霉素和链霉素具有耐药性。
2.4体外安全性试验
选取健康雌性21日龄昆明(Kunming,KM)小鼠30只，适应性饲喂1周，自由采食、饮水，随机分成10只/组，共3组，分别为：正常对照组，低剂量组，高剂量组。各实验组小鼠均饲喂基础日粮，正常组每日灌胃生理盐水0.2mL/只/天，实验组灌胃本发明菌株副干酪乳杆菌BY5，具体实验设计见表3。试验持续14天，每天观察小鼠的生长状况、精神状态、被毛、两便等情况，做好记录。试验结束后，计算小鼠增重率，解剖观察脏器有无病变。
表3小鼠安全性试验设计
结果如表3所示，试验期间各组小鼠采食、精神、行为以及两便均正常，无明显差异，说明本发明菌株对小鼠的生长状况无影响。
表4小鼠体重增率(％)
解剖后仔细观察各组小鼠脏器，试验小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏均无肉眼可见病变，说明本发明副干酪乳杆菌BY5对小鼠是安全的。
实施例3菌株的益生特性
3.1耐酸耐胆盐试验
将BY5连续三次传代活化，按2％的接种量接种于不同pH＝3.0，以及0.3％(w/v)猪胆盐的PBS中，涡旋混匀后放置于37℃静置培养，分别于0h和3h取样，稀释到适宜梯度后在MRS平板上计数，37℃厌氧培养24h。
菌株耐受性的计算公式为：存活率(％)＝N3/N0×100％，
式中：N3为3h活菌数；N0为0h活菌数；活菌数用lg CFU/mL表示。
结果表明，BY5在酸和胆盐环境中的存活率较高，菌株BY5在pH＝3.0及以上条件下分别耐受3h后，存活率于75.12％，0.3％胆盐条件下能存活，存活率较低。
3.2抑菌试验
将副干酪乳杆菌BY5的新鲜菌悬液离心(4℃，6000rpm，10min)，上清液由0.22μm滤器过滤，本实施例中12株致病菌株分别为：大肠埃希氏杆菌ATCC43888、小肠结肠炎耶尔森菌ATCC23715、金黄色葡萄球菌ATCC6538、普通变形杆菌ATCC29905、以及沙门氏菌ATCC14028购自中国兽医药品监察所；牛支原体08m由宁夏农林科学院动物科学研究所惠赠；大肠埃希氏杆菌LXR1、大肠埃希氏杆菌LXR2、肺炎克雷伯菌SQ3A、***链球菌NM1、无乳链球菌BY1、以及肺炎克雷伯菌SQ5A均为本实验室分离获得。用无菌PBS将12株抑菌所用致病菌株浓度调节至1×106CFU/mL，并用无菌棉签均匀涂布于NA平板上，室温条件下静置10-20min后打孔(孔径±8mm，深度±4.5mm)，用1％琼脂封底，并吸取150μL滤液加入孔中，室温放置2h后37℃培养，待出现清晰抑菌圈时取出(大约18h)。用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)，用抑菌圈直径的大小表示益生菌抑菌活性。
结果表明，副干酪乳杆菌BY5均对12株常见致病菌有不同程度的抑制作用。如表5所示，该菌株可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、普通变形杆菌等多种病原菌的生长，对牛支原体有较强的抑制作用，抑菌圈直径达17.5mm(图4)，对金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑制作用如图5所示。
表5副干酪乳杆菌BY5抑菌能力测定(mm)
3.3抑制致病菌黏附性实验
Caco-2细胞的培养：将含有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培养基作为细胞培养、传代培养基，Caco-2细胞于37℃、5％ CO2恒温培养箱中培养，生长1d细胞换液，3d后传代(传代时用胰酶消化，1：5传代)。
致病菌标记：将新鲜培养的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli，ATCC43888)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium，ATCC14028)菌悬液离心(4℃，4000rpm,5min)，用无菌PBS连续洗涤三次，最后一次洗涤完成后用提前室温放置30min的FITC溶液重悬菌体，37℃振荡暗孵育2h，孵育结束后离心(4℃，4000rpm)并用PBS洗涤菌株3次，洗去未结合的FITC标记液，用RPMI-1640细胞培养液重悬并调节菌液浓度为2×108CFU/mL，测定菌株在波长485nm(吸收波长)和波长530nm(发射波长)条件下的相对荧光强度值(RFU)记为黏附前菌株相对荧光强度值R0。
益生菌菌悬液的制备：将本发明副干酪乳杆菌BY5菌株连续3次传代活化后，离心(4℃，4000rpm，10min)收集菌体，无菌PBS洗涤三次后用RPMI-1640细胞培养液调整菌液浓度为2×108CFU/mL。
竞争试验：以下试验在避光条件下进行。设置试验孔和空白对照孔，试验孔中加入0.3mL益生菌菌悬液和0.3mL已标记的致病菌菌悬液并混合均匀，空白对照组中加入0.3mLRPMI-1640细胞培养液和0.3mL已标记的致病菌菌悬液并混合均匀，每株益生菌同时设置3个重复孔，37℃、5％ CO2培养箱中暗孵育2h。
排斥试验：以下试验在避光条件下进行。设置试验孔和空白对照孔，首先试验孔中加入0.6mL的益生菌菌悬液，空白对照组加入0.6mL RPMI-1640细胞培养液，每株益生菌同时设置3个重复孔，37℃、5％ CO2培养箱中孵育1h后用PBS洗涤；其次每孔加入0.6mL已标记的致病菌菌悬液，避光孵育1h。
置换试验：以下试验在避光条件下进行。设置试验孔和空白对照孔，首先每孔加入0.6mL已标记的致病菌菌悬液，37℃、5％CO2培养箱中暗孵育1h后用PBS洗涤；其次试验组加入0.6mL益生菌菌悬液，空白对照组加入0.6mL RPMI-1640细胞培养液，每株益生菌设置3个重复孔，37℃、5％CO2培养箱中暗孵育1h。
试验结束后，用PBS洗涤三次后每孔加入0.3mL胰酶消化5min，用0.5mL RPMI-1640细胞培养液终止消化；在相同波长条件下测定细胞悬液的相对荧光强度值(RFU)。
菌株对致病菌的抑制黏附率(％)计算公式：(1-R/R0)×100％，式中：R：实验组的相对荧光强度值；R0：空白组的相对荧光强度值。
本发明上述异硫氰酸荧光素(FITC)标记液的配制(1mL)：取出4℃保存的FITC在室温条件下放置30min，称取0.5g FITC溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，即配成500mg/mL的溶液；吸取1μL上述溶液加入到999μL无菌PBS中，即工作浓度为500μg/mL的荧光标记液。
抑制致病菌黏附试验结果表明，上述发明菌株副干酪乳杆菌均可竞争性、置换性和排斥性抑制三种致病菌的黏附，其中对金黄色葡萄球菌的置换性抑制率最高达29.33％，其次为对金黄色葡萄球菌的竞争性抑制率为25.72％。说明本发明菌株副干酪乳杆菌BY5可以有效地通过竞争性和置换性抑制金黄色葡萄球菌的黏附，达到预防由金黄色葡萄球菌引起的奶牛***炎。
表6副干酪乳杆菌BY5对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌黏附Caco-2细胞的抑制率(％)
实施例4副干酪乳杆菌BY5在防治奶牛***炎的临床应用
4.1试验方法
在内蒙古巴彦淖尔市某奶牛场进行本次试验，选择泌乳条件相当，经LMT检测为隐性***炎的泌乳奶牛60头，随机分为对照组、BY5组、复合组，并编号，每组20头。对照组饲喂正常饲料，BY5组在对照组基础上添加益生菌BY5(1.5×1010CFU/头)，复合组在对照组基础上加复合益生菌制剂(副干酪乳杆菌BY5、枯草芽孢杆菌TA1、植物乳杆菌YJ3各1.2×1010CFU/头)。试验期为7d，每天进行LMT检测。试验前后分别对60只奶牛的生产性能、牛乳品质已经***炎程度进行判断，试验期间各组基础日粮完全相同，且自由饮水。
4.2LMT判定标准
将被检奶牛的4个乳区的牛乳分别挤在诊断盘中的4个小室中，倒出多余乳使每个小室内保留乳汁约2mL分别加入2mL试剂于小室内，同心圆摇动诊断盘，根据表7所示的判定标准进行判断。
表7LMT判定标准
4.3防治结果
如表8-9所示，防治奶牛***炎期间，养殖场无动物死亡。BY5组通过饲喂BY5益生菌制剂后奶牛隐性***炎防治有效率达85.0％，治愈率为85.0％；复合组通过饲喂复合益生菌制剂后奶牛隐性***炎防治有效率达90.0％，治愈率为90.0％。说明BY5单一制剂和BY5复合制剂均对奶牛***炎具有良好的防治效果。
表8奶牛隐形***炎检测结果
表9益生菌制剂防治奶牛***炎结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)BY5，其特征在于，该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63639。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5。
3.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备防治奶牛***炎的药物中的应用。
4.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备抑制致病菌粘附性的产品中的应用；
所述致病菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的至少一种；
所述产品为微生物菌剂或者药物。
5.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备治疗大肠杆菌引起的奶牛隐性***炎的药物中的应用。
6.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛隐性***炎的药物中的应用。
7.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备治疗沙门氏菌引起的奶牛隐性***炎的药物中的应用。
8.如权利要求1所述副干酪乳杆菌BY5或权利要求2所述微生物菌剂在制备治疗普通变形杆菌引起的奶牛隐性***炎的药物中的应用。
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