WO2014001102A1 - Propionibakterienstamm propionibacterium freundenreichii kt 021 - Google Patents

Abstract

Als Ergebnis des Screening-Verfahrens der Propionibakterien, isoliert aus Milchablagerungen, wurde der Stamm KT021 isoliert, der als zur Spezies Propionibacterium freundenreichii gehörig identifiziert wurde und sich durch hervorragende Fähigkeiten zur B12-Vitamin-, Folsäure- und Propionsäureproduktion auszeichnet. Dieser Stamm wurde in der Polnischen Kollektion der Mikroorganismen (Polska Kolekcja Mikroorganizmów) in Wrocław unter der Nummer B/00040 eingelagert.

Description

Propionibakterienstamm

Propionibacterium freundenreichii KT 021

Der Erfindungsgegenstand betrifft einen neuen Propionibakterienstamm

Propionibacterium freudenreichii, isoliert aus Milchablagerungen und aus einer großen Isolatpopulation durch das Screening-Verfahren herausselektiert, mit der Fähigkeit zur Propionsäure- und B 12- Vitaminproduktion.

Mikrobiologische Prozesse werden in großem Maßstab für die Herstellung von Lebensmitteln, Chemikalien, Biokraftstoffen und Arzneimitteln genutzt. Das Wesen dieser Prozesse besteht in der Fähigkeit der Mikroorganismen zur Biokonversion der

Züchtungsnährstoffbestandteile in bestimmte Zellmetaboliten. In industriellen Verfahren werden heraus selektierte Mikroorganismen genutzt, die sich durch bestimmte technologische Eigenschaften auszeichnen. In der entschiedenen Mehrheit der Produktionsverfahren werden einzelne Stämme genutzt, die unter Bedingungen gezüchtet werden, die der Ansteckung des Nährstoffs mit anderen Mikroorganismen vorbeugen. Dadurch kann der Prozess kontrolliert werden und die gewonnenen Endprodukte haben eine bestimmte, definierte chemische Zusammensetzung. Der entscheidende Faktor besteht in der Qualität des industriell genutzten Mikroorganismus. Diese Qualität ist abhängig von den überdurchschnittlichen Fähigkeiten zur Synthese bestimmter chemischer Verbindungen und zum Wachstum unter künstlichen, vom Menschen geschaffenen Bedingungen. Bei den industriell genutzten Mikroorganismen spielt die Widerstandsfähigkeit des betreffenden Organismus gegen Umweltstress, der bei der Züchtung in Bioreaktoren und während der Verarbeitung der Züchtungsflüssigkeiten entsteht, eine große Rolle. Die Fermentationsfähigkeiten industriell genutzter Mikroorganismen entscheiden über die Produktionsrentabilität und über die Marktposition des Herstellers. Deshalb werden außergewöhnliche Bemühungen zur Selektion der industriell genutzten Stämme unternommen.

In der Natur wird jede Spezies der Mikroorganismen durch eine riesige Population einzelner Zellen vertreten. Diese Zellen unterliegen zahlreichen Spontanmutationen, was zu großen Unterschieden in den metabolischen Fähigkeiten unter den Stämmen führt. Um wertvolle Stämme zu erhalten werden spezielle Selektionsverfahren durchgeführt, die es erlauben, Stämme zu isolieren, die sich durch hervorragende produktive Fähigkeiten auszeichnen. Diese Verfahren beruhen vor allem auf Fermentationstests, die eine Bestimmung der biochemischen Eigenschaften des betreffenden Stamms ermöglichen. Zu den am häufigsten verwendeten Tests gehören Tests zur Bestimmung der Fähigkeit der Bakterien zur Zuckerfermentation. Auf der Grundlage einer detaillierten Analyse der chemischen

Bestandteile - meistens mithilfe einer chromatographischen Untersuchung - der Metaboliten, die vom betreffenden Stamm erzeugt werden, werden die Haupt- und Nebenmetaboliten bestimmt. Über Materialbilanzen ist die Bestimmung technologischer Kennziffern, wie der Ergiebigkeit der Konversion des Substrats in den Metaboliten, des Nutzungsgrads des Substrats, der Leistungsfähigkeit der Zellbiomasse, der Volumenproduktivität des Bioreaktors und anderer wichtiger Parameter, möglich. Eine wichtige Rolle spielt hier ebenfalls die

Wachstumskinetik des Stamms auf einem bestimmten Nährstoff. Zu diesem Zweck wird der Test in Labor-Bioreaktoren durchgeführt.

In anderen Züchtungstests werden die Widerstandsfähigkeit des betreffenden Stamms gegen Toxine, hohen Osmosedruck, hohe Temperaturen, Ansäuerung der Nährstoffe und andere Züchtungsparameter untersucht.

Auf diese Art und Weise wird ein Ranking der isolierten Stämme nach festgelegten

Auswahlkriterien aufgestellt, was die Auswahl der wertvollsten Stämme erlaubt.

Im Verfahren zur Auswahl der Stämme für die Produktion spielt die genaue taxonomische Identifizierung des heraus selektierten Stammes eine wesentliche Rolle. Für eine vollständige Identifizierung sollten sowohl phänotypische wie auch genotypische Methoden genutzt werden. Die phänotypische Analyse umfasst die morphologische Charakteristik der Zellen und Kolonien, die chemische Zusammensetzung der Zellwände (Gram- Färbung),

Zelleinschlüsse, Vorratsstoffe, die Erzeugung von Farbstoffen, die Art und Weise der Ernährung (fotoautotroph, chemoorganotroph, chemolithotroph), Anforderungen an die Nährstoffe, Fermentationsprodukte, Temperatur- und pH-Wertebereiche, die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, Pathogenität, Verhältnis zum Sauerstoff, Serotypen und andere Eigenschaften. Solche Untersuchungen werden von speziellen, kommerziell zugänglichen Tests erleichtert. Zu den gängigsten Tests gehören die API- Tests, angeboten von der Firma Bio-Merieux und andere Systeme, wie das AMBIS-System zur Eiweißprofilanalyse und das System HP 5898A zur Fettprofilanalyse, die Systeme Micro-ID, Cobas IDA, RapID, Riboprint, MIS und andere. Unter den genotypischen Methoden werden Molekularsonden und die 16S-rRNA - Sequenzanalyse genutzt.

Der heraus selektierte wilde Stamm wird dann einer genetischen Verbesserung unterzogen. Sie wird durch langwierige Anpassungstechniken, physikalische und chemische Mutagenisierung sowie durch Gentechnik erzielt. Bei diesen Verfahren kommt es zu dauerhaften genetischen Änderungen im Genom des Ausgangs Stamms. Berücksichtigt werden nur die Mutanten oder Rekombinanten, die sich durch bessere technologische Eigenschaften auszeichnen als der Ausgangstamm.

Unter den industriell genutzten Mikroorganismen bilden die Propionibakterien eine wichtige Gruppe, die vor allem zur Herstellung von Schweizer Käse und zur Propionsäure- und B12- Vitaminproduktion verwendet werden. Die Effektivität der Fermentation hängt im

entscheidenden Grade von den metabolischen Fähigkeiten der verwendeten Mikroorganismen ab. Seit vielen Jahren werden intensive Untersuchungen mit dem Ziel der Auswahl von Stämmen durchgeführt, die als Überproduzenten (hervorragende Produzenten) von B12- Vitamin bezeichnet werden.

Bisher ist eine Reihe von Propionibakterienstämmen der Gattung Propionibacterium bekannt, die hervorragende Fähigkeiten zur B 12- Vitaminbiosynthese aufweisen. In diesem

Zusammenhang sind Stämme aufzuführen, die Gegenstand von Patentansprüchen sind, wie Propionibacterium jensenii 702 (Patent WO 2004001022 AI), Propionibacterium shermanii 1 (PL-Patent 392014), P. freundenreichii CBS 929.97, P. freundenreichii, P. shermanii NOC 11012, P. shermanii NOC 11012 (US-Patent 2002/6,492,141), Propionibacterium

acidipropionici DSM 8250 (US-Patent 2005/6,878,534).

Das Wesentliche der Erfindung besteht darin, dass im Ergebnis des Screening- Verfahrens, das die (1) Isolierung der Stämme unter Verwendung eines selektiven Nährstoffs mit

Natriumlactat und Schwermetallen, (2) Fermentationstests auf Molkenährstoff in der

Richtung auf die Propionsäureherstellung und in der Richtung der B 12- Vitaminbiosynthese, (3) chromatographische Analyse der Flüssigkeiten aus der Züchtung, (4)

Anpassungszüchtungen, (5) Verbesserungen durch chemische Mutagenisierung und (6) Fermentationen im Bioreaktor umfasst, ein neuer Bakterienstamm isoliert und ausgewählt wurde, der sich durch eine hohe Fähigkeit zur Propionsäure- und B 12- Vitaminproduktion auszeichnet. Auf der Grundlage des obigen Verfahrens wurde unter den gewonnenen Isolaten der Propionibakterien ein neuer Stamm ausgewählt, der sich durch die beste Fähigkeit zur B 12- Vitaminbiosynthese auszeichnet.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Propionibakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT021, isoliert aus Milchablagerungen und ausgewählt aus einer Isolatgruppe mit einem Screening-Verfahren, der in der Polnischen Kollektion der Mikroorganismen (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw am Institut für Immunologie und

Experimentelle Therapie "Ludwik Hirszfeld" (Instytut Immunologii i Terapii Doswiadczalnej im. Hirszfelda) in Wroclaw - Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Weigla 12, 53-114 Wroclaw, Polen - am 23. Mai 2012 unter der Nummer B/00040 hinterlegt worden ist. In bestimmten Ausführungsformen ist der erfindungs gemäße Bakterienstamm

Propionibacterium freundenreichii KT 021 dadurch gekennzeichnet, dass die Fähigkeit zur B 12- Vitaminherstellung in Züchtungen mit Süßmolke über 6 mg/1 beträgt.

Weiterhin kann der Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 in bestimmten Ausführungsformen im Ergebnis der Propionsäurefermentation von Molke die Fähigkeit zur Propionsäureproduktion in einer Menge über 20 g/1 haben.

Isolierungsmethode Die Bakterien, die zur Gattung Propionibacterium gehören, wurden aus Milchablagerungen isoliert. Für die Isolierung der Propionibakterien wurde das Nähragar YEL (Hefeextrakt - Lactat) gem. Malik u. a. 1986 verwendet. Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30-32 °C über 14 Tage durchgeführt. Der isolierte Stamm ist eine gram-positive Bakterie, die unter anaeroben Bedingungen wächst, jedoch fakultativ anaerob ist. Morphologische Eigenschaften

Diese Bakterien haben die Form kurzer, kleiner Stäbchen mit der Fähigkeit zur Pleomorphie (insbesondere unter den Bedingungen einer starken Ansäuerung der Züchtungsumgebung). Sie sind gram-positiv, unbeweglich, bilden keine Sporen. Auf dem Nähragar bilden sie weiße/leicht cremefarbene Kolonien mit einer runden Form und einem Durchmesser von ca. 1 mm.

Das gewonnene Isolat wurde dann einem Fermentationstest unterzogen, wobei hierfür der Test API 49 CH verwendet wurde. Nachfolgend wurde die Fermentationscharakteristik des neuen Stamms vorgestellt.

Inosit + (nach 72 h)

D-Mannitol +

D-Sorbitol +

Methyl-aD-mannopyranosid -

Methyl-aD-glukopyranosid -

N- Acetylgluco s amin +

Amygdalin +

Arbutin +

Aesculin Eisencitrat +

Salicin +

D-Cellobiose +

D-Maltose +

D-Lactose +

D-Melibiose -

D-Sacharose -

D-Trehalose +

Inulin -

D-Melezitose -

D-Raffinose -

Stärke -

Glykogen -

Xylitol -

Gentiobiose +

D-Turanose -

D-Lyxose -

D-Tagatose +

D-Fucose -

L-Fucose -

D-Arabitol -

L-Arabitol - Kaliumgluconat +

Kalium-2-Ketogluconat -

Kalium-5-Ketogluconat -

Biotechnologische Eigenschaften

Menge des erzeugten B 12- Vitamins im Wachstums verlauf mit verschiedenen Züchtungsnährstoffen

Propionsäureherstellung

Nebenmetabolite, gebildet im Ergebnis der Fermentation süßer Labmolke:

Bernsteinsäure - ca. 1 g/1

Essigsäure - ca. 3 g/1 Temperaturprofil

Wachstum im Bereich 17-37 °C mit einem Optimum bei 30 °C Auf der Grundlage der Nukleotidsequenzanalyse der 16S rRNA wurde festgestellt, dass sie eine 79 -tige Homologie zur Referenz sequenz für die Spezies Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii aufweist.

ATANTGCAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAA GAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGG GGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGG CATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGC ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGAC CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGA AGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAA GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TGTTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCA GCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGA GATAGAGC TTTCCCTTTGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTT GCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACG TGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCT CTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGC CGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGG TGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGT GAAGTCGTAACAGGGTAGC

Der Gegenstand der Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen vorgestellt.

Beispiel 1. (für Wachstum mit selektiven Nährstoffen)

Der Stamm P. freundenreichii KT021 wurde auf dem Nährboden YEL mit 2% Natriumlactat gezüchtet. Der Nährstoff wurde mit den Bakterien geimpft und die Züchtung wurde bei einer Temperatur von 30 °C über 72 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung wurde eine Trübung auf der YEL-Nährstoffoberfläche festgestellt, was die Wachstumsfähigkeit des untersuchten Stamms auf diesem selektiven Nährstoff bestätigt.

Beispiel 2. (Morphologische Eigenschaften)

Die Bakterien R freundenreichii KT021 wurden auf mit Agar verfestigtem Nährbouillon ausgesät und in einem Brutschrank bei einer Temperatur von 30 °C über 72 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurden ausgewachsene Bakterienkolonien beobachtet. Die weißen und weißbeigen Kolonien hatten eine runde Form mit einem Durchmesser von ca. 1 mm. Auf dieser Grundlage wurde festgestellt, dass die Form der Kolonien für Bakterien der Spezies

Propionibacterium freundenreichii typisch ist.

Beispiel 3. (für die Fermentationsfähigkeit)

Der Stamm P. freundenreichii KT 0021 wurde auf einem flüssigen Nährstoff mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet (g/1): 1,0 - Hefeextrakt, 0,2 - Magnesiumsulfat, 0,05 - Mangansulfat, 0,1 - Tween 80. Es wurden drei Fermentationstests durchgeführt: mit 2% Glucose, 2% Lactose und 2% Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle für die Zellen. Zusätzlich wurde ein Kontrolltest durchgeführt, bei dem der Nährstoff ohne Zusatz von Zucker oder Alkohol verwendet wurde. Die Züchtung wurde über 72 h in der Temperatur von 30 °C bei einem pH-Wert von 6,5 durchgeführt, wobei ein Mittel hinzugefügt wurde, das die entstehende Propionsäure neutralisiert. Nach dieser Zeit wurde eine Trübung des Nährstoffs in allen Kulturen festgestellt. Auf der Grundlage einer mengenmäßigen Untersuchung wurde festgestellt, dass in den Nährstoffen mit Glucose, Lactose und Glycerin im Vergleich zum Kontrolltest ein deutlicher Anstieg der Zellenzahl erfolgte, was die Fähigkeit des untersuchten Bakterienstamms zur Fermentation von Glucose, Lactose und Glycerin bestätigt.

Beispiel 4. (für die B 12- Vitaminbiosynthese aus Molke)

Die Labmolke mit 5,2% Lactose wurde in einen Labor-Bioreaktor mit einem Volumen von 5 1 eingebracht, bei einer Temperatur von 121 °C über 15 min sterilisiert, auf die Temperatur von 30 °C abgekühlt - der pH- Wert wurde auf 7,0 geregelt - und mit den Bakterien

Propionibacterium freundenreichii in der Menge von l,3xl0⁶ cfu/ml geimpft. Dann wurden Hefeextrakt in der Menge von 1,5 g/1, 5 mg Kobaltchlorid, 15 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol und 10 mg para-Aminobenzoesäure in den Nährstoff eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt über 168 h, bei sanftem Mischen des Nährstoffs und bei Aufrechterhaltung des pH- Werts im Bereich von 6,5-7,0 durchgeführt. In der fertig fermentierten Molke betrug die B12- Vitaminkonzentration 6,34 mg/1 und die Folsäurekonzentration 3,2 mg/1.

Beispiel 5. (für die B 12- Vitaminbiosynthese aus Abfallglycerin)

Der Fermentationsnährstoff mit den folgenden Substanzen in 1 1: 20 % Glycerin, 3 g

Caseinhydrolysat, 10 g Abioseston, 1.76 g K3P04, 2.29 g NaH2P04x2H20, 0.3 mg Biotin, 4 mg Calciumpantothenat, 5 mg FeS04x7H20, 2 mg CoS04x6H20, 10 mg MnC12x4H20, 2 mg ZnC12, 0.2 g MgC12x6H20 wurde der Pasteurisierung im Plattenwärmeaustauscher in der Temperatur von 121°C über 15 min unterzogen und in einen sterilen Bioreaktor mit einem Volumen von 1500 1 gepumpt, der mit einem System zur Mantelthermostatierung und mit einem mechanischen Mischer ausgestattet war. Die Temperatur des Glycerinnährstoffs wurde auf 28 °C verringert und der pH- Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Der so vorbereitete Nährstoff wurde mit den Bakterien Propionibacterium freundenreichii KT021 in der Menge von 1,1 xlO⁶ cfu/ml geimpft. Die Züchtung wurde bis zur vollständigen Fermentierung des Glycerins bei sanftem Mischen zur Gewährleistung der Homogenität des Nährstoffs und bei

Aufrechterhaltung des pH- Werts auf einem konstanten Niveau durchgeführt. In der 72.

Stunde wurden B 12- Vitaminvorläufer in Gestalt von 2 mg Kobaltsulfat und 16 mg/1 5,6- Dimethylbenzimidazol hinzugegeben. Im fermentierten Nährstoff wurde eine B12- Vitaminkonzentration von 8,9 mg/1 festgestellt. Beispiel 6. (für die Propionsäureproduktion aus Molke)

Die Sauermolke mit 4,3% w/v Lactose wurde in einen Labor-Bioreaktor mit einem Volumen von 5 1 eingebracht, bei einer Temperatur von 121 °C über 15 min sterilisiert, auf die Temperatur von 30 °C abgekühlt - der pH- Wert wurde auf 7,0 geregelt - und mit den

Bakterien Propionibacterium fr eundenreichii KT021 in der Menge von 1,3x10(5 cfu/ml geimpft. Dann wurde Hefeextrakt in der Menge von 1,0 g/1 in den Nährstoff eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt über 96 Stunden bei sanftem Mischen des Nährstoffs

durchgeführt. Auf der Grundlage der chromatographischen Analyse wurde festgestellt, dass die Bakterien 2,1% w/v Propionsäure hergestellt haben.

Beispiel 7. (für die Propionsäureproduktion aus Glycerin)

Der Fermentationsnährstoff mit den folgenden Substanzen in 1 1: 50 g Glycerin, 3 g

Caseinhydrolysat, 5 g Abioseston, 2 g K3P04, 4 g NaH2P04x2H20, 0.3 mg Biotin, 4 mg Calciumpantothenat, 5 mg FeS04x7H20, 2 mg CoS04x6H20, 10 mg MnC12x4H20, 2 mg ZnC12, 0.2 g MgC12x6H20 wurde der Pasteurisierung im Plattenwärmeaustauscher bei der Temperatur von 85°C über 10 min unterzogen und in einen sterilen Bioreaktor mit einem Volumen von 150 1 gepumpt, der mit einem System zur Mantelthermostatierung und mit einem mechanischen Mischer ausgestattet war. Die Temperatur des Glycerinnährstoffs wurde auf 28 °C verringert und der pH- Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Der so vorbereitete Nährstoff wurde mit den Bakterien Propionibacterium freundenreichii KT021 in der Menge von 1,1 xlO⁶ cfu/ml geimpft. Die Züchtung wurde bis zur vollständigen Fermentierung des Glycerins bei sanftem Mischen zur Gewährleistung der Homogenität des Nährstoffs durchgeführt. Im fermentierten Nährstoff wurde eine Propionsäurekonzentration von 15,8 g/1 festgestellt. Beispiel 8. (für die B 12- Vitaminproduktion aus einer Mischung von Molke und Glycerin) Labmolke mit 5,7% Lactose wurde in einen Bioreaktor eingebracht, der mit einem Mischer und einem Heizmantel ausgestattet war - 2% Glycerin wurden hinzugefügt, das Ganze wurde gemischt und der thermischen Sterilisierung bei einer Temperatur von 115 °C über 15 min unterzogen. Dann wurde der Nährstoff auf die Temperatur von 30 °C gekühlt, der Säuregrad wurde auf den pH-Wert von 7,2 geregelt und mit den Bakterien Propionibacterium

freundenreichii KT021 in der Menge von l,3xl0⁶ cfu/ml geimpft. Nach 72 Stunden

Fermentation wurden in den Nährstoff bekannte Vorläufer und Stimulatoren der B12- Vitaminsynthese, das sind 5 mg/1 Kobaltchlorid, 15 mg/1 5,6-Dimethylbenzimidazol und 12 mg/1 para-Aminobenzoesäure, eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt überl68 Stunden bei sanftem Mischen des Nährstoffs durchgeführt. Nach Abschluss der Fermentation enthielt der Nährstoff 8,2 mg B 12- Vitamin/ 1 Nährstoff.

Claims

Patentansprüche

1. Propionibakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT021, isoliert aus

Milchablagerungen und ausgewählt aus einer Isolatgruppe mit dem Screening- Verfahren, in der Polnischen Kollektion der Mikroorganismen (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw unter der Nummer B/00040 hinterlegt.

2. Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Fähigkeit zur B 12- Vitaminherstellung in den Züchtungen mit Süßmolke über 6 mg/1 beträgt.

3. Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass er im Ergebnis der Propionsäurefermentation der Molke die Fähigkeit zur Propionsäureproduktion in der Menge über 20 g/1 hat.