WO2014001102A1 - Propioni bacteria phylum propionibacterium freundenreichii kt 021 - Google Patents

Abstract

As a result of a screening method for propioni bacteria that can be isolated from milk deposits, phylum KT021 was isolated and identified as belonging to the species propioni freundenreichii. Said bacterium is characterised by excellent capabilities for vitamin B12, folic acid and propionic acid production. Said phylum has been stored in the Polish collection of microorganisms (Polska Kolekcja Mikroorganizmów) in Wroclaw under number B/00040.

Description

Propionibakterienstamm  Propionibakterienstamm

Propionibacterium freundenreichii KT 021  Propionibacterium freundereichii KT 021

Der Erfindungsgegenstand betrifft einen neuen Propionibakterienstamm The subject invention relates to a new Propionibakterienstamm

Propionibacterium freudenreichii, isoliert aus Milchablagerungen und aus einer großen Isolatpopulation durch das Screening-Verfahren herausselektiert, mit der Fähigkeit zur Propionsäure- und B 12- Vitaminproduktion. Propionibacterium freudenreichii, isolated from milk deposits and selected from a large isolate population by the screening method, with the ability to produce propionic acid and B 12 vitamins.

Mikrobiologische Prozesse werden in großem Maßstab für die Herstellung von Lebensmitteln, Chemikalien, Biokraftstoffen und Arzneimitteln genutzt. Das Wesen dieser Prozesse besteht in der Fähigkeit der Mikroorganismen zur Biokonversion der Microbiological processes are used on a large scale for the production of food, chemicals, biofuels and pharmaceuticals. The essence of these processes is the ability of microorganisms to bioconvert the

Züchtungsnährstoffbestandteile in bestimmte Zellmetaboliten. In industriellen Verfahren werden heraus selektierte Mikroorganismen genutzt, die sich durch bestimmte technologische Eigenschaften auszeichnen. In der entschiedenen Mehrheit der Produktionsverfahren werden einzelne Stämme genutzt, die unter Bedingungen gezüchtet werden, die der Ansteckung des Nährstoffs mit anderen Mikroorganismen vorbeugen. Dadurch kann der Prozess kontrolliert werden und die gewonnenen Endprodukte haben eine bestimmte, definierte chemische Zusammensetzung. Der entscheidende Faktor besteht in der Qualität des industriell genutzten Mikroorganismus. Diese Qualität ist abhängig von den überdurchschnittlichen Fähigkeiten zur Synthese bestimmter chemischer Verbindungen und zum Wachstum unter künstlichen, vom Menschen geschaffenen Bedingungen. Bei den industriell genutzten Mikroorganismen spielt die Widerstandsfähigkeit des betreffenden Organismus gegen Umweltstress, der bei der Züchtung in Bioreaktoren und während der Verarbeitung der Züchtungsflüssigkeiten entsteht, eine große Rolle. Die Fermentationsfähigkeiten industriell genutzter Mikroorganismen entscheiden über die Produktionsrentabilität und über die Marktposition des Herstellers. Deshalb werden außergewöhnliche Bemühungen zur Selektion der industriell genutzten Stämme unternommen. Breeding nutrient ingredients in certain cell metabolites. In industrial processes selected microorganisms are used, which are characterized by certain technological properties. In the decided majority of the production methods, individual strains are used, which are bred under conditions that prevent the nutrient from infecting with other microorganisms. Thus, the process can be controlled and the final products obtained have a specific, defined chemical composition. The decisive factor is the quality of the industrially used microorganism. This quality depends on the above-average ability to synthesize certain chemical compounds and grow under artificial, man-made conditions. In the industrially used microorganisms, the resistance of the organism to environmental stress, which arises during the cultivation in bioreactors and during the processing of the breeding fluids, plays a major role. The fermentation capabilities of industrially used microorganisms determine the production profitability and the market position of the manufacturer. Therefore, extraordinary efforts are being made to select the industrially used tribes.

In der Natur wird jede Spezies der Mikroorganismen durch eine riesige Population einzelner Zellen vertreten. Diese Zellen unterliegen zahlreichen Spontanmutationen, was zu großen Unterschieden in den metabolischen Fähigkeiten unter den Stämmen führt. Um wertvolle Stämme zu erhalten werden spezielle Selektionsverfahren durchgeführt, die es erlauben, Stämme zu isolieren, die sich durch hervorragende produktive Fähigkeiten auszeichnen. Diese Verfahren beruhen vor allem auf Fermentationstests, die eine Bestimmung der biochemischen Eigenschaften des betreffenden Stamms ermöglichen. Zu den am häufigsten verwendeten Tests gehören Tests zur Bestimmung der Fähigkeit der Bakterien zur Zuckerfermentation. Auf der Grundlage einer detaillierten Analyse der chemischen In nature, each species of microorganism is represented by a huge population of individual cells. These cells undergo numerous spontaneous mutations, resulting in large differences in the metabolic capabilities among the strains. To obtain valuable strains special selection procedures are carried out, which allow to isolate strains that are characterized by excellent productive abilities distinguished. These methods are mainly based on fermentation tests, which allow a determination of the biochemical properties of the strain in question. The most commonly used tests include tests to determine the ability of the bacteria to ferment sugar. On the basis of a detailed analysis of the chemical

Bestandteile - meistens mithilfe einer chromatographischen Untersuchung - der Metaboliten, die vom betreffenden Stamm erzeugt werden, werden die Haupt- und Nebenmetaboliten bestimmt. Über Materialbilanzen ist die Bestimmung technologischer Kennziffern, wie der Ergiebigkeit der Konversion des Substrats in den Metaboliten, des Nutzungsgrads des Substrats, der Leistungsfähigkeit der Zellbiomasse, der Volumenproduktivität des Bioreaktors und anderer wichtiger Parameter, möglich. Eine wichtige Rolle spielt hier ebenfalls dieIngredients - mostly by means of a chromatographic study - of the metabolites produced by the strain in question, the major and minor metabolites are determined. Material balances allow the determination of technological parameters such as the conversion efficiency of the substrate into the metabolite, the degree of utilization of the substrate, the efficiency of the cell biomass, the volume productivity of the bioreactor and other important parameters. An important role also plays here the

Wachstumskinetik des Stamms auf einem bestimmten Nährstoff. Zu diesem Zweck wird der Test in Labor-Bioreaktoren durchgeführt. Growth kinetics of the strain on a given nutrient. For this purpose, the test is carried out in laboratory bioreactors.

In anderen Züchtungstests werden die Widerstandsfähigkeit des betreffenden Stamms gegen Toxine, hohen Osmosedruck, hohe Temperaturen, Ansäuerung der Nährstoffe und andere Züchtungsparameter untersucht. In other breeding tests, the resistance of the strain in question to toxins, high osmotic pressure, high temperatures, acidification of nutrients and other breeding parameters are examined.

Auf diese Art und Weise wird ein Ranking der isolierten Stämme nach festgelegten In this way, a ranking of isolated strains is determined according to

Auswahlkriterien aufgestellt, was die Auswahl der wertvollsten Stämme erlaubt. Selection criteria, which allows the selection of the most valuable strains.

Im Verfahren zur Auswahl der Stämme für die Produktion spielt die genaue taxonomische Identifizierung des heraus selektierten Stammes eine wesentliche Rolle. Für eine vollständige Identifizierung sollten sowohl phänotypische wie auch genotypische Methoden genutzt werden. Die phänotypische Analyse umfasst die morphologische Charakteristik der Zellen und Kolonien, die chemische Zusammensetzung der Zellwände (Gram- Färbung), In the process for selecting the strains for production, the exact taxonomic identification of the selected strain plays an essential role. For a complete identification both phenotypic and genotypic methods should be used. The phenotypic analysis includes the morphological characteristics of the cells and colonies, the chemical composition of the cell walls (Gram stain),

Zelleinschlüsse, Vorratsstoffe, die Erzeugung von Farbstoffen, die Art und Weise der Ernährung (fotoautotroph, chemoorganotroph, chemolithotroph), Anforderungen an die Nährstoffe, Fermentationsprodukte, Temperatur- und pH-Wertebereiche, die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, Pathogenität, Verhältnis zum Sauerstoff, Serotypen und andere Eigenschaften. Solche Untersuchungen werden von speziellen, kommerziell zugänglichen Tests erleichtert. Zu den gängigsten Tests gehören die API- Tests, angeboten von der Firma Bio-Merieux und andere Systeme, wie das AMBIS-System zur Eiweißprofilanalyse und das System HP 5898A zur Fettprofilanalyse, die Systeme Micro-ID, Cobas IDA, RapID, Riboprint, MIS und andere. Unter den genotypischen Methoden werden Molekularsonden und die 16S-rRNA - Sequenzanalyse genutzt. Cell inclusions, storage substances, the production of dyes, the way of nutrition (photoautotroph, chemoorganotroph, chemolithotroph), requirements for nutrients, fermentation products, temperature and pH ranges, sensitivity to antibiotics, pathogenicity, relation to oxygen, serotypes and other properties. Such studies are facilitated by special, commercially available tests. The most common tests include the API tests offered by the company Bio-Merieux and other systems such as the AMBIS protein profile analysis system and the HP 5898A lipid profile analysis system, the Micro-ID systems, Cobas IDA, RapID, Riboprint, MIS and others. Among the genotypic methods, molecular probes and 16S rRNA sequence analysis are used.

Der heraus selektierte wilde Stamm wird dann einer genetischen Verbesserung unterzogen. Sie wird durch langwierige Anpassungstechniken, physikalische und chemische Mutagenisierung sowie durch Gentechnik erzielt. Bei diesen Verfahren kommt es zu dauerhaften genetischen Änderungen im Genom des Ausgangs Stamms. Berücksichtigt werden nur die Mutanten oder Rekombinanten, die sich durch bessere technologische Eigenschaften auszeichnen als der Ausgangstamm. The selected wild strain is then subjected to genetic improvement. It is achieved by lengthy adaptation techniques, physical and chemical mutagenization and genetic engineering. These processes result in permanent genetic changes in the genome of the parent strain. Only the mutants or recombinants that have better technological properties than the parent strain are considered.

Unter den industriell genutzten Mikroorganismen bilden die Propionibakterien eine wichtige Gruppe, die vor allem zur Herstellung von Schweizer Käse und zur Propionsäure- und B12- Vitaminproduktion verwendet werden. Die Effektivität der Fermentation hängt im Among the industrially used microorganisms, the propionibacteria constitute an important group, which are mainly used for the production of Swiss cheese and for propionic acid and B12 vitamin production. The effectiveness of the fermentation depends on

entscheidenden Grade von den metabolischen Fähigkeiten der verwendeten Mikroorganismen ab. Seit vielen Jahren werden intensive Untersuchungen mit dem Ziel der Auswahl von Stämmen durchgeführt, die als Überproduzenten (hervorragende Produzenten) von B12- Vitamin bezeichnet werden. decisive degree of the metabolic abilities of the microorganisms used. For many years, intensive studies have been carried out with the aim of selecting strains called overproducers (excellent producers) of B12 vitamin.

Bisher ist eine Reihe von Propionibakterienstämmen der Gattung Propionibacterium bekannt, die hervorragende Fähigkeiten zur B 12- Vitaminbiosynthese aufweisen. In diesem Heretofore, a number of propionibacterial strains of the genus Propionibacterium are known which have excellent B 12 vitamin biosynthesis abilities. In this

Zusammenhang sind Stämme aufzuführen, die Gegenstand von Patentansprüchen sind, wie Propionibacterium jensenii 702 (Patent WO 2004001022 AI), Propionibacterium shermanii 1 (PL-Patent 392014), P. freundenreichii CBS 929.97, P. freundenreichii, P. shermanii NOC 11012, P. shermanii NOC 11012 (US-Patent 2002/6,492,141), Propionibacterium  In this context, there should be mentioned strains which are the subject of patent claims, such as Propionibacterium jensenii 702 (patent WO 2004001022 A1), Propionibacterium shermanii 1 (PL patent 392014), P. friendsandii CBS 929.97, P. friendsiiii, P. shermanii NOC 11012, P. Shermanii NOC 11012 (US Patent 2002 / 6,492,141), Propionibacterium

acidipropionici DSM 8250 (US-Patent 2005/6,878,534). acidipropionic DSM 8250 (US Patent 2005 / 6,878,534).

Das Wesentliche der Erfindung besteht darin, dass im Ergebnis des Screening- Verfahrens, das die (1) Isolierung der Stämme unter Verwendung eines selektiven Nährstoffs mit The essence of the invention is that, as a result of the screening method, the (1) isolation of the strains using a selective nutrient with

Natriumlactat und Schwermetallen, (2) Fermentationstests auf Molkenährstoff in der Sodium lactate and heavy metals, (2) fermentation tests on whey nutrient in the

Richtung auf die Propionsäureherstellung und in der Richtung der B 12- Vitaminbiosynthese, (3) chromatographische Analyse der Flüssigkeiten aus der Züchtung, (4) Direction of Propionic Acid Production and the Direction of B 12 Vitamin Biosynthesis, (3) Chromatographic Analysis of Liquids from Breeding, (4)

Anpassungszüchtungen, (5) Verbesserungen durch chemische Mutagenisierung und (6) Fermentationen im Bioreaktor umfasst, ein neuer Bakterienstamm isoliert und ausgewählt wurde, der sich durch eine hohe Fähigkeit zur Propionsäure- und B 12- Vitaminproduktion auszeichnet. Auf der Grundlage des obigen Verfahrens wurde unter den gewonnenen Isolaten der Propionibakterien ein neuer Stamm ausgewählt, der sich durch die beste Fähigkeit zur B 12- Vitaminbiosynthese auszeichnet. Adaptation breeding; (5) chemical mutagenization enhancements; and (6) fermentation in the bioreactor comprising a new bacterial strain isolated and selected which is characterized by a high capacity for propionic acid and B 12 vitamin production. Based on the above procedure, among the recovered isolates of the propionibacteria, a new strain was selected which has the best ability for B 12 vitamin biosynthesis.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Propionibakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT021, isoliert aus Milchablagerungen und ausgewählt aus einer Isolatgruppe mit einem Screening-Verfahren, der in der Polnischen Kollektion der Mikroorganismen (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw am Institut für Immunologie und The present invention relates to the propionibacterial strain Propionibacterium freundereichii KT021, isolated from milk deposits and selected from an isolate group by a screening method described in the Polish Collection of Microorganisms (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw at the Institute of Immunology and

Experimentelle Therapie "Ludwik Hirszfeld" (Instytut Immunologii i Terapii Doswiadczalnej im. Hirszfelda) in Wroclaw - Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Weigla 12, 53-114 Wroclaw, Polen - am 23. Mai 2012 unter der Nummer B/00040 hinterlegt worden ist. In bestimmten Ausführungsformen ist der erfindungs gemäße Bakterienstamm Experimental therapy "Ludwik Hirszfeld" (Instytut Immunologii i Terapii Doswiadczalnej in Hirszfelda) in Wroclaw - Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences, Weigla 12, 53-114 Wroclaw, Poland - on May 23, 2012 under the number B / 00040 has been deposited. In certain embodiments, the bacterial strain according to the invention is

Propionibacterium freundenreichii KT 021 dadurch gekennzeichnet, dass die Fähigkeit zur B 12- Vitaminherstellung in Züchtungen mit Süßmolke über 6 mg/1 beträgt.  Propionibacterium freundereichii KT 021, characterized in that the ability for B 12 vitamin production in sweet whey breeds is above 6 mg / l.

Weiterhin kann der Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 in bestimmten Ausführungsformen im Ergebnis der Propionsäurefermentation von Molke die Fähigkeit zur Propionsäureproduktion in einer Menge über 20 g/1 haben. Furthermore, in certain embodiments, the bacterial strain Propionibacterium freundereichii KT 021 may have the ability to produce propionic acid in an amount greater than 20 g / l as a result of the propionic acid fermentation of whey.

Isolierungsmethode Die Bakterien, die zur Gattung Propionibacterium gehören, wurden aus Milchablagerungen isoliert. Für die Isolierung der Propionibakterien wurde das Nähragar YEL (Hefeextrakt - Lactat) gem. Malik u. a. 1986 verwendet. Die Züchtung wurde unter anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30-32 °C über 14 Tage durchgeführt. Der isolierte Stamm ist eine gram-positive Bakterie, die unter anaeroben Bedingungen wächst, jedoch fakultativ anaerob ist. Morphologische Eigenschaften Isolation method The bacteria belonging to the genus Propionibacterium were isolated from milk deposits. For the isolation of the propionibacteria, the nutrient agar YEL (yeast extract - lactate) was gem. Malik and others 1986 used. The cultivation was carried out under anaerobic conditions at a temperature of 30-32 ° C for 14 days. The isolated strain is a Gram-positive bacterium that grows under anaerobic conditions, but is optionally anaerobic. Morphological properties

Diese Bakterien haben die Form kurzer, kleiner Stäbchen mit der Fähigkeit zur Pleomorphie (insbesondere unter den Bedingungen einer starken Ansäuerung der Züchtungsumgebung). Sie sind gram-positiv, unbeweglich, bilden keine Sporen. Auf dem Nähragar bilden sie weiße/leicht cremefarbene Kolonien mit einer runden Form und einem Durchmesser von ca. 1 mm. These bacteria are in the form of short, small rods with the ability to pleomorphic (especially under the conditions of a strong acidification of the breeding environment). They are gram-positive, immobile, do not form spores. On the nutrient agar they form white / slightly cream-colored colonies with a round shape and a diameter of about 1 mm.

Das gewonnene Isolat wurde dann einem Fermentationstest unterzogen, wobei hierfür der Test API 49 CH verwendet wurde. Nachfolgend wurde die Fermentationscharakteristik des neuen Stamms vorgestellt. The recovered isolate was then subjected to a fermentation test using the API 49 CH test. The fermentation characteristics of the new strain were presented below.

Inosit + (nach 72 h)

Inositol + (after 72 h)

D-Mannitol + D-mannitol +

D-Sorbitol +  D-sorbitol +

Methyl-aD-mannopyranosid - Methyl-a-mannopyranoside -

Methyl-aD-glukopyranosid -Methyl-a-glucopyranoside -

N- Acetylgluco s amin + N-acetylglucosamine +

Amygdalin +  Amygdalin +

Arbutin +  Arbutin +

Aesculin Eisencitrat +  Aesculin iron citrate +

Salicin +  Salicin +

D-Cellobiose +  D-cellobiose +

D-Maltose +  D-maltose +

D-Lactose +  D-lactose +

D-Melibiose - D-Melibiose -

D-Sacharose -D-sucrose -

D-Trehalose + D-trehalose +

Inulin - Inulin -

D-Melezitose -D-melezitose -

D-Raffinose -D-raffinose -

Stärke -Strength -

Glykogen -Glycogen -

Xylitol -Xylitol -

Gentiobiose + Gentiobiose +

D-Turanose - D-Turanose -

D-Lyxose -D-Lyxose -

D-Tagatose + D-tagatose +

D-Fucose - D-fucose -

L-Fucose -L-fucose -

D-Arabitol -D-arabitol -

L-Arabitol - Kaliumgluconat +L-arabitol - Potassium gluconate +

Kalium-2-Ketogluconat -Potassium 2-ketogluconate -

Kalium-5-Ketogluconat -Potassium 5-ketogluconate -

Biotechnologische Eigenschaften Biotechnological properties

Menge des erzeugten B 12- Vitamins im Wachstums verlauf mit verschiedenen Züchtungsnährstoffen Amount of B 12 vitamin produced in the growth course with various breeding nutrients

Propionsäureherstellung Propionsäureherstellung

Nebenmetabolite, gebildet im Ergebnis der Fermentation süßer Labmolke:  Secondary metabolites, formed as a result of fermentation of sweet rennet whey:

Bernsteinsäure - ca. 1 g/1 Succinic acid - about 1 g / 1

Essigsäure - ca. 3 g/1 Temperaturprofil Acetic acid - about 3 g / 1 temperature profile

Wachstum im Bereich 17-37 °C mit einem Optimum bei 30 °C Auf der Grundlage der Nukleotidsequenzanalyse der 16S rRNA wurde festgestellt, dass sie eine 79 -tige Homologie zur Referenz sequenz für die Spezies Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii aufweist. Growth in the range 17-37 ° C with an optimum at 30 ° C Based on the nucleotide sequence analysis of the 16S rRNA, it was found that it has a 79-homology to the reference sequence for the species Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii.

ATANTGCAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAA GAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGG GGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGG CATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGC ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGAC CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGA AGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAA GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TGTTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCA GCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGA GATAGAGC TTTCCCTTTGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTT GCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACG TGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCT CTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGC CGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGG TGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGT GAAGTCGTAACAGGGTAGC ATANTGCAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAA GAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGG GGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGG CATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGC ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGAC CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGA AGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAA GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TGTTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCA GCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGA GATAGAGC TTTCCCTTTGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTT GCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACG TGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCT CTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGC CGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGG TGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGT GAAGTCGTAACAGGGTAGC

Der Gegenstand der Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen vorgestellt. The object of the invention is presented in the following embodiments.

Beispiel 1. (für Wachstum mit selektiven Nährstoffen) Example 1. (for growth with selective nutrients)

Der Stamm P. freundenreichii KT021 wurde auf dem Nährboden YEL mit 2% Natriumlactat gezüchtet. Der Nährstoff wurde mit den Bakterien geimpft und die Züchtung wurde bei einer Temperatur von 30 °C über 72 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung wurde eine Trübung auf der YEL-Nährstoffoberfläche festgestellt, was die Wachstumsfähigkeit des untersuchten Stamms auf diesem selektiven Nährstoff bestätigt.  The strain P. freundereichii KT021 was grown on the medium YEL with 2% sodium lactate. The nutrient was inoculated with the bacteria and the cultivation was carried out at a temperature of 30 ° C for 72 hours. Upon completion of the cultivation, turbidity was detected on the YEL nutrient surface, confirming the ability of the strain studied to grow on this selective nutrient.

Beispiel 2. (Morphologische Eigenschaften) Example 2. (morphological properties)

Die Bakterien R freundenreichii KT021 wurden auf mit Agar verfestigtem Nährbouillon ausgesät und in einem Brutschrank bei einer Temperatur von 30 °C über 72 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurden ausgewachsene Bakterienkolonien beobachtet. Die weißen und weißbeigen Kolonien hatten eine runde Form mit einem Durchmesser von ca. 1 mm. Auf dieser Grundlage wurde festgestellt, dass die Form der Kolonien für Bakterien der Spezies  The bacteria R friends KIII were seeded on agar-solidified broth and incubated in an incubator at a temperature of 30 ° C for 72 h. After this time, mature bacterial colonies were observed. The white and white-beige colonies had a round shape with a diameter of about 1 mm. On this basis, it was found that the shape of the colonies for bacteria of the species

Propionibacterium freundenreichii typisch ist. Propionibacterium freundereichii is typical.

Beispiel 3. (für die Fermentationsfähigkeit) Example 3. (for the fermentation ability)

Der Stamm P. freundenreichii KT 0021 wurde auf einem flüssigen Nährstoff mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet (g/1): 1,0 - Hefeextrakt, 0,2 - Magnesiumsulfat, 0,05 - Mangansulfat, 0,1 - Tween 80. Es wurden drei Fermentationstests durchgeführt: mit 2% Glucose, 2% Lactose und 2% Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle für die Zellen. Zusätzlich wurde ein Kontrolltest durchgeführt, bei dem der Nährstoff ohne Zusatz von Zucker oder Alkohol verwendet wurde. Die Züchtung wurde über 72 h in der Temperatur von 30 °C bei einem pH-Wert von 6,5 durchgeführt, wobei ein Mittel hinzugefügt wurde, das die entstehende Propionsäure neutralisiert. Nach dieser Zeit wurde eine Trübung des Nährstoffs in allen Kulturen festgestellt. Auf der Grundlage einer mengenmäßigen Untersuchung wurde festgestellt, dass in den Nährstoffen mit Glucose, Lactose und Glycerin im Vergleich zum Kontrolltest ein deutlicher Anstieg der Zellenzahl erfolgte, was die Fähigkeit des untersuchten Bakterienstamms zur Fermentation von Glucose, Lactose und Glycerin bestätigt. The strain P. freundereichii KT 0021 was cultured on a liquid nutrient having the following composition (g / l): 1.0 - yeast extract, 0.2 - magnesium sulfate, 0.05 - manganese sulfate, 0.1 - Tween 80 carried out three fermentation tests: with 2% glucose, 2% lactose and 2% glycerol as carbon and energy source for the cells. In addition, a control test was performed in which the nutrient was used without the addition of sugar or alcohol. The cultivation was carried out for 72 hours at the temperature of 30 ° C at a pH of 6.5, adding an agent containing the neutralized resulting propionic acid. After this time, turbidity of the nutrient was detected in all cultures. Based on a quantitative study, it was found that in the nutrients with glucose, lactose and glycerol compared to the control test, a significant increase in the number of cells, which confirms the ability of the examined bacterial strain for the fermentation of glucose, lactose and glycerol.

Beispiel 4. (für die B 12- Vitaminbiosynthese aus Molke) Example 4 (for B 12 vitamin biosynthesis from whey)

Die Labmolke mit 5,2% Lactose wurde in einen Labor-Bioreaktor mit einem Volumen von 5 1 eingebracht, bei einer Temperatur von 121 °C über 15 min sterilisiert, auf die Temperatur von 30 °C abgekühlt - der pH- Wert wurde auf 7,0 geregelt - und mit den Bakterien  The rennet whey with 5.2% lactose was placed in a laboratory bioreactor with a volume of 5 l, sterilized at a temperature of 121 ° C for 15 min, cooled to the temperature of 30 ° C - the pH was raised to 7 , 0 regulated - and with the bacteria

Propionibacterium freundenreichii in der Menge von l,3xl0⁶ cfu/ml geimpft. Dann wurden Hefeextrakt in der Menge von 1,5 g/1, 5 mg Kobaltchlorid, 15 mg 5,6-Dimethylbenzimidazol und 10 mg para-Aminobenzoesäure in den Nährstoff eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt über 168 h, bei sanftem Mischen des Nährstoffs und bei Aufrechterhaltung des pH- Werts im Bereich von 6,5-7,0 durchgeführt. In der fertig fermentierten Molke betrug die B12- Vitaminkonzentration 6,34 mg/1 und die Folsäurekonzentration 3,2 mg/1. Propionibacterium freundereichii in the amount of l, 3xl0 ⁶ cfu / ml vaccinated. Then, yeast extract in the amount of 1.5 g / 1, 5 mg of cobalt chloride, 15 mg of 5,6-dimethylbenzimidazole and 10 mg of para-aminobenzoic acid were introduced into the nutrient. Culturing was performed for a total of 168 hours, with gentle mixing of the nutrient and maintaining the pH in the range of 6.5-7.0. In the finished fermented whey, the B12 vitamin concentration was 6.34 mg / l and the folic acid concentration was 3.2 mg / l.

Beispiel 5. (für die B 12- Vitaminbiosynthese aus Abfallglycerin) Example 5 (for B 12 vitamin biosynthesis from waste glycerol)

Der Fermentationsnährstoff mit den folgenden Substanzen in 1 1: 20 % Glycerin, 3 g  The fermentation nutrient with the following substances in 1 1: 20% glycerol, 3 g

Caseinhydrolysat, 10 g Abioseston, 1.76 g K3P04, 2.29 g NaH2P04x2H20, 0.3 mg Biotin, 4 mg Calciumpantothenat, 5 mg FeS04x7H20, 2 mg CoS04x6H20, 10 mg MnC12x4H20, 2 mg ZnC12, 0.2 g MgC12x6H20 wurde der Pasteurisierung im Plattenwärmeaustauscher in der Temperatur von 121°C über 15 min unterzogen und in einen sterilen Bioreaktor mit einem Volumen von 1500 1 gepumpt, der mit einem System zur Mantelthermostatierung und mit einem mechanischen Mischer ausgestattet war. Die Temperatur des Glycerinnährstoffs wurde auf 28 °C verringert und der pH- Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Der so vorbereitete Nährstoff wurde mit den Bakterien Propionibacterium freundenreichii KT021 in der Menge von 1,1 xlO⁶ cfu/ml geimpft. Die Züchtung wurde bis zur vollständigen Fermentierung des Glycerins bei sanftem Mischen zur Gewährleistung der Homogenität des Nährstoffs und bei Casein hydrolyzate, 10g of abiosestone, 1.76g K3PO4, 2.29g NaH2PO4x2H20, 0.3mg biotin, 4mg calcium pantothenate, 5mg FeSO4x7H20, 2mg CoSO4x6H20, 10mg MnC12x4H20, 2mg ZnC12, 0.2g MgC12x6H20 was pasteurized in the plate heat exchanger at the temperature of 121 ° C for 15 minutes and pumped into a sterile bioreactor with a volume of 1500 1, which was equipped with a jacket thermostating system and with a mechanical mixer. The temperature of the glycerin nutrient was reduced to 28 ° C and the pH was adjusted to 7.0. The thus prepared nutrient was inoculated with the bacteria Propionibacterium freundereichii KT021 in the amount of 1.1 x 10 ⁶ cfu / ml. Cultivation was until complete fermentation of the glycerin with gentle mixing to ensure homogeneity of the nutrient and at

Aufrechterhaltung des pH- Werts auf einem konstanten Niveau durchgeführt. In der 72. Maintaining the pH at a constant level. In the 72nd

Stunde wurden B 12- Vitaminvorläufer in Gestalt von 2 mg Kobaltsulfat und 16 mg/1 5,6- Dimethylbenzimidazol hinzugegeben. Im fermentierten Nährstoff wurde eine B12- Vitaminkonzentration von 8,9 mg/1 festgestellt. Beispiel 6. (für die Propionsäureproduktion aus Molke) 1 hour of B 12 vitamin precursors in the form of 2 mg of cobalt sulfate and 16 mg / 1 5,6-dimethylbenzimidazole were added. The fermented nutrient was found to have a B12 vitamin concentration of 8.9 mg / l. Example 6 (for the production of propionic acid from whey)

Die Sauermolke mit 4,3% w/v Lactose wurde in einen Labor-Bioreaktor mit einem Volumen von 5 1 eingebracht, bei einer Temperatur von 121 °C über 15 min sterilisiert, auf die Temperatur von 30 °C abgekühlt - der pH- Wert wurde auf 7,0 geregelt - und mit den  The acid whey with 4.3% w / v lactose was placed in a laboratory bioreactor with a volume of 5 1, sterilized at a temperature of 121 ° C for 15 min, cooled to the temperature of 30 ° C - the pH was regulated to 7.0 - and with the

Bakterien Propionibacterium fr eundenreichii KT021 in der Menge von 1,3x10(5 cfu/ml geimpft. Dann wurde Hefeextrakt in der Menge von 1,0 g/1 in den Nährstoff eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt über 96 Stunden bei sanftem Mischen des Nährstoffs Bacteria Propionibacterium for eundereichii KT021 was inoculated in the amount of 1.3x10 (5 cfu / ml) Then yeast extract was added to the nutrient in the amount of 1.0 g / l The cultivation was continued for a total of 96 hours with gentle mixing of the nutrient

durchgeführt. Auf der Grundlage der chromatographischen Analyse wurde festgestellt, dass die Bakterien 2,1% w/v Propionsäure hergestellt haben. carried out. Based on the chromatographic analysis, it was found that the bacteria produced 2.1% w / v propionic acid.

Beispiel 7. (für die Propionsäureproduktion aus Glycerin) Example 7 (for propionic acid production from glycerol)

Der Fermentationsnährstoff mit den folgenden Substanzen in 1 1: 50 g Glycerin, 3 g  The fermentation nutrient with the following substances in 1 1: 50 g glycerol, 3 g

Caseinhydrolysat, 5 g Abioseston, 2 g K3P04, 4 g NaH2P04x2H20, 0.3 mg Biotin, 4 mg Calciumpantothenat, 5 mg FeS04x7H20, 2 mg CoS04x6H20, 10 mg MnC12x4H20, 2 mg ZnC12, 0.2 g MgC12x6H20 wurde der Pasteurisierung im Plattenwärmeaustauscher bei der Temperatur von 85°C über 10 min unterzogen und in einen sterilen Bioreaktor mit einem Volumen von 150 1 gepumpt, der mit einem System zur Mantelthermostatierung und mit einem mechanischen Mischer ausgestattet war. Die Temperatur des Glycerinnährstoffs wurde auf 28 °C verringert und der pH- Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Der so vorbereitete Nährstoff wurde mit den Bakterien Propionibacterium freundenreichii KT021 in der Menge von 1,1 xlO⁶ cfu/ml geimpft. Die Züchtung wurde bis zur vollständigen Fermentierung des Glycerins bei sanftem Mischen zur Gewährleistung der Homogenität des Nährstoffs durchgeführt. Im fermentierten Nährstoff wurde eine Propionsäurekonzentration von 15,8 g/1 festgestellt. Beispiel 8. (für die B 12- Vitaminproduktion aus einer Mischung von Molke und Glycerin) Labmolke mit 5,7% Lactose wurde in einen Bioreaktor eingebracht, der mit einem Mischer und einem Heizmantel ausgestattet war - 2% Glycerin wurden hinzugefügt, das Ganze wurde gemischt und der thermischen Sterilisierung bei einer Temperatur von 115 °C über 15 min unterzogen. Dann wurde der Nährstoff auf die Temperatur von 30 °C gekühlt, der Säuregrad wurde auf den pH-Wert von 7,2 geregelt und mit den Bakterien Propionibacterium Casein hydrolyzate, 5g of abiosestone, 2g of K3PO4, 4g of NaH2PO4x2H20, 0.3mg of biotin, 4mg of calcium pantothenate, 5mg of FeS04x7H20, 2mg of CoS04x6H20, 10mg of MnC12x4H20, 2mg of ZnC12, 0.2g MgC12x6H20 were pasteurized in the plate heat exchanger at the temperature of 85 ° C for 10 minutes and pumped into a sterile bioreactor with a volume of 150 1, which was equipped with a system for jacket thermostatting and with a mechanical mixer. The temperature of the glycerin nutrient was reduced to 28 ° C and the pH was adjusted to 7.0. The thus prepared nutrient was inoculated with the bacteria Propionibacterium freundereichii KT021 in the amount of 1.1 x 10 ⁶ cfu / ml. The cultivation was carried out until complete fermentation of the glycerol with gentle mixing to ensure the homogeneity of the nutrient. The fermented nutrient was found to have a propionic acid concentration of 15.8 g / l. Example 8. (for the B 12 vitamin production from a mixture of whey and glycerol) Lab whey with 5.7% lactose was placed in a bioreactor equipped with a mixer and a heating mantle - 2% glycerol was added, the whole became mixed and subjected to thermal sterilization at a temperature of 115 ° C for 15 min. Then, the nutrient was cooled to the temperature of 30 ° C, the acidity was controlled to the pH of 7.2 and treated with the bacteria Propionibacterium

freundenreichii KT021 in der Menge von l,3xl0⁶ cfu/ml geimpft. Nach 72 Stunden Freundreichii KT021 in the amount of l, 3xl0 ⁶ cfu / ml vaccinated. After 72 hours

Fermentation wurden in den Nährstoff bekannte Vorläufer und Stimulatoren der B12- Vitaminsynthese, das sind 5 mg/1 Kobaltchlorid, 15 mg/1 5,6-Dimethylbenzimidazol und 12 mg/1 para-Aminobenzoesäure, eingebracht. Die Züchtung wurde insgesamt überl68 Stunden bei sanftem Mischen des Nährstoffs durchgeführt. Nach Abschluss der Fermentation enthielt der Nährstoff 8,2 mg B 12- Vitamin/ 1 Nährstoff. Fermentation were in the nutrient known precursors and stimulators of B12-vitamin synthesis, which are 5 mg / 1 cobalt chloride, 15 mg / 1 5,6-dimethylbenzimidazole and 12 mg / 1 para-aminobenzoic acid. The cultivation was carried out for a total of over 68 hours with gentle mixing of the nutrient. Upon completion of the fermentation, the nutrient contained 8.2 mg B 12 vitamin / 1 nutrient.

Claims

Patentansprüche claims

1. Propionibakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT021, isoliert aus 1. Propionibacterium strain Propionibacterium freundenreichii KT021, isolated from

Milchablagerungen und ausgewählt aus einer Isolatgruppe mit dem Screening- Verfahren, in der Polnischen Kollektion der Mikroorganismen (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw unter der Nummer B/00040 hinterlegt. Milk deposits selected from an isolate group using the screening method, deposited in the Polish Collection of Microorganisms (Polska Kolekcja Mikroorganizmow) in Wroclaw under number B / 00040.

2. Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Fähigkeit zur B 12- Vitaminherstellung in den Züchtungen mit Süßmolke über 6 mg/1 beträgt. 2. bacterial strain Propionibacterium freundenreichii KT 021 according to claim 1, characterized in that the ability for vitamin B production in the breeds with sweet whey over 6 mg / 1.

3. Bakterienstamm Propionibacterium freundenreichii KT 021 gemäß Patentanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass er im Ergebnis der Propionsäurefermentation der Molke die Fähigkeit zur Propionsäureproduktion in der Menge über 20 g/1 hat. 3. Bacterial strain Propionibacterium freundenreichii KT 021 according to claim 1, characterized in that it has the ability to propionic acid production in the amount above 20 g / 1 as a result of the propionic acid fermentation of the whey.