CN116024146A

CN116024146A - 一株高抗菌活性枯草芽孢杆菌及其发酵条件优化

Info

Publication number: CN116024146A
Application number: CN202310312662.1A
Authority: CN
Inventors: 董娜; 曹云鹤; 吴迪; 付灵龙
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-03-28
Filing date: 2023-03-28
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2043-03-28
Also published as: CN116024146B

Abstract

本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一株高抗菌活性枯草芽孢杆菌及其发酵条件优化。本发明提供枯草芽孢杆菌BS21，将枯草芽孢杆菌BS21和/或其代谢产物制备成的微生态制剂具有替代抗生素的潜力，且不产生耐药性的危害，同时还能调节动物的机体免疫，在动物肠道中产生多种消化酶，有助于动物营养物消化吸收，从而提高动物的生产性能。本发明还优化了枯草芽孢杆菌BS21发酵工艺，通过优化发酵工艺充分发挥了菌种的潜在生产能力、降低生产成本、提高生产效率。

Description

一株高抗菌活性枯草芽孢杆菌及其发酵条件优化

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一株高抗菌活性枯草芽孢杆菌及其发酵条件优化。

背景技术

在饲料中添加抗生素能够促进动物生长，预防动物疾病，提高经济效益。然而长期使用抗生素会导致细菌耐药性的产生和抗生素残留等问题，最终危害人类健康。因此寻找安全、高效的抗生素替代品成为近年来研究的热点。

微生态制剂是最有潜力的抗生素替代品之一，能够促进动物生长、增强机体免疫力、改善肠道健康等。枯草芽孢杆菌是非致病性***，能产生芽孢，被广泛应用于微生物制剂的研制。枯草芽孢杆菌能够分泌多种具有抑菌特性的次级代谢产物，如抗菌肽、聚酮类和多烯类化合物等，其抑菌机理多为通过作用于目的菌的细胞壁、细胞膜和生物膜等产生抑菌作用，安全性较高。代谢产物中的抗菌肽也是一种常见的抗生素替代品，也称宿主防御肽，近年来，枯草芽孢杆菌抗菌肽（如surfactin，brevilaterin）被报道具有免疫调节和抗肿瘤的作用。但是现有技术中缺少一种具有广谱抑菌能力的枯草芽孢杆菌。

发明内容

本发明提供一株高抗菌活性枯草芽孢杆菌及其发酵条件优化，该枯草芽孢杆菌具有广谱抑菌能力、耐高温、耐酸、耐胆盐，可以饲用。

本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是从巴马香猪粪便样品中分离得到的，命名为BS21。经过16SRNA基因序列分析，该菌株为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCC No.25977。

本发明的枯草芽孢杆菌BS21的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，长度为2-4μm，单菌落大小为3-4mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面粗糙，呈圆形***。具有广谱抑菌的特性，对消化道环境具有较好的耐受性。

本发明提供一种微生态制剂，其含有所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21和/或其代谢产物。

本发明还提供一种饲料添加剂、动物饲料或药物，包括所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21或所述的微生态制剂。

本发明还提供一种药物或组合物，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21产生的抑菌活性物质。

本发明还提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的培养基，其原料包括其原料包括2.0-2.5%玉米粉、1.5-2.0 %豆粕和0.5-1%NaCl；优选的，余量为水；

所述％为占培养基的质量体积百分比g/100mL。

优选的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的培养基，其原料包括2%玉米粉、1.5%豆粕和0.5%NaCl；

所述％为占培养基的质量体积百分比g/100mL。

本发明还提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的发酵培养方法，利用所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21培养基。

根据本发明所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的发酵培养方法，发酵条件为：温度为28-32℃，pH为6.5-7.5，转速为220-250 rpm，发酵时间为24-36 h。

优选的，发酵条件为：温度为30℃，pH为7.0，转速为220rpm，发酵时间为24 h。

本发明还提供枯草芽孢杆菌BS21和/或其发酵产物的以下任一应用：

1）用于制备抗菌药物或组合物；

2）用作饲料添加剂；

3）用于动物生产。

本发明还提供枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21产生的抑菌活性物质的以下任一应用：

1）用于制备抗菌药物或组合物；

2）用作饲料添加剂；

3）用于动物生产。

根据本发明所述的应用，所述菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鼠柠檬酸杆菌和志贺氏菌中的一种或几种。

优选的，所述菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中的一种或两种。将枯草芽孢杆菌BS21发酵液稀释10000倍对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌仍具有抑菌作用。

本发明的有益效果：

本发明通过体外法鉴定了BS21菌体和上清液抑菌物质的耐受性，结果表明，枯草芽孢杆菌BS21和上清液抑菌物质能够抵抗胃肠道的内环境且对高温具有一定是耐受性。

本发明对BS21菌株进行了全基因组测序，共预测到7个具有抑菌作用的次级代谢产物基因簇，并在发酵上清液中检测到了5种抑菌代谢产物。

将枯草芽孢杆菌和/或其代谢产物制备成的微生态制剂具有替代抗生素的潜力，且不产生耐药性的危害，同时还能调节动物的机体免疫，在动物肠道中产生多种消化酶，有助于动物营养物消化吸收，从而提高动物的生产性能。

发酵工艺对微生物的生产能力具有重要影响。优化发酵工艺可以充分发挥菌种的潜在生产能力、降低生产成本、提高生产效率。本发明通过单因素法对BS21的发酵培养基和发酵条件进行了优化，使发酵上清液的抑菌活性提高了40%。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：本发明实施例1枯草芽孢杆菌BS21的菌落形态图。

图2：本发明实施例1枯草芽孢杆菌BS21菌体的革兰氏阳性染色图。

图3：本发明实施例2枯草芽孢杆菌BS21的生长曲线图。

图4：本发明实施例2枯草芽孢杆菌BS21的耐酸检测结果图。

图5：本发明实施例2枯草芽孢杆菌BS21的耐胆盐检测结果图。

图6：本发明实施例2枯草芽孢杆菌BS21的耐高温检测结果图。

图7：本发明实施例2枯草芽孢杆菌BS21的抗生素敏感性检测结果图。

图8：本发明实施例3枯草芽孢杆菌BS21发酵液稀释不同倍数对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。

图9：本发明实施例4枯草芽孢杆菌BS21发酵上清液抑菌物质的蛋白酶耐受性检测结果图。

图10：本发明实施例4枯草芽孢杆菌BS21发酵上清液抑菌物质的耐酸检测结果图。

图11：本发明实施例4枯草芽孢杆菌BS21发酵上清液抑菌物质的耐高温检测结果图。

图12：本发明实施例7枯草芽孢杆菌BS21发酵条件优化前和优化后上清液抑菌活性比较图。

图13：本发明实施例9枯草芽孢杆菌BS21与不同枯草芽孢杆菌抑菌活性对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特殊说明，本发明中的百分比浓度为该组分在体系中的质量体积百分比浓度g/100mL。

实施例1：枯草芽孢杆菌BS21的分离与鉴定

步骤1：菌株的分离培养

取巴马香猪新鲜粪样1g，在无菌生理盐水中混匀，置于4℃冰箱内静置一晚，用无菌生理盐水进行梯度稀释，然后选择适宜梯度的稀释液各100ul涂布于LB培养基上，37℃培养24小时。选取LB平板上长势良好、形态不同的单菌落于5ml LB培养基中，220 rmp，37℃培养24小时，取150ul置于有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测平皿中，37℃培养24 h，观察抑菌圈直径，选择抑菌能力强的菌株，命名为BS21。

步骤2：菌株的形态学和16S RNA序列同源性分析

1. 形态学鉴定

观察菌株在培养皿上的菌落形态，对形成菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态进行描述。单菌落大小为3-4mm，颜色呈乳白色，不透明，菌落表面褶皱，中心凸起，边缘呈不规则（图1）。

2. 对枯草芽孢杆菌BS21进行革兰氏染色，采用光学显微镜观察菌体形态。枯草芽孢杆菌BS21为革兰氏阳性，细胞形态为杆状，长度为2-4μm（图2）。

3. 16S RNA序列同源性分析

取1 mL枯草芽孢杆菌BS21菌液，送至睿博兴科生物技术有限公司进行16S RNA测序鉴定，将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

该菌株已于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为CGMCC No.25977。

实施例2：枯草芽孢杆菌BS21的特性检测

种子液活化：将枯草芽孢杆菌BS21接种到灭菌的LB液体培养基中，37℃培养24h后取出备用。

步骤1：生长曲线测定

按1v％接种量从种子液中吸取定量的枯草芽孢杆菌BS21接种到LB液体培养基中，30℃培养。每隔2h使用酶标仪测定发酵液在OD600的值。结果显示（图3），BS21菌株在6h进入对数生长期，28h进入平台期。

步骤2：耐酸性检测

按1v％接种量将枯草芽孢杆菌BS21的种子培养液分别接种到pH为2.0、3.0、4.0的生理盐水中，分别在0h、1h、2h、3h、4h采用平板倾注法测定活菌数，计算细菌存活率。结果显示（图4），在pH为2或3的环境中，枯草芽孢杆菌BS21的存活率能够随培养时间的延长逐渐提高，pH=4不影响枯草芽孢杆菌BS21的存活率，说明枯草芽孢杆菌BS21能够耐受胃肠道的酸性化境。

步骤3：耐胆盐检测

按1v％接种量将枯草芽孢杆菌BS21的种子培养液分别接种到含有0.1%、0.2%和0.3%（其中的百分比浓度为胆盐在体系中的质量体积百分比浓度）胆盐的生理盐水中，分别在2h和4h采用平板倾注法测定活菌数，计算细菌存活率。结果显示（图5），枯草芽孢杆菌BS21具有良好的耐胆盐能力。

步骤4：耐热性检测

按1v％接种量将枯草芽孢杆菌BS21的种子培养液分别接种到生理盐水中，将其分别置于60℃、70℃、80℃，10min后采用平板倾注法测定活菌数，计算细菌存活率。结果显示（图6），枯草芽孢杆菌BS21具有较强的耐热能力。

步骤5：抗生素敏感性检测

将枯草芽孢杆菌BS21溶于LB琼脂板上，将红霉素、四环素、多西环素、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、头孢拉定、青霉素、氨苄西林的药敏片放置于琼脂板上。12小时后，取出观察细菌培养板记录生长情况。结果显示（图7），枯草芽孢杆菌BS21对以上抗生素均敏感。

实施例3：枯草芽孢杆菌BS21抑菌活性检测

采用牛津杯法对发酵液和无菌发酵液上清的抑菌活性进行检测。将BS21在37℃培养至24h，分别收集发酵液和无菌发酵液上清。指示菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌。将指示菌接种于40℃左右的LB固体培养基中，使其终浓度为10⁶CFU/ml，倒入已经置于牛津杯的培养皿中，待LB固体培养基凝固后，将牛津杯取出。分别取150ul发酵液和无菌发酵液上清置于孔中，培养过夜，观察抑菌圈情况。BS21对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鼠柠檬酸杆菌和志贺氏菌均具有抑菌活性（表1）。发酵液稀释10000倍之后对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌CVCC43300仍具有抑菌活性，说明枯草芽孢杆菌BS21具有优良的抑菌活性（图8）。

表1：枯草芽孢杆菌BS21的抑菌谱

注：+表示对指示菌有抑菌效果

实施例4：枯草芽孢杆菌BS21无菌发酵上清液抑菌活性耐受性检测

步骤1：耐蛋白酶性检测

将无菌发酵上清液用1 mg/m L（终浓度）的胰蛋白酶和胃蛋白酶处理，37℃水浴处理1 h后，采用牛津杯法检测抑菌活性。不同蛋白酶处理后，其活性保持在90％以上，可以耐受胰蛋白酶和胃蛋白酶（图9）。

步骤2：耐酸性检测

将无菌发酵上清液分别调至pH为2、3、4，37℃水浴处理1 h后，采用牛津杯法检测抑菌活性。不同pH处理后，其活性保持在90％以上，可以耐受胃肠道酸性环境（图10）。

步骤3：耐热性检测

将无菌发酵上清液分别置于60、70、80、90℃，孵育10min，冷却至室温后，采用牛津杯法检测抑菌活性。不同温度处理后，其活性保持在85％以上，可以耐受高温（图11）。

实施例5：枯草芽孢杆菌BS21的安全性评价

本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价枯草芽孢杆菌BS21的安全性。

步骤1：实验方法

选取3周龄的小鼠28只，随机分为4组（A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照10⁹cfu/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照10⁸cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量组按照10⁷cfu/只的量灌服菌液），每组7只鼠。每天灌胃1次，每次200μL，连续灌服21天。实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每周清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。

步骤2：检测指标

1. 试验期间，每周统计小鼠存活情况

表2：不同剂量枯草芽孢杆菌BS21对小鼠存活情况的影响

2. 脏器指数

取完整的心、肝、脾、肾（双侧）称湿重，分别计算心脏指数＝（心脏湿重/体重）×100％、肝脏指数＝（肝脏湿重/体重）×100％、脾脏指数＝（脾脏湿重/体重）×100％、肾脏指数＝（肾脏湿重/体重）×100％。

表3：不同剂量枯草芽孢杆菌BS21对小鼠器官指数的影响

3. 血清生化指标

实验结束当天采用眼球取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、甘油三酯、总胆固醇、尿素等血液生化指标。结果均显示正常，说明枯草芽孢杆菌BS21对小鼠的生理指标不构成影响。

实施例6：枯草芽孢杆菌BS21的全基因组测序和次级代谢产物基因的预测

菌株测序在美吉生物医药有限公司进行，枯草芽孢杆菌BS21的基因组采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的测序方式，通过antismash软件对枯草芽孢杆菌BS21的次级代谢产物合成基因簇进行预测。共预测到7抗菌基因簇，其中bacillibactin、subtilosinA、bacilysin、fengycin、surfactin、zwittermicin A为抗菌肽，bacillaene为聚酮类物质，均具有抑菌活性。

表4：枯草芽孢杆菌BS21次级代谢产物抗菌基因簇及抗菌谱

实施例7：枯草芽孢杆菌BS21发酵条件的优化

以大肠杆菌K88作为指示菌，以发酵上清液的抑菌圈直径作为抑菌活性强弱的指标，采用单因素法优化枯草芽孢杆菌BS21发酵产抑菌活性物质的最适发酵条件。

步骤1：发酵培养基成分的优化

1.单因素试验筛选碳源

初始培养基为LB培养基，分别添加1%葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉作为碳源，接种量取1v%，30°C培养24 h后，检测吸光度OD₆₀₀和上清液抑菌圈直径。最适碳源确定后，设计浓度梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，同样培养24 h，检测上清液抑菌圈直径，得到最适的碳源浓度范围。

2. 单因素试验筛选氮源

在上一步确定最适碳源和浓度的基础上，分别用1%蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、豆粕、发酵豆粕、菜籽粕作为氮源替代培养基中的蛋白胨和酵母提取物，接种量取1v%，30°C培养24 h后，检测上清液抑菌圈直径。最适氮源确定后，设计浓度梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，同样培养24 h，检测上清液抑菌圈直径，得到最适的氮源浓度范围。

3. 单因素试验筛选无机盐

在上一步确定最适碳源、氮源种类和浓度的基础上，分别用1%的NaCl、CaCl₂、KH₂PO₄、MgSO₄、ZnSO₄、MnSO₄取代基础培养基中的NaCl，接种量取1v%，30°C培养24 h后，检测上清液抑菌圈直径。最适无机盐种类确定后，设计浓度梯度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%同样培养24 h，检测上清液抑菌圈直径，得到最适的无机盐浓度范围。

优化后的发酵培养基配方为：2.0%玉米粉、1.5%豆粕、0.5%NaCl。

步骤2：发酵条件的优化

在确定了最适碳、氮源、无机盐种类及浓度的基础上配置培养基，采用单因素法对枯草粉芽孢杆菌BS21的发酵条件进行优化。

1. 发酵温度

发酵温度分别设置为20、25、30、25和40°C，其他发酵条件参照上一步，检测上清液抑菌圈直径，确定最适发酵温度。

2. 初始pH

将种子液接种于初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的优化培养基中，其他发酵条件参照上一步，检测上清液抑菌圈直径，确定最适初始pH。

3. 转速

转速设置为160、190、220、250和280rpm，其他发酵条件参照上一步，检测上清液抑菌圈直径，确定最适转速。

4. 发酵时间

发酵时间设置为12、24、36、48、60小时，其他发酵条件参照上一步，检测上清液抑菌圈直径，确定最适发酵时间。

优化后的发酵条件为：温度为30 ℃，pH为7.0，转速为220 rpm，发酵时间为24 h。

步骤3：发酵条件的优化验证

用牛津杯法来验证发酵工艺优化前和优化后BS21产生的抑菌活性物质的抑菌活性。优化前的发酵条件：种子液按1v%接种于LB培养基，37 ℃、220rpm发酵24 h。优化后的发酵条件：培养基成分为2.0%玉米粉、1.5%豆粕、0.5%NaCl；发酵条件为温度为30 ℃，pH为7.0，转速为220 rpm，发酵时间为24 h。与优化前相比，抑菌圈直径提高了40%（图12）。

步骤4：30L发酵罐发酵

1.挑取枯草芽孢杆菌单菌落3-5个，接种于5mL LB培养基，培养12小时，再转接于500mL营养肉汤培养基，继续培养12小时后，接种于30L发酵罐中。

2.发酵培养基配方为：2%玉米粉、1.5%豆粕、0.5%NaCl、。发酵条件为：温度为30℃，pH为7.0，转速为220 rpm，发酵时间为24 h。

3.将均质好的发酵液冻干，得到枯草芽孢杆菌微生态制剂。

实施例8：UHPLC-MS/MS检测枯草芽孢杆菌BS21合成的抑菌代谢产物

采用美国Agilent公司超高效液相色谱-6460三重四极杆质谱联用仪(UHPLC-MS/MS)检测枯草芽孢杆菌BS21上清液中的抑菌代谢物。液相条件:C18柱(100 × 2.1 mm, 1.7μm)，流动相A：0.1%甲酸水（v/v），流动相B：0.1%甲酸乙腈（v/v），流速300 μL/min，洗脱梯度：95% A/5% B, 0 min ~ 5% A/95% B, 60 min。质谱条件:安捷伦6460型三重四极杆质谱仪；脱溶剂气温度：350℃;脱溶剂气流量:10 L/min; 鞘气温度：350℃; 鞘气流量：11 L/min; 毛细管电压：3500 V; 采用全扫描模式（MS2-SCAN），采集离子: 扫描时间500 ms，质荷比范围200 ~ 2000 m/z。

UHPLC-MS/MS在枯草芽孢杆菌BS21的发酵上清液中共检测到5种具有抑菌活性的代谢产物，包括四种抗菌肽表面活性素（surfactin）、丰原素(fenygcin)、bacillibactin、杆菌溶素(bacilysin)和一种聚酮类物质bacillaene。

实施例9：枯草芽孢杆菌BS21与不同枯草芽孢杆菌抑菌活性对比

将枯草芽孢杆菌BS21、市场上购买的商业枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌BW600，用优化后发酵培养基培养，以大肠杆菌K88作为指示菌，以发酵上清液的抑菌圈直径作为抑菌活性强弱的指标，比较三株不同枯草芽孢杆菌的抑菌活性。枯草芽孢杆菌BS21的抑菌活性优于商业枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌BW600（图13）。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21, 其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 25977。

2.一种微生态制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS21和/或其代谢产物。

3.一种饲料添加剂、动物饲料或药物，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21或权利要求2所述的微生态制剂。

4.一种药物或组合物，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21产生的抑菌活性物质。

5.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的培养基，其特征在于，其原料包括2.0-2.5%玉米粉、1.5-2.0 %豆粕和0.5-1%NaCl；

所述％为占培养基的质量体积百分比g/100mL。

6.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的发酵培养方法，其特征在于，利用权利要求5所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21培养基。

7.根据权利要求6所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21的发酵培养方法，其特征在于，发酵条件为：温度为28-32℃，pH为6.5-7.5，转速为220-250rpm，发酵时间为24-36h。

8.枯草芽孢杆菌BS21和/或其发酵产物的以下任一应用：

1）用于制备抗菌药物或组合物；

2）用作饲料添加剂；

3）用于动物生产。

9.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS21产生的抑菌活性物质的以下任一应用：

1）用于制备抗菌药物或组合物；

2）用作饲料添加剂；

3）用于动物生产。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鼠柠檬酸杆菌和志贺氏菌中的一种或几种。