WO2013046980A1 - 細胞選別器及び細胞選別方法 - Google Patents

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WO2013046980A1
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cell
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bone
cells
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達也 務中
阿部　浩久
叶井　正樹
平 前川
晋也 木村
英司 芦原
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株式会社島津製作所
国立大学法人京都大学
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Definitions

  • the present invention relates to a cell sorter used for sorting cancer stem cells from other cells and a cell sorting method using the cell sorter.
  • the microenvironment in the living body has attracted attention.
  • the system in which osteoclasts exist in the bone marrow microenvironment is considered to provide a niche that is comfortable for other cells as well as the forefront of bone reconstruction.
  • Cancer stem cells that have drug resistance and prevent cancer from being cured are thought to be deeply related to the existence of this niche.
  • Cancer stem cells are thought to be a hindrance to cancer eradication because they are the source of many cancer cells and have drug resistance. Therefore, drug discovery targeting cancer stem cells is considered important for the cure of cancer. In order to examine the effects of drugs that target cancer stem cells, it is necessary to select cancer stem cells from other cells. However, until now, no method has been established for sorting cancer stem cells from other cells.
  • Cell functions include, for example, cell characteristics such as cell migration and invasion, and surface antigen, cell cycle, drug resistance, and the like, and these functions can generally be evaluated by optical observation.
  • cancer stem cells are thought to express functions while interacting with the surrounding microenvironment (niche). Therefore, directly observing the interaction is considered to be a simple and effective method for studying the effect of bone marrow microenvironment on cancer stem cells.
  • the first issue is the effect of convection. Since the bone marrow microenvironment is a size of several ⁇ m to several hundred ⁇ m, it is hardly affected by flow and mixing, and convection hardly occurs. In this environment, there is a special feature that the movement of humoral factors is governed by diffusion. However, containers such as petri dishes, flasks, and well plates that are commonly used in conventional cell culture have a large volume, and there are carbon dioxide incubators, microscope irradiation lamps, fluorescent lamps, and other electrical devices as heat sources. Therefore, the movement of liquid mainly occurs due to convection of heat inside these containers, and these containers cannot be said to be an environment that accurately reproduces the bone marrow microenvironment.
  • the second problem is that it is difficult to observe in real time.
  • Most conventional observation methods combine photographs at a certain point in time using tissue sections.
  • An example of performing real-time observation using a very thin slice is described in Non-Patent Document 1, but in this example, the sample is exposed to the atmosphere and the state of oxygen concentration gradient of the original bone marrow microenvironment is observed. Since it changes, it is unlikely that information on cell activity in vivo can be obtained accurately.
  • an object of the present invention is to make it possible to directly observe the characteristics of cells in the bone marrow microenvironment and to select cells based on the observation results. It is.
  • the cell sorter according to the present invention has a micro space that is filled with a liquid and has a typical length of 1 mm or less, and has a bottom surface made of a light-transmitting material that enables optical observation of the inside of the micro space.
  • the “representative length” is a characteristic length (Characteristic Length) used to calculate the Reynolds number in fluid mechanics. (Area / Cross-section perimeter), D (diameter) is the representative length for circular tubes (see Non-Patent Document 3).
  • the “matrix” means “bone matrix”, which is a bone matrix of an extracellular component constituting bone, and refers to collagen fibers, hydroxyapatite, and the like.
  • the constituent protein is mainly type I collagen, and there are osteocalcin, osteopontin, bone morphogenetic proteins and the like.
  • bone matrix is simply referred to as “matrix”.
  • the cell sorting method of the present invention uses the above-described cell sorter according to the present invention.
  • a sample cell labeled with a fluorescent substance is placed around a bone fragment in a well of the cell sorter of the present invention, and after a certain period of time, the position of the sample cell is optically observed, thereby Cells that migrate between the matrix and bone fragments and cells that do not migrate are selected.
  • the present inventors have found that when sample cells are arranged around a bone fragment to which osteoclasts are attached, there are cells that migrate so as to be attracted to the part to which osteoclasts are attached.
  • the cell sorting method according to the present invention has been made based on this discovery.
  • the substance that attracts cells is a substance released from bone or osteoclasts by bone resorption by osteoclasts.
  • Non-Patent Document 2 calcium (Ca 2+ ) and various cytokines (TGF- ⁇ ) and growth factors (IGFs) are released by bone resorption of osteoclasts. Therefore, it is considered that any one of these substances acts as an attractant and causes specific cells to migrate.
  • the inside of the well is made into a minute space having a typical length of 1 mm or less, thereby eliminating the convection of the solution filling the well, arranging the matrix on the bottom of the minute space,
  • the bone marrow micro-space is reproduced by placing bone fragments on the surface.
  • the bottom surface of the well is made of a light-transmitting material that enables optical observation of the interior of the micro space, so that the characteristics of the cells in the micro space that reproduces the micro space of the bone marrow can be optically viewed from the bottom surface in real time. Can be observed. Since osteoclasts have entered between the matrix and bone fragments, substances such as calcium and cytokines are released by the bone resorption of osteoclasts, and migrate with cells that are attracted by these substances to migrate. Cells that do not.
  • the behavior of the sample cells can be easily observed in real time by optical observation by labeling the sample cells with a phosphor.
  • FIG. 1 It is a figure which shows one Example of a cell sorter
  • (A) is a perspective view
  • (B) is sectional drawing which shows the inside of a well. It is an image of the state which has arrange
  • (A) is the time when observation is started
  • (B) is 4 Image after 5 hours.
  • a collagen gel obtained by mixing porcine tendon-derived acid-soluble Type-I collagen developed for tissue culture and a concentrated medium / reconstitution buffer is used as a matrix.
  • the bone marrow microenvironment is reproduced by coating the bottom surface of the well with the collagen gel.
  • a gel prepared from a soluble basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma rich in extracellular matrix protein or hydroxyapatite can be used instead of collagen gel. .
  • the diameter can be mentioned, and in that case, the depth of the well is preferably 300 ⁇ m or less.
  • the oxygen concentration at the position where the osteoclasts are arranged is preferably about 5%. Since the oxygen concentration in the bone marrow microenvironment is considered to be about 5%, the region where osteoclasts are arranged can be made an environment close to the bone marrow microenvironment.
  • green fluorescent protein can be used as a fluorescent agent for labeling sample cells.
  • the cell sorter is configured as a chip 2.
  • the chip 2 is made of, for example, a material such as PDMS (polydimethylsiloxane), quartz glass, or silicon, and is bonded to one surface of the first substrate 3a provided with a through-hole serving as the well 4 and the first substrate 3a.
  • the second substrate 3b is used.
  • the well 4 is formed by using a microfabrication technique called ⁇ TAS (micro Total Analysis system) or microfluidics.
  • the space in the well 4 is a minute space having a typical length of 1 mm or less.
  • the bottom surface of the well 4 is circular, the typical length being 1 mm in diameter, and the depth being 300 ⁇ m.
  • the thickness of the bottom surface 6 of the well 4 is 0.17 mm, and the inside of the well 4 can be optically observed from the bottom surface 6 side.
  • grooves 5 a and 5 b serving as flow paths for injecting and discharging the solution to the well 4 are formed.
  • the upper surface side of the chip 2 is covered with a member such as a PDMS substrate to seal the upper surface of the well 4, and at that time, the grooves 5 a and 5 b form a flow path.
  • a matrix 8 made of a collagen gel coating is disposed on the bottom of the well 4.
  • a bone fragment 10 is arranged on the matrix 8.
  • the size of the bone fragment 10 is, for example, about 200 ⁇ m ⁇ in the case of a rectangular parallelepiped shape, which is a scale equivalent to the scale of the bone marrow microenvironment.
  • Osteoclasts 12 are arranged between the matrix 8 and the bone fragments 10. Osteoclasts 12 are differentiated from osteoblasts. In FIG.
  • the upper surface is in an open state, but when this chip 2 is used, in the well 4, a large number of cells to be selected and (a) medium and / or (b) water or phosphorus
  • the well 4 is filled with a cell suspension which is a mixture with a liquid such as a buffer solution typified by acid buffered saline, and the upper surface of the well 4 is sealed with a sealing member made of a material such as PDMS.
  • a large number of cells are cells to be sorted according to the present invention, and refer to a plurality of cells that can be suspended under normal experimental conditions. However, even if a single cell is used, the effect of the present invention can be achieved. , Including the singular.
  • the volume of the well 4 is as small as about 240 nL, the apparent viscosity of the solution filling the well 4 increases, and an experiment that is not affected by convection or stirring is possible.
  • Whether or not convection is generated in the solution in the well may be determined by considering the Rayleigh number Ra, which is a dimensionless number that characterizes the state of thermal convection in natural convection.
  • the Rayleigh number Ra is expressed by the following equation. Note that L is the typical length of the well 4, g is the acceleration of gravity, ⁇ is the thermal expansion coefficient of the fluid, ⁇ is the kinematic viscosity, a is the thermal conductivity, and ⁇ T is the typical temperature difference.
  • Ra (L 3 ⁇ g ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ T) / ⁇ a
  • ⁇ T ′ 1.2 ⁇ 10 ⁇ 4 (° C.) It becomes. That is, it is considered that convection of the solution in the well occurs when the typical temperature difference is 1.2 ⁇ 10 ⁇ 4 ° C. or more.
  • the actual representative temperature difference of the well 4 is at most a difference of about 12 ° C. between 37 ° C. and room temperature 25 ° C., and it is unlikely that it will be larger than the above ⁇ T ′ (120 ° C.). Therefore, it is considered that natural convection of the solution in the well 4 does not occur if the typical length of the well 4 is 1 mm or less.
  • This cell sorter induces osteoclasts 12 between the bone fragments 10 and the matrix 8 by co-culturing bone, osteoblasts, and bone marrow cells in the well 4 of the chip 2, and the bone marrow microenvironment. , And a system in which specific cancer cells migrate is constructed.
  • the chip 2 uses a silicon substrate having a thickness of 300 ⁇ m as the first substrate 3a.
  • the silicon substrate 3a is etched using a fine processing technique to form a circular through hole having a diameter of 1 mm.
  • a transparent glass substrate having a thickness of 0.17 mm as the second substrate 3b is anodically bonded to one surface of the silicon substrate 3a to form the bottom surface 6 of the well 4.
  • a collagen gel is coated on the surface of the glass substrate 3 b which is the bottom surface 6 in the well 4 to form a matrix 8.
  • a bone fragment 10 of about 200 ⁇ m ⁇ is arranged on the matrix 8.
  • the size of the bone piece 10 is not particularly limited as long as it can be accommodated in the well 4.
  • the maximum dimension is about 200 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows an image in which the bone fragment 10 is actually arranged in the well 4.
  • the bone fragment 10 is obtained by collecting the femur bone of 5 to 10 weeks old BALB / cA mouse, flushing out the bone marrow with a medium, and then cutting with a surgical knife. After filling the well 4 with the culture medium, the upper surface of the well 4 is sealed with a member made of, for example, a PDMS substrate, and the well 4 is used except for the operation of supplying various cells and culture medium into the well 4 and the operation of exchanging the culture medium. Avoid exposing the media and cell suspension to the atmosphere. Note that the volume in the well 4 (culture chamber) of the chip 2 is 240 nL.
  • Osteoblasts obtained from the parietal bone of 1-2 day old BALB / cA mice are introduced into well 4 at a concentration of about 200 cells / well. After 4 to 6 hours, after osteoblasts adhere to the bottom surface of well 4, bone marrow cells obtained by flushing out the bone marrow of the femur of 5 to 10-week-old BALB / cA mice were about 800 cells / well. Introduce by concentration. To well 4, 0.02 ⁇ M vitamin D3 and 2 ⁇ M prostaglandin E2 are added to ⁇ MEM containing 10% fetal calf serum as a medium, and co-culture is performed under conditions of 37 ° C., 5% CO 2 , and water vapor saturation.
  • Bone marrow cells are differentiated into osteoclasts by co-culturing for 7 to 10 days with several medium changes. Osteoclasts enter the lower part of bone fragment 10. This state is the state of FIG. In FIG. 1, illustration of osteoblasts and bone marrow cells is omitted.
  • a leukemia cell line (Ba / F3 wt bcr-abl GFP) labeled with green fluorescent protein (GFP) was introduced into well 4 at a density of about 100 cells / well.
  • GFP fluorescence is imaged at regular intervals from the back surface side of the chip 2 (the bottom surface 6 side of the well 4) through the bottom surface 6 of the well 4 using a fluorescence microscope. The so-called time-lapse observation was performed.
  • the chip 2 was placed on a temperature CO 2 with a mixer installed in a fluorescence microscope and a stage in a control chamber.
  • FIG. 3 is an image obtained by using a fluorescence microscope to acquire a GFP fluorescence image in the well 4 of the cell sorter in which osteoclasts are induced under the bone fragment.
  • A leukemia cells were not present under the bone fragments, but were present with almost even dispersion at other locations. After about 2 hours, some leukemia cells began to invade the lower part of the bone, and after 4.5 hours, as shown in (B), how many leukemia cells stay below the bone fragment. I was seen.
  • FIG. 4 is an image obtained by using a fluorescence microscope to obtain a GFP fluorescence image in the well of a cell sorter in which osteoclasts are not induced under the bone fragment. Even after time, no leukemia cells invaded under the bone fragments.
  • osteoclasts in the lower part of the bone causes leukemia cells to enter the bone fragment through the barrier even though there is a barrier of bone fragments.
  • a microenvironment in which cancer cells migrate can be constructed, and the migration phenomenon can be observed in real time.
  • the characteristics of the migrated cell and the non-migrated cell are different, and it is possible to select a cell having the characteristic of migrating in such an environment and a cell having no such characteristic.
  • the cell sorter and the cell sorting method of the present invention are not limited to the above examples. In order to function as a cell sorter, it is necessary to satisfy the following requirements, and the structure is not limited as long as these requirements are satisfied. 1. 1. A minute space with a typical length of 1 mm or less in which no convection of the solution occurs Low oxygen concentration that is close to the bone marrow microspace (up to 21%, preferably less than 5%, the same as the atmosphere) 3. Presence of bone fragments and osteoclasts. Examples of substances that directly induce cell migration include cytokines (TGF- ⁇ ), growth factors (IGFs), Ca 2+ , and chemokines that are released by osteoclast bone resorption.
  • TGF- ⁇ cytokines
  • IGFs growth factors
  • Ca 2+ chemokines that are released by osteoclast bone resorption.
  • the following effects can be obtained by engineeringly reproducing the microenvironment in the living body using the cell sorter.
  • the reproducibility of the experiment is improved by constructing an experimental system using a chip as in the present invention.
  • experimental conditions can be set freely, special conditions that cannot be achieved in vivo can be set freely, and the characteristics and behavior of cells under such conditions can be observed. It is.
  • the volume of the chip well is extremely small, it is possible to save the amount of reagents and cells necessary for the experiment, which is advantageous in terms of price and environment. Even when using cells and tissues that can be collected only in small amounts, and valuable and expensive reagents, it is effective that the volume of the well is small.

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Abstract

　チップ２は例えば直径が約１ｍｍのウエル４を備えている。ウエル４の深さは例えば約３００μｍである。ウエル４の底面にコラーゲンゲルのコーティングからなるマトリックス８が配置されており、マトリックス８上に骨片１０が配置されている。マトリックス８と骨片１０との間に破骨細胞が配置されている。破骨細胞は、ウエル４内において骨髄細胞から分化させ、骨片１０の下に誘引したものである。

Description

細胞選別器及び細胞選別方法
　本発明は、がん幹細胞を他の細胞から選別するために用いられる細胞選別器及びその細胞選別器を用いた細胞選別方法に関するものである。
　最近、生体内の微小環境が注目を集めている。中でも、骨髄微小環境に破骨細胞が存在する系は、本来の骨の再構築の最前線としてだけでなく、他の細胞にとって居心地の良いニッチ（巣）を提供していると考えられている。そして、薬剤耐性をもち、がんの根治の妨げになっているがん幹細胞は、このニッチの存在と深く関わっていると考えられている。
　がん幹細胞は多くのがん細胞の源となり、かつ薬剤耐性をもつため、がん根絶の妨げとなっていると考えられている。そのため、がん幹細胞を標的とした創薬ががんの根治に重要であると考えられる。がん幹細胞を標的とする薬の効果を調べるためには、がん幹細胞を他の細胞から選別する必要がある。しかし、これまで、がん幹細胞を他の細胞から選別する方法は確立されていない。
C. Lo Celso, H.E. Fleming, J.W. Wu, C.X. Zhao, S. Miake-Ｌye, J. Fujisaki, D. Cote, D.W. Rowe, C.P. Lin, D.T. Scadden, Live-animal tracking of individual haematopoietic stem／progenitor cells in their niche, Nature 457 (2008) 92-96. Weilbaecher, K.N., Guise, T.A. & McCauley, L.K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nature Reviews Cancer 11, 411-425 (2011). Mohamed Gad-el-Hak, The MEMS HANDBOOK, second edition, pp.10-6-pp.10-7(2009)
　細胞機能には、例えば、細胞遊走・浸潤などの細胞の特性や、表面抗原、細胞周期、薬剤耐性などの特性があり、これらの機能は一般的に光学的な観測で評価することができる。しかし、がん幹細胞は周囲の微小環境（ニッチ）と相互作用しながら機能を発現していると考えられる。したがって、その相互作用を直接的に観察することは、骨髄微小環境ががん幹細胞へ与える影響を研究する上でシンプルかつ有効な方法であると考えられる。ところが、がん幹細胞と骨髄微小環境との相互作用を直接的に観察する上で、以下の２つの課題があった。
　１つ目の課題は、対流の影響である。骨髄微小環境は数μｍ～数百μｍという大きさであるため、流れや混合の影響を受けにくく、対流はほとんど発生しない。この環境では、液性因子の移動が拡散に支配されるという特殊な特徴がある。しかし、従来の細胞の培養において一般的に用いられてきたシャーレ、フラスコ又はウエルプレートなどの容器は容積が大きく、しかも熱源として炭酸ガスインキュベータ、顕微鏡照射ランプ、蛍光ランプ、その他の電気機器等が存在するので、これらの容器内部では熱の対流を主な原因とする液体の移動が起き、これらの容器は骨髄微小環境を正確に再現した環境とはいえない。
　２つ目の課題は、リアルタイムでの観測が困難であることである。従来の観測法は、組織切片を用いたある時点の写真を組み合わせる例がほとんどである。非常に薄い切片を用いてリアルタイム観測を行なった例が非特許文献１に記載されているが、その例では、試料が大気に暴露され、本来の骨髄微小環境がもつ酸素濃度勾配などの状態が変化してしまうため、正確に生体内における細胞の活動に関する情報が得られるとは考えにくい。
　そこで、本発明は、骨髄微小環境における細胞の特性を直接的に観測することができるようにするとともに、その観測結果に基づいて細胞の選別を行なうことができるようにすることを目的とするものである。
　本発明にかかる細胞選別器は、液で満たされ代表的長さが１ｍｍ以下である微小空間をもち、その微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質からなる底面をもつウエルと、ウエル内の底面に配置されたマトリックスと、ウエル内のマトリックス上に配置された骨片と、マトリックスと骨片との間に配置された破骨細胞と、を備えたものである。
　ここで、「代表的長さ」とは、流体力学におけるレイノルズ数を算出するために用いられる特徴的な長さ（Characteristic Length）のことであり、例えば、一般に矩形流路では、４×（断面積／断面周囲長）、円形管ではＤ(直径）が代表長さとなる（非特許文献参照３参照）。
　また、「マトリックス」とは「骨マトリックス」のことであり、骨を構成する細胞外成分の骨基質であり、コラーゲン線維やハイドロキシアパタイトなどをいう。その構成タンパク質はＩ型コラーゲンが主たるもので、その他、オステオカルシン、オステオポンチン、骨形態形成タンパク質(bone morphogenetic proteins)などがある。以下、「骨マトリックス」を単に「マトリックス」と記載する。
　本発明の細胞選別方法は上記の本発明にかかる細胞選別器を用いたものである。本発明の細胞選別器のウエル内の骨片の周辺に蛍光体により標識化したサンプル細胞を配置し、一定時間が経過した後、サンプル細胞の位置を光学的に観測することにより、ウエル底面のマトリックスと骨片との間へ遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別する。
　本発明者らは、破骨細胞が付着した骨片の周辺にサンプル細胞を配置すると、破骨細胞の付着している部分に引き寄せられるように遊走する細胞が存在することを発見した。本発明にかかる細胞選別方法は、この発見に基づいてなされたものである。
　本発明者らの実験において、骨片に破骨細胞が付着している場合に細胞遊走が見られ、骨片に破骨細胞が付着していない場合に細胞遊走が見られなかった。このことから、細胞を誘引する物質は破骨細胞による骨吸収により骨又は破骨細胞から放出された物質であることが考えられる。非特許文献２によれば、破骨細胞の骨吸収により、カルシウム（Ｃａ2+）と様々なサイトカイン類（ＴＧＦ-β）や増殖因子（ＩＧＦｓ）が放出される。したがって、これらのいずれかの物質が誘引物質となって特定の細胞を遊走させると考えられる。
　本発明の細胞選別器では、ウエル内を代表的長さ１ｍｍ以下の微小空間とすることで、ウエル内を満たす溶液の対流をなくし、その微小空間の底面にマトリックスを配置し、そのマトリックスの上に骨片を配置することで骨髄微小空間を再現している。そして、ウエルの底面を微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質により構成しているので、骨髄微小空間を再現した微小空間内の細胞の特性を底面側からリアルタイムで光学的に観測することができる。マトリックスと骨片の間に破骨細胞が入り込んだ状態となっているので、破骨細胞の骨吸収によってカルシウムやサイトカイン類などの物質が放出され、これらの物質に誘引されて遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別することができる。
　上記の細胞選別器を用いた本発明の細胞選別方法では、サンプル細胞を蛍光体により標識化しておくことで、その挙動を光学的観測により容易にリアルタイムで観測することができる。
細胞選別器の一実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はウエル内を示す断面図である。 細胞選別器のウエルに骨片を配置した状態の画像である。 骨片の下に破骨細胞を誘導した細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であり、（Ａ）は観測を開始した時、（Ｂ）は４．５時間が経過した後の画像である。 骨片の下に破骨細胞を誘導しなかった細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であり、（Ａ）は観測を開始した時、（Ｂ）は４．５時間が経過した後の画像である。
　本発明の細胞選別器の好ましい実施形態では、マトリックスとして組織培養用として開発されたブタ腱由来酸可溶性のType-Iコラーゲンと濃縮培地・再構成用緩衝液を混合して得られるコラーゲンゲルを使用し、そのコラーゲンゲルでウエルの底面をコーティングすることで、骨髄微小環境を再現する。
　なお、マトリックスとしては、コラーゲンゲルに代えて、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜を調製したゲルやハイドロキシアパタイトなどを使用することもできる。
　また、ウエルの代表的長さとしては、円筒状ウエルの場合は直径を挙げることができ、その場合、ウエルの深さを３００μｍ以下とすることが好ましい。そうすれば、溶液の対流の発生をなくすことができ、ウエル内の空間を骨髄微小環境に近い環境を再現することができる。
　また、破骨細胞が配置されている位置の酸素濃度は約５％とすることが好ましい。骨髄微小環境における酸素濃度は約５％程度と考えられるので、破骨細胞が配置されている領域を骨髄微小環境に近い環境にすることができる。
　本発明の細胞選別方法では、サンプル細胞を標識化するための蛍光剤として例えば緑色蛍光タンパク質を用いることができる。
　細胞選別器の一実施例について図１を用いて説明する。
　細胞選別器はチップ２として構成されている。チップ２は例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）や石英ガラス、シリコンなどの材質で構成され、ウエル４となる貫通穴が設けられた第１基板３ａと、第１基板３ａの一方の面に張り合わされた第２基板３ｂにより構成されている。ウエル４は、μＴＡＳ（micro Total Analysis system）又は微小流体制御技術（microfluidics）と呼ばれる微細加工技術を用いて形成されている。ウエル４内の空間は代表的長さが１ｍｍ以下の微小空間である。
　この実施例ではウエル４の底面は円形であり、代表的長さである直径が１ｍｍ、深さが３００μｍである。ウエル４の底面６の厚みは０．１７ｍｍであり、底面６側からウエル４内を光学的に観測することができるようになっている。チップ２の上面側に、ウエル４への溶液の注入と排出を行なうための流路となる溝５ａ，５ｂが形成されている。図１において図示されていないが、チップ２の上面側は、ウエル４の上面を封止するためにＰＤＭＳ基板などの部材によって覆われ、そのときに溝５ａ，５ｂが流路を形成する。
　ウエル４の底面にはコラーゲンゲルのコーティングからなるマトリックス８が配置されている。マトリックス８の上に骨片１０が配置されている。骨片１０の大きさは例えば直方体形状であれば２００μｍ□程度であり、骨髄微小環境のスケールと同等のスケールである。マトリックス８と骨片１０の間に破骨細胞１２が配置されている。破骨細胞１２は骨芽細胞から分化させたものである。図１では、上面が開放された状態となっているが、このチップ２を使用する際はウエル４内において、選別対象の多数の細胞と、（ａ）培地及び／又は（ｂ）水もしくはリン酸緩衝生理食塩水に代表される緩衝液などの液体との混合物である細胞懸濁液などで満たされ、ウエル４の上面は例えばＰＤＭＳなどの材質からなる封止部材により封止される。ここで、多数の細胞とは、本発明の選別対象の細胞であって、通常の実験条件で懸濁しうる程度の複数の細胞をいうが、単数であっても本件発明の効果は奏しうるので、単数も含むものとする。
　ウエル４の容積は約２４０ｎＬと極めて小さいため、ウエル４を満たす溶液の見かけ上の粘性が上昇し、対流や攪拌の影響を受けない実験が可能である。ウエル内の溶液に対流が発生するか否かは、自然対流における熱対流の様子を特徴づける無次元数であるレイリー数Ｒａを考えると良い。レイリー数Ｒａは以下の式で表わされる。なお、Ｌはウエル４の代表的長さ、gは重力加速度、βは流体の熱膨張率、νは動粘性率、aは熱伝導率、ΔＴは代表的温度差である。
Ｒａ＝（Ｌ3・ｇ・β・ΔＴ）／νａ
　自然対流の層流から乱流への遷移や対流時のベナールセル（対流構造の一つで、薄い層状流体を下面から均一に熱した際に生じる規則的に区切られたセル状構造をいう。）の発生などはレイリー数Ｒａの値で規定される。水平流体層においてベナールセルが発生し始める臨界レイリー数Ｒａ'は、流体層の厚さをＬとし、流体層の上下面の温度差をΔＴとすると、上下面が固体面の場合でＲａ'＝１７０８となる。なお、g＝９．８ ｍ／ｓ2、β＝０．２×１０-3／℃、ν＝１×１０-2ｃｍ2／ｓ、ａ＝１．４１×１０-3ｃｍ2／ｓとする。
　例えば、代表的長さＬ=１０ｃｍとしてレイリー数Ｒａを計算すると、
Ｒａ＝１０3×９８０×０．２×１０-3×ΔＴ／（１×１０-2×１．４１×１０-3）
　＝９８０×０．２／１．４１×ΔＴ×１０2×１０3
　＝１３９×１０5×ΔＴ
　≒１．４×１０7×ΔＴ
Ｒａ＝Ｒａ'（＝１７０８）のときの代表的温度差ΔＴ'は、
ΔＴ'＝１．２×１０-4（℃）
となる。すなわち、代表的温度差が１．２×１０-4℃以上になるとウエル内の溶液の対流が発生すると考えられる。
　一方、ウエルの代表的長さＬを１ｍｍにしたときのＲａは、
Ｒａ＝１０-3×９８０×０．２×１０-3×ΔＴ／（１×１０-2×１．４１×１０-3）
　　＝１４×ΔＴ
Ｒａ＝Ｒａ'（＝１７０８）のときの代表的温度差ΔＴ'は、
ΔＴ'＝１２０（℃）
となる。すなわち、代表的温度差が１２０℃以上にならないとウエル内の溶液の対流が発生しないと考えられる。
　ウエル４の実際の代表的温度差はせいぜい３７℃と室温２５℃の差１２℃程度であり、上記のΔＴ'（１２０℃）よりも大きくなることは考えられない。したがって、ウエル４の代表的長さを１ｍｍ以下にしておけば、ウエル４内の溶液の自然対流は発生しないと考えられる。
　この実施例の細胞選別器の製造方法の一例について説明する。
　この細胞選別器は、チップ２のウエル４内で、骨・骨芽細胞・骨髄細胞を共培養することにより、破骨細胞１２を骨片１０とマトリックス８との間に誘導し、骨髄微小環境を再構築し、特定のがん細胞が遊走するシステムを構築したものである。
　チップ２は、第１基板３ａとして厚さ３００μｍのシリコン基板を使用する。微細加工技術を用いてシリコン基板３ａをエッチングし、直径１ｍｍの円形状の貫通穴を形成する。シリコン基板３ａの一方の面に、第２基板３ｂとして厚さ０．１７ｍｍの透明ガラス基板を陽極接合してウエル４の底面６を形成する。
　次に、ウエル４内の底面６となっているガラス基板３ｂの表面にコラーゲンゲルをコーティングしてマトリックス８を形成する。そして、マトリックス８上に２００μｍ□程度の骨片１０を配置する。骨片１０の大きさは特に限定されるものではなく、ウエル４内に収容できる大きさであればよい。例えば直方体形状であれば、最大の寸法が２００μｍ程度である。
　骨片１０をウエル４内に実際に配置した画像を図２に示す。骨片１０は、５～１０週齢のＢＡＬＢ／ｃＡマウス大腿骨を採取し、骨髄部を培地でフラッシュアウト（洗浄）した後に、サージカルナイフで切断したものである。ウエル４内に培地を充填した後、ウエル４の上面を例えばＰＤＭＳ基板からなる部材によって封止し、ウエル４内に各種細胞や培地を供給する作業時や培地交換などの作業時以外はウエル４内の培地や細胞懸濁液が大気に暴露されないようにする。なお、このチップ２のウエル４内（培養室）の容積は２４０ｎＬである。
　１～２日齢ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの頭頂骨から得た骨芽細胞を約２００セル／ウエルの濃度でウエル４に導入する。４～６時間後、骨芽細胞がウエル４の底面に接着した後で、５～１０週齢ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの大腿骨の骨髄をフラッシュアウトして得た骨髄細胞を約８００セル／ウエルの濃度で導入する。ウエル４に、培地として１０％牛胎児血清を含むαＭＥＭに０．０２μＭビタミンＤ３と２μＭプロスタグランジンＥ２を加え、３７℃、５％ＣＯ2、水蒸気飽和の条件下で共培養を行なう。何回かの培地交換を行ないながら７～１０日間の共培養を経ることで、骨髄細胞を破骨細胞に分化させる。破骨細胞は骨片１０の下部に入り込む。この状態が図１の状態である。なお、図１では、骨芽細胞や骨髄細胞の図示は省略している。
　この実施例の細胞選別器を用いて行なった細胞選別の一例について説明する。
　サンプル細胞として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により標識化した白血病細胞株（Ｂａ／Ｆ３ ｗｔ ｂｃｒ－ａｂｌ　ＧＦＰ）を約１００個／ウエルの密度になるようにウエル４に導入した。ウエル４の上面をＰＤＭＳ基板によって封止した後、直ちに蛍光顕微鏡を使用してチップ２の裏面側（ウエル４の底面６側）からウエル４の底面６を介してＧＦＰ蛍光を一定時間ごとに撮像する、いわゆるタイムラプス観測を行なった。チップ２は、蛍光顕微鏡内に設置された混合器付の温度ＣＯ2及び制御チャンバ内のステージの上に配置した。同ステージでは、３７℃水蒸気飽和、５％ＣＯ2の環境を維持した。タイムラプス計測が終了したチップについてＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性フォスファダーゼ）染色を行い破骨細胞の位置を同定した。
　図３は骨片の下に破骨細胞を誘導した細胞選別器のウエル４内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像である。
　観察開始当初は、（Ａ）に示されているように、白血病細胞は骨片の下には存在せず、それ以外の場所にほぼ均等にばらついて存在していた。約２時間後、いくつかの白血病細胞が骨の下部に侵入し始めて、４．５時間が経過した後では、（Ｂ）に示されているように、骨片の下に留まる白血病細胞がいくつか見られた。
　また、図４は骨片の下に破骨細胞を誘導していない細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であるが、この細胞選別器では、４．５時間が経過した後でも骨片の下に侵入する白血病細胞は見られなかった。
　以上のことから、破骨細胞が骨下部に存在することにより、骨片という障壁があるにもかかわらず、白血病細胞がその障壁を通って骨片の下に侵入したと考えられる。このように、ウエル４内において骨片の下に破骨細胞を配置しておくことで、がん細胞が遊走する微小環境を構築することができ、その遊走現象をリアルタイムで観測することができる。遊走した細胞と遊走しなかった細胞とではその特性が異なっており、このような環境下において遊走する特性をもつ細胞とそのような特性をもたない細胞との選別が可能である。
　なお、本発明の細胞選別器及び細胞選別方法は上記実施例に限定されるものではない。細胞選別器として機能させるためには以下の要件を満たす必要があり、これらを満たすものであれば、構造は限定されない。
１．溶液の対流が発生しない代表長さが１ｍｍ以下の微小空間
２．骨髄微小空間に近い酸素濃度である低酸素濃度（最大で大気と同じ２１％、好ましくは５％以下）
３．骨片と破骨細胞の存在。なお、細胞遊走を直接的に誘引させる物質としては、破骨細胞の骨吸収により放出されるサイトカイン類(ＴＧＦ－β)や増殖因子（ＩＧＦｓ）、Ｃａ2+、ケモカインなどが考えられる。
　上記実施例のように、細胞選別器を用いて生体内の微小環境を工学的に再現することで、以下の効果が得られる。
　生態を用いた実験では、酸素濃度、栄養素、液性因子の濃度など、種々の条件を実験ごとに再現性良く一致させることは一般的に困難である。これに対し、本発明のように、チップを用いた実験系を構築することにより、実験の再現性が向上する。さらに、実験条件を自由に設定することが可能となるので、生体内では実現できないような特殊な条件を自由に設定し、そのような条件下での細胞の特性・挙動を観測することも可能である。
　また、小動物を用いるような実験の代替となることは、動物愛護の精神からも重要な効果が見込まれる。さらに、対象がヒトである場合には、直接観察することが技術的にも倫理的にも困難な脳などの部位についての実験が可能となる。さらに、生物ではなく工学的に制御可能なチップで実験が可能であるため、実験の自動化を容易にする。チップは並列化が容易であるため、複数のチップにおいて同時に観測を行なうことも可能である。
　また、チップのウエルの容量が極微量であるため、実験に必要な試薬や細胞の量を節約することができ、価格面と環境面からも利点がある。少量しか採取できない細胞や組織、貴重で高価な試薬を用いる際にもウエルの容量が小さいことは効果的である。
　白血病幹細胞周辺の微小環境を調べることや白血病幹細胞を選別することは、幹細胞の態様解明に強く寄与し、がんの根治研究につながる。肺がんや乳がんなどの固形がんの腫瘍中心部周辺の微小環境を調べることや腫瘍細胞を選別することは、がん細胞の浸潤・転移の態様を解明することに寄与し、がんの本質の研究・転移の抑制などに応用することができる。このように、生体内の微小環境を本発明の細胞選別器において再現し、生体内の微小環境におけるがん細胞の特性や挙動のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの観察を可能にして細胞の選別を可能にすることで、基礎生物学としての研究対象としてだけでなく、治療、創薬に貢献する可能性を有する。
　　　２　　　チップ
　　　３ａ　　第１基板
　　　３ｂ　　第２基板
　　　４　　　ウエル
　　　５ａ，５ｂ　　溝
　　　６　　　ウエル底面
　　　８　　　マトリックス
　　１０　　　骨片
　　１２　　　破骨細胞

Claims (6)

  1. 　液で満たされ代表的長さが１ｍｍ以下である微小空間をもち、その微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質からなる底面をもつウエルと、
    　前記ウエル内の底面に配置されたマトリックスと、
    　前記ウエル内の前記マトリックス上に配置された骨片と、
    　前記マトリックスと前記骨片との間に配置された破骨細胞と、を備えた細胞選別器。
  2. 　前記マトリックスはコラーゲンゲルである請求項１に記載の細胞選別器。
  3. 　前記ウエルは円筒形であり、その代表的長さは直径であり、前記ウエルの深さは３００μｍ以下である請求項１又は２に記載の細胞選別器。
  4. 　前記破骨細胞が配置されている位置の酸素濃度は約５％である請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞選別器。
  5. 　請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞選別器を準備する工程、
    　前記細胞選別器のウエル内の前記骨片の周辺に蛍光体により標識化されたサンプル細胞を配置する工程、
    　ある時間が経過した後、サンプル細胞の位置を光学的に観測することにより、前記ウエル底面のマトリックスと前記骨片との間へ遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別する工程、を備えた細胞選別方法。
  6. 　前記蛍光体は緑色蛍光タンパク質である請求項５に記載の細胞選別方法。
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