JP2021118686A - バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年3月31日出願された、発明の名称を「バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法」とする米国仮出願第61/972,520号に基づいており、同仮出願の利益を主張し、同仮出願を参照により組み込む。
連邦政府の支援を受けた研究に関する陳述
、著しく妨害してきた。したがって、臨床的に有効な数の機能的なヒトPLTを生成可能な、効率的で、ドナーに依存しないPLTシステムが、PLTの調達及び保管に関連するリスクを回避し、増大する輸血の必要性に合致するのを手助けするのに必要である。
れてもよい。例えば、このモデルは、機能的なヒトPLTを産生するのに使用することができる。
vivoにおいて、ほとんど理解されていないままである。MKは、BMニッチに見出され、幾つかの証拠から、細胞−細胞、細胞−マトリクス、及びBMストローマの可溶性因子相互作用が、プロPLT形成及びPLT放出に関与することが示唆されている。実際に、ケモカインであるSDF−1及び成長因子であるFGF−4は、MKを類洞内皮細胞にリクルートする。細胞外マトリクス(ECM)タンパク質は、BM血管ニッチの別の主な構成物である。証拠から、膜貫通型糖タンパク質(GP)受容体を介したシグナル伝達は、例えば、ベルナール−スリエ症候群、グランツマン血小板無力症に見出される欠損を伴って、プロPLT形成、PLTの数及びサイズを制御することが示唆される。IV型コラーゲン及びビトロネクチンは、プロPLT産生を促進する。この産生は、そのコンジュゲートインテグリン受容体であるGPIbαに対する抗体により阻害され得る。同様に、
フィブリノゲンは、GPIIblllaを介したプロPLT形成及びPLT放出を制御する。これらの知見は、プロPLT産生の環境決定因子を明らかにするが、還元論アプローチにより限定される。したがって、BM複雑性を定義する寄与を包含する新たなモデルが、MKのPLTへの生理学的制御を解明するのに必須である。
てもよい。内皮細胞は、4% ホルムアルデヒドで固定されてもよく、細胞の局在及びアーキテクチャを解明するために細胞のバイオマーカーについてプローブされてもよい。内皮化されたBMバイオチップの第2の流路104は、蛍光又は発色媒体、例えば、FITC−デキストラン、又は、ビーズで満たされてもよく、サンプル/細胞/分子拡散を評価し、血管透過性を決定するために、生細胞顕微鏡観察により可視化されてもよい。
成することができるようにあることができる。例えば、多孔質メンブラン1208は、直径が0.1〜20マイクロメートル、及びより具体的には、5〜8マイクロメートルの範囲にある孔を有することができる。一部の態様では、多孔質メンブラン1208は、特定の材料、化学物質、又は作用剤を含むように作製されてもよい。例えば、多孔質メンブラン1208は、血小板産生を制御するペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−L−リジン、フィブリノゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、CCL5(RANTES)、S1PR1、SDF−1、FGF−4等を含んでもよい。
てもよい等である。一部の設計では、注入口は、生体材料、例えば、MKが、各システム1200内に1つ以上の供給源を使用して、ランダムに又は同時に導入及び分布されてもよいような方式で設計されてもよい。加えて、各システム1200からの排出口は、アレイ状の全システム1200からの、ターゲットとなる生体物質、例えば、プロPLT及びPLTを含有する流出液の1つの容器内に収集可能な1つの主な流路に接続されていてもよい。
と、これは、各装置が、約2×1010個の細胞を捕捉可能である場合があることを意味しており、これは、in vivo(動物及びヒト)での検査及び注入に十分な数のPLTを産生するのに十分高い値を表す。
ソフトリソグラフィを使用して、微少流体装置を作製した。図1の例に示されたように、前記装置は、気泡及びダストを捕捉するための受動フィルタ、続けて、流体抵抗を含む2つの流路を含んだ。前記流体抵抗は、動作中に上昇する流量の変動を減衰させるのに使用した。前記流路を、長さ1300マイクロメートル、幅130マイクロメートル、及び深さ30マイクロメートルの長方形領域に組み合わせ、3マイクロメートルの間隔を空けた一連のカラム(幅10マイクロメートル及び長さ90マイクロメートル)により分離した。効率的なガス交換を確保し、細胞培養中における高解像での生細胞顕微鏡観察を支持するために、前記微少流体装置を、スライドガラスと結合させた細胞不活性ケイ素系有機ポリマーで構築した。
細胞がガラスと直接接触するのを防止するために、装置を、0.22μmろ過した10% BSA溶液(Millipore,Billerica,MA)で、30分間コートした。図1を参照して、第1の注入口118及び第2の注入口122それぞれに、12.5μL/時間の量で、2つのシリンジ微少流体ポンプ(Harvard Apparatus,Holliston,MA)を使用して、初代MK及び媒体を注入した。第1の排出口120を閉じた時点で、両入力溶液を、初代MKを捕捉させる第2の排出口124に方向を変えさせた。
前記流路をローダミン−コンジュゲートフィブリノゲン(1mg/mL)又はフィブロネクチン(50μg/mL、Cytoskeleon Inc.,Denver,CO)で30分間満たすことにより、微少流体装置を、細胞外マトリクスタンパク質で選択的にコートした。層状の流動流が混ざらないように、サンプルを、両注入口を通して平行に注入し、両排出口から収集した。装置を、1×PBSで洗浄し、任意の残りの曝されたガラスをコートするために、0.22μmろ過した(Millipore,Billerica,MA)10% BSA溶液(Roche,South San Francisco,CA)で、30分間コートした。
初代MKを、培養培地中に、平均分子量150〜250kD(Pronova SLG100、FMC biopolymer,Norway)を有する、1% 無菌アルギン酸塩中に再懸濁させ、MKが捕捉されるまで、前記微少流体装置(図1における、第1の注入口118、第2の排出口124)にわたって満たした。次いで、前記第2の流路を、1×PBSで選択的に満たして、この流路からアルギン酸塩を除去した。均一なアルギン酸塩ゲルを作製するために、30mM ナノ粒子炭酸カルシウム(mkNANO,Canada)を、カルシウム源として使用し、ゆっくり加水分解する、60mM D−グルコノ−δ−ラクトン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)に溶解させ、これにより、前記溶液中にカルシウムを放出する(Khavari et al NJP 2013をレビューすること)。前記炭酸カルシウム懸濁液を、前記第1の流路に保持された前記アルギン酸塩溶液が重合するまで(約20分間)、前記第2の流路に沿って注入した。次いで、前記第2の流路を、1×PBSで選択的に洗浄し、培養培地で置き換えた。アルギン酸塩ゲルの機械的特性を決定するために、0.25%、0.5%、1.0%、及び2.0% アルギン酸塩ゲルを調製し、その周波数依存性せん断係数を、37℃におけるレオロジーにより測定した(Ares G2 TA instruments,New Castle,DE)。
微少流体装置を、上記されたように、50μg/mL フィブロネクチン(Cytoskeleon Inc.,Denver CO)及び10% BSA(Roche,South San Francisco,CA)で選択的にコートし、37℃、5% CO2のインキュベータに移した。EBM培地(Lonza,Basel,Switzerland)中の1000万個/mL HUVECを、前記フィブロネクチンコート流路上に、12.5μL/時間で播種し、この表面に3時間にわたって付着させた。前記注入口のサンプルを、細胞を含まないEBM培地に置き換え、HUVECがコンフルエントに達するまで(2〜8日)、前記流路を通して満たした。細胞を、5μM CellTracker Red及び1μg/mL Hoescht 33342(Invitrogen,Carlsbad,CA)で、45分間染色し、新鮮な培地で洗浄し、又は、4% ホルムアルデヒド中で固定させ、共焦点蛍光顕微鏡観察により可視化した。
MKに加えられるせん断応力を、前記微少流体装置内における流体力学のコンピュータモデルで推定した。市販の有限要素法ソフトウェア(COMSOL)を使用して、ナビエ−ストークス方程式を解いた。圧縮できない流動についての定常状態ナビエストークス流動方程式は、下記のとおりである。
り境界条件は、前記流路壁において推定されなかった。注入流量は、12.5〜200μL/時間の範囲であった。スリットでより細かく作製した三角形メッシュを使用して、前記ドメインを離散化した。前記モデルは、315,317度の自由度を含んだ。メッシュの独立性を、せん断速度間における10%未満の差異を得ることにより確認し、251,101〜415,309度の自由度が見出された。UMFPACK線形系ソルバーを使用して、定常状態の溶液を得た。
マウスFLCを、WT CD1マウス(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)から収集し、MKを培養した。
巨核球入力物及びバイオリアクタ溶出物を、0.1M カコジル酸塩バッファー(pH7.4)中の1.25% パラホルムアルデヒド、0.03% ピクリン酸、2.5% グルタルアルデヒドで、1時間固定し、1% 四酸化オスミウムで後固定し、一連のアルコールにより脱水し、プロピレンオキシドを浸潤させ、エポキシ樹脂中に包埋した。超薄切片を染色し、Tecnai G2 Spirit BioTwin電子顕微鏡(Hillsboro,OR)により、加速電圧80kVで調べた。AMTデジタル取得及び解析ソフトウェア(Advanced Microscopy Techniques,Danvers,MA)を使用して、Advanced Microscopy Techniques(AMT)2K電荷結合素子カメラにより、画像を記録した。
巨核球、放出されたプロPLT、又はバイオリアクタ溶出物を精製し、プローブした。サンプルを、5μM CellTracker Green(Invitrogen,Carlsbad,CA)と、45分間インキュベートし、新鮮な媒体で洗浄し、生細胞蛍光顕微鏡観察により可視化し、又は、4% ホルムアルデヒド中で固定し、ポリ−L−リジン(1μg/mL)でコートしたカバーガラス上で遠心分離した。細胞骨格成分の分析のために、サンプルを、0.5% Triton−X−100で透過処理し、免疫蛍光ブロッキングバッファー(50ml 1×PBS中の0.5g BSA、0.25ml 10% アジ化ナトリウム、5ml FCS)中で、抗体標識前に一晩ブロッキングした(55)。微小管細胞骨格を描写するために、サンプルを、マウス又はヒトβ1−チューブリン用のウサギポリクローナル一次抗体とインキュベートした。アクチン細胞骨格を描写するために、サンプルを、Alexa 568ファロイジン(Invitrogen,Carlsbad,CA)とインキュベートした。細胞核を、1μg/mL Hoescht 33342(Invitrogen,Carlsbad,CA)で標識した。バックグラウンド蛍光及び非特異的抗体標識を補正するために、スライドを、二次抗体単独とインキュベートした。したがって、全ての画像を調節した。サンプルを、10×(開口数、0.30)Plan−Neofluar air及び63×(開口数、1.4)Plan−ApoChromatオイル液浸対物レンズを備えたZeiss Axiovert 200(Carl Zeiss,Thornwood,NY)で調べた。CCDカメラ(Hamamatsu Photonics,Boston,MA)を使用して、画像を得た。画像解析ソフトウェアであるMetamorphバージョン7.7.2.0(Molecular Devices,Sunnyvale,California,USA)及びImageJバージョン1.47pソフトウェア(NIH、http://rsb.info.nih.gov.ezp−prod1.hul.harvard.edu/ij/)を使用して、画像を解析した。
細胞について、個々に閾値を決め、高含量細胞質領域及び周辺測定を、ImageJにおいて、以下に概説された研究者コードソフトウェアを使用して行った。解析を、全サンプルの手検測により確認した。不適切に閾値決定された細胞を、この解析から除外した。MKの直径を、非円形細胞を説明するために、面積測定から算出した。2000個超の細胞を、各条件についてカウントした。MK面積及び溶出液組成の解析を、少なくとも3つの独立したサンプルについて行った。対応するサンプルについての両側のスチューデントt検定を使用して、統計学的有意差を確立した。エラーバーは、平均周囲のある標準偏差を表す。
せん断培養のために、MKを、「ネイキッド」な微少流体装置(BSAコートのみ)にロードした。注入量を、12.5μL/時間から200μL/時間に、2時間にわたって漸次倍加させた。静的培養のために、単離されたMKを、3% BSAでコートしたガラスのカバースライドを、1cmの孔を有する10mmペトリ皿上に載せることにより形成されたチャンバ中にピペッティングし、24時間培養した。静的及びせん断培養を両方とも、37℃及び5% CO2で維持し、10×(開口数、0.30)Plan−Neof
luar air対物レンズを備えたZeiss Axiovert 200(Carl
Zeiss,Thornwood,NY)で調べた。CCDカメラ(Hamamatsu Photonics,Boston,MA)を使用して、2秒(せん断培養)又は20分(静的培養)のいずれかの間隔で、微分干渉(DIC)画像を得た。Metamorphバージョン7.7.2.0画像解析ソフトウェア(Molecular Devices,Sunnyvale,California,USA)及びImageJソフトウェアバージョン1.47pを使用して、画像を解析した。プロPLT伸長速度を、少なくとも3つの独立したサンプルからの200個のMKにわたって手作業で決定した。PLT展開実験のために、溶出液を、微少流体装置から2時間後に収集し、上記されたように、コートしていない静的培養チャンバ中にピペッティングした。PLTを、重力沈降によりガラスと接触させた。展開を、5秒間隔で5分間にわたって捕捉した。
Dendra2融合β1チューブリンを、pMSCVプラスミド中にクローニングした。パッケージング細胞であるHEK 293細胞を、10% ウシ胎仔血清(FBS)を補足したDMEM中で、30〜50%コンフルエントに培養した。gag/pol、vsvG、及び、pMSCVベクター中でDendra2と融合したβ1チューブリンをコードする、2μg DNAプラスミドを使用して、HEK 293細胞のトランスフェクションを行った。翌日、培地を交換した後、細胞を、ウイルス産生のために、72時間インキュベートした。0.22μm フィルタ(Millipore,Billerica,MA)を通して、上清をろ過した。アリコートを、−80℃で保存した。培養の2日目に、上記された胎仔肝臓培養物から単離されたMKを、10% FBS、8μg/mL ポリブレン(Sigma)、及び前記レトロウイルス上清を含有するDMEM中に再懸濁させた。サンプルを、6ウェルプレートに移し、800×gにおいて、25℃で90分間遠心分離し、次いで、37℃で90分間インキュベートした。インキュベート後、MKを、遠心分離により洗浄し、10% FBS及びTPOを含有する新鮮なDMEM中に再懸濁させた。MKを、培養の4日目までに成熟させ、次いで、先に説明されたように、BSA勾配により単離した。
血小板を、静的MK培養又はバイオリアクタ溶出液の放出されたプロPLT画分から収集し、休止状態下で調べた。サンプルを、CD42a又はCD41/61(Emfret
Analytics,Eibelstadt,Germany)に対するFITC−コンジュゲート抗体でプローブし、FACSCaliburフローサイトメーター(Beckton Dickinson)にランした。PLTを、PLTが検出器を通過する際の、その特徴的な前方及び側方散乱によりゲーティングした。FITC−コンジュゲートIgG抗体特異性コントロール(Emfret Analytics)を差し引いた後に、その合計蛍光強度を算出した。PLT収量の定量化を、正味のGP IX+PLT産生を、溶出液回収期間にわたる正味のGP IX+MK枯渇で割ることにより決定し、少なくとも3つの独立したサンプルについて行った。結果は、GP IIbIIIa+細胞と同一であった。
ImageJ及びAdobe Photoshop CS3(Adobe Systems,San Jose,CA)を使用して、Metamorphにおいて取得したデジタル画像を解析した。境界線は、明確に、種々の画像を分離し、又は、同じ画像の領域を分離する。画像内の特異的な特徴について、強調、ぼかし、移動、除去、又は導入は行っておらず、輝度、コントラスト及びカラーバランスに対してなされた調節は、画像全体に線形適用した。
生理学的条件を反復するために、前記流路をそれぞれ、フィブリノゲン及びフィブロネクチンそれぞれで選択的にコートして、BMのECM組成及び血管微小環境を再現した(図2Aに示す)。前記微少流体装置にわたって流動をランすることにより、第1の流路に沿って注入された初代MKは、前記カラム間に連続的に捕捉されることになり、前記第2の流路内にプロPLTを伸長し(図2Bに示す)、生理学的なプロPLTの伸長を反復するであろう。3D ECM組織化及び生理学的BM剛性(250Pa)をモデル化するために、MKを、前記微少流体内で重合された、1% アルギン酸塩溶液に注入した。前記微少流体装置は、MKを前記第1の流路内のアルギン酸塩ゲル中に選択的に包埋する一方で、前記第2の流路において、血流を維持した。アルギン酸塩は、プロPLT産生を阻害せず、前記第2の流路からのMKの距離を制御することができた。
せん断速度は、注入量に対して直線的に比例し、生理学的範囲(500〜2500s-1)に広がるように調節した。空の微小流路ジャンクションにおけるせん断速度は、前記第1の流路からの距離に対して増大する(図2Fに示す)が、MK捕捉に基づいて、流動を、次の利用可能なギャップに向きを変えさせた。これにより、MKは、これらの部位において、生理学的(760〜780s-1)せん断速度を受け続けた(図2Gに示す)。
in vivoでのBMにおいて、MKは、プロPLTを、血流方向に伸長し、PLT、プロPLT、大きな細胞質フラグメント(プレPLT)、及びMK全体さえも、類洞血管内に放出し、これを、肺の微小血管床において捕捉することができ、又は、循環中で他の方法で成熟させることができる。PLT産生における生理学的せん断の効果を決定するために、マウス胎仔肝臓培養物由来(mFLC)MKを、培養4日目に単離し、前記微少流体装置内に注入する前に、サイズ及び倍数性により特徴決定した(図3Aに示す)。
が予測される(図4Cに示す)。前記生理学的範囲内で微少流体せん断速度を増大させることは、培養における、中央プロPLT伸長速度又はプロPLT伸長速度の分布に影響を及ぼさなかった(図4Fに示す)。GFP−β1を発現するようにレトロウイルス性にトランスフェクションしたMKにおけるプロPLT投影には、外周微小管(MT)が含まれた。外周微小管は、PLTサイズ端においてコイルを形成した(図4Gに示す)。プロPLTは、5mm超の長さに達し、in vitroにおいて、最大1000s-1のせん断速度に耐えた。このことは、生体内顕微鏡観察からのプロPLT産生の生理学的例示を反復し、脱離イベントがせん断により生じなかったことを証明している。せん断誘導プロPLT伸長が細胞骨格由来であったことを確認するために、MKを、微少流体装置への注入前に、5μM ジャスプラキノリド(Jasplankinolide)(Jas、アクチン安定化剤)又は1mM エリスロ−9−(3−[2−ヒドロキシノニル](EHNA、細胞質ダイニン阻害剤)と共にインキュベートした。Jas及びEHNAは両方とも、静的及び生理学的せん断条件下の両方において、せん断誘導プロPLT産生(図4H及び図4Iに示す)及びPLT放出を阻害した。
PLTは、その表面にバイオマーカーであるGP IX及びIIbIIIaを発現する直径約1〜3μmの無核の円板状細胞であり、アクチン系細胞骨格ネットワークを取り囲む6〜8個のMTの皮質MTコイルにより特徴付けられる。PLT収量を確立するために、バイオマーカー発現並びに前方/側方散乱及び糖タンパク質(GP)IX+mFLC−MKの相対濃度を、培養4日目において、本発明者らの微少流体装置への注入直前に、フローサイトメトリーにより測定した(図5Aに示す)。溶出液を、注入後2時間で収集し、mFLC−MK入力と比較した(図5Bに示す)。入力MK及び溶出液PLTは両方とも、その表面にGP IX及びIIbIIIaを発現し、特徴的な前方/側方散乱を示した。せん断の適用により、前記溶出液の細胞組成は、培養5日目に単離した静的培養上清に対して、よりPLTサイズのGPIX+細胞に向かってシフトした(図5Cに示す)。85±1% MKが、2時間にわたってPLTに変換された。この変換は、% プロPLT産生の本発明者らの定量(図3D)と一致し、静的培養を上回る有意義な改善を構成する(図5D)。本発明者らの微少流体装置への2時間にわたる約500s-1 せん断の連続的な注入は、MK当たりに約21個のPLTを産生し、もっと長い期間(6〜8日)にわたって匹敵する数のPLTを生成する既存の培養アプローチを上回るPLT産生速度の主な利点を構成する。
ヒトPLTを生成するために、本発明者らの微少流体装置中のmFLC−MKを、hiPSC由来MKで置き換えた。hiPSC由来MKは、注入用MKの実質的に無限の供給源を提供する。hiPSC−MKを、培養15日目に単離し、その時点で、hiPSC−MKは、最大直径20〜60μmに達しており(図6Aに示す)、初代ヒトMKと超微細構造的に類似した(図6Bに示す)。静的培養において、hiPSC−MKは、単離後6時間でプロPLTを産生し始め、18時間で最大プロPLT産生に達した(図6Cに示す)。それに比べて、生理学的せん断(約500s-1)下でのhiPSC−MKは、捕捉直後にプロPLTを産生し始め、培養の最初の2時間以内にプロPLTを伸長/放出した(図6Dに示す)。せん断下での プロPLT産生hiPSC−MKパーセント(%)は、静的培養(約10%)を上回って、約90%に顕著に増大した(図6Eに示す)。
血小板減少症は、突然現れ、多くの場合、意図せず、大量出血し、死亡する恐れがある。抗体及び細胞媒介性自己免疫応答が、血小板減少症を引き起こすことが示されてきた。また加えて、血小板減少症は、癌治療剤、例えば、ダサチニブを含む広い範囲の薬品によってもトリガされる場合がある。動物モデルは、一般的には、ヒトにおける薬品の安全性及び有効性の予測因子としては不十分であり、臨床研究には、時間と費用がかかり、有害である恐れもある。ヒトBMを模倣して設計された微少流体装置は、主な臨床的に重要な領域におけるイノベーションを提供し、BM及びMKの生物学に基づく各種の薬品の影響を研究するのに効率的で現実的なプラットホームを提供する。
成を妨害することが証明された(図7に示す)。治療剤、例えば、T−DM1がMK成熟及びプロPLT産生に影響を及ぼす経路を定義することは、薬剤誘引血小板減少症を管理し、in vivoにおけるPLT産生を制御する戦略を生む可能性がある。
することと、(2)MK当たりに生理学的数の機能的なヒトPLT(約103〜104個)を生成することとである。ヒト胚性幹細胞培養(hESC)の開発、及びごく最近、ヒト誘導多能性幹細胞培養(hiPSC)は、in vitroにおいてヒトMKに分化して、第1の定量的障害に取り組むことができる前駆体細胞の潜在的に無限の供給源を提供する。実際には、PLTは無核であるため、PLT微少流体装置由来ユニットは、hESC又はhiPSCから得られた細胞生成物が発癌性又は催奇形性である恐れがあるという懸念に取り組むため、注入前に照射される場合がある。
の内皮細胞接触を再現していない。
セスは、制御可能な生理学的せん断速度及び制御された微小環境により刺激又は最適化されることができる。流体流に入った放出されたPLTは、例えば、高解像での顕微鏡観察を使用して可視化を可能にするプロセスにより、溶出液から収集することができる。
Claims (16)
- 長手方向に沿って第1の入力から第1の出力に延在する第1の流路と、
前記第1の流路に実質的に平行であり、前記長手方向に沿って第2の入力から第2の出力に延在する第2の流路と、
前記第1の流路と前記第2の流路との間の分離バリアと、を備える微少流体装置を含むバイオミメティック微少流体システムであって、
前記第1の流路は、少なくとも1つの第1の生体組成を第1の流路流量で受けるように構成され、
前記少なくとも1つの第1の生体組成は、ターゲットとなる生体物質を産生可能な生体供給材料を含み、
前記第2の流路は、少なくとも1つの第2の生体組成を第2の流路流量で選択的に受けるように構成され、
前記分離バリアは、前記第1の流路と前記第2の流路との間の流体連通経路を形成する複数の微小流路を有し、
前記複数の微小流路は、前記生体供給材料を選択的に捕捉するようなサイズであり、
前記第1の流路流量及び前記第2の流路流量は、前記複数の微小流路において前記生体供給材料を選択的に捕捉するように構成されているとともに、捕捉された前記生体供給材料によって前記ターゲットとなる生体物質の産生を引き起こすのに十分な範囲内にある前記第2の流路に沿った生理学的せん断速度を生成するように前記第1の流路と前記第2の流路との間の差異を生じさせるように構成されている、バイオミメティック微少流体システム。 - 前記分離バリアは、前記第1の流路と前記第2の流路の間に配置された、フィルム、一連のカラム、メンブランおよびメッシュのうちの少なくとも1つである、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 前記複数の微小流路は、前記第1の流路と前記第2の流路の間に延在する孔、ギャップ
又はスリットの少なくとも1つとして形成される、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。 - 前記生体供給材料は巨核球を含み、前記ターゲットとなる生体物質は血小板を含む、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 前記生理学的せん断速度は、複数の血小板の産生を引き起こすために100s−1〜10,000s−1の範囲内になるように生成される、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 前記生理学的せん断速度は、複数の血小板の産生を引き起こすために500s−1〜2,500s−1の範囲内になるように生成される、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 前記複数の微小流路は、0.1マイクロメートル〜20マイクロメートルの間のサイズである、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 基材をさらに備え、
前記第1の流路及び前記第2の流路が前記基材に形成される、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。 - 複数の微少流体装置を備える、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。
- 前記第1の入力の上流に位置する第1の流動フィルタと、
前記第2の入力の上流に位置する第2の流動フィルタと、をさらに備え、
上流とは、前記少なくとも1つの第1の生体組成及び前記少なくとも1つの第2の生体組成の流れの方向に対して定義されるものである、請求項1に記載のバイオミメティック微少流体システム。 - 生体物質を産生するための方法であって、
ターゲットとなる生体物質を産生可能な生体供給材料を含む少なくとも1つの第1の生体組成を、第1の流路流量でバイオミメティック微少流体システムの第1の流路に導入することと、
第2の生体組成を、第2の流路流量で前記バイオミメティック微少流体システムの第2の流路に導入することと、
前記第1の流路と前記第2の流路との間の分離バリアに流体連通経路を形成する複数の微小流路によって、前記生体供給材料を選択的に捕捉することと、
捕捉された前記生体供給材料によって前記ターゲットとなる生体物質の産生を引き起こすのに十分な前記第2の流路に沿った生理学的せん断速度を生成するように流路間の差異を生じさせることと、を有する、方法。 - 前記分離バリアは、前記第1の流路と前記第2の流路の間に配置されたフィルム、一連のカラム、メンブランおよびメッシュのうちの少なくとも1つである、請求項11に記載の方法。
- 前記複数の微小流路は、0.1マイクロメートル〜20マイクロメートルの間のサイズである、請求項11に記載の方法。
- 500s−1〜2,500s−1の範囲内の生理的せん断速度を生成するよう前記差異を生じさせることをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記生体供給材料は巨核球を含み、前記ターゲットとなる生体物質は血小板を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第2の生体組成を用いて、産生された前記ターゲットとなる生体物質を収集することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
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