JPH0956369A - マルチウェル骨細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は骨細胞の活性を定量的および／また
は定性的に評価するのに使用されるマルチウェル骨細胞
培養装置１０に関するものである。 【解決手段】 マルチウェル骨細胞培養装置１０は、片
面に焼結したリン酸カルシウム材の膜１４を有する平坦
な基部１２と、該膜１４の上部に配置された開放端のマ
ルチチャンバユニット１８とを含み、該マルチチャンバ
ユニット１８は、密封手段により、膜被覆１４を有する
基部１２に密封されて、個々の収容ウェル５８を形成す
る。該装置１０は、骨細胞疾患の検査および判断のた
め、並びに骨細胞の活性を変化させる薬剤を開発するた
め、骨細胞の機能を分析するときに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、健康および病気の
ときの骨細胞の機能を分析するのに有用である、たとえ
ば破骨細胞および造骨細胞の活性のような骨細胞活性の
評価に用いる複数ウェル（マルチウェル）骨細胞培養装
置の開発に関する。かかる骨細胞活性の評価は、人間に
おける骨粗鬆症、または線維性骨炎のような骨疾患の判
断に有効であり、また、骨細胞の活性を変化させる効果
を有する新規な薬剤を同定するにも有効であり、更に、
骨疾患の治療方法を開発することを可能にするものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】骨は、無機または鉱物相、有機マトリッ
クス相、水から構成されている複合鉱化系である。無機
鉱物相は結晶性リン酸カルシウムで構成されているが、
有機マトリックス相は殆どコラーゲンとその他の非コラ
ーゲン性蛋白とから成る。骨の石灰化は、有機相と無機
相との緻密な結合に依存し、その結果鉱化した組織が作
られる。

【０００３】骨増殖の過程は構造的および機械的ストレ
スに対抗できるように制御されている。骨の形成、維
持、吸収の過程に関与する細胞は造骨細胞（osteoblas
t）、骨細胞（osteocyte)、破骨細胞（osteoclast）で
ある。造骨細胞は骨の有機マトリックスである類骨（os
teoid)を合成し、この類骨はリン酸カルシウム結晶の成
長とコラーゲンの集積後石灰化された状態となる。骨細
胞は骨無機質と細胞外体液との間のカルシウムとリン酸
の流れを制御する。破骨細胞は骨を吸収する機能があ
り、骨再造形の過程を継続する上で必須である。骨の形
成と吸収の自然のバランスが崩れると様々な骨障害が起
こる。破骨細胞活性の増加は、骨粗しょう症、線維性骨
炎、ページェット病にみられるような骨密度の低下が特
徴的な骨疾患を来すことが証明されている。これらの疾
患はすべて骨吸収増加の結果である。

【０００４】骨細胞機能の制御に関与しているメカニズ
ムを理解するために、骨細胞（bonecell)の正常機能
と、さまざまな骨疾患におけるこの活性の混乱の程度も
測定できることが重要である。そうすれば異常な骨細胞
活性を正常水準内に取り戻すことを目的とする薬剤を同
定することができるようになるだろう。

【０００５】単離した破骨細胞の活性を生体外（in vit
ro）で直接観察する方法がいくつかの研究グループによ
って開発されている。骨髄細胞群から単離された破骨細
胞は、マッコウクジラぞうげ質（Boyde ら、Brit. Den
t. J. 156, 216, 1984)または骨（Chambersら、J. Cell
Sci. 66, 383, 1984）などの自然物質の薄い切片上で
培養された。後者の研究グループは、この吸収活性は単
核食細胞群のその他の細胞にはないことを証明すること
ができた（ChambersおよびHorton、Calcif Tissue Int.
36, 556, 1984）。破骨細胞系統の研究にこれらとは別
の細胞培養法を利用しようという最近の試みも、やはり
皮質薄片を利用することに頼っており（Amano ら、およ
び Kerbyら、J. Bone & Min. Res. 7(3)）、その吸収活
性の定量は、さまざまな深度の吸収ピット面積の二次元
分析、または吸収容積の立体マッピングに基づいて行わ
れている。このような方法を用いて、比較的厚い下層の
吸収を評価するならば、精度はせいぜい５０％ほどであ
る。そのうえこれらの分析方法は非常に時間もかかり、
非常に専門的な装置と訓練が必要である。さらに、骨ま
たはぞうげ質薄片の調製とその後の検査は、破骨細胞活
性の測定法として容易でもなく実用的でもない。

【０００６】破骨細胞培養のための基層として、人工的
なリン酸カルシウム配合物を用いることもこれまでほと
んど成功しなかった。Jones ら（Anat. Embryol 170, 2
47,1984）は、破骨細胞は合成アパタイトを生体外で吸
収すると報告したが、この観察所見を裏付ける実験的証
拠は提示できなかった。Shimizuら（Bone and Mineral
6, 261, 1989）は、単離した破骨細胞は失活させた骨表
面のみ吸収し、合成カルシウムヒドロキシアパタイトは
吸収しないと報告している。これらの成績は、機能的破
骨細胞は生体外で培養が困難であることを示唆している
ものと思われる。

【０００７】こうした理由のため、骨の細胞を培養し、
その活性を測定するために使用されている現在の公知の
方法は、有意義でかつ統計的な分析を行うための、一貫
したまたは信頼性の高い基準データを提供することはで
きないと考えられる。このため、こうした方法は、正常
な健康状態および／または病気の状態にて、骨細胞の機
能を評価するための広範囲な検査には適していない。ま
た、これらの方法は、疾患の診断検査にも適していな
い。

【０００８】一般的な組織培養のために開発された培養
装置も、骨細胞の培養には、不適当である。米国特許第
３，７２６，７６４号には、直接基部上で組織を培養す
るための密封可能な側壁開閉口を有し、その後に検査し
かつ貯蔵するための微生物チャンバ装置が記載されてい
る。米国特許第３，７４５，０９１号には、組織培養に
使用するため、ガスケットにより基部に接着させた受け
入れ部を有する生物学的反応チャンバ装置が記載されて
いる。これら何れの装置も破骨細胞および造骨細胞の双
方の培養および活性評価に適しているわけでなく、ま
た、適応し得るように改変できない。

【０００９】当該出願人の国際公開されたＰＣＴ出願第
ＷＯ９４／２６８７２号公報には、リン酸カルシウム系
の薄い膜で被覆されたディスクが記載されており、この
ディスクは、個々の密封ウェル内に入れられ、骨細胞を
その上で培養する。この装置は、活性な骨細胞を培養す
るには満足し得るが、特に個々のディスクの洗浄および
分析の点で多くの取り扱いを必要とする。また、骨細胞
のディスクから移動の問題があるだけでなく、また、各
ディスク上に存在する膜の被覆がウェル毎に異なるとい
う問題もある。この装置は、骨細胞の活性を定量的に評
価しその骨細胞疾患を診断することを目的とする大規模
な検査システムには適していない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、骨細胞活性
を評価するために使用される、新規で改良された骨細胞
培養装置を提供するものである。この骨細胞培養装置の
開発は、活性な骨細胞を培養し骨細胞の活性の信頼性の
高い評価をするときに、いままで経験されていた問題点
を解決するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、骨細胞
の活性を定量的におよび／または定性的に評価するため
の新規なマルチウェル骨細胞培養装置が提供される。

【００１２】本発明の第一の形態によれば、全般に平坦
な基部と、該基部は骨細胞の培養に適したリン酸カルシ
ウム材の焼結薄膜を少なくともその片面に有しており、
上記基部の上記膜被覆上には端部開放のマルチチャンバ
ユニットが配置されており、上記マルチチャンバユニッ
トを上記膜被覆に対して密封する手段とを含み、上記マ
ルチチャンバユニットは上記膜被覆に対して密封され
て、個々の収容ウェルを形成しており、骨細胞の活性を
定量的におよび／または定性的に評価するのに使用され
るマルチウェル骨細胞培養装置が提供される。

【００１３】本発明の第二の形態によれば、骨細胞の活
性を測定する分析方法が提供され、上記分析方法は、本
発明の第一の形態によるマルチウェル骨細胞培養装置を
提供する段階と、所定量の骨細胞を上記培養装置のウェ
ルの少なくとも一つに植え付ける段階と、上記細胞を適
当な培地内で培養する段階と、個々の試料間で膜被覆の
内部または膜被覆上における変化を検出するため、上記
基部上の膜成分の顕微鏡検査法および／または走査を行
う段階とを含む。

【００１４】本発明の第三の形態によれば、骨細胞の活
性に対する薬剤／化学物質の効果を測定する薬剤の検査
分析法が提供され、上記分析検定方法は、本発明の第一
の形態によるマルチウェル骨細胞培養装置を提供する段
階と、所定量の骨細胞を上記装置のウェルの少なくとも
二つに植え付ける段階と、上記細胞を適当な培地内で培
養する段階と、上記装置の上記ウェルの少なくとも一つ
に薬剤／化学物質を添加する段階と、対照試料および処
理された試料との間で、膜被覆の内部または膜被覆上に
おける変化を検出するため、上記基部の膜成分を顕微鏡
観察しおよび／または走査する段階とを含む。

【００１５】

【発明の実施の形態】図１には、本発明のマルチウェル
骨細胞培養装置が示され、該培養装置は、全体として参
照番号１０で示す。本発明の好適な実施例によれば、マ
ルチウェル骨細胞培養装置１０は、平坦な基部１２を備
えており、基部１２上にリン酸カルシウム材の薄膜被覆
１４を有し、該薄膜被覆は、基部の片面１６に露出片を
残す。この任意に露出された表面１６は、適当な識別標
識、またはラベルを取り付けて標識することができる。
マルチチャンバユニット１８は、この被覆１４の上に置
かれる。マルチチャンバユニット１８は、それ自体、端
部が開放した複数の円筒体１８ａから成る。適当な密封
装置２０を有する各円筒体１８ａの底部分１８ｂは、図
８に関して以下により詳細に説明する。該密封装置２０
は、マルチチャンバユニット１８を膜被覆１４に密封す
る。該密封装置２０は、マルチチャンバユニットを膜に
密封する適当なシーラントを有する。マルチチャンバユ
ニットの全体を覆うことのできる蓋２２が設けられてい
る。

【００１６】本発明の好適な実施例は、特徴的な研磨、
縁部の斜角、平坦さおよび両面の並行性を有する溶融石
英から成る平坦な基部１２を提供する。しかし、適当な
リン酸カルシウム膜１４で均一に被覆することが可能
な、生体適合性のある任意の材料であり、ガンマ放射
線、またはエチレンオキサイド処理のような滅菌過程お
よび燒結過程の双方に耐え得ることができ、機械的支持
体としてその機能を保ち、またその構造の一体性を劣化
させたり、喪失するものでなければ、また、この装置に
使用できることが技術に熟練している者には理解され
る。構造的一体性は、材料の組成に固有の物理的特性で
あると考えられる。これには、金属、ポリマー、または
セラミック材料の使用を含む。ガラスを使用してもよい
のは、短時間、ガラス表面を極めて高温度まで加熱する
表面焼結装置を使用して、膜材料を燒結し、要求される
タイプの膜１４を提供するのに必要な程度の焼結を実現
する場合である。

【００１７】本発明の装置の膜成分１４は、でこぼこし
た表面、再現性のある化学的特性を有しており、また輸
送に耐えるのに十分な機械的強度を有する。純粋または
実質的に純粋なカルシウムヒドロオキシアパタイトを提
供するものは、膜１４を形成するときに選択するリン酸
カルシウム材であると考えられるが、カルシウムヒドロ
オキシアパタイト、およびα−リン酸三カルシウムを含
むリン酸カルシウム材の混合物を使用すれば、最大の吸
収性が得られることを我々は確認している。この形態
は、例えば、光の透過を許容する薄膜を提供する本発明
のその他の形態と共に、本発明に従い装置１０の膜１４
の成分上で培養されている骨細胞の機能的特性の評価を
目的とする診断方法の実施を可能にするものである。

【００１８】膜１４の厚さは、０．１μｍより厚いこと
が理想的であり、それは、膜１４の厚さが０．１μｍよ
り薄いと、分散するボイドの発生なしに膜１４で均一に
覆うことが難しいからである。この厚さは、１μｍより
厚ければより好ましい。膜１４は、当該出願人の国際公
開されたＰＣＴ出願の第ＷＯ９４／２６８７２号公報に
詳細に記載された各種の技術を使用して、平坦な基部１
２に付与することができる。図２に示した好適な実施例
は、浸漬方法である。この浸漬方法において、基部１２
は、該基部１２と同一寸法の外周を画成する平坦な縁部
２６ａを有する真空パッド２６を備える浸漬投入装置２
４により保持されている。該パッド２６は、真空圧を付
与し得るように管２８と連通した中央孔を有する。パッ
ドの下方の真空吸引が基部１２を浸漬投入装置２４に確
実に保持する。これは、リン酸カルシウムのゾル・ゲル
混合液３２が入った容器３０に浸漬する間に、膜１４が
基部１２の裏側を被覆することを防止する。図３には、
片面に膜１４が均一に被覆された基部１２が示してあ
る。該基部１２は、被覆されているが、該基部１２の片
面に任意に露出した面１６の薄片を残し、識別のために
標識、または、ラベルを貼り得る。

【００１９】図４に示すように、基部１２の上における
リン酸カルシウム膜１４の焼結は、１，０００°Ｃの温
度またはその他の所望の焼結温度まで加熱した加熱炉３
４内で行われる。該基部１２は、その温度で最高１時間
まで焼結され、その後に加熱炉３４内で冷却されて、最
終的に取り出される。図５は、焼結後、基部１２は平坦
のままであり、その構造的一体性を保つことを示す。即
ち、基部１２は、焼結工程中分解することなく、機械的
支持体として機能する。均一な薄い焼結膜１４の被覆が
基部１２に残る。

【００２０】本発明の基部成分１２は、図６に示したよ
うに矢印２１の方向に向けて配置されたマルチチャンバ
ユニット１８を備えている。該基部は、個々の１６個の
円筒状ユニット１８ａを有するマルチチャンバユニット
１８を受け入れ得るような寸法にしてある。しかし、基
部１２は、マルチチャンバユニット１８をその上に密封
可能である、各種寸法および形状にて作成することが可
能である。その制限となるのは、リン酸カルシウム材１
４を均一に被覆することのできる基部１２の面積であ
る。

【００２１】同様に、図６に示したマルチチャンバユニ
ット１８は、個々の１６個の円筒状ユニット１８ａから
成っているが、この円筒状ユニットの数は変更可能であ
る。平坦な基部に密封した円筒状ユニット１８ａの数
は、膜１４の均一な被覆を有する基部１２の寸法に依存
して、単一のチャンバ１８ａのみを有する場合から多分
９６個以上のチャンバを有する場合まで可能である。本
発明に従い大形のチャンバを一つ設ける場合、長期にわ
たって骨細胞の培養を評価し得るよう膜を広く提供し、
これにより、その広い膜の全体に大量の骨細胞を成長さ
せることができる。特に１６個のチャンバ１８ａを有す
るマルチチャンバユニット１８を使用することが好まし
く、それは、この数のチャンバであれば、標準寸法の市
販の培養プレート・ホルダに取り付けることが可能であ
るからである。また、一台の装置１０に使用することの
できるチャンバ１８ａの数の上限値は、底部の密封装置
２０からシーラント３４を注入して漏洩防止シールを形
成し得る性能によって制限される。該マルチ・チャンバ
・ユニット１８は、ポリスチレンでできたものが好まし
い。しかし、滅菌処理することができ、薄膜被覆１４と
化学的に適合可能であり、また、生体適合性があり、し
かも、基部密封装置２０を収容する独特の形状に製造す
ることのできる限り、任意の同様の材料を使用できるこ
とが理解されよう。また、個々のチャンバ１８ａは、図
示したものよりも外周を小さくしまたは大きくすること
が可能であることも理解される。その結果、個々に製造
した別個のウェル５８の寸法（容積）および／または幾
何学的配置も異なることになる。

【００２２】図７に示すように、マルチチャンバユニッ
ト１８は、基部１２の上に配置されており、密封装置２
０中に中空のチャンバ（通路）４２と連通する注入口４
０を有している。該注入口４０は、シーラント３６の供
給源に取り付けられたノズル４６を受け入れる。該注入
口４０は、隣接する円筒状チャンバ１８ａの内壁４８、
５０の間に配置され、また、該注入口は、円形の開口部
５２に配置され、該円形の開口部は、密封装置２０の開
放した通路４２内に設けられている。シーラント３６が
入ったときに、スロット（穴）４９ａ、４９ｂが、チャ
ンバ４２内の空気を除去する通気口として機能する。該
マルチチャンバユニット１８は、加圧状態でシーラント
３６の注入に耐えるために基部１２にクランプ止めされ
ている。このクランプは解除可能である。シーラント３
６が注入されると、該シーラントは、密封装置２０の通
路４２を通って流れる。円筒状ユニット１８ａの断面図
は、通路４２を示し、二つの等しい長さの対向する壁４
８ａ、４８ｂと、円筒状ユニット１８ａの底部１８ｂに
相互に接続する上方壁４８ｃとからなり、該通路４２は
膜１４に対して平坦に位置する。これにより、独立ウェ
ル５８が形成される。

【００２３】図８に示すように、チャンバは、その両端
に円形の開口部３８ａ、３８ｂを有する円筒状である。
しかし、これらのチャンバ１８ａは、任意の所望の形状
に製造して構わない。各円筒状ユニット１８ａの底部に
配置された密封装置２０は、壁４８ａ、４８ｂ、４８ｃ
により画定された連続的な開放通路４２を備えており、
該通路は、各円筒状ユニット１８ａの基部の全体を通じ
て連続的な回路網を形成する。また、隔離部分４４が存
在しており、その側部４４ａ、４４ｂ、４４ｃ、４４ｄ
の各々は、円筒状ユニット１８ａに接続して、相互に保
持する働きをする。該隔離部分４４は、また、密封装置
２０の相互に接続した通路４２の全体にシーラント３６
が流れるのを助ける。

【００２４】本発明の装置１０に使用される好適なシー
ラント３６はシリコンである。シリコンは長年にわた
り、細胞培養の目的に合った生体適合性を有するものと
して使用されている。シリコンは、さまざまな圧力下に
てマルチチャンバユニット１８の通路４２内に容易に注
入される。図８に示すように、シリコン３６は、円筒状
ユニット１８ａの密封装置２０の通路４２を通って流
れ、硬化時に、連続的なシールを形成する。

【００２５】図９には、シーラント３６が通路４２を充
填する状態が示してあり、該通路４２は、円筒状ユニッ
ト１８ａの底部４８ａを有する内壁５４と、Ｌ字形の外
壁部分４８ｂ、４８ｃとにより画定され、膜１４に平ら
に着座する。図１０に示すように、シリコンは、通常、
でこぼこした膜１４の表面内に自由に流動し、膜構造ま
たは組成に影響を与えずに、膜１４と円筒状ユニット１
８ａの内壁４８ａとの間に接合部を形成する。

【００２６】対照実験によると、シリコン３６は、封入
されており、個々の収容ウェル５８内に滲み出さないこ
とがわかる。該シリコンは確実な接合部を形成し、この
接合部も骨細胞がウェル間の移動を許容しない。このこ
とは、当該出願人の国際公開された上記ＰＣＴ出願に勝
る特に有利な点である。シリコン３６は、一旦硬化した
ならば、滅菌処理可能でもある。シーラント３６は、微
多孔質の薄膜１４の被覆に優先的に接着し、要求通りシ
ールを完全な状態に保つ一方で、マルチウェル装置の取
り外しを容易にする。図１１に示すように、硬化したシ
リコン３６は、膜の表面から単一のユニット６０として
除去することができる。上述のシリコンの特性と同様の
特性を有する材料であれば、シリコンに代えてこの装置
のシーラント３６として使用可能できることは、技術に
熟練した人たちには理解されよう。

【００２７】また、本発明では、装置１０のウェルを覆
うように、緩く取り付けた蓋２２も提供する。該蓋２２
は、緩く取り付けられて、細胞培養実験に必要とされる
ならば、気体を交換することを可能にする。該蓋２２
は、滅菌処理に耐え得る材料である透明なポリスチレン
で製造されることが好ましい。しかし、同様の材料なら
使用できることが、技術に熟練した人たちにはわかるで
あろう。該蓋２２は、蓋をすべき対応するマルチチャン
バユニットの寸法および形状に依存して、さまざまの寸
法および形状で製造することができる。図１に示した好
適な実施例は、個々の１６個の円筒状ユニット１８ａか
ら成るマルチチャンバユニット１８に取り付けられる平
坦な上部２２ａを有する蓋２２である。該蓋の上部２２
ａは平坦であり、その側部２２ｂは、マルチチャンバユ
ニット１８の深さの半分を覆うのに十分な深さまで伸び
ている。このため、蓋２２は容易に滑り落ちることがな
い。また、蓋２２がマルチウェルユニット１０の上に正
確に配置されたことを示すため、蓋２２は一つの長手方
向側部２２ｂに形成された切欠き２２ｃをも有してい
る。

【００２８】本発明の装置は組み立てが極めて簡単であ
り、一般的な実験用装置およびその技術があれば使用可
能である。該装置は、骨細胞の活性の定量的分析に適し
ており、また、安価に製造できるが、通常程度の取り扱
いに耐え得るのに十分丈夫である。本発明のマルチウェ
ル骨細胞培養装置は、人間、または動物の破骨細胞の何
れかの吸収活性を検査するため、または造骨細胞による
新たな骨マトリックスの合成を検査するための分析試験
としての使用に適するよう再現可能な方法で製造でき
る。該装置は、骨細胞疾患の有無について診断試験とし
て使用することができる。骨細胞の活性は、薬剤、また
はその他の生物学的に活性な物質で治療した後に、また
は機械的、化学的或いは物理的な環境の変化の後に骨細
胞活性を評価することも可能である。更に、骨疾患を治
療する化合物を、骨細胞の活性に対するそれらの作用に
基づいて提供するため、骨細胞の活性および疾患の広範
囲の検査および診断、並びに臨床的な薬剤検査過程に
て、本装置は経済的に使用できる。

【００２９】各々の場合に、単核または多核形態の何れ
においても、破骨細胞が活性状態で生存し、膜の人工的
なリン酸カルシウムを吸収し得ると考えられる培養状態
とすることができる。同様に、造骨細胞による良好な培
養が行われる状態を保つことも可能である。

【００３０】該装置は、単細胞のような前駆体細胞を破
骨細胞に分化する過程を研究し、その吸収活性を監視す
るためにも利用可能である。

【００３１】直接的にあるいは間接的に破骨細胞の吸収
活性に影響を及ぼす、薬剤ような化学剤の培養媒体で細
胞への封入の結果または疾患の進行の何れかとして、該
装置は、破骨細胞の吸収活性を測定吸収の活性度の変化
を監視するために使用することができる。同様に、該装
置は、正常および疾患状態のときおよび／または造骨細
胞活性に影響を及ぼす薬剤が存在するときに、造骨細胞
の活性を評価するために使用することができる。また、
この装置において変更を加えた膜上における骨細胞の活
性の挙動を評価することも可能である。例えば、有機分
子および／または生物的作用のある分子を膜に組み込
み、または膜に付与して、破骨細胞および造骨細胞のよ
うな培養した骨細胞に対してかかる分子が与える効果を
判断することもできる。

【００３２】該装置は、破骨細胞の吸収活性または造骨
細胞の合成活性を定量化する手段として使用することも
可能である。かかる活性の分析は、連続的なリアルタイ
ムの監視、時間的間隔を置いた監視、または終了時点で
判断する監視の形態が採用可能である。破骨細胞活性／
造骨細胞活性を確立する段階は、骨細胞（動物またはヒ
トの何れか）が特定の条件下で装置のウェル内で培養さ
れる点で上記の監視方法の各々に共通である。その培養
期間は、数時間から数日にわたり（最適な時間は、細胞
の種および培養方法に依存する）、その期間中、破骨細
胞活性／造骨細胞活性の程度を連続的に監視して、また
は定期的に監視して、または継続的に監視せずに、単に
終了時点で判断するようにしてもよい。

【００３３】破骨細胞の活性の幾つかの異なる分析技術
を独立してまたは組み合わせて採用することができる。
その各技術の前提は、培養中の破骨細胞の細胞によりリ
ン酸カルシウムの薄膜面が吸収される程度を定量化する
ことである。吸収が為されたことを検出に関して、ま
た、各種の検出技術があることを考慮すれば、本発明の
薄膜成分により、リン酸カルシウム材の物理的消失を検
出できる。物理的消失は、直接的にまたは間接的に検出
できる。造骨細胞の活性は、テトラサイクリンを標識と
して使用する蛍光分析、簡単な密度測定法または放射性
標識法により分析することができる。

【００３４】生じている面を最終時点で光学的に評価す
る一例は、各チャンバにより画成された膜の顕微鏡検査
法および／または走査を行う段階を含む。かかる顕微鏡
検査法および／または走査段階は、各培養ウェルから培
地を取り出す段階と、膜面から全ての細胞を取り出す段
階とを含むことができる。マルチチャンバユニットを取
り出し、その後に、膜から硬化したシーラントを剥離す
る。その結果、膜被覆された基部のみが残り、該基部に
おいて、個々のウェル領域内でリン酸カルシウム材の吸
収、または有機骨マトリックスの分泌が生じる。多数の
試料領域を有する単一の基部を残して、マルチウェル骨
細胞培養装置を簡単に取り外すことができることは、そ
の他の公知の骨細胞培養方法よりも極めて有利である。
その理由は、多数の試料の分析および取り扱いが遥かに
容易であり、また、大規模な試料の分析により適してい
るからである。チャンバを取り出すための各種の処理を
行う前に、またはその処理後に、膜で被覆した基部は、
光学顕微鏡検査法、透過型電子顕微鏡法を使用して分析
され、自動画像分析法により走査され、または密度測定
を受ける。そして、膜構造および／または組成は定量的
におよび／または定性的に分析される。特定の分析技
術、および吸収されたリン酸カルシウム材の定量化方法
の詳細および記述は、当該出願人の国際公開されたＰＣ
Ｔ出願の第ＷＯ９４／２６８７２号公報に記載されてい
る。

【００３５】上述の技術は、分析方法の効率を高めるた
め自動化してもよい。その自動化の程度は、培養技術か
ら破骨細胞および／または造骨細胞活性の分析にまで含
めることが可能である。加えて、かかる自動化は、得ら
れるデータを統計的に分析し得るように、コンピュータ
利用によるデータベースと接続可能な形態とすることも
できる。

【００３６】更に、任意の時点で多数の試料を評価し得
るように、膜で被覆した幾つかの基部を同時に評価する
ことも可能である。

【００３７】破骨細胞の包括的な評価のためには、標準
化された細胞培養の露出方法が必要とされる。この最終
的な分析には、表面が自由に評価され得るように全ての
細胞材料を除去する必要がある。このとき、所定の比較
実験にて露出時間は、固定されるため、本発明の装置で
生じる吸収の程度は、破骨細胞により除去される膜と、
培地に露出される膜全体との比率として表すことができ
る。この膜は薄いため、除去される材料の量は、形成さ
れるボイドの平面面積と関係付けることができる。三次
元的な吸収を二次元的に正確に評価する方法は、吸収程
度を評価するために必要とされる技術を非常に簡略化す
る。一方、従来の骨スライス片を評価する方法では、深
さが一定でない複雑で不規則な三次元的吸収窩を測定し
なければならない。本発明の装置を使用すれば、吸収程
度が大きいことは、膜内にしばしば相互に連結される、
大きなボイドとして表れ、そのボイドは、特徴的な有機
質の境界輪郭（ホタテ貝状のもの）を有する。一方、吸
収程度が小さいことは、膜に稀にピンホールが形成さ
れ、局部的に小斑点の形状となることで表れる。造骨細
胞により膜上に骨状物質が蓄積することは、膜表面の隆
起として表れる。

【００３８】

【発明の効果】本発明によるマルチウェル骨細胞培養装
置は、骨細胞の機能特性の研究および理解を著しく進歩
させるものである。本発明により提供される装置は、同
一の装置内だけでなく別個の装置同士に含まれたそれぞ
れのウェル間で、膜組成物が均一である骨細胞の培養を
可能にする。このことは、均一で一貫した評価を行うこ
とを可能にし、優れた、統計的に重要なデータを与え
る。該膜は、リン酸カルシウム材の吸収だけでなく、膜
上における新たな骨マトリックスの発生を検出すること
を可能にするものである。

【００３９】本発明の顕著な利点は、幾つかの試料を同
時に保持することのできる単一の支持基層上にリン酸カ
ルシウム材の薄い膜を提供することであり、同一の膜表
面を使用して造骨細胞および破骨細胞を同時に培養する
ことを含む。例えば、三つの隣接するウェルにおいて、
それぞれ、破骨細胞、造骨細胞および適当な対照細胞の
培養を行うことができる。このようにして、同様の条件
下にある造骨細胞と破骨細胞の機能の生理学的に重要な
比較をすることが可能となる。

【００４０】本明細書に記載した装置は、骨細胞が膜の
表面から移動するのを防止する。全体として、このマル
チウェル骨細胞培養装置は、取り扱いおよび操作が容易
であり、また、骨細胞の活性を制御し骨細胞疾患を治療
する上で重要であり、薬剤の同定およびその効果に必須
である、異常な骨細胞の活性の大規模な検査および診断
を経済的に行い得る。

【００４１】本発明の好適な実施例について詳細に説明
したが、本発明の技術的思想から逸脱せずに、さまざま
の形態が可能であることは、技術に熟練した人たちには
理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】マルチウェル骨細胞培養装置の平面図である。

【図２】平坦な基部の一表面を被覆するための浸漬過程
を示す図である。

【図３】図２にて被覆した基部を示す図である。

【図４】被覆した基部を加熱炉内で焼結する過程を示す
図である。

【図５】上部に均一に焼結された膜被覆を有する基部の
平面図である。

【図６】端部が開放したチャンバユニットの被覆基部上
への配置を図示し、シーラントを注入するノズルの位置
も示す図である。

【図７】マルチウェル骨細胞培養装置の線５−５に沿っ
た断面図である。

【図８】中空端部のマルチチャンバユニットの底面図で
ある。

【図９】膜被覆した基部上に密封されたチャンバの拡大
断面図である。

【図１０】膜被覆の微多孔質構造上に流動するシーラン
トを示す図７の拡大断面図である。

【図１１】膜被覆した基部からシールの除去を示す図で
ある。

【符号の説明】

１０ マルチウェル骨細胞培養装置 １２ 基部 １４ リン酸カルシウム膜 １６ 基部の片面 １８ マルチチャンバユニット １８ａ 円筒状ユニット １８ｂ 円筒状ユニットの底部分 ２０ 密封装置 ２２ 蓋 ２２ａ 蓋の平坦な上部 ２２ｂ 蓋の側部 ２２ｃ 蓋の切欠き ２４ 浸漬投入装置 ２６ 真空パッド ２６ａ 真空パッドの平坦な縁部 ２８ 真空パッドの管 ３０ 容器 ３２ ゾル・ゲル混合液 ３４ 加熱炉 ３６ シーラント／シリコン ３８ａ 円筒状チャンバの開口部 ３８ｂ 円筒状チャンバの開口部 ４０ 注入口 ４２ 密封装置の通路 ４４ 隔離部分 ４４ａ 隔離部分の側部 ４４ｂ 隔離部分の側部 ４４ｃ 隔離部分の側部 ４６ ノズル ４８ 円筒状チャンバの内壁 ４８ａ 円筒状チャンバの内壁底部 ４８ｂ Ｌ字形の外壁部分 ４８ｃ Ｌ字形の外壁部分 ４９ａ スロット（穴） ４９ｂ スロット（穴） ５０ 円筒状チャンバの内壁 ５２ 開口部 ５４ 円筒状チャンバの内壁 ５８ 収容ウェル ６０ 単一のユニット（硬化したシリコン）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 ティモシー・ジェイ・エヌ・スミス カナダ国、ケイ７エム １エム１ オンタ リオ、キングストン、ピクウィック・プレ イス 21

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全般に通常平坦な基部と、該基部は骨細
   胞の培養に適したリン酸カルシウム材の焼結薄膜を少な
   くともその片面に有しており、上記基部の上記膜被覆上
   には端部開放のマルチチャンバユニットが配置されてお
   り、上記マルチチャンバユニットを上記膜被覆に対して
   密封する手段とを含み、上記マルチチャンバユニットは
   上記密封手段により上記膜被覆に対して密封されて、個
   々の収容ウェルを形成しており、骨細胞の活性を定量的
   におよび／または定性的に評価するのに使用されるマル
   チウェル骨細胞培養装置。
2. 【請求項２】 上記膜成分が、その上で骨細胞が培養さ
   れるリン酸カルシウム材を含む請求項１に記載のマルチ
   ウェル骨細胞培養装置。
3. 【請求項３】 膜の構造および／または膜組成を定量的
   にかつ定性的に分析するために、上記膜成分が、光学顕
   微鏡検査法または透過型電子顕微鏡検査法を使用して分
   析され、自動画像分析法により走査され、または密度測
   定を受けることができる、請求項１または請求項２に記
   載のマルチウェル骨細胞培養装置。
4. 【請求項４】 隣接する各個々のチャンバにある上記基
   部部分が連結され、上記チャンバの底部が該基部の膜に
   対して平たく置かれた請求項１ないし請求項３の何れか
   の請求項に記載のマルチウェル骨細胞培養装置。
5. 【請求項５】 上記マルチチャンバユニットが、上記密
   封手段と共に平坦な底部を有し、上記密封手段が、シー
   ラントの充填に適した中空の連続的なチャンバを有する
   請求項４に記載のマルチウェル骨細胞培養装置。
6. 【請求項６】 上記密封手段が、膜被覆の表面に接着し
   得るように注入されたシーラントを含む請求項５に記載
   のマルチウェル骨細胞培養装置。
7. 【請求項７】 上記マルチチャンバユニットが、膜被覆
   した基部上に個々のウェルを形成し、上記膜上の特定の
   領域を占め、形成された上記ウェルが骨細胞の培養に適
   する請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の
   マルチウェル骨細胞培養装置。
8. 【請求項８】 請求項５に記載の培養装置を提供する段
   階と、上記密封装置の中空の連続的なチャンバにシーラ
   ントを注入する段階とを含む、上記マルチチャンバユニ
   ットを膜被覆に対して密封する方法。
9. 【請求項９】 請求項１ないし請求項７の何れかの請
   求項に記載の培養装置を提供する段階と、上記装置の少
   なくとも一つのウェルに、所定量の骨細胞を植え付ける
   段階と、上記細胞を適当な培地内で培養する段階と、上
   記基部上の膜成分の顕微鏡検査および／または走査を行
   い、個々の試料間の膜被覆内部または膜被覆上における
   変化を検出する段階とを含む、骨細胞の活性を測定する
   分析方法。
10. 【請求項１０】 請求項１ないし請求項７の何れかの請
    求項に記載の培養装置を提供する段階と、上記装置の少
    なくとも二つのウェルに、所定量の骨細胞を植え付ける
    段階と、上記細胞を適当な培地内で培養する段階と、上
    記装置の上記ウェルの少なくとも一つに薬剤／化学物質
    を添加する段階と、上記基部上の膜成分の顕微鏡検査お
    よび／または走査を行い、対照試料と処理した試料間の
    膜被覆内部または該膜被覆上における変化を検出する段
    階とを含む骨細胞の活性に対する薬剤／化学物質の効果
    を測定するための薬剤の検査分析法。