WO2013029580A1 - Verfahren zur fluoreszenzmessung - Google Patents

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WO2013029580A1
WO2013029580A1 PCT/DE2012/000658 DE2012000658W WO2013029580A1 WO 2013029580 A1 WO2013029580 A1 WO 2013029580A1 DE 2012000658 W DE2012000658 W DE 2012000658W WO 2013029580 A1 WO2013029580 A1 WO 2013029580A1
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fluorescence
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excitation
intensity
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PCT/DE2012/000658
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Axel Hagen
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Bundesrepublik Deutschland, vertreten durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie, dieses vertreten durch den Präsidenten der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt
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    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
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    • G01N2021/6491—Measuring fluorescence and transmission; Correcting inner filter effect
    • G01N2021/6493—Measuring fluorescence and transmission; Correcting inner filter effect by alternating fluorescence/transmission or fluorescence/reflection

Definitions

  • the invention relates to a method for fluorescence measurement.
  • the invention relates to a fluorescence distribution measuring device for measuring a distribution of fluorescent material in an object, comprising (i) an excitation radiation source for irradiating excitation radiation of an excitation wavelength onto the object to be measured, (ii) an auxiliary radiation source for irradiating an auxiliary radiation an auxiliary radiation wavelength to the object to be measured, wherein the auxiliary radiation wavelength is greater than the excitation wavelength, (iii) at least one measuring device, which is designed for spatially resolved measurement of a fluorescence radiation intensity of fluorescence radiation originating from the object, was caused by the excitation radiation and a Has fluorescence wavelength.
  • Such a dye can also be used for the labeling and localization of tumor-related lymph nodes in the context of cancer therapy, as well as for tissue softening examinations.
  • EP 0 237 363 A2 discloses a fluorescence measurement method.
  • the excitation and the fluorescence wavelength are only slightly different or the excitation radiation has a radiation component which is located in the frequency range of the fluorescence radiation. Therefore, it is hardly possible to distinguish the fluorescence radiation from reflected excitation radiation.
  • a second measurement is carried out with a radiation which does not cause any fluorescence, but resembles the excitation radiation in the region of the fluorescence wavelengths. The two results are then subtracted from each other. However, this only happens in a single test on the sample to be examined.
  • EP 1 775 565 A1 discloses a method for color measurement of printed samples with brighteners.
  • brighteners are substances that emit fluorescence radiation under illumination with ultraviolet light, which lies in the visible range.
  • ultraviolet light which lies in the visible range.
  • the measured brightness value changes. Therefore, the sample to be examined is irradiated once with a UV-free light and once with a pure UV light. Both measurements are stored separately and added spectrally weighted. This makes it possible to calculate the actual brightness value for different light types in which the respective proportion of visible and UV light is known.
  • DE 10 2007 008 850 A1 also deals with the measurement of colorimetric values, in particular of a degree of whiteness, in the case of material surfaces which contain optical brighteners.
  • This document proposes to irradiate the sample with a mixture of visible and UV light and to decompose the spectrum then measured into a fluorescence component and a reflection component. The fluorescence component is then converted to the type of light via empirically determined fluorescence factors for which the color combination is to be determined.
  • DE 40 26 465 C2 discloses a method for producing a two-dimensional distribution image of an ion concentration in a living cell.
  • a fluorescence measurement is performed.
  • the fluorescence intensity image is compared with another image of the cell, which may be, for example, a bright field image, to determine where the edges of the cell are located.
  • the fluorescence outside these edges is considered background fluorescence.
  • the value of this background fluorescence at the site of the cell walls is considered to be constant and subtracted from the fluorescence value within the cell.
  • DE 695 35 254 T2 discloses a high speed light source having two single light sources emitting light of different wavelengths.
  • Both light sources are electrically operated, wherein the intensity of each emitted radiation directly depends on the current with which the respective light source is operated.
  • the frequency of the emitted light can be quickly switched back and forth between the two values of the individual light sources.
  • the invention has for its object to optimize the accuracy of the spatially resolved fluorescence measurement in scattering media.
  • Measurement accuracy is understood to mean the correlation of fluorescence image contrast to the dye concentration present in the scattering medium.
  • the invention has for its object to improve the accuracy of the spatially resolved fluorescence measurement in scattering media.
  • the invention solves the problem by a method for fluorescence measurement, comprising the steps of (a) irradiating excitation radiation of an excitation wavelength on an object to be measured, wherein the object to be measured contains fluorescent material, (b) spatially resolved measuring a fluorescence radiation intensity of fluorescence radiation (c) irradiating an auxiliary radiation wavelength on the object to be measured, wherein the auxiliary radiation wavelength is greater than the excitation wavelength, (d) spatially resolved determining an auxiliary radiation intensity of scattered auxiliary radiation and (e) determining a spatially resolved parameter which is a measure of the concentration of fluorescent material in the object, at least also from the fluorescence zenzstrahlungs intensity and the auxiliary radiation intensity, wherein (f) the spatially resolved determining the auxiliary radiation intensity and the spatially resolved measuring the fluorescence radiation intensity comprises suppressing scattered excitation radiation
  • the invention solves the problem by a generic fluorescence measuring device which has a filter for suppressing scattered excitation radiation and for passing fluorescence radiation and auxiliary radiation and in which the measuring device is designed for spatially resolved measurement of an auxiliary radiation intensity of auxiliary radiation that was scattered in the object.
  • An advantage of the invention is the increased measurement accuracy.
  • the invention is based on the finding that the fluorescent light is also scattered and absorbed in the object before it reaches the detector. This scattering and absorption depends on the local property of the object and the wavelength of the fluorescence radiation. This means that the measurement result depends not only on the spatially resolved concentration of fluorescent material, but also on the unknown scattering and absorption properties of the object. Because of that
  • Auxiliary radiation which corresponds to the wavelength or frequency of the fluorescent radiation, the influence of the unknown scattering and absorption properties can be minimized to the fluorescence radiation. It is thus obtained an optimal measurement result, which is particularly important in medical applications.
  • Another advantage is that as in a preferred embodiment provided in scrubstrahlan woman can be measured.
  • this is meant in particular that an angle between the optical axis of the incident light and the optical axis of the detected
  • the fluorescence distribution measuring device according to the invention can be used as a handheld device be formed, which is particularly favorable for medical applications.
  • wavelengths always refer to vacuum wavelengths.
  • the wavelength of radiation depends on the refractive index, so that the wavelength in the object is usually smaller, but for the sake of simplicity the vacuum wavelength is decisive.
  • the parameter which is a measure of the concentration of fluorescent material, is understood to mean any number or size that correlates so strongly with the concentration of fluorescent material or a location derivative that a reliable indication of the concentration is possible.
  • this spatially resolved parameter is the quotient of fluorescence radiation intensity and auxiliary radiation intensity or a variable or number derived therefrom.
  • the auxiliary radiation wavelength preferably corresponds to the fluorescence wavelength. This is understood in particular to mean that the auxiliary radiation wavelength lies within an interval of ⁇ 25 nanometers around the global maximum of the intensity of the fluorescence radiation.
  • the fluorescence radiation generally has a wavelength spectrum with a maximum and is not described on a single wavelength. It is thus possible, but not necessary, for the auxiliary radiation to have only one wavelength. It is also conceivable that the auxiliary radiation has a plurality of wavelengths or has wavelengths from a wavelength interval. In this case, the statement refers to the intensity weighted average.
  • auxiliary radiation corresponds to the fluorescence radiation
  • the more accurately the evaluation succeeds since the scattering and absorption properties of the object with respect to the fluorescence radiation are then particularly similar are to the scattering and absorption properties with respect to the auxiliary radiation. It is therefore optimal if the spectrum of the auxiliary radiation corresponds to the spectrum of the fluorescence radiation. Since such auxiliary radiation is usually expensive to produce, it has proven to be advantageous to use such auxiliary radiation, which has only one wavelength, this wavelength should be close to the maximum of the spectrum of fluorescence radiation.
  • the irradiation of the excitation radiation and the irradiation of the auxiliary radiation take place alternately.
  • the spatially resolved measurement of the auxiliary radiation intensity and the spatially resolved measurement of the fluorescence radiation intensity are carried out with one and the same detector, the measuring device being synchronized with a radiation source emitting the excitation radiation and the auxiliary radiation.
  • the auxiliary radiation intensity and the fluorescent radiation intensity are performed in the same measuring device, it is understood, in particular, that the conversion of the optical signal in the form of the intensities into an electrical signal is carried out with the same sensor element. This allows a simple measurement setup and saves an otherwise necessary alignment of sensor elements for the different intensities relative to each other.
  • the measuring device comprises a long-pass filter, which is selected so that the excitation radiation is filtered out.
  • the radiation is first filtered so that the excitation radiation is suppressed, then the fluorescence radiation intensity and the auxiliary radiation Intensity measured time-shifted spatially resolved, in synchronism with the change in irradiation between excitation radiation and auxiliary radiation.
  • the object to be measured is part of a human or animal body to which a fluorescent dye has been added.
  • a fluorescent dye indocyanine green has been found.
  • a fluorescence distribution measuring device is designed for automatically performing a described method and comprises an evaluation unit which is set up for calculating a spatially resolved parameter from the fluorescence radiation intensity and the auxiliary radiation intensity, this parameter being a measure of the concentration of fluorescent material in the object is.
  • the parameter is the ratio of fluorescence intensity and auxiliary radiation intensity.
  • the fluorescence distribution measuring device is designed as a handheld device and the measuring device for measuring the fluorescence radiation intensity and the auxiliary radiation intensity is arranged with respect to the auxiliary radiation source and the excitation radiation source in the reflecting position.
  • FIG. 1 shows a schematic drawing of a fluorescence distribution measuring device according to the invention
  • FIG. 2 shows a spatially resolved fluorescence radiation intensity and excitation radiation backscatter intensity recorded using a method according to the prior art, a measurement carried out with the fluorescence distribution measuring apparatus according to FIG. 1 according to the invention under laboratory conditions.
  • FIG. 1 shows a fluorescence distribution measuring device 10 according to the invention for measuring a distribution of fluorescent material 12 in an object 14.
  • the fluorescent material 12 is, for example, indocyanine green, which is present in different concentrations at different locations.
  • the fluorescence distribution measuring device 10 has an excitation radiation source 16, which in the present case comprises a first light source 18, an alternating device 20 and an optical fiber 22.
  • the excitation radiation source 16 is designed to irradiate excitation radiation 24 with an excitation wavelength end length onto the object 14 to be measured.
  • the fluorescence distribution measuring device 10 additionally comprises an auxiliary radiation source 26 which comprises a second light source 28 and shares with the excitation radiation source 16 the alternator 20 and the optical fiber 22.
  • the excitation radiation source 16 and the auxiliary radiation source 26 are arranged such that auxiliary radiation 30 is emitted in the same emission direction RA as the excitation radiation 24.
  • the fluorescence distribution measuring device 10 also has a measuring device 32, for example in the form of a CCD camera, which is arranged such that fluorescence radiation 34 emitted by the object 14 with a fluorescence wavelength A and backscattered auxiliary radiation can be measured in a spatially resolved manner.
  • the measuring device 32 is arranged such that radiation originating from an irradiation direction R E is detected.
  • An angle ⁇ between the direction of irradiation R E and radiation direction R A is less than 10 ° in the present case.
  • the measuring device 32 comprises a detector 36, in the present case in the form of a CCD chip, a lens system 38 and a long-pass filter 40.
  • the detector is connected to an evaluation unit 37, which calculates from the measurement data of the detector 36 the concentration parameter P described below.
  • the measuring device 32 is part of a handheld device 42, which may have a handle 44. On the handset 42, a jet dispenser is also arranged.
  • the beam delivery device 46 is aligned with the measuring device 32 in such a way that fluorescence radiation 34 and scattered auxiliary radiation 30 can be detected with the measuring device 32, which were caused by irradiation with the excitation radiation 24 or auxiliary radiation 30.
  • the measuring device 32 is designed for the spatially resolved measurement of a fluorescence radiation intensity I 34 and an auxiliary radiation intensity I 30 .
  • the measuring device 32 is connected via a connection 48, in the present case by means of an electric cable, to the alternator 20, which are also referred to as choppers can, which was realized in the present case by a chopper.
  • the excitation radiation source 16 emits continuously or discontinuously excitation radiation 24 at the excitation wavelength.
  • the auxiliary radiation source 26 continuously or discontinuously outputs auxiliary radiation 30 with the auxiliary radiation wavelength X, from. Both radiations reach the alternating device 20, which alternately switches the radiation sources 16, 26 onto the optical fiber 22, so that excitation radiation 24 and auxiliary radiation 30 alternate with one another. The object 14 is thus irradiated alternately with excitation radiation 24 and auxiliary radiation 30.
  • a synchronization signal is sent to the measuring device 32, so that the intensity measured in the detector 36 can be unambiguously identified as fluorescence radiation intensity l 34 or as auxiliary radiation intensity l 30 .
  • the connection 48 and a control device, not shown in FIG. 1, of the alternating device 20, which generates the trigger signal, are part of a synchronizing device.
  • Figure 1 shows that the handset 42 can be grasped with the handle 44 and moved in space.
  • the potentially heavy radiation sources 16 and 26 may remain stationary and be connected via the optical fiber 22 and the connection 48 to the handset 42. It is then easy to direct the handset 42, for example, to parts of the human body.
  • 2 shows the fluorescence radiation intensity I34 when measured on a female breast gland 14.
  • the partial image on the top right shows an excitation radiation backscatter intensity I24, ie the intensity distribution of that excitation radiation 24 (see FIG Case of the female mammary gland was scattered.
  • This excitation radiation backscatter intensity I24 was measured by a separate detector as known in the art.
  • FIG. 3 shows a measurement carried out under laboratory conditions using the fluorescence distribution measuring device according to the invention according to FIG. 1, with liquid droplets arranged in a grid on a sample carrier 50.
  • concentration c of indocyanine green increases column by column from top left to bottom right.
  • the left partial image shows the fluorescence radiation intensity l 34
  • the middle image the auxiliary radiation Intensity l 3 o.
  • the right image shows the relationship between the two. It can be seen that the fluorescence image contrast in the ratio image correlates with the course of the indocyanine green concentration c used.
  • An advantageous fluorescence distribution meter comprises the following components:
  • a light source for the excitation of the ICG fluorescence (760 nm)
  • a light source for the absorption correction (820 nm)
  • a PC for controlling the system, for data acquisition and display
  • the detector can be either an EMCCD camera with front-exposed sensor ("Luca” from Andor Technologies, 20% quantum efficiency at 800 nm) or alternatively with a back-illuminated sensor ("iXon” from Andor Technologies, 60% quantum efficiency at 800 nm). , Both cameras have a cooling of the sensor to minimize the dark current.
  • a tunable titanium sapphire oscillator (Mai Tai from Spectra-Physics, now Newport) at 760 nm and for absorption correction a diode laser (LDH Series, PicoQuant) at 820 nm is currently used. Both wavelengths are multiplexed with the aid of a chopper (hms elektronik) and coupled into a 0.48 NA multimode fiber (Thorlabs), which serves to illuminate the tissue phantoms and whose ends are close to that for small working distances (up to 10 cm). designed camera lens (HF9HA-1 B, Fujinon) is attached.
  • an optical diffuser (ED1-C50-MD, Thorlabs) is additionally used at the fiber end.
  • the light output after diffuser is in the range of 100 - 300 mW for the excitation radiation (760 nm) and 1 - 3 mW for the auxiliary radiation (820 nm).
  • a 800 nm long pass filter (3rd Millennium, Laser Components) and a 780 nm red glass filter (RG 780, Schott) are mounted in front of the lens.
  • the reading of the camera is synchronized with the chopper movement so that one fluorescence image and one absorption image are alternately taken one after the other.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung, mit den Schritten: Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) einer Anregungswellenlänge (λ1) auf ein zu vermessendes Objekt (14), wobei das zu vermessende Objekt (14) fluoreszierendes Material (12) enthält, ortsaufgelöstes Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (I34) von Fluoreszenzstrahlung (34), die von der Anregungsstrahlung (24) im Objekt (14) hervorgerufen wurde und zumindest eine Fluoreszenzwellenlänge (λ3) hat, Einstrahlen einer Hilfsstrahlung (30) mit zumindest einer Hilfsstrahlungswellenlänge (λ2) auf das zu vermessende Objekt (14), wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge (λ2) größer ist als die Anregungswellenlänge (λ1), ortsaufgelöstes Ermitteln einer Hilfsstrahlungs-Intensität (I30) gestreuter Hilfsstrahlung (30) und Ermitteln eines ortsaufgelösten Parameters (P), der ein Maß für die Konzentration (c) an fluoreszierendem Material (12) ist, aus der Fluoreszenzstrahlungs-lntensität (I34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (I30), wobei das ortsaufgelöste Ermitteln der Hilfsstrahlungs-Intensität (I30) und das ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (I34) ein Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung (24) umfasst.

Description

Verfahren zur Fluoreszenzmessung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung. Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Fluoreszenzverteilungs- Messgerät zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material in einem Objekt, mit (i) einer Anregungsstrahlungsquelle zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung einer Anregungswellenlänge auf das zu vermessende Objekt, (ii) einer Hilfsstrahlungsquelle zum Einstrahlen einer Hilfsstrahlung mit einer Hilfsstrahlungswellenlänge auf das zu vermessende Objekt, wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge größer ist als die Anregungswellenlänge, (iii) zumindest einer Messvorrichtung, die ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität von Fluoreszenzstrahlung, die aus dem Objekt stammt, von der Anregungsstrahlung hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenzwellenlänge hat.
Die Messung der Verteilung von fluoreszierendem Material in einem Objekt ist insbesondere in der Medizin von Interesse. So ist bekannt, dass Substanzen existieren, die mit Anregungsstrahlung zu Fluoreszenz ange- regt werden können, wobei sich diese Substanzen in Tumorgewebe oder an den Rändern von Tumoren im Vergleich zum umgebenden Gewebe anreichern und weitgehend ungiftig sind. Es ist daher möglich, nach Gabe dieses Farbstoffs die Fluoreszenz zu messen und aus der Fluoreszenz auf
|Bestätigungskopie| etwaig vorhandene Tumore zu schließen. Darüber hinaus kann solch ein Farbstoff auch zur Markierung und Lokalisierung von Tumornahen Lymphknoten im Rahmen einer Krebstherapie verwendet werden, sowie für Ge- webeperfusions-Untersuchungen.
Aus der US 6,175,759 B1 ist bekannt, Licht zweier Wellenlängen durch das zu untersuchende Objekt zu schicken und das Verhältnis der Absorption beider Strahlungen zur Detektion von Tumoren einzusetzen. Allerdings ist dort nicht erwähnt, wie die Wellenlängen zu wählen sind, um die Messgenauigkeit zu optimieren. Ferner lässt US 6, 175,759 B1 offen, wie bei einer Fluoreszenzmessung vorzugehen ist.
Aus der DE 10 2008 057 1 15 A1 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration von Fluorophoren einer Substanz in einer Probe bekannt. Dabei wird neben der eigentlichen Fluoreszenzmessung, bei der Licht einer Anregungswellenlänge auf die zu untersuchende Substanz gestrahlt wird, parallel ein Referenzlicht einer Referenzlichtwellenlänge auf ein optisches Element gesendet, das als Remissionsstandard verwendet wird. Somit ist eine quantitative Bestimmung der Anzahl der Fluorophoren in der zu untersuchenden Substanz möglich.
Die EP 0 237 363 A2 offenbart ein Fluoreszenzmessungsverfahren. Dabei sind die Anregungs- und die Fluoreszenzwellenlänge nur leicht unterschiedlich bzw. verfügt die Anregungsstrahlung über einen Strahlungsan- teil, der sich im Frequenzbereich der Fluoreszenzstrahlung befindet. Daher ist es kaum möglich, die Fluoreszenzstrahlung von reflektierter Anregungsstrahlung zu unterscheiden. Dabei wird eine zweite Messung mit einer Strahlung durchgeführt, die keine Fluoreszenz hervorruft, im Bereich der Fluoreszenzwellenlängen jedoch der Anregungsstrahlung ähnelt. Die beiden Ergebnisse werden anschließend voneinander abgezogen. Dies geschieht jedoch lediglich in einem einzigen Test bei der zu untersuchenden Probe. Die EP 1 775 565 A1 offenbart ein Verfahren zur Farbmessung von gedruckten Proben mit Aufhellern. Dabei sind Aufheller Substanzen, die unter Beleuchtung mit ultraviolettem Licht eine Fluoreszenzstrahlung abge- ben, die im sichtbaren Bereich liegt. Je nach dem, wie groß der Anteil von ultraviolettem Licht bei der Messstrahlung ist, ändert sich der gemessene Helligkeitswert. Daher wird die zu untersuchende Probe einmal mit einem UV-freien Licht und einmal mit einem reinen UV-Licht bestrahlt. Beide Messungen werden separat gespeichert und spektral gewichtet addiert. Damit ist es möglich, für unterschiedliche Lichtarten, bei denen der jeweilige Anteil von sichtbarem und UV-Licht bekannt ist, den tatsächlichen Helligkeitswert zu berechnen.
Auch die DE 10 2007 008 850 A1 befasst sich mit der Messung von farb- metrischen Werten, insbesondere eines Weißgrades, bei Materialoberflächen, die optische Aufheller beinhalten. Diese Druckschrift schlägt vor, die Probe mit einer Mischung aus sichtbarem und UV-Licht zu bestrahlen und das daraufhin gemessene Spektrum in einen Fluoreszenzanteil und einen Reflexionsanteil zu zerlegen. Der Fluoreszenzanteil wird anschließend über empirisch bestimmte Fluoreszenzfaktoren auf die Lichtart umgerechnet, für die die Farbkombination ermittelt werden soll.
Die DE 40 26 465 C2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines zweidimensionalen Verteilungsbildes einer lonenkonzentration in einer leben- den Zelle. Dabei wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Um das so ermittelte Fluoreszenzintensitätsbild von Hintergrundfluoreszenz zu befreien, wird das Fluoreszenzintensitätsbild mit einem weiteren Bild der Zelle, das beispielsweise ein Hellfeldbild sein kann, abgeglichen, um festzustellen, wo sich die Ränder der Zelle befinden. Die Fluoreszenz außerhalb dieser Ränder wird als Hintergrundfluoreszenz angesehen. Der Wert, den diese Hintergrundfluoreszenz am Ort der Zellwände aufweist, wird als konstant angesehen und vom Fluoreszenzwert innerhalb der Zelle abgezogen. Die DE 695 35 254 T2 offenbart eine Hochgeschwindigkeitslichtquelle, die über zwei Einzellichtquellen verfügt, die Licht unterschiedlicher Wellenlänge aus senden. Beide Lichtquellen werden elektrisch betrieben, wobei die Intensität der jeweils ausgesandten Strahlung direkt von der Stromstärke abhängt, mit der die jeweilige Lichtquelle betrieben wird. Über ein rasches Umschalten der Stromstärken an den beiden Lichtquellen kann die Frequenz des ausgesandten Lichtes schnell zwischen den beiden Werten der Einzellichtquellen hin und her umgeschaltet werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Messgenauigkeit bei der ortsaufgelösten Fluoreszenzmessung in streuenden Medien zu optimieren. Unter Messgenauigkeit wird hier die Korrelation von Fluoreszenz-Bildkontrast zur im streuenden Medium vorhandenen Farbstoffkonzentration verstanden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Messgenauigkeit bei der ortsaufgelösten Fluoreszenzmessung in streuenden Medien zu verbessern.
Die Erfindung löst das Problem durch ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung, mit den Schritten (a) Einstrahlen von Anregungsstrahlung einer Anregungswellenlänge auf ein zu vermessendes Objekt, wobei das zu vermessende Objekt fluoreszierendes Material enthält, (b) ortsaufgelöstes Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität von Fluoreszenzstrahlung, die von der Anregungsstrahlung im Objekt hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenz-Wellenlänge hat, (c) Einstrahlen einer Hilfsstrahlungswellen- länge auf das zu vermessende Objekt, wobei die Hilfsstrahlungswellenlän- ge größer ist als die Anregungswellenlänge, (d) ortsaufgelöstes Ermitteln einer Hilfsstrahlungs-Intensität gestreuter Hilfsstrahlung und (e) Ermitteln eines ortsaufgelösten Parameters, der ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material im Objekt ist, zumindest auch aus der Fluores- zenzstrahlungs-lntensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität , wobei (f) das ortsaufgelöste Ermitteln der Hilfsstrahlungs-Intensität und das ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität ein Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung umfasst
Gemäß einem zweiten Aspekt löst die Erfindung das Problem durch ein gattungsgemäßes Fluoreszenz-Messgerät, das einen Filter zum Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung und zum Passierenlassen von Fluoreszenzstrahlung und Hilfsstrahlung aufweist und bei dem die Mess- Vorrichtung ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Hilfsstrahlungs-Intensität von Hilfsstrahlung, die im Objekt gestreut wurde.
Vorteilhaft an der Erfindung ist die erhöhte Messgenauigkeit. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass auch das Fluoreszenzlicht im Objekt gestreut und absorbiert wird, bevor es den Detektor erreicht. Diese Streuung und Absorption ist von der lokalen Eigenschaft des Objekts und der Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung abhängig. Das bedeutet, dass das Messergebnis nicht nur von der ortsaufgelösten Konzentration an fluoreszierendem Material abhängig ist, sondern auch von den unbekannten Streu- und Absorptionseigenschaften des Objekts. Dadurch, dass eine
Hilfsstrahlung verwendet wird, die hinsichtlich ihrer Wellenlänge bzw. Frequenz der Fluoreszenzstrahlung entspricht, kann der Einfluss der unbekannten Streu- und Absorptionseigenschaften auf die Fluoreszenzstrahlung minimiert werden. Es wird so ein optimales Messergebnis erhalten, was insbesondere in der medizinischen Anwendung wichtig ist.
Ein weiterer Vorteil ist, dass wie in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen in Rückstrahlanordnung gemessen werden kann. Hierunter ist insbesondere zu verstehen, dass ein Winkel zwischen der optischen Ach- se des eingestrahlten Lichts und der optischen Achse des detektierten
Lichts höchstens 45° beträgt und insbesondere kleiner ist als 25°. So kann das erfindungsgemäße Fluoreszenzverteilungs-Messgerät als Handgerät ausgebildet werden, was für medizinische Anwendungen besonders günstig ist.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden unter den genannten Wellenlängen immer Vakuumwellenlängen verstanden. Selbstverständlich hängt die Wellenlänge von Strahlung vom Brechungsindex ab, so dass die Wellenlänge im Objekt in der Regel kleiner ist, maßgeblich ist aber der Einfachheit halber die Vakuumwellenlänge. Unter dem Parameter, der ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material ist, wird jede Zahl oder Größe verstanden, die mit der Konzentration an fluoreszierendem Material oder einer Ableitung nach dem Ort so stark korreliert, dass eine verlässliche Aussage über die Konzentration möglich ist. Beispielsweise handelt es sich bei diesem ortsaufgelösten Pa- rameter um den Quotienten aus Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und Hilfsstrahlungs-Intensität oder eine daraus abgeleitete Größe oder Zahl.
Vorzugsweise entspricht die Hilfsstrahlungswellenlänge der Fluoreszenzwellenlänge. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die Hilfsstrah- lungswellenlänge innerhalb eines Intervalls von ±25 Nanometern um das globale Maximum der Intensität der Fluoreszenzstrahlung liegt Die Fluoreszenzstrahlung hat in der Regel ein Wellenlängenspektrum mit einem Maximum und ist nicht auf eine einzelne Wellenlänge beschrieben. Es ist also möglich, nicht aber notwendig, dass die Hilfsstrahlung lediglich eine Wellenlänge besitzt. Denkbar ist auch, dass die Hilfsstrahlung mehrere Wellenlängen aufweist oder Wellenlängen aus einem Wellenlängen- Intervall besitzt. In diesem Fall bezieht sich die Aussage auf den auf Intensitätsanteile gewichteten Mittelwert. Je mehr die Hilfsstrahlung der Fluoreszenzstrahlung entspricht, desto genauer gelingt die Auswertung, da die Streu- und Absorptionseigenschaften des Objekts bezüglich der Fluoreszenzstrahlung dann besonders ähnlich sind zu den Streu- und Absorptionseigenschaften bezüglich der Hilfsstrahlung. Optimal ist es daher, wenn das Spektrum der Hilfsstrahlung dem Spektrum der Fluoreszenzstrahlung entspricht. Da eine derartige Hilfsstrahlung meist aufwändig herzustellen ist, hat es sich als vorteilhaft er- wiesen, eine solche Hilfsstrahlung zu verwenden, die lediglich eine Wellenlänge hat, wobei diese Wellenlänge dicht beim Maximum des Spektrums der Fluoreszenzstrahlung liegen sollte.
Vorzugsweise erfolgen das Einstrahlen der Anregungsstrahlung und das Einstrahlen der Hilfsstrahlung alternierend. Das hat den Vorteil, dass die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und die Hilfsstrahlungs-Intensität mit ein und demselben Detektor gemessen werden können, der dazu lediglich mit dem Wechsel der Anregungsstrahlung zur Hilfsstrahlung synchronisiert werden muss. Es handelt sich dabei quasi um ein Zeitmultiplexen der bei- den Strahlungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden das ortsaufgelöste Messen der Hilfsstrahlungs-Intensität und das ortsaufgelöste Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität mit ein und demselben Detektor durchge- führt, wobei das Messgerät mit einer Strahlungsquelle, die die Anregungsstrahlung und die Hilfsstrahlung abgibt, synchronisiert wird. Unter dem Merkmal, dass die Hilfsstrahlungs-Intensität und die Fluoreszenzstrah- lungs-lntensität in demselben Messgerät durchgeführt werden, wird insbesondere verstanden, dass die Umsetzung des optischen Signals in Form der Intensitäten in ein elektrisches Signal mit dem gleichen Sensorelement durchgeführt wird. Das ermöglicht einen einfachen Messaufbau und erspart ein ansonsten notwendiges Ausrichten von Sensorelementen für die unterschiedlichen Intensitäten relativ zueinander. In aller Regel umfasst das Messgerät einen Langpassfilter, der so gewählt ist, dass die Anre- gungsstrahlung herausgefiltert wird. In anderen Worten wird die Strahlung zunächst so gefiltert, dass die Anregungsstrahlung unterdrückt wird, danach werden die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und die Hilfsstrahlungs- Intensität zeitversetzt ortsaufgelöst gemessen, und zwar synchron zum Wechsel beim Einstrahlen zwischen Anregungsstrahlung und Hilfsstrahlung. Vorzugsweise ist das zu vermessende Objekt ein Teil eines menschlichen oder tierischen Körpers, dem ein Fluoreszenzfarbstoff zugeführt wurde. Als geeigneter Fluoreszenzfarbstoff hat sich Indocyaningrün herausgestellt. Ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät ist zum automatischen Durchführen eines beschriebenen Verfahrens ausgebildet und umfasst eine Auswerteeinheit, die eingerichtet ist zum Berechnen eines ortsaufgelösten Parameters aus der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität, wobei dieser Parameter ein Maß für die Konzentration an fluoreszierendem Material im Objekt ist. Insbesondere handelt es sich bei dem Parameter um das Verhältnis aus Fluores- zenzstrahlungs-lntensität und Hilfsstrahlungs-Intensität. Vorzugsweise ist das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät als Handgerät ausgebildet und die Messvorrichtung zum Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und der Hilfsstrahlungs-Intensität ist bezüglich der Hilfsstrahlungsquelle und der Anregungsstrahlungsquelle in Rückstrahllage angeordnet.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigt
Figur 1 eine Schemazeichnung eines erfindungsgemäßen Fluores- zenzverteilungs-Messgeräts,
Figur 2 eine mit einem Verfahren nach Stand der Technik aufgenommene ortsaufgelösten Fluoreszenzstrahlungs-Intensität und Anregungsstrahlungsrückstreu-Intensität, eine mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzverteilungs- Messgerät gemäß Figur 1 unter Laborbedingungen durchge führte Messung. Figur 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material 12 in einem Objekt 14. Das fluoreszierende Material 12 ist beispielsweise Indocya- ningrün, das an verschiedenen Orten in verschiedenen Konzentrationen vorliegt.
Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 besitzt eine Anregungsstrah- lungsquelle 16, die im vorliegenden Fall eine erste Lichtquelle 18, eine Alterniervorrichtung 20 und eine Lichtleitfaser 22 umfasst. Die Anregungs- strahlungsquelle 16 ist ausgebildet zum Einstrahlen von Anregungsstrah- lung 24 mit einer Anregungswellendlänge auf das zu vermessende Objekt 14. Beispielsweise kann die Anregungswellenlänge Λ, = 760 Nanome- ter betragen.
Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 10 umfasst zudem eine Hilfsstrah- lungsquelle 26, die eine zweite Lichtquelle 28 umfasst und mit der Anre- gungsstrahlungsquelle 16 die Alterniervorrichtung 20 und die Lichtleitfaser 22 teilt. Die Hilfsstrahlungsquelle 26 ist eingerichtet zum Abgeben von Hilfsstrahlung mit einer Wellenlänge . Beispielsweise beträgt die Wel- lenlänge der Hilfsstrahlung λ2 = 820 Nanometer.
Die Anregungsstrahlungsquelle 1 6 und die Hilfsstrahlungsquelle 26 sind so angeordnet, dass Hilfsstrahlung 30 in die gleiche Abstrahlrichtung RA abgegeben wird wie die Anregungsstrahlung 24.
Das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät 1 0 besitzt zudem eine Messvorrichtung 32, beispielsweise in Form einer CCD-Kamera, die so angeordnet ist, dass vom Objekt 14 abgegebene Fluoreszenzstrahlung 34 mit einer Fluoreszenzwellenlänge A, und zurück gestreute Hilfsstrahlung ortsaufgelöst messbar sind. Die Messvorrichtung 32 ist so angeordnet, dass aus einer Einstrahlrichtung RE stammende Strahlung erfasst wird. Ein Winkel α zwischen Einstrahlrichtung RE und Abstrahlrichtung RA beträgt im vorliegenden Fall weniger als 1 0° .
Die Messvorrichtung 32 umfasst einen Detektor 36, im vorliegenden Fall in Form eines CCD-Chips, ein Linsensystem 38 sowie einen Langpassfilter 40. Der Langpassfilter 40 besitzt eine Absorptionskante zwischen der Anregungswellenlänge A, und der Fluoreszenzwellenlänge A, . Im vorliegen- den Fall liegt die Absorptionskante des Langpassfilters 40 beispielsweise bei ÄK = 800 Nanometer. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinheit 37 verbunden, die aus den Messdaten des Detektors 36 den unten beschriebenen Konzentrations-Parameter P berechnet. Die Messvorrichtung 32 ist Teil eines Handgeräts 42, das einen Handgriff 44 aufweisen kann. Am Handgerät 42 ist zudem eine Strahlabgabevorrichtung angeordnet. Die Strahlabgabevorrichtung 46 ist so zur Messvorrichtung 32 ausgerichtet, dass mit der Messvorrichtung 32 Fluoreszenzstrahlung 34 und gestreute Hilfsstrahlung 30 detektiert werden können, die durch Bestrahlung mit der Anregungsstrahlung 24 bzw. Hilfsstrahlung 30 hervorgerufen worden sind. Die Messvorrichtung 32 ist ausgebildet zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l34 sowie einer Hilfsstrahlungs-Intensität l30. Damit beide Intensitäten, l34, l30) mit dem gleichen Detektor 36 gemes- sen werden können, ist die Messvorrichtung 32 über eine Verbindung 48, im vorliegenden Fall mittels eines elektrischen Kabels, mit der Alterniervorrichtung 20 verbunden, die auch als Chopper bezeichnet werden kann, die im vorliegenden Fall durch einen Chopper realisiert wurde. Im Betrieb gibt die Anregungsstrahlungsquelle 16 kontinuierlich oder diskontinuierlich Anregungsstrahlung 24 mit der Anregungswellenlänge ab. Zudem gibt die Hilfsstrahlungsquelle 26 kontinuierlich oder diskontinuierlich Hilfsstrahlung 30 mit der Hilfsstrahlungswellenlänge X, ab. Beide Strahlungen erreichen die Alterniervorrichtung 20, die die Strahlungsquel- len 16, 26 alternierend auf die Lichtleitfaser 22 schaltet, so dass Anregungsstrahlung 24 und Hilfsstrahlung 30 einander abwechseln. Das Objekt 14 wird so abwechselnd mit Anregungsstrahlung 24 und Hilfsstrahlung 30 bestrahlt. Über die Verbindung 48 wird ein Synchronisierungssignal an die Messvorrichtung 32 gesendet, so dass die im Detektor 36 gemessene Intensität eindeutig als Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l34 oder als Hilfsstrahlungsintensität l30 identifiziert werden kann. Die Verbindung 48 und eine in Figur 1 nicht eingezeichnete Steuervorrichtung der Alterniervorrichtung 20, die das Triggersignal generiert, sind Teil einer Synchronisiervorrichtung.
Figur 1 zeigt, dass das Handgerät 42 mit dem Handgriff 44 ergriffen und im Raum bewegt werden kann. Die möglicherweise schweren Strahlungsquellen 16 und 26 können ortsfest bleiben und über die Lichtleitfaser 22 und die Verbindung 48 mit dem Handgerät 42 Verbunden sein. Es ist dann einfach, das Handgerät 42 beispielsweise auf Teile des menschlichen Körpers zu richten. Figur 2 zeigt oben links die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität I34 bei Messung an einer weiblichen Brustdrüse 14. Das Teilbild oben rechts zeigt eine Anregungsstrahlungsrückstreu-Intensität I24, also die Intensitätsvertei- lung derjenigen Anregungsstrahlung 24 (vgl. Figur 1 ), die vom Objekt, im vorliegenden Fall der weiblichen Brustdrüse gestreut wurde. Diese Anre- gungsstrahlungsrückstreu-lntensität I24 wurde von einem separaten Detektor gemessen, wie er im Stand der Technik bekannt ist.
Das in der Mitte angeordnete Teilbild 2.3 zeigt das Verhältnis— , das mit
■^24
aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ermittelt wurde. Es ist zu erkennen, dass dieses Verhältnis am Rand besonders klein ist und im Inneren der Brustdrüse größer. Es ist zudem ein heller Fleck erkennbar, der einen Tumor 54 darstellt.
Im Teilbild 2.4 ist der Konzentrations-Parameter P = ^ gezeigt, der mit
'30
einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde. Es ist zu erkennen, dass jenseits des hellen Punktes mit dem Tumor 54 der Konzentrations- Parameter P im Wesentlichen gleich 1 ist. Der Konzentrations-Parameter P eignet sich damit deutlich besser als das in Figur 2.3 gezeigte Verhältnis
-^- zum Bestimmen der einen ortsaufgelösten Konzentration c des fluo-
'34,R
reszierenden Materials.
Figur 3 zeigt eine mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzverteilungs- Messgerät gemäß Figur 1 unter Laborbedingungen durchgeführt Messung, wobei auf einem Probenträger 50 rasterartig angeordnete Flüssigkeitstropfen aufgebracht sind. Die Konzentration c an Indocyaningrün steigt spaltenweise von links oben nach rechts unten. Das linke Teilbild zeigt die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität l34, das mittlere Bild die Hilfsstrahlungs- Intensität l3o. Das rechte Bild zeigt das Verhältnis aus beiden. Es ist zu erkennen, dass der Fluoreszenz-Bildkontrast im Verhältnisbild mit dem Verlauf der eingesetzten Indocyaningrün-Konzentration c korreliert. Ein vorteilhaftes Fluoreszenzverteilungs-Messgerät umfasst die folgenden Komponenten:
eine EMCCD-Kamera mit Triggereingang (Detektor),
eine Lichtquelle für die Anregung der ICG-Fluoreszenz (760 nm), eine Lichtquelle für die Absorptionskorrektur (820 nm),
- eine Abbildungsoptik mit Filtern zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung,
einen Lichtwellenleiter mit Optik zur Ausleuchtung des Untersuchungsgebietes,
einen Chopper mit Triggerelektronik zum multiplexen der beiden Wel- lenlängen und
einen PC zur Steuerung des Systems, zur Datenerfassung und - anzeige
Als Detektor dient wahlweise eine EMCCD-Kamera mit frontseitig belichte- tem Sensor („Luca" von Andor Technologies; 20 % Quanteneffizienz bei 800 nm) oder alternativ mit rückwärtig belichtetem Sensor („iXon" von Andor Technologies; 60 % Quanteneffizienz bei 800 nm). Beide Kameras verfügen zur Minimierung des Dunkelstroms über eine Kühlung des Sensors.
Zur Anregung der ICG-Fluoreszenz wird derzeit ein durchstimmbarer Titan-Saphir-Oszillator (Mai Tai von Spectra-Physics, jetzt Newport) bei 760 nm und zur Absorptionskorrektur ein Diodenlaser (LDH Series, PicoQuant) bei 820 nm verwendet. Beide Wellenlängen werden mit Hilfe eines Chop- pers (hms elektronik) gemultiplext und in eine 0,48 NA Multimodefaser (Thorlabs) eingekoppelt, die zur Beleuchtung der Gewebephantome dient und deren Ende dicht neben dem für kleine Arbeitsabstände (bis 10 cm) ausgelegten Kameraobjektiv (HF9HA-1 B, Fujinon) angebracht ist. Zur Verbesserung der Homogenität der Ausleuchtung wird zusätzlich noch ein optischer Diffuser (ED1 -C50-MD, Thorlabs) am Faserende eingesetzt. Die Lichtleistung nach Diffuser liegt im Bereich von 100 - 300 mW für die An- regungsstrahlung (760 nm) und bei 1 - 3 mW für die Hilfsstrahlung (820 nm). Zur Unterdrückung der Anregungsstrahlung ist ein 800 nm Langpass- Filter (3rd Millennium, Laser Components) sowie ein 780 nm Rotglas-Filter (RG 780, Schott) vor dem Objektiv angebracht. Über eine selbst entwickelte Triggerelektronik wird das Auslesen der Kamera mit der Chopperbewegung synchronisiert, so dass abwechselnd nacheinander jeweils ein Fluoreszenzbild und ein Absorptionsbild aufgenommen werden. Diese Bilder werden dann im PC verrechnet (Untergrundabzug, Division, ggf. Filterung) und als absorptionskorrigierte Fluo- reszenzbilder in Echtzeit am Monitor dargestellt. Die verwendete Software wurde mit LabVIEW (Version 8.6, National Instruments) sowie dem Nl Vision Development Modul (National Instruments) erstellt.
Bezugszeichenliste
10 Fluoreszenzverteilungs-
Messgerät A, Anregungswellenlänge
12 fluoreszierendes Material , Hilfsstrahlungswellenlänge
14 Objekt
A3 Fluoreszenzwellenlänge
16 Anregungsstrahlungsquelle
ÄK Absorptionskante
18 erste Lichtquelle c Konzentration
20 Alterniervorrichtung
l30 Hilfsstrahlungs-Intensität
22 Lichtleitfaser
I34 Fluoreszenzstrahlungs¬
24 Anregungsstrahlung
intensität
26 Hilfsstrahlungsquelle
P Konzentrations-Parameter
28 zweite Lichtquelle
RA Abstrahlrichtung
RE Einstrahlrichtung
30 Hilfsstrahlung
32 Messvorrichtung
34 Fluoreszenzstrahlung
36 Detektor
37 Auswerteeinheit
38 Linsensystem
40 Langpassfilter
42 Handgerät
44 Handgriff
46 Strahlabgabevorrichtung
48 Verbindung
50 Probenträger
54 Tumor

Claims

Verfahren zur Fluoreszenzmessung, mit den Schritten:
(a) Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) einer Anregungswellenlänge { Äy ) auf ein zu vermessendes Objekt (14), wobei das zu vermessende Objekt (14) fluoreszierendes Material (12) enthält,
(b) ortsaufgelöstes Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) von Fluoreszenzstrahlung (34), die
von der Anregungsstrahlung (24) im Objekt (14) hervorgerufen wurde und
zumindest eine Fluoreszenzwellenlänge ( ^ ) hat,
(c) Einstrahlen einer Hilfsstrahlung (30) mit zumindest einer Hilfs- strahlungswellenlänge ( L, ) auf das zu vermessende Objekt (14), wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge ( X, ) größer ist als die Anregungswellenlänge { Äy ) ,
(d) ortsaufgelöstes Ermitteln einer Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) gestreuter Hilfsstrahlung (30) und
(e) Ermitteln eines ortsaufgelösten Parameters (P), der ein Maß für die Konzentration (c) an fluoreszierendem Material (12) ist, aus der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o),
(f) wobei das ortsaufgelöste Ermitteln der Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) und das ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenzstrahlungs Intensität (l34) ein Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung (24) umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die H
strahlungswellenlänge ( X, ) der Fluoreszenzwellenlänge ( A, ) entspricht.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das Einstrahlen der Anregungsstrahlung (24) und
das Einstrahlen der Hilfsstrahlung (30) alternierend erfolgen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das ortsaufgelöste Messen der Hilfsstrahlungs-Intensität (ho) und das ortsaufgelöste Messen der Fluoreszenzstrählungs- Intensität (l34) mit ein und demselben Detektor (36) durchgeführt werden und
das Messgerät mit einer Strahlungsquelle, die die Anregungsstrahlung (24) und die Hilfsstrahlung (30) abgibt, synchronisiert wird.
Fluoreszenzverteilungs-Messgerät zum Messen einer Verteilung von fluoreszierendem Material (12) in einem Objekt (14), mit
(i) einer Anregungsstrahlungsquelle (16) zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) einer Anregungswellenlänge ( , ) auf das zu vermessende Objekt (14),
(ii) einer Hilfsstrahlungsquelle (26) zum Einstrahlen einer Hilfsstrahlung (30) mit einer Hilfsstrahlungswellenlänge (^ ) auf das zu vermessende Objekt (14), wobei die Hilfsstrahlungswellenlänge ( ^ ) größer ist als die Anregungswellenlänge ( , ) und
(iii) zumindest einer Messvorrichtung (32), die ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (l34) von Fluoreszenzstrahlung (34), die
aus dem Objekt (14) stammt,
von der Anregungsstrahlung (24) hervorgerufen wurde und eine Fluoreszenzwellenlänge ( , ) hat, dadurch gekennzeichnet, dass
(iv) das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät einen Filter (40) zum Unterdrücken von gestreuter Anregungsstrahlung und zum Passierenlassen von Fluoreszenzstrahlung (34) und Hilfsstrahlung (30) aufweist,
(v) die Messvorrichtung (32) ausgebildet ist zum ortsaufgelösten Messen einer Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o) von Hilfsstrahlung (30), die im Objekt (14) gestreut wurde, und
(vi) dass das Fluoreszenzverteilurigsmessgerät ausgebildet ist zum automatischen Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Auswerteeinheit (37), die eingerichtet ist zum Berechnen eines ortsaufgelösten Parameters (P), der ein Maß für die Konzentration (c) an fluoreszierendem Material (12) ist, aus der Fluores- zenzstrahlungs-lntensität (l34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o).
7. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass
die Anregungsstrahlungsquelle (16) und die Hilfsstrahlungsquel- le (26) ausgebildet sind zum periodisch alternierenden Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) und Hilfsstrahlung (30) auf das zu vermessende Objekt (14),
das Fluoreszenzverteilungs-Messgerät (10) eine Synchronisiervorrichtung zum Synchronisieren der Messvorrichtung (32) einerseits mit der Anregungsstrahlungsquelle (16) und der Hilfs- strahlungsquelle (26) andererseits aufweist und dass die Messvorrichtung (32) eingerichtet ist zum periodisch alternierenden Messen der Fluoreszenzstrahlungs-Intensität (I34) und der Hilfsstrahlungs-Intensität (l3o) synchron zum Einstrahlen von Anregungsstrahlung (24) und Hilfsstrahlung (30).
8. Fluoreszenzverteilungs-Messgerät nach einem der vorstehenden Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass
es ein Handgerät (42) umfasst, mittels dem die Anregungsstrahlung (24) und die Hilfsstrahlung (30) auf das Objekt (14) abgebbar ist und die Fluoreszenzstrahlungs-Intensität ( I34) und die Hilfsstrahlungs-Intensität (l30) in Rückstrahlungslage messbar sind.
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