EP2624743A2 - Verwendung einer kombination von auswertungsverfahren in einer vorrichtung zur detektion von tumoren sowie vorrichtung zur detektion von tumoren - Google Patents

Verwendung einer kombination von auswertungsverfahren in einer vorrichtung zur detektion von tumoren sowie vorrichtung zur detektion von tumoren

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EP2624743A2
EP2624743A2 EP11813772.8A EP11813772A EP2624743A2 EP 2624743 A2 EP2624743 A2 EP 2624743A2 EP 11813772 A EP11813772 A EP 11813772A EP 2624743 A2 EP2624743 A2 EP 2624743A2
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EP
European Patent Office
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evaluation method
oscillator
combination
signals
stokes
Prior art date
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Application number
EP11813772.8A
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Inventor
Karsten KÖNIG
Hans Georg Breunig
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JenLab GmbH
Original Assignee
JenLab GmbH
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • G01N21/65—Raman scattering
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    • G01N21/65—Raman scattering
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    • G01N2021/655—Stimulated Raman

Definitions

  • the present invention relates to a use of a combination of evaluation methods in a device for detecting tumors according to claim 1 and a device for detecting tumors according to claim 2 or 3.
  • the present invention is based on the object to improve the safety in the detection of tumors.
  • Claim 1 relates to the use of a combination of evaluation methods in a device for detecting tumors, wherein the combination of the evaluation methods comprises the multiphoton excitation evaluation method and / or the second harmonic generation method, and furthermore either the evaluation method of the coherent anti-Stokes-Raman Scattering or the evaluation method of stimulated Raman scattering includes.
  • Claim 2 relates to a device for the detection of tumors using a combination of evaluation methods, wherein the combination of the evaluation method, the evaluation method of multiphoton excitation and / or the evaluation method the generation of the second harmonic and further comprises the method of evaluation of coherent anti-Stokes Raman scattering.
  • the device comprises a femtosecond oscillator or a picosecond oscillator whose output signals are supplied to an optical parametric oscillator, wherein the output signals of the optical parametric Oscillator be projected by means of a focusing on the skin of a person to be examined, wherein scattered signals with a frequency which results as a frequency due to the coherent anti-Stokes-Raman scattering from the two frequencies of the optical parametric oscillator, are analyzed in terms of their intensity
  • the apparatus further comprises means for masking one of the output signals of the optical parametric oscillator for performing the multiphoton excitation evaluation method and the second harmonic generation evaluation method.
  • Said device is suitable when using the evaluation method of the coherent anti-Stokes Raman scattering.
  • Claim 3 relates to a device for the detection of tumors using a combination of evaluation methods, wherein the combination of the evaluation method comprises the multiphoton excitation evaluation method and / or the second harmonic generation method and further the Raman scattering evaluation method; Femtose III- oscillator or a picosecond oscillator whose output signals are supplied to an optical parametric oscillator, wherein the output signals of the optical parametric oscillator are projected by means of a focusing on the skin of a person to be examined, wherein scattered signals of the frequency of Pumpfeldes and / or the Frequency of the Stokes E-field, are analyzed in terms of their intensity, the apparatus further comprising means for masking one of the output signals of the optical parametric oscillator for carrying out the multiphoton excitation evaluation method and the second harmonic generation evaluation method. It also proves to be advantageous that several components can be used together to carry out the different evaluation methods. Said device is suitable when using the evaluation method of the stimulated Raman scattering.
  • the output signals of the optical parametric oscillator and the backscattered signals are distinguished by the polarization planes of the signals are rotated in the path of the signals.
  • This embodiment again relates to the stimulated Raman scattering, because in this case the frequencies of the scattered radiation coincide with the frequencies of the introduced radiation.
  • the evaluation takes place in this case in that the scattered radiation amplifies the radiation introduced with respect to one frequency and is weakened with respect to the other frequency. In order to distinguish the scattered radiation from the introduced radiation, these radiations are polarized differently.
  • the object of the present invention is therefore an apparatus for performing optical tomography of the skin, wherein the imaging signals by generation and detection of multiphoton fluorescence, coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) or the second harmonic (SHG) of the incident light arise.
  • CARS coherent anti-Stokes Raman scattering
  • SHG second harmonic
  • Coherent anti-Stokes Raman microscopy allows imaging of chemical or biological samples using molecular vibration transitions as a contrasting mechanism.
  • an electromagnetic pump field with a central frequency (Dp and an electromagnetic Stokes field with central frequency w s are used.
  • CARS microscopy (as well as SHG microscopy) does not require fluorophores, since the imaging mechanism is based on vibrational excitation of chemical and biological samples, and provides significantly higher coherence properties due to CARS microscopy Sensitivity as the spontaneous Raman microscopy, whereby a clear H lower average excitation power can be used or a shorter measurement time is necessary.
  • US Patent No. 6108081 deals with an apparatus and method for microscopically imaging molecular vibrations using CARS with a collinear excitation geometry.
  • collinear pump and Stokes beams are focused onto the sample with the aid of a high numerical aperture objective. Due to the nonlinear dependence of the signal on the excitation intensity, only in The small focus volume generates signals so that a three-dimensional scanning of the sample is possible. The signals are detected only in the beam direction.
  • US Patent No. 6934020 deals with an apparatus in which the signal is detected from the sample in the reverse direction (opposite to the beam direction, Epi-CARS).
  • This reverse signal typically has a higher signal-to-noise ratio, but is weaker in many applications than the signal simultaneously generated in the forward direction.
  • US Patent 7414729 describes an endoscopy system in which at least two stimulating electromagnetic fields and the generated signal are transmitted through an optical fiber system.
  • the signal is again generated by the non-linear interaction of the exciting electromagnetic fields with the sample volume and passed through the same fiber as the exciting fields to the detector.
  • the subject matter of the present invention is a tomograph which generates and detects signals in a spatially resolved manner by non-linear optical excitation.
  • the image signals are generated by pixel-by-pixel detection of the signal intensities.
  • the spatial resolution is generated by minimizing the focus volume, since only in this volume signals arise.
  • the signals to be detected are multiphoton autofluorescence, the second harmonics of the incident light and CARS light.
  • CARS signals For the generation of CARS signals, at least two collinear laser beams of different wavelengths must be focused through a microscope objective onto the sample in a common focus volume.
  • the signal light must be collected and (spectrally) separated from the incident radiation and detected.
  • an oscillator in combination with an optical parametric oscillator can be used.
  • the laser beams can be moved over the skin with the aid of scanner mirrors and the collected signal can be detected with a photomultiplier.
  • OPO optical parametric oscillator
  • the use of a single laser beam is sufficient, the second laser beam can be blocked in this mode of operation.
  • different excitation wavelengths and filters must generally be used. Exemplary embodiments of the tomograph for carrying out optical skin examinations on the basis of multiphoton excitations, the generation of the second harmonic and coherent anti-Stokes-Raman scattering are described below.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the combined multiphoton excitation CARS tomograph.
  • the excitation is carried out by a femtosecond oscillator and an optical parametric oscillator.
  • the pulses of a femtosecond oscillator (a) (eg MaiTai HP Spectra Physics) are directed via deflecting mirrors located under a cover (b) into an optical parametric oscillator (OPO) (c) (eg Chameleon APE Berlin)
  • OPO generates sig- naled signal and idler pulses that emerge through an opening on the side, in addition to which the OPO has an output opening for the oscillator pulses, which are spatially and temporally superimposed on oscillator and Stokes pulse trains by means of a delay path and a dichroic mirror.
  • the pulses are then focused on the skin to be examined via a scanner-detector module (e) and a mirror arm with focusing optics.
  • the (mirror) scanner is used for pixel-by-pixel scanning of the sample with the stimulating pulses.
  • the generated signals (depending on the configuration CARS, autofluorescence, SHG) are collected by the same focusing optics and passed through the mirror arm (f) back into the scan detector module (e).
  • stimulating radiation and signal are separated by a dichroic mirror and the signal is detected.
  • the beam path of the exciting laser pulses and the generated signal is shown in FIG.
  • a single beam is sufficient.
  • either the oscillator, signal or Idlerpulse be used and blocked the other beams each.
  • suitable filters are introduced into the signal beam path, for example by sliding tabs, eg color glass filters BG 39 for the detection of SHG and autofluorescence, and suitable bandpass filters for the exclusive detection of SHG or CARS signals.
  • the superimposed Stokes and oscillator pulses are used for the excitation of CARS signals, for example of water (eg central wavelength of the oscillator pulses: 810 nm, signal pulses: 1105 nm, CARS signal at 639 nm, filter used: bandpass 624/40) or the CH 2 Stretching vibration used, which occurs in lipid molecules (eg oscillator pulses: 810 nm, signal pulses: 1052 nm, CARS signal at 658 nm, bandpass filter 660/10).
  • an oscillator another laser is conceivable that can generate pulses in the fs range.
  • a picosecond oscillator may be used in the described construction.
  • the pulse duration of the OPO pulses is then also in the picosecond range. With these pulses, CARS can achieve higher spectral accuracy of excitation, but the pulse intensities available to excite autofluorescence are lower.
  • one of the previously described possibilities is used to generate the exciting electromagnetic fields and to generate autofluorescence / SHG signals.
  • another non-linear Raman technique is used.
  • One such technique is stimulated Raman scattering (SRS).
  • SRS stimulated Raman scattering
  • Two E fields (pump and Stokes) of different wavelengths are simultaneously irradiated onto the sample and spatially superimposed. If the energy difference of pump and Stokes E fields corresponds to the energy of a vibration transition, then the molecule can be excited to vibrate.
  • the Stokes E field is amplified by stimulated emission and the pump field is attenuated. The intensity of this increase in intensity or attenuation is used as a signal for imaging.
  • SRS measurement in epi-geometry does not allow spectral separation of stimulating rays and backscattered signal.
  • a beam splitter can be used for a separation, which either lets pass or reflects differently polarized light.
  • a quarter-wave plate is introduced into the excitation / signal beam path, which circularly polarizes the linearly polarized exciting radiation.
  • the amplified or attenuated signal light passes through the quarter-wave plate a second time on the way to the detector and is thus linearly polarized with a plane of polarization shifted by 90 ° with respect to the exciting radiation.
  • Exciting light and signal light are then spatially separated by a polarization beam splitter and the signal light is detected.
  • the lock-in technique is used.
  • the intensity of the Stokes beam is modulated at high frequency and the intensity of the pump beam at the modulation frequency detected with a lock-in amplifier.
  • the pump beam can also be modulated and the intensity of the Stokes beam can be detected.
  • SHG / Autofluoreszenzsignalen is converted to the configuration shown in Figure 2 by the detector and filter and beam splitters are mounted on slidable riders.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination von Auswertungsverfahren in einer Vorrichtung zur Detektion von Tumoren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen umfasst sowie weiterhin entweder das Auswertungsverfahren der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung oder das Auswertungsverfahren der stimulierten Raman-Streuung umfasst. Um die Sicherheit bei der Erkennung von Tumoren zu verbessern wird im Rahmen der Erfindung vorgeschlagen, die genannten Auswertungsverfahren zu kombinieren.

Description

BESCHREIBUNG
Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren in einer Vorrichtung zur Detektion von Tumoren sowie Vorrichtung zur Detektion von Tumoren
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren in einer Vorrichtung zur Detektion von Tumoren nach Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung zur Detektion von Tumoren nach Anspruch 2 oder 3.
Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, zur Detektion von Tumoren eines der Verfahren der Multiphotonfluoreszenz, der Erzeugung der Zweiten Harmonischen oder der kohärenten Anti-Stokes-Ramanstreuung zu verwenden.
Demgegenüber liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, die Sicherheit bei der Erkennung von Tumoren zu verbessern.
Dies wird vorteilhaft nach der vorliegenden Erfindung erreicht durch eine Kombination der genannten Auswertungsverfahren.
Anspruch 1 betrifft die Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren in einer Vorrichtung zur Detektion von Tumoren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen umfasst sowie weiterhin entweder das Auswertungsverfahren der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung oder das Auswertungsverfahren der stimulierten Raman-Streuung umfasst.
Es hat sich gezeigt, dass gerade durch die Kombination die Auswertungssicherheit verbessert werden kann. Abhängig davon, ob die zu untersuchenden Tumore eine Multiphotonenautofluoreszenz aufweisen, kann dieses Auswertungsverfahren mit berücksichtigt werden oder nicht.
Anspruch 2 betrifft eine Vorrichtung zur Detektion von Tumoren unter Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen sowie weiterhin das Auswertungsverfahren der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung umfasst., wobei die Vorrichtung einen Femtosekunden-Oszillator oder einen Pikosekunden-Oszillator aufweist, dessen Ausgangssignale einem Optischen Parametrischen Oszillator zugeführt werden, wobei die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators mittels einer Fokussiereinrichtung auf die Haut einer zu untersuchenden Person projiziert werden, wobei gestreute Signale mit einer Frequenz, die sich als Frequenz auf Grund der kohärenten Anti-Stokes-Raman Streuung aus den beiden Frequenzen des Optischen Parametrischen Oszillators ergibt, hinsichtlich deren Intensität analysiert werden, wobei die Vorrichtung weiterhin Mittel aufweist zur Ausblendung eines der Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators zur Durchführung des Auswertungsverfahrens der Multiphotonenanregung sowie des Auswertungsverfahrens der Erzeugung der Zweiten Harmonischen.
Dabei erweist es sich als vorteilhaft, dass mehrere Bauteile gemeinsam genutzt werden können zur Durchführung der unterschiedlichen Auswertungsverfahren. Die genannte Vorrichtung eignet sich bei Verwendung des Auswertungsverfahrens der kohärenten Anti- Stokes-Raman- Streuung .
Anspruch 3 betrifft eine Vorrichtung zur Detektion von Tumoren unter Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen sowie weiterhin das Auswertungsverfahren der stimulierten Raman-Streuung umfasst, wobei die Vorrichtung einen Femtosekunden- Oszillator oder einen Pikosekunden-Oszillator aufweist, dessen Ausgangssignale einem Optischen Parametrischen Oszillator zugeführt werden, wobei die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators mittels einer Fokussiereinrichtung auf die Haut einer zu untersuchenden Person projiziert werden, wobei gestreute Signale der Frequenz des Pumpfeldes und/oder der Frequenz des Stokes-E-Feldes, hinsichtlich deren Intensität analysiert werden, wobei die Vorrichtung weiterhin Mittel aufweist zur Ausblendung eines der Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators zur Durchführung des Auswertungsverfahrens der Multiphotonenanregung sowie des Auswertungsverfahrens der Erzeugung der Zweiten Harmonischen. Dabei erweist es sich ebenfalls als vorteilhaft, dass mehrere Bauteile gemeinsam genutzt werden können zur Durchführung der unterschiedlichen Auswertungsverfahren. Die genannte Vorrichtung eignet sich bei Verwendung des Auswertungsverfahrens der stimulierten Raman- Streuung.
Bei der Ausgestaltung nach Anspruch 4 werden die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators und die rückgestreuten Signale unterschieden werden, indem die Polarisationsebenen der Signale auf dem Weg der Signale gedreht werden.
Diese Ausgestaltung bezieht sich wieder auf die stimulierte Raman-Streuung, weil hierbei die Frequenzen der gestreuten Strahlung mit den Frequenzen der eingeleiteten Strahlung übereinstimmen. Die Auswertung erfolgt hierbei dadurch, dass die gestreute Strahlung die eingeleitete Strahlung hinsichtlich einer Frequenz verstärkt und hinsichtlich der anderen Frequenz geschwächt wird. Um die gestreute Strahlung von der eingeleiteten Strahlung zu unterscheiden, werden diese Strahlungen unterschiedlich polarisiert.
Bei dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung geht es daher um ein Gerät zur Durchführung von optischen Tomographien der Haut, wobei die bildgebenden Signale durch Erzeugung und Detektion von Multiphotonenfluoreszenz, kohärente Anti-Stokes- Ramanstreuung (CARS) oder der Zweiten Harmonischen (SHG) des eingestrahlten Lichts entstehen. Zur Erzeugung der Signale werden ein oder mehrere Laserstrahlen gepulster Laser auf bzw. in die Haut fokussiert und das Fokusvolumen so verstellt, dass der zu untersuchende Bereich nacheinander (pixelweise) abgerastert wird. Die im Fokusvolumen erzeugten Signale werden durch die gleiche Fokussieroptik gegen die Strahlrichtung eingesammelt und detektiert. Durch Übertragen der Signalintensitäten in Grauwerte der entsprechenden Bildpunkte wird ein Bild generiert. Bei der Multiphotonenfluoreszenz werden pro Anregungsprozess zwei oder mehr Photonen von in der Haut natürlicherweise vorkommenden Molekülen absorbiert und diese zur Autofluoreszenz angeregt, die detektiert wird. Bei der Erzeugung der Zweiten Harmonischen findet ein spezieller kohärenter Streuprozess statt, bei dem zwei zeitgleich eingestrahlte Photonen gleicher Energie zu einem Photon mit der doppelten Energie umgewandelt werden. Die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung wird durch gleichzeitig eingestrahlte Pump-, Stokes- und Test-Photonen hervorgerufen und führt, wenn die Energiedifferenz der eingestrahlten Pump- und Stokes-Photonen gerade einem Vibrationsübergang des Moleküls entspricht zu einem resonanzverstärkten kohärenten molekülspezifischen Signal. Sie ermöglicht damit auch die Detektion nicht autofluresszierender oder SHG erzeugender Substanzen. Im Gewebe ermöglicht dies beispielsweise die Detektion von Lipiden und Wasser.
Die Kohärente Anti-Stokes-Raman-Mikroskopie ermöglicht die Abbildung von chemischen oder biologischen Proben, wobei molekulare Schwingungsübergänge als Kontrastmechanismus eingesetzt werden. Bei der CARS Mikroskopie/Tomographie werden mindestens zwei Laserfelder, ein elektromagnetisches Pump-Feld mit einer Zentralfrequenz (Dp sowie ein elektromagnetisches Stokes-Feld mit Zentralfrequenz cos verwendet. Durch die Wechselwirkung von Pump- und Stokes-Feldern mit der Probe wird ein kohärentes Anti- Stokes-Feld mit der Frequenz CÜAS = 2 cop - cos in der Richtung generiert, die durch die Phasenanpassung vorgeben ist. Insbesondere wenn die Frequenzdifferenz cop - cos einem bestimmten Schwingungsübergang entspricht, wird bei der Anti-Stokes Frequenz CÜAS ein CARS Signal erzeugt. Im Unterschied zur Fluoreszenz-Mikroskopie-Tomographie erfordert die CARS Mikroskopie (sowie auch die SHG-Mikroskopie) keine Fluorophore, da der Bildgebungsmechanismus auf der Schwingungsanregung von chemischen und biologischen Proben beruht. Aufgrund der Kohärenzeigenschaften der CARS Mikroskopie liefert sie deutlich höhere Empfindlichkeit als die spontane Raman-Mikroskopie, wodurch eine deutlich geringere durchschnittliche Anregungsleistung verwendet werden kann bzw. eine kürzere Messzeit notwendig ist.
Mikroskopie basierend auf kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung wird bereits in einer Reihe von Patenten beschrieben. Das US Patent Nr. 4405237 behandelt ein CARS- Bildgebungsgerät, in dem die Probe simultan von zwei Laserpulszügen mit verschiedenen Wellenlängen, die räumlich und zeitlich überlagert werden, beleuchtet wird. In Kombination mit einem Flächendetektor erzeugt der Signal-Strahl in phasenangepasster Richtung die räumliche Auflösung.
Das US Patent Nr. 6108081 behandelt einen Apparat und eine Methode zur mikroskopischen Abbildung molekularer Schwingungen mit Hilfe von CARS mit einer kollinearen Anregungsgeometrie. In dem dort beschriebenen Apparat werden kollineare Pump- und Stokes-Strahlen mit Hilfe eines Objektivs hoher numerischer Apertur auf die Probe fokussiert. Durch die nichtlineare Abhängigkeit des Signals von der Anregungsintensität werden nur in dem kleinen Fokusvolumen Signale erzeugt, so dass ein dreidimensionales Abrastern der Probe möglich wird. Die Signale werden ausschließlich in Strahlrichtung detektiert.
Im Unterschied zur Detektion des Signals in Strahlrichtung behandelt das US-Patent Nr. 6934020 einen Apparat, bei dem das Signal von der Probe aus in umgekehrter Richtung (entgegengesetzt zur Strahlrichtung, Epi-CARS) detektiert wird. Dieses Signal in Gegenrichtung enthält typischerweise ein höheres Signal-Rausch- Verhältnis, ist aber in vielen Anwendungen schwächer als das Signal, das gleichzeitig in Vorwärtsrichtung generiert wird.
Das US-Patent 7414729 beschreibt ein Endoskopie- System, bei dem mindestens zwei anregende elektromagnetische Felder sowie das generierte Signal durch ein optisches Fasersystem übertragen werden. Das Signal wird hierbei wieder durch die nichtlineare Wechselwirkung der anregenden elektromagnetischen Felder mit dem Probenvolumen erzeugt und durch die gleiche Faser wie die anregenden Felder zum Detektor geleitet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Tomograph, der Signale durch nichtlineare optische Anregung ortsaufgelöst erzeugt und detektiert. Die Bildsignale entstehen durch pixelweise Detektion der Signalintensitäten. Die räumliche Auflösung wird durch Minimieren des Fokusvolumens erzeugt, da nur in diesem Volumen Signale entstehen. Die zu detektierenden Signale sind Multiphotonenautofluoreszenz, die Zweite Harmonische des eingestrahlten Lichtes sowie CARS-Licht. Für die Erzeugung von CARS-Signalen müssen mindestens zwei kollineare Laserstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen durch ein Mikroskopobjektiv auf die Probe in einem gemeinsamen Fokusvolumen fokussiert werden. Das Signallicht muss eingesammelt werden und (spektral) von der eingestrahlten Strahlung getrennt und detektiert werden. Für die Erzeugung der eingestrahlten Laserstrahlen zum Generieren des CARS-Signals kann ein Oszillator in Kombination mit einem optischen Parametrischen Oszillator (OPO) verwendet werden. Die Laserstrahlen können mit Hilfe von Scannerspiegeln über die Haut bewegt werden und das eingesammelte Signal mit einem Photomultiplier detektiert werden. Für die Erzeugung von Multiphotonenautofluoreszenz und SHG reicht die Verwendung eines einzelnen Laserstrahls aus, der zweite Laserstrahl kann in diesem Betriebsmodus geblockt werden. Für die Erzeugung von Multiphotonenautofluoreszenz, SHG und CARS müssen im Allgemeinen unterschiedliche Anregungswellenlängen und Filter verwendet werden. Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele des Tomographen zur Durchführung von optischen Hautuntersuchungen auf Basis von Multiphotonenanregungen, der Erzeugung der Zweiten Harmonischen und kohärenter Anti-Stokes-Raman- Streuung beschrieben.
Figur 1 zeigt eine Ausführung des kombinierten Multiphotonenanregung-CARS- Tomographen. Die Anregung erfolgt durch einen Femtosekunden-Oszillator und einen Optisch Parametrischen Oszillator. Die Pulse eines Femtosekunden-Oszillators (a) (z.B. MaiTai HP Spectra Physics, werden über Umlenkspiegel, die sich unter einer Abdeckung (b) befinden, in einen Optischen Parametrischen Oszillator (OPO) (c) (z.B. Chameleon APE Berlin) geleitet. Der OPO erzeugt sognannte Signal- und Idler-Pulse, die durch eine Öffnung an der Seite austreten. Zusätzlich verfügt der OPO über eine Austrittsöffnung für die Oszillatorpulse. Oszillator- und Stokes-Pulszüge werden mit Hilfe einer Verzögerungsstrecke und einem dichroitischen Spiegel räumlich und zeitlich überlagert (d). Die Pulse werden dann über ein Scanner-Detektor-Modul (e) und einen Spiegelarm mit Fokussieroptik auf die zu untersuchende Haut fokussiert.
Der (Spiegel-)Scanner dient zum pixelweisen Abrastern der Probe mit den anregenden Pulsen. Die erzeugten Signale (je nach Konfiguration CARS, Autofluoreszenz, SHG) werden durch die gleiche Fokussieroptik eingesammelt und durch den Spiegelarm (f) zurück in das Scan-Detektor-Modul (e) geleitet. Innerhalb des Scan-Detektor-Moduls (e) wird anregende Strahlung und Signal durch einen dichroitischen Spiegel getrennt und das Signal detektiert.
Der Strahlengang der anregenden Laserpulse und des erzeugten Signals ist in Figur 2 dargestellt. Zur Generierung von Autofluoreszenz- oder SHG-Signalen genügt ein einzelner Strahl. Dazu werden wahlweise die Oszillator, Signal oder Idlerpulse verwendet und die anderen Strahlen jeweils blockiert. Je nach zu messendem Signal werden z.B. durch verschiebbare Reiter geeignete Filter in den Signalstrahlengang eingebracht z.B. Farbglasfilter BG 39 zur Detektion von SHG und Autofluoreszenz, und geeignete Bandpassfilter zur ausschließlichen Detektion von SHG oder CARS-Signalen. Die überlagerten Stokes- und Oszillatorpulse werden für die Anregung von CARS-Signalen z.B. von Wasser (z.B. Zentralwellenlänge der Oszillatorpulse: 810 nm, Signalpulse: 1105 nm, CARS-Signal bei 639 nm, eingesetzter Filter: Bandpass 624/40) oder der CH2-Streckschwingung verwendet, die in Lipidmolekülen auftritt (z.B. Oszillatorpulse: 810 nm, Signalpulse: 1052 nm, CARS-Signal bei 658 nm, Bandpass-Filter 660/10). Statt eines Oszillators ist auch ein anderer Laser denkbar, der Pulse im fs-Bereich erzeugen kann.
In einer anderen Ausführung kann in dem beschriebenen Aufbau ein Pikosekunden-Oszillator verwendet werden. Die Pulsdauer der OPO-Pulse liegt dann auch im Pikosekunden Bereich. Mit diesen Pulsen lässt sich beim CARS eine höhere spektrale Genauigkeit der Anregung erzielen, jedoch sind die Pulsintensitäten, die zur Anregung der Autofluoreszenz zur Verfügung stehen geringer.
Zur Erzeugung des CARS Signales ist auch der Einsatz von zwei (oder drei) einzelnen synchronisierten Lasern (Oszillatoren) möglich (fs/fs, ps/ps, fs/ps). Im Ausführungsbeispiel der Figur 1 ist dann der OPO c) durch einen zweiten Oszillator zu ersetzten. In diesem Fall ist eine zusätzliche zeitliche Synchronisation der Pulse nötig, bei genügend hoher Genauigkeit ist dann der Einsatz einer Verzögerungsstrecke zur Erzeugung einer zeitlichen Überlappung der Pulse (in Figur 1 mit„(d)" bezeichnet) nicht mehr nötig. Es lassen sich fs oder ps Oszillatoren einsetzten oder für eine hohe spektrale Genauigkeit der CARS-Anregung (fs/ps) und hohe Effizienz der SHG/Autofluoreszenz-Generierung eine Kombination aus ps- und fs- Oszillatoren (Multiplex-CARS).
Zur Anregung der CARS-Signale kann auch eine Kombination aus Oszillatorpulsen und Superkontinuum, d.h. (Oszillator-)Pulse, deren Spektrum durch Transmission durch eine Faser und den dabei statt findenden Wechselwirkungsprozess (Selbstphasenmodulation) verbreitet sind. In diesem Ausführungsbeispiel wird (c) in Abbildung 1 durch ein Medium zur Generation eines Superkontinuum ersetzt. Für den CARS-Prozess muss nicht das gesamte Superkontinuum eingesetzt werden, sondern es können - z.B. mit geeigneten Filtern - geeignete Spektralbereiche herausgefiltert werden.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird eine der vorher beschriebenen Möglichkeiten eingesetzt, um die anregenden elektromagnetischen Felder zu generieren und Autofluoreszenz/SHG-Signale zu erzeugen. Statt eines CARS-Signals wird jedoch eine andere nichtlineare Raman-Technik verwendet. Eine solche Technik, stellt die stimulierte Raman- Streuung (SRS) dar. Dabei werden zwei E-Felder (Pump und Stokes) unterschiedlicher Wellenlänge simultan auf die Probe eingestrahlt und räumlich überlagert. Entspricht die Energiedifferenz von Pump- und Stokes-E-Feldern gerade der Energie eines Schwingungsübergangs, so kann das Molekül zur Schwingung angeregt werden. Bei solch einem stimulierten Raman-Prozess wird das Stokes-E-Feld durch stimulierte Emission verstärkt und das Pump-Feld abgeschwächt. Die Stärke dieser Intensitätszunahme oder Abschwächung wird als Signal zur Bilderzeugung verwendet. Bei einer SRS-Messung in EpiGeometrie ist keine spektrale Trennung von anregenden Strahlen und rückgestreutem Signal möglich.
In diesem Fall kann entsprechend der Darstellung der Figur 3 für eine Separation beispielsweise ein Strahlteiler verwendet werden, der unterschiedlich polarisiertes Licht entweder passieren lässt oder reflektiert. Dazu ist in den Anrege-/Signalstrahlengang ein Viertelwellenplättchen eingebracht, das die linear polarisierte anregende Strahlung zirkulär polarisiert. Das verstärkte oder abgeschwächte Signallicht passiert auf dem Weg zum Detektor ein zweites Mal das Viertelwellenplättchen und wird so linear polarisiert mit einer gegenüber der anregenden Strahlung um 90° verschobenen Polarisationsebene. Anregendes Licht und Signallicht werden dann durch einen Polarisationsstrahlteiler räumlich getrennt und das Signallicht detektiert. Um diese geringe Zunahme der Stokespulse oder Abnahme der Pumppulse zu detektieren, wird die Lock-in-Technik eingesetzt. Dazu wird z.B. die Intensität des Stokes-Strahls mit hoher Frequenz moduliert und die Intensität des Pump-Strahls bei der Modulationsfrequenz mit einem Lock-In- Verstärker detektiert. Alternativ kann auch der Pumpstrahl moduliert und die Intensität des Stokesstrahls detektiert werden. Zur Detektion von SHG/Autofluoreszenzsignalen, wird auf die in Figur 2 dargestellte Konfiguration umgestellt, indem Detektor und Filter sowie Strahlteiler auf verschiebbaren Reitern angebracht werden.
Bezugszeichenliste :
201 Stokes - Laser
202 Pump - Laser
203 Scanner Einheit
204 Dichroischer Spiegel (Polarisationsstrahlteiler)
205 Filter
206 Detektor
207 Fokussier Optik
208 In vivo Haut
209 Strahlengang
210 Energieniveaus CARS
211 Opump
212 COstokes
213 COprobe
214 COCARS
215 Ω
216 Energieniveaus SHG
217 Energieniveaus TPEF
301 Stokes - Laser
302 Pump - Laser
303 Scanner Einheit
304 Dichroischer Spiegel (Polarisationsstrahlteiler)
305 Detektor
306 Lock-In-V erstärker
307 λ 4 - Plättchen
308 Fokussier Optik
309 In vivo Haut
310 Strahlengang

Claims

ANSPRÜCHE
1. Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren in einer Vorrichtung zur Detektion von Tumoren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen umfasst sowie weiterhin entweder das Auswertungs verfahren der kohärenten Anti-Stokes-Raman- Streuung oder das Auswertungsverfahren der stimulierten Raman- Streuung umfasst.
2. Vorrichtung zur Detektion von Tumoren unter Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen sowie weiterhin das Auswertungsverfahren der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung umfasst.,
dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Femtosekunden-Oszillator oder einen Pikosekunden-Oszillator aufweist, dessen Ausgangssignale einem Optischen Parametrischen Oszillator zugeführt werden, wobei die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators mittels einer Fokussiereinrichtung auf die Haut einer zu untersuchenden Person projiziert werden, wobei gestreute Signale mit einer Frequenz, die sich als Frequenz auf Grund der kohärenten Anti-Stokes-Raman Streuung aus den beiden Frequenzen des Optischen Parametrischen Oszillators ergibt, hinsichtlich deren Intensität analysiert werden, wobei die Vorrichtung weiterhin Mittel aufweist zur Ausblendung eines der Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators zur Durchführung des Auswertungsverfahrens der Multiphotonenanregung sowie des Auswertungsverfahrens der Erzeugung der Zweiten Harmonischen.
3. Vorrichtung zur Detektion von Tumoren unter Verwendung einer Kombination von Auswertungsverfahren, wobei die Kombination der Auswertungsverfahren das Auswertungsverfahren der Multiphotonenanregung und/oder das Auswertungsverfahren der Erzeugung der Zweiten Harmonischen sowie weiterhin das Auswertungsverfahren der stimulierten Raman- Streuung umfasst.,
dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Femtosekunden-Oszillator oder einen Pikosekunden-Oszillator aufweist, dessen Ausgangssignale einem Optischen Parametrischen Oszillator zugeführt werden, wobei die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators mittels einer Fokussiereinrichtung auf die Haut einer zu untersuchenden Person projiziert werden, wobei gestreute Signale der Frequenz des Pumpfeldes und/oder der Frequenz des Stokes-E-Feldes, hinsichtlich deren Intensität analysiert werden, wobei die Vorrichtung weiterhin Mittel aufweist zur Ausblendung eines der Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators zur Durchführung des Auswertungsverfahrens der Multiphotonenanregung sowie des Auswertungsverfahrens der Erzeugung der Zweiten Harmonischen.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgangssignale des Optischen Parametrischen Oszillators und die rückgestreuten Signale unterschieden werden, indem die Polarisationsebenen der Signale auf dem Weg der Signale gedreht werden.
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