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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Durchführung von optischen Messungen, insbesondere der Spektroskopie.
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Hochdurchsatz-Screening
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Hochdurchsatz-Messungen mit Hilfe von Mikrotiterplatten sind in der Biologie, Medizin und Pharmazie weit verbreitet. Durch die Verwendungen von Automaten können je nach Anwendungen mehr als 100000 Proben pro Tag untersucht werden.
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Hochdurchsatz-Messungen werden für verschiedene Analysemethoden durchgeführt.
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Bei optischen Methoden zur Untersuchung der Streustrahlung entscheiden der Streuquerschnitt und die maximale Leistung, welche ohne Zerstörung der Probe verwendet werden kann, über die für einen Container (eine Kavität) der Mikrotiterplatte notwendige Messzeit. Die Probencontainer (Kavitäten) werden durch Automaten mit mehreren Pipetten gleichzeitig gefüllt. Das Auslesen geschieht häufig in einem Raster, sodass jeder Container (Kavität) einzeln ausgelesen wird.
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Auch Raman-spektroskopische Untersuchungen eignen sich grundsätzlich zur Untersuchung diverser Eigenschaften von Stoffen. So offenbart die
WO 2013/064159 A1 bspw. eine Methode zur Bestimmung von Kern-DNA in Spermien und die
DE 102 37 394 A1 offenbart bspw. ein Verfahren zur Bestimmung mechanischer Eigenschaften von Polymerprodukten. Dabei wird von mindestens einem Spermium bzw. einem Polymerprodukt ein Raman-Spektrum aufgenommen und aus dem Raman-Spektrum des mindestens einen Spermiums/Polymerproduktes die mindestens eine biochemische/mechanische Eigenschaft des Spermiums/Polymerproduktes berechnet, so dass eine schnelle, nicht-invasive, reproduzierbare und ohne Probenvorbereitung auskommende Methode zur biochemischen/mechanischen Charakterisierung von Spermien/Polymerprodukten bereitgestellt wird.
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Darüber hinaus sind aus der
EP 1 463 392 A1 sowie
EP 1 651 934 A1 Verfahren zur Detektion pathogener Mikroorganismen, aus der Schrift
EP 1 766 350 A1 spektroskopische Verfahren zur Analyse von Komponententeilchen, aus der
EP 1 766 351 A1 ein multimodales Verfahren zur Identifizierung von gefährlichen Mitteln und aus der
WO 2012/165837 A3 eine Anordnung und ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening mittels Raman-Spektroskopie mit core-capshell-Nanopartikeln zur Wirkstoffsuche bekannt. Nachteilig an der technischen Lösung gemäß
WO 2012/165837 A3 ist, dass durch die Verwendung von Filtern nur schlechte oder überhaupt keine Spektren erfasst werden können.
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Um die Messzeit bei Hochdurchsatz-Messungen unter Verwendung von Mikrotiterplatten so gering wie möglich zu halten, ist es notwendig mehrere Container (Kavitäten) der Mikrotiterplatte gleichzeitig auszulesen. Die Spektren müssen möglichst schnell und ohne zeitlichen Versatz ausgelesen werden. Dafür ist es notwendig die Beleuchtungsleistung zu maximieren und einen möglichst großen Anteil der Streustrahlung zu übertragen. Für die Verwendung größtmöglicher Beleuchtungsleistungen ist es notwendig, die Probencontainer (die Kavitäten der Mikrotiterplatte) homogen und in ihrer Fläche so weit wie möglich auszuleuchten. Dafür ist eine inkohärente Beleuchtung von Vorteil. Außerdem muss die Beleuchtung für jeden Probencontainer (jede Kavität der Mikrotiterplatte) identisch sein. Die Wände der Mikrotiterplatte sollen nicht beleuchtet werden, so wird die Erzeugung von unerwünschter Streustrahlung vermieden. Zusätzlich kann es je nach spektroskopischer Analysemethode von Vorteil sein, die Probe mit depolarisiertem Licht zu bestrahlen, wodurch auch eine einfache Einstellung der Polarisation über einen linearen Polarisationsfilter ermöglicht wird. Um die Vergleichbarkeit der Spektren der einzelnen Probencontainer zu gewährleisten muss eine Normierung durchgeführt werden können.
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Zur Verwendung von Mikrotiterplatten verschiedener Größe muss das System leicht auf dieses einstellbar sein.
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Durch die bekannten Rastermethoden können Spektren nur einzeln aufgenommen werden, was (je nach untersuchter Strahlung) zu sehr langen Messzeiten und dazu führt, dass bei zeitlich veränderlichen Proben keine gleichzeitigen Untersuchung der einzelnen Container (Kavitäten) möglich sind. Außerdem werden die einzelnen Container (Kavitäten der Mikrotiterplatte) durch eine einfache Fokussierung in der Probenebene nicht homogen ausgeleuchtet, wodurch die maximale Probenleistung stark begrenzt ist. Übliche Weit-Feld-Methoden führen zu wesentlich schlechteren Ergebnissen, als diese die bei Verwendung eines Spektrometers erreicht werden. Eine Bildgebung dieser Art ist darüber hinaus überflüssig und störend, da nur einzelne Container (Kavitäten) und keine kompletten chemischen Bilder ausgelesen werden sollen.
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Nachteilig bei den bekannten technischen Lösungen ist, dass durch ein Screening mit Hilfe der Spektroskopie an einer Mikrotiterplatte nicht alle Spektren gleichzeitig und schnell in den Kavitäten vermessen werden können und die Anregungsleistung für sämtliche Kavitäten und die Intensität der übertragenden Streustrahlung (insbesondere bei der Raman-Spektroskopie) nicht hoch sind.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Durchführung von spektroskopischen Messungen, insbesondere für die Raman-Spektroskopie bereitzustellen, welche die Nachteile des Standes der Technik vermeidet, insbesondere ermöglicht, dass alle Spektren der Kavitäten einer Mikrotiterplatte gleichzeitig und schnell in den Kavitäten vermessen werden können.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des 1. und des 6. Patentanspruchs gelöst. Weitere günstige Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung sind in den nachgeordneten Patentansprüchen angegeben.
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Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass bei dem Hochdurchsatz-Screening-System zur Durchführung von optischen Messungen in der Spektroskopie ein dimensionsreduzierendes Faserbündel zur Aufnahme/zur Erfassung der spektroskopischen Strahlung und ein spezielles Beleuchtungs- und Abbildungssystem eingesetzt werden.
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Dazu umfasst das Hochdurchsatz-Screening-System eine Anregungseinheit mit einem Laser und einem optischen Leitweg, eine Ausleseeinheit mit einem Faserbündel aus optischen Fasern und einem Spektrometer, eine Mikrotiterplatte mit Kavitäten für einzelne Proben und eine Bewegungs- und Positioniereinheit für die Anordnung der Kavitäten der Mikrotiterplatte gegenüber dem Faserbündel.
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Wesentlich ist, dass das Faserbündel ein dimensionsreduzierendes Faserbündel ist, welches auf seiner der Probe zugewandten Seite eine quadratische Anordnung der optischen Fasern und auf seiner dem Spektrometer zugewandten Seite eine linienförmige Anordnung der optischen Fasern aufweist, und dass eine optische stark multimodige Beleuchtungsfaser über eine Linse und ein Mikrolinsen-Array in eine Zwischenbildebene vervielfacht abbildbar ist und anschließend über zwei weitere Linsen in die Ebene der Probe abbildbar ist, wobei alle Kavitäten gleichzeitig durch die Anregungs- und Ausleseeinheit mit einer Strahlung beleucht- und vermessbar ist, in dem die erzeugbare zu messende Strahlung über ein System optischer Linsen von den Kavitäten auf das Faserbündel und von diesem in das Spektrometer übertragbar ist.
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Die Beleuchtungsfaser weist eine große Länge im Bereich mehrere Dekameter auf und ist mit einer Vibrationseinrichtung versehen, so dass die Polarisation und die Kohärenz der von dem Laser aussendbaren Strahlung in der Faser durch die Vibrationseinrichtung und die Länge der Faser zerstörbar ist, dergestalt, dass die Probe mit gleichmäßig unpolarisiertem Licht bzw. bei Verwendung eines linearen Polarisationsfilters mit linear polarisiertem Licht beliebiger Polarisationsrichtung bestrahlt werden kann.
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Im Rahmen der Erfindung liegt auch, dass neben der mit einer Vibrationseinrichtung versehenen Beleuchtungsfaser bei einer CCD Beleuchtungszeiten verwendet werden, welche groß gegenüber der inversen Vibrationsfrequenz sind, wodurch die Kohärenz der Beleuchtung der Probe zerstört wird und die beleuchteten Flächen der Probe mit gleicher Intensität und homogen beleuchtet werden können.
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Der optische Leitweg führt dabei von dem Laser über die optische Beleuchtungsfaser und einen Linienfilter, so dass die in der Faser erzeugte Streustrahlung entfernbar ist.
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Das Faserbündel besteht aus lichtleitenden Fasern mit eckigem oder rundem Querschnitt, zwischen denen sich nichtlichtleitende Zwischenfasern mit rundem Querschnitt befinden, welche die lichtleitenden Fasern auf der dem Spektrometer zugewandten Seite voneinander beabstanden.
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Die lichtleitenden Fasern auf der der Probe zugewandten Seite sind in einem Abstand zueinander im Array angeordnet, so dass nur das Licht, welches in den Proben erzeugt wird, und nicht das von den Wänden der Mikrotiterplatte ausgehende Licht aufgenommen wird.
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Das Hochdurchsatz-Screening-Systems wird bestimmungsgemäß so betrieben, dass die Proben in den Kavitäten der Mikrotiterplatten gleichzeitig mit gleichmäßig unpolarisiertem Licht oder durch die Verwendung eines zusätzlichen linearen Polarisationsfilters mit linear polarisiertem Licht, bestrahlt werden, in dem der Laser eine monochromatische Strahlung erzeugt, die über die Beleuchtungsfaser sowie den Linienfilter geführt wird, so dass in der Beleuchtungsfaser die in der Faser erzeugte Streustrahlung entfernt wird, wobei gleichzeitig mit der Vibrationseinrichtung an der Beleuchtungsfaser eine Vibration erzeugt wird, so dass die Kohärenz der von dem Laser aussendbaren Strahlung in der Beleuchtungsfaser durch die Vibrationseinrichtung zerstört wird.
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Das so erzeugte Anregungslicht wird so auf die Proben in den Kavitäten abgebildet, dass die beleuchteten Flächen nach Abbildung auf das Faserbündel in ihrer Ausdehnung mit den Fasern des Faserbündels übereinstimmen, so dass homogene und intensitätsgleiche Beleuchtungsflächen in den Probe-enthaltenden Kavitäten der Mikrotiterplatte erzeugt werden.
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Die von den Proben ausgehende Strahlung wird mit dem Faserbündel ausgelesen.
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Anschließend erfolgt eine computergestützte Normierung der ausgelesenen Daten mit einer homogen streuenden Probe, um genaue quantitative Aussagen in Bezug auf die Intensitäten der von den Proben ausgehenden Streustrahlung zu erhalten.
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Das Licht kann vor dem Eintritt in die Beleuchtungsfaser auch noch aufgeweitet und durch eine Lochblende in der Leistung gesteuert werden.
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Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Möglichkeit, dass die Mikrotiterplatte während der Bestrahlung so bewegt wird, dass je Kavität jeweils eine größere Probenfläche beleuchtet und damit eine höhere maximal mögliche Beleuchtungsleistung ermöglicht wird, wodurch eine kürzere notwendige Belichtungszeit oder eine höheres Verhältnis aus Signal und Rauschen ermöglicht wird.
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Darüber hinaus ist es auch möglich, durch einen Austausch der Linse zwischen der Beleuchtungsfaser und der Mikrotiterplatte das Hochdurchsatz-Screening-System sehr schnell und automatisch auf verschiedene Mikrotiterplatten einzustellen, ohne dass sich die Funktionalität der Beleuchtung dadurch an sich ändert.
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Das Verfahren kann auch für die Raman-Spektroskopie, die Fluoreszenzspektroskopie, die Absorptionsspektroskopie, die Transmissionsspektroskopie oder für die Kombination dieser Spektroskopiearten verwendet werden.
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Es ist auch möglich, dass mehrere Laser in die Beleuchtungsfaser eingekoppelt werden, um damit lediglich durch Wechseln der Filter, bei sonst gleich bleibender Beleuchtung, Messungen bei verschiedenen Anregungswellenlängen durchführen zu können, oder dass mehrere Lichtquellen gleichzeitig in die Beleuchtungsfaser eingekoppelt werden, so dass die Probe von diesen Lichtquellen gleichzeitig angeregt, und die von der Probe ausgehende Strahlung, untersucht wird oder dass die faserbasierte Probenbeleuchtung nicht im Auflichtverfahren, sondern durch ein weitere Linse, bzw. Objektiv, im Durchlichtverfahren durchgeführt wird.
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Das Verfahren kann bspw. zur zeitgleichen Aufnahme von mindestens zwei Spektren zur Berechnung von Differenzspektren bezogen auf das simultan gemessenes Referenzspektrum und zur Analyse kleinster spektraler Verschiebungen bei der optischen Spektroskopie verwendet werden.
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Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Ausführungsbeispiele und der Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:
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1: eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Hochdurchsatz-Screening-Systems zur Durchführung von optischen Messungen in der Spektroskopie,
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2: eine Darstellung der mit einer Strahlprofilkamera aufgenommenen typischen Intensitätsverteilung, wie sie in einer einzelnen Kavität bei Verwendung des Systems gemäß 1 auftritt,
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3: eine schematische Darstellung eines Ausschnitts der Beleuchtung gemäß 1 in der Probenebene mit einer quadratischen Beleuchtungsfaser (Die gefüllten Quadrate stellen dabei die Beleuchtung mit monochromatischer Strahlung dar. Die gestrichelten Quadrate symbolisieren die Fasern des Faserbündels, wie sie durch die Abbildung der Streustrahlung beleuchtet werden),
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4: eine schematische Darstellung des dimensionsreduzierenden Faserbündels gemäß 1 und
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5: eine Darstellung der Polarisationsabhängigkeit der Transmission einer Beleuchtungsfaser gemäß 1 von 30 m Länge bei eingekoppelter Strahlung mit einer Wellenlänge von 532 nm (Die Dreiecke stellen dabei die Polarisations-Abhängigkeit des Lasers dar. Die Quadrate beziehen sich auf die Messung mit der Beleuchtungsfaser. Zum Vergleich wurde eine Vergleichsmessung mit einer kürzeren Faser aufgenommen. Die entsprechenden Messwerte sind als Kreise gezeichnet.).
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Das in 1 dargestellte Hochdurchsatz-Screening-System zur Durchführung von optischen Messungen in der Spektroskopie umfasst eine Anregungseinheit mit einem Laser (1) und einem optischen Leitweg mit einer Beleuchtungsfaser (6), eine Ausleseeinheit mit einem Faserbündel (23) aus optischen Fasern und einem Spektrometer (25), eine Mikrotiterplatte (18) mit Kavitäten für einzelne Proben und eine Bewegungs- und Positioniereinheit für die Anordnung der Kavitäten der Mikrotiterplatte (18) gegenüber dem Faserbündel (23).
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Der optische Leitweg verläuft dabei vom Laser (1) über eine Lochblende (3), eine Linse (4) oder über ein Objektiv in die Stirnseite (5) der Beleuchtungsfaser (6), so dass das Licht vom Laser (1) in die Beleuchtungsfaser (6) einkoppelbar ist.
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Zwischen dem Laser (1) und der Lochblende (3) kann auch noch ein Teleskop (2) angeordnet sein.
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Der Kopf der Beleuchtungsfaser (6) befindet sich dabei kurz hinter der Brennebene der Linse (4), damit eine Fokusbildung in der Beleuchtungsfaser (6) verhindert wird.
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Die Beleuchtungsfaser (6) ist eine optisch stark multimodige Faser, die über die Linse (4) und ein Mikrolinsen-Array in eine Zwischenbildebene vervielfacht abbildbar ist und anschließend über zwei weitere Linsen in die Ebene der Probe abbildbar ist, wobei alle Kavitäten gleichzeitig durch die Anregungseinheit mit einer Strahlung beleuchtbar und durch die Ausleseeinheit auslesbar (Auslesen der spektroskopischen Strahlung) sind, in dem die erzeugbare zu messende Strahlung über ein System optischer Linsen von den Kavitäten auf das linienförmig angeordnete Faserbündel (23) und von diesem in das Spektrometer (25) übertragbar ist.
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Ausgehend von dem Laser (1) als monochromatische Lichtquelle wird das Anregungslicht über die Linse (4) oder über ein Objektiv in die Stirnseite (5) der Beleuchtungsfaser (6) eingekoppelt. Der Faserkopf befindet sich dabei kurz hinter der Brennebene der Linse (4), damit eine Fokusbildung in der Faser verhindert wird.
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Vor der Linse befindet sich eine Lochblende (3). Diese dient der schnellen, einfachen sowie zeitlich stabilen Justage der Leistung mit der die Probe bestrahlt wird.
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Um den einstellbaren Leistungsbereich zu erhöhen kann vor der Lochblende (3) noch ein Teleskop (2) angebracht werden. Der aus dieser Leistungsanpassung folgende unterschiedliche Fokusdurchmesser im Brennpunkt der Linse (4) sowie die wechselnde nummerische Apertur bei der Einkopplung in den Faserkopf (5) der Beleuchtungsfaser (6) beeinflussen nur die Leistung mit welcher die Probe angeregt wird. Alle weiteren Eigenschaften der Beleuchtung bleiben konstant.
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Bei der Beleuchtungsfaser (6) handelt es sich um eine stark multimodige optische Faser mit einer Länge von mehreren Dekametern. Die Länge ist entscheidend für die Generierung von depolarisiertem Licht. Die beiden Stirnseiten (5) und (8) haben die gleiche Gestalt. Die Stirnseite (5) ist dabei die dem Laser (1) zugewandte Seite und die Stirnseite (8) ist dabei die dem Laser (1) abgewandte Seite.
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Die Beleuchtungsfaser (6) hat einen Kern mit einer Abmessung welche die Führung, einer für die Homogenisierung ausreichender Anzahl an Moden, gewährleistet.
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Die Form des Kerns (beispielsweise kreisförmig oder quadratisch) entscheidet über die Form der beleuchteten Fläche einer Probe-befüllbaren Kavität der Mikrotiterplatte (18). Die Kerne der Fasern des Faserbündels (23) haben die gleiche Form wie der Kern der Beleuchtungsfaser (6). Die Abmessungen können jedoch verschieden gewählt werden.
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Über die Kopplung der Beleuchtungsfaser (6) an eine Vibrationseinrichtung (7) wird diese in eine zeitliche Schwingung versetzt. Die Schwingung führt zur zeitlichen Überlagerung der Interferenzen in der Beleuchtungsfaser (6), sodass die Kohärenz für Belichtungszeiten größer einem Vielfachem der Periodendauer der Schwingung verschwindet. Dadurch werden Interferenzmuster vermieden und es kommt zu einer homogen Leistungsverteilung auf den beleuchteten Flächen.
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Die Beleuchtungsfaser (6) selbst erzeugt durch die Anregung mit der von dem Laser (1) ausgehenden Strahlung ein Störsignal. Dieses Signal wird durch einen Linienfilter (14), welcher alle Wellenlängen außer die des monochromatischen Lasers (1) blockiert, herausgefiltert.
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Das monochromatische Anregungslicht wird ausgehend von der Stirnseite (8) der Faser über eine Abbildung, bestehend aus der Linse (9) und dem Linsen-Array (10), in eine Zwischenebene (11) abgebildet. Die Stirnseite (8) der Beleuchtungsfaser (6) befindet sich dabei im Brennpunkt der Linse (9) und die Zwischenebene (11) entsteht im Brennpunkt des Linsen-Arrays (10).
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Die Anzahl der Linsen des Mikrolinsen-Arrays (10) ist dabei gleich der Anzahl der Fasern im Faserbündel (23) zu wählen.
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Für eine optimale Ausnutzung haben die Linsen des Mikrolinsen-Arrays (10) eine quadratische Form.
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In der Zwischenebene (11) entstehen, entsprechend der Anzahl der Linsen im Mikrolinsen-Array (10), eine bestimmte Anzahl an Bildern der Faserendfläche (8), welche alle die gleiche Intensität und homogene Verteilung aufweisen.
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Die Zwischbildenebene (11) wird über das durch die Linse (12) und die Linse (17), bzw. das Objektiv, gebildete Unendlich-Mikroskop auf die Ebene der Mikrotiterplatte (18) abgebildet.
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Die Mikrotiterplatte (18) weist eine sehr große Anzahl an gleichartigen Kavitäten auf. Die Anzahl der Kavitäten sollte dabei mindestens so groß wie die Anzahl der Fasern im Faserbündel (23) sein.
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Über die Linse (17) und die Linse (21) wird die zu untersuchende Strahlung auf die Endfläche des Faser-Arrays (22)/des Faserbündels (23) abgebildet. Die Brennweiten der Linsen (9), (10), (12), (17) und (21) sind dabei so gewählt, dass die ausgeleuchteten Probenflächen nach der Abbildung auf die Endfläche des Faser-Arrays (22)/des Faserbündels in Position und Abmessung mit den Kernen der Fasern auf der Endfläche des Faser-Arrays (22) übereinstimmen. Dabei werden die Brennweiten so gewählt, dass die größtmögliche numerische Apertur der zu untersuchenden Strahlung übertragen werden kann.
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Die numerische Apertur der Beleuchtung wird über die Blende (13) so eingestellt, dass je nach Größe der Kavitäten der Mikrotiterplatte (18) es nicht zur Anregung des Materials der Mikrotiterplatte kommt.
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Innerhalb des Strahlengangs des durch die Komponenten (12) und (17) gebildeten Unendlich-Mikroskops, wird das monochromatische Anregungslicht durch einen Strahlteiler, wie zum Beispiel einem dichroitischen Spiegel (16) im Winkel von 45° oder durch einen Kantenfilter unter sehr geringem Winkel, welcher üblicherweise kleiner als 10° ist, reflektiert. Der Filter (16) transmittiert dabei Strahlung mit einer Wellenlänge größer als die der Anregungswellenlänge und reflektiert Strahlung mit einer Wellenlänge kleiner oder gleich der Anregungswellenlänge. Durch den Einsatz eines drehbaren linearen Polarisationsfilters (15) kann die Probenfläche (18) mit linear polarisiertem Licht bestrahlt werden.
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Durch das Herausnehmen, oder Herausklappen, dieses Polarisationsfilters (15) wird die Probe in der Mikrotiterplatte (18) mit unpolarisiertem Licht bestrahlt.
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Im Strahlengang des Streulichts, gebildet aus der Linse (17) und Linse (21), kann für polarisationsabhängige Messungen ein linearer Polarisationsfilter (20) eingefügt werden.
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Zur Unterdrückung der Rayleigh-Strahlung und des von der Probe reflektierten Anregungslichts, welches von dem Laser (1) ausgeht, wird ein zusätzlicher Kantenfilter (19) eingefügt. Das Faser-Array (27) befindet sich in der Brennebene der Linse (21).
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Durch einen Wechsel der Linse (17) werden der Anregungsstrahlengang und der Strahlengang des Streulichts in gleicher Weiße verändert, so dass weiterhin nur die durch das Faser-Array (22) abgebildeten Probenflächen über den Laser (1) beleuchtet werden. Das System kann damit sehr leicht auf verschiedene Mikrotiterplatten angepasst werden.
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Das Faser-Array (22) besteht aus einem Faserbündel (23) von identischen Multimode-Fasern, welche einen definierten Abstand voneinander haben. Das Faserbündel (23) zum Auslesen der Proben ist dabei ein dimensionsreduzierendes Faserbündel, welches auf seiner der Probe zugewandten Seite eine rechteckige oder quadratische Anordnung der optischen Fasern und auf seiner dem Spektrometer zugewandten Seite (24) [= Stirnseite] eine linienförmige Anordnung der optischen Fasern aufweist. Diese Stirnseite (24) befindet sich dabei genau in der Spaltebene des Spektrometers (25). In das Faserbündel (23) können weitere Fasern eingeflochten sein, welche kein Licht leiten. Diese Zwischenfasern dienen als Abstandshalter auf der Stirnseite (24). Zwischen je zwei Fasern des Faser-Arrays befindet sich dann jeweils mindestens eine Zwischenfaser auf der Stirnseite (24).
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Hierdurch wird ein Übersprechen durch die Abbildung im Spektrometer vermieden.
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Die technischen Vorgaben und das Ziel der Maximierung der eingesammelten numerischen Apertur führen mitunter dazu, dass nur eine relative kleine Fläche jeder Probe ausgeleuchtet werden kann. Um eine höhere Leistung zur Beleuchtung verwenden zu können, um hierdurch kleinere Belichtungszeiten bzw. ein größeres Verhältnis von Signal und Rauschen zu erhalten, kann die Mikrotiterplatte (18) während der Aufnahme so automatisiert bewegt werden, so dass insgesamt eine größere Menge jeder Probe beleuchtet und damit eine Beschädigung der Proben vermieden wird. Hierbei wird von einer homogenen Probenverteilung innerhalb einer Kavität ausgegangen und mittels des Bewegungsverfahrens ein (lateraler) Durchschnittswert des Probeninhalts gemessen.
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Im Folgendem wird das Ausführungsbeispiel an Hand der 1 bis 5 noch weiter konkretisiert:
Bei der verwendeten Lichtquelle in 1 handelt es sich um einen frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser, welcher eine TEM00-Mode bei 532 nm abstrahlt. Der Laser wird über eine bikonvexe Linse (4) mit einer Brennweite von 2 cm in die Beleuchtungsfaser (6) eingekoppelt. Der Querschnitt von Kern und Mantel der Beleuchtungsfaser ist jeweils quadratisch. Der Seitenlänge des Kerns beträgt 160 μm und die des Mantels 200 μm. Die Beleuchtungsfaser ist 30 m lang und in FC-Stecker gefasst. Die Länge ist ausreichend um nahezu vollständig depolarisiertes Licht zu generieren.
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Zur Verdeutlichung dieser Tatsache wurde die Intensität am Ende einer 30 m langem Faser mit Hilfe eines Analysators gemessen. In 5 ist die Abhängigkeit von der Analysatorstellung dargestellt. Die als ausgefüllte Kreise dargestellten Messwerte beziehen sich dabei auf eine Referenzmessung mit einer quadratischen Faser von nur 2 m Länge. Die als ausgefüllte Dreiecke dargestellten Messwerte zeigen die polarisationsabhängige Intensität des Lasers ohne faseroptische Beleuchtung. Alle Messwerte sind zur besseren Vergleichbarkeit normiert dargestellt.
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Als Vibrationseinrichtung (7) wird eine handelsübliche Zahnbürste verwendet. In 2 ist ein Abbild der Endfläche einer Beleuchtungsfaser dargestellt. In diesem Beispiel wird eine Faser mit einer Kernseitenlänge von 400 μm gewählt. Die Messung wurde mit einer Strahlprofilkamera durchgeführt. Die Standardabweichung der Intensität auf dem Plateau beträgt stets weniger als 2%.
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Die Faserendfläche (8) befindet sich im Zentrum der Brennebene einer Linse (9) mit einer Brennweite von 8 cm.
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Das Mikrolinsen-Array (10) besteht aus 64 quadratisch angeordneten Linsen mit einer Brennweite von jeweils 1 cm und einem Linsenabstand von 1 mm. In der Brennebene (11) des Linsen-Arrays entstehen 64 gleiche Abbilder der Faserendfläche (8) mit einer Seitenlänge von insgesamt 8 mm. Die einzelnen Abbilder haben jeweils eine Seitenlänge von 20 μm.
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Über die Linse (12) mit einer Brennweite von 3 cm und die Linse (17) mit einer Brennweite von ebenfalls 3 cm, wird das Zwischenbild (11) in die Probenebene übertragen.
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In 3 ist ein Ausschnitt einer Mikrotiterplatte (18) schematisch dargestellt (nicht maßstabsgerecht). Die Kavitäten der Mikrotiterplatte (222) haben einen Abstand von 1 mm zueinander. Die ausgefüllten Flächen (333) stellen die durch den Laser (1) beleuchteten Flächen dar. Diese Quadrate haben eine Seitenlänge von 20 μm. Bei dieser Beleuchtung werden die Wände (111) der Mikrotiterplatte (18) bis zu einer Tiefe von 5 mm nicht angeregt.
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Das Streulicht wird durch die Linse (17) und die Linse (21), welche eine Brennweite von 12 cm hat auf das Faser-Array abgebildet (siehe dazu 1).
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Die gestrichelten Quadrate (444) in 3 symbolisieren die Fasern des Faserbündels wie sie durch die Abbildung der Streustrahlung beleuchtet werden. Der Strahlengang des Streulichts ist von dem des Anregungslichtes durch einen dichroitischen Spiegel (16) getrennt. Dieser reflektiert Licht mit einer Wellenlänge kleiner oder gleich 532 nm. Licht mit einer größeren Wellenlänge wird transmittiert. Nach dem dichroitischen Filter folgt ein Kantenfilter (19), welcher nur Licht mit einer Wellenlänge größer als 532 nm transmittiert (siehe dazu 1)
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In 4 sind das Faserbündel (2222) und dessen Stirnseiten (1111 und 3333) schematisch dargestellt. Die 64 Fasern haben auf der Array-Seite (22) einen Abstand von jeweils 4 mm voneinander. Der Kern und der Mantel einer jeden Faser sind quadratisch und haben eine Seitenlänge von 100 μm bzw. 120 μm. Auf der Stirnseite (3333) sind die Fasern in einer Linie angeordnet, wobei zwischen je zwei lichtführenden Fasern (2222) immer eine Zwischenfaser (4444) liegt. (siehe dazu 4)
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Die Zwischenfasern sind quadratisch und die Seitenlänge des Mantels beträgt 120 μm.
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Über die Linsen (17) und (21) wird die Probenebene mit vierfacher Vergrößerung auf das Faser-Array abgebildet (siehe dazu 1). Da in diesem Beispiel die Anzahl der Fasern des Faserbündels geringer ist als die Anzahl der Kavitäten einer typischen Mikrotiterplatten (18), kann die Probe zusätzlich über automatisch gesteuerte Verschiebetische verschoben werden.
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Der Vorteil dieses Hochdurchsatz-Screening-Systems besteht darin, dass durch den Einsatz eines Faserbündels und einer besonderen Beleuchtung erreicht wird, dass alle Spektren mehrerer Kavitäten einer Mikrotiterplatte gleichzeitig und schnell in den Kavitäten vermessen werden können.
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Dadurch, dass die Fasern des Bündels auf der dem Spektrometer zugewandten Seite in einer Linie angeordnet sind und auf der der Probe zugewandten Seite Fasern in einem Array zweidimensional angeordnet sind, so dass zwischen den Fasern jeweils ein bestimmter, für alle Fasern gleicher, Abstand besteht, und die Beleuchtung auf der vielfachen Abbildung der Endfläche einer stark multimodigen optischen Faser durch ein Mikrolinsenarray basiert, wird dieses gleichzeitige Auslesen der Kavitäten ermöglicht.
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Das Hochdurchsatz-Screening-System führt somit zu folgenden Vorteilen:
- • Alle Spektren werden gleichzeitig ohne spektrale und ohne laterale Rasterung aufgenommen,
- • die Anregung erfolgt mit depolarisierten und inkohärenten Licht,
- • die Probenbeleuchtung für eine maximierte Anregungsleistung wird gewährleistet,
- • ein quantitativer und qualitativer Vergleich der Proben in den Kavitäten ist möglich
- • die Aufnahme aller Spektren ist sehr schnell und
- • eine Maximierung der übertragenden Strahlung wird gewährleistet,
so dass dieses System alle erforderlichen Anforderungen zur Hochdurchsatzmessung in der Spektroskopie erfüllt.
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Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ausführungsbeispielen, den Ansprüchen und Zeichnungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Laser
- 2
- Teleskop
- 3
- Lochblende
- 4
- Linse
- 5; 333
- Stirnseite (dem Laser zugewandte Seite)
- 6
- Beleuchtungsfaser
- 7
- Vibrationseinrichtung
- 8
- Stirnseite (dem Laser abgewandte Seite)
- 9
- Linse
- 10
- Mikrolinsen-Array
- 11
- Zwischenebene
- 12
- Objektivlinse des unendlich Mikroskops
- 13
- Blende
- 14
- Linienfilter
- 15
- drehbarer linearer Polarisationsfilter
- 16
- Filter
- 17
- Linse des unendlich Mikroskops
- 18; 222
- Mikrotiterplatte
- 19
- Kantenfilter
- 20
- linearer Polarisationsfilter
- 21
- Linse
- 22
- Faser-Array
- 23
- Faserbündel
- 24; 3333
- Stirnseite (Spektrometer zugewandte Seite)
- 25
- Spektrometer
- 111
- Wände der Mikrotiterplatte
- 444
- Fasern des Faserbündels
- 1111
- Stirnseite (Spektrometer abgewandte Seite)
- 2222
- lichtführende Faser
- 4444
- Zwischenfaser
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2013/064159 A1 [0005]
- DE 10237394 A1 [0005]
- EP 1463392 A1 [0006]
- EP 1651934 A1 [0006]
- EP 1766350 A1 [0006]
- EP 1766351 A1 [0006]
- WO 2012/165837 A3 [0006, 0006]
