WO2013022070A1 - 連続培養によるイソプロピルアルコール製造方法 - Google Patents

連続培養によるイソプロピルアルコール製造方法 Download PDF

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WO2013022070A1
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isopropyl alcohol
culture
escherichia coli
producing
tank
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Inventor
寛子 柴本
Original Assignee
三井化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing isopropyl alcohol.
  • Propylene is an important basic raw material for synthetic resins such as polypropylene and petrochemical products, and is widely used in automotive bumpers, food containers, films, medical equipment, and so on.
  • Isopropyl alcohol produced from plant-derived materials is promising as a carbon-neutral propylene material because it can be converted to propylene through a dehydration step.
  • Kyoto Protocol it is obliged to reduce greenhouse gas emissions by 5% compared to 1990 in the developed countries as a whole between 2008 and 2012.
  • Carbon neutral propylene is extremely environmentally friendly due to its versatility. is important.
  • Microorganisms that assimilate plant-derived materials to produce isopropyl alcohol are already known.
  • International Publication No. 2009/008377 discloses that isopropyl alcohol is produced using Escherichia coli modified to produce isopropyl alcohol using glucose as a raw material while performing semi-batch culture by sequential addition of a substrate solution.
  • This isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is described as having excellent properties as a biocatalyst for industrial production because of the high selectivity of isopropyl alcohol.
  • the produced isopropyl alcohol is expelled from the culture solution into the gas by gas stripping, and the isopropyl alcohol contained in the gas is recovered using water as a capture solution.
  • An Erlenmeyer flask is used as the culture tank, and the specific surface area is increased by charging a small amount of culture solution of 1/10 or less of the flask volume.
  • the culture solution is also evaporated, the amount of the culture solution is reduced and a long operation time of 240 hours is possible.
  • acetic acid is by-produced in aerobic culture in which oxygen gas or oxygen-containing gas is used, using Escherichia coli. Incurs a decline. Therefore, in order to suppress high acetic acid accumulation, the DO-Stat method is well known in which the aeration or stirring speed is controlled so that the dissolved oxygen concentration in the culture tank is controlled to several ppm. Biotech. Bioeng. , 36, pp. In 750-758, (1990), acetic acid accumulation was 35 g / L at the 48th hour in normal half-batch culture, and 17 g / L at the 36th hour under the control by the DO-Stat method. It is reported that the Balanced DO-Stat method, in which the concentration of glucose in the culture tank is controlled by controlling the addition rate of the substrate solution in the half-batch culture in addition to the control of the oxygen concentration, does not produce acetic acid.
  • An object of this invention is to provide the manufacturing method of isopropyl alcohol which manufactures isopropyl alcohol by continuous culture simply and stably for a long time with high productivity.
  • Each aspect of the present invention provides the following isopropyl alcohol production method.
  • [1] Ability to produce isopropyl alcohol introduced or modified by genetic recombination while continuously supplying a substrate solution containing plant-derived materials to the culture vessel and continuously removing the culture solution containing the product from the culture vessel Culturing isopropyl alcohol-producing Escherichia coli having the above-mentioned conditions under the cell growth conditions in which the Escherichia coli stably grows in the isopropyl alcohol production period and maintaining the number of cells in the culture tank; The isopropyl alcohol-producing Escherichia coli and the plant-derived raw material were brought into contact with each other to produce isopropyl alcohol, and the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli was produced from the culture solution containing the product extracted from the culture tank.
  • Recovering isopropyl alcohol; and a method for producing isopropyl alcohol [2] The production method according to [1], wherein the cell growth condition is a condition that a specific growth rate is 0.015 / h or more. [3] The production method according to [1] or [2], wherein the culture is performed at an oxygen uptake rate of 10 mmol / L / h to 250 mmol / L / h. [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the cell growth condition is a condition that a specific growth rate is 0.02 / h or more.
  • 6 is a graph showing changes over time in the rate of plasmid loss in Examples 2 to 4 and Comparative Example 2 of the present invention.
  • 6 is a graph showing the correlation between OUR and isopropyl alcohol yield in Examples 5 to 10 of the present invention.
  • 6 is a graph showing the correlation between OUR and isopropyl alcohol production rate in Examples 5 to 10 of the present invention. It is a graph which shows the time-dependent change of the isopropyl alcohol production mass in Example 5, Example 7, and Example 9 of this invention.
  • It is a graph which shows the time-dependent change of the dissolved oxygen in the culture tank in Example 5 of this invention.
  • It is a graph which shows the time-dependent change of the dissolved oxygen in the culture tank in Example 7 of this invention.
  • a substrate solution containing a plant-derived raw material is continuously supplied to a culture vessel, and a culture solution containing a product is continuously extracted from the culture vessel, or introduced by genetic recombination.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli and the plant-derived raw material are contacted in the culture tank to produce isopropyl alcohol, and from the culture solution containing the product extracted from the culture tank, the isopropyl alcohol Recovering isopropyl alcohol produced by the production E. coli, Russia is a pill alcohol production method.
  • the present invention has the ability to produce isopropyl alcohol introduced or modified by genetic recombination while continuously supplying the substrate solution into the culture vessel and withdrawing the culture solution containing the product from the culture vessel. Maintaining the number of cells of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, and maintaining the number of cells in the culture tank under the cell growth conditions in which the Escherichia coli stably grows during the isopropyl alcohol production period. Incubate the production E. coli.
  • isopropyl alcohol is produced while continuously cultivating isopropyl alcohol-producing Escherichia coli under the predetermined cell growth conditions while maintaining the number of cells, so even in continuous culture using isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, In addition, isopropyl alcohol can be produced with high productivity stably for a long time.
  • the present invention focuses on the behavior of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in the isopropyl alcohol-producing period after a predetermined time from the start of culture, not at the beginning of the introduction of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli into the culture tank.
  • the culture conditions are adjusted to conditions under which the bacterial cells can stably grow. This reduces isopropyl alcohol productivity of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in aerobic culture without complicated control of dissolved oxygen concentration and glucose concentration in the culture tank by DO-Stat method and Balanced DO-stat method. Therefore, isopropyl alcohol can be produced over a long period of time by a simple culture method. Furthermore, isopropyl alcohol can be produced more efficiently by adjusting the aeration / stirring conditions within a range suitable for isopropyl alcohol production.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the term “process” is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of this process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • the amount of each component in the composition when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition, the plurality present in the composition unless otherwise specified. Means the total amount of substances. The present invention will be described below.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to the present invention is an Escherichia coli equipped with an isopropyl alcohol production system for producing isopropyl alcohol. Since Escherichia coli originally does not have a system for producing isopropyl alcohol, the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to the present invention is an Escherichia coli having the ability to produce isopropyl alcohol introduced or modified by genetic recombination. Such an isopropyl alcohol production system may be any system as long as the target Escherichia coli produces isopropyl alcohol.
  • At least a part of the isopropyl alcohol production system is introduced or modified by genetic recombination.
  • introduction or modification by gene recombination a known method can be used, and examples thereof include homologous recombination into the genome and introduction by a plasmid.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to the present invention is preferably Escherichia coli having enhanced enzyme activity involved in the production of isopropyl alcohol.
  • “By genetic recombination” means that the base sequence is changed by insertion of a foreign base sequence having a different sequence from the base sequence of the native gene, or by substitution, deletion or a combination of a part of the gene. Any occurrences may be included, for example, may be obtained as a result of mutation.
  • isopropyl alcohol-producing Escherichia coli In the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to the present invention, four types of enzyme activities of acetoacetate decarboxylase activity, isopropyl alcohol dehydrogenase activity, CoA transferase activity, and thiolase activity are imparted from outside the cell body, or the expression is enhanced in the cell body, or these More preferably, both are made.
  • the thiolase in the present invention is classified into enzyme number 2.3.1.9 based on the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and a reaction for producing acetoacetyl CoA from acetyl CoA.
  • the acetoacetate decarboxylase in the present invention is classified into enzyme number 4.1.1.4 based on the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee and produces acetone from acetoacetate.
  • the generic name of the enzyme that catalyzes The isopropyl alcohol dehydrogenase in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.180 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and a reaction for producing isopropyl alcohol from acetone.
  • the CoA transferase in the present invention is classified into enzyme number 2.8.3.8 based on the report of the International Biochemical Union (IUB) Enzyme Committee, and generates acetoacetate from acetoacetyl CoA.
  • Examples of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli provided with the isopropyl alcohol production system in the present invention include the pIPA / B strain or pIaaa / B strain described in WO2009 / 008377.
  • the Escherichia coli is enhanced by enhancing the expression of each gene on the genome of the Escherichia coli to enhance CoA transferase activity and thiolase activity. Enhancement of acetate decarboxylase activity includes strains in which expression of each gene is enhanced with a plasmid (sometimes referred to as pIa / B :: atoDAB strain).
  • Recombinant E. coli that has effectively improved isopropyl alcohol productivity may also be used, such as inactivated GntR activity, inactivated glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, Examples include inactivated phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity and enhanced glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity.
  • inactivated GntR activity inactivated glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity
  • examples include inactivated phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity and enhanced glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity.
  • Glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) in the present invention is classified into enzyme number 5.3.1.9 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee.
  • Glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.149 according to the report of the International Biochemical Union (IUB) enzyme committee. , A generic term for enzymes that catalyze the reaction of producing D-glucono-1,5-lactone-6-phosphate from D-glucose-6-phosphate.
  • the glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) gene used in the present invention is based on DNA having a base sequence of a gene encoding a thiolase obtained from each of the aforementioned derived organisms or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences synthesized in this way can be used.
  • the phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.144 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and 6-phospho-D A generic term for enzymes that catalyze the reaction of producing D-ribulose-5-phosphate and CO 2 from gluconic acid.
  • a strain obtained by inactivating the GntR activity of the pIPA / B strain, pIaa / B strain or pIa / B :: atoDAB strain or the GntR activity of the pIA / B :: atoDAB strain And a strain in which glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity is inactivated and glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity is enhanced, or GntR activity and glucose-6 of pIa / B :: atoDAB strain -A strain in which phosphate isomerase (Pgi) activity and phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity are inactivated, and glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity is enhanced.
  • Pgi glucose-6-phosphate isomerase
  • Zwf glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase
  • the method for producing isopropyl alcohol of the present invention is to produce isopropyl alcohol from plant-derived materials by continuous culture using the above-mentioned isopropyl alcohol-producing Escherichia coli.
  • the method for producing isopropyl alcohol includes the step of continuously supplying a substrate solution containing a plant-derived raw material to a culture tank and continuously removing the culture solution containing a product from the culture tank.
  • a culturing step Culturing the produced Escherichia coli under microbial growth conditions in which the Escherichia coli stably grows during the isopropyl alcohol production period and maintaining the number of microbial cells in the culture tank (hereinafter referred to as a culturing step), Producing isopropyl alcohol by contacting the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli with plant-derived raw materials in a culture tank (hereinafter referred to as “production process”), and a culture solution containing the product extracted from the culture tank Recovering isopropyl alcohol produced by the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli (hereinafter referred to as a recovery step); Including the.
  • the culture of the isopropyl alcohol-producing E. coli in the production method is performed under cell growth conditions for stably growing the isopropyl alcohol-producing E. coli while maintaining the number of cells. Maintenance of the number of cells is achieved by supplying the substrate solution and extracting the culture solution and culturing under the cell growth conditions. As a result, the ability of the Escherichia coli to grow can be maintained even during the isopropyl alcohol production period, and as a result, production of isopropyl alcohol can be maintained even during continuous culture.
  • the production process of producing isopropyl alcohol by contacting the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli with the plant-derived raw material in a culture tank proceeds simultaneously with the culture process.
  • simple culture for growing or maintaining isopropyl alcohol-producing Escherichia coli that does not depend on the cell growth conditions may not be performed simultaneously with the production process.
  • the recovery step recovers isopropyl alcohol produced by isopropyl alcohol-producing Escherichia coli from a culture solution containing the product extracted from the culture tank, the recovery step is performed simultaneously with the culture step and the production step. It may not be simultaneous with the culture process and the production process.
  • the culturing step is performed after the microbial cell concentration at the initial stage of culture reaches a microbial cell concentration that can stably maintain the microbial cell number.
  • the “cell concentration that can stably maintain the number of cells” at the beginning of the culture is not particularly limited as long as it is a cell concentration that can maintain the growth of the E. coli after the start of continuous culture. A cell concentration corresponding to 4 g-dry cell / L is sufficient.
  • continuous culture refers to “Fundamental engineering” (PF Stanbury, Society Press, 1988, p14-p15, [Principles of Fermentation Technology (Stanbury, Peter F .; Whitaker, Allan )])
  • the substrate solution is continuously supplied to the culture tank (hereinafter sometimes referred to as “feed”), and the culture solution containing the product is continuously withdrawn, It means that cells are cultured and the desired product is produced from the cells.
  • the amount of the culture solution equal to that of the supplied substrate solution is withdrawn from the culture vessel, so that the amount of the solution becomes substantially constant in the culture vessel.
  • the feeding method is not particularly limited, and examples thereof include a chemo stat method for feeding at a constant rate and a method for intermittently feeding in order to reduce loss of a carbon source (plant-derived material).
  • Examples of the intermittent feeding method include a pHstat method. In this pHstat method, when the carbon source (plant-derived raw material) is fed and stopped once the carbon source (plant-derived raw material) in the culture tank is depleted, the pH rises, the dissolved oxygen concentration rises, the exhaust carbon dioxide concentration This is a method of resuming the feed using the decrease in the index as an index.
  • the term “continuous supply” or “continuous extraction” includes any form of feed method as long as the amount of liquid in the culture tank is maintained substantially constant.
  • the amount of liquid in the culture tank is almost constant means that the fluctuation of the liquid volume when compared to the amount of liquid in the culture tank at the start of isopropyl alcohol production is within the range of 0 to 10% by volume. From the viewpoint of the stability of continuous operation, it is preferably in the range of 0% to 5% by volume.
  • isopropyl alcohol production period refers to a period during which isopropyl alcohol is produced after cell growth reaches a steady state.
  • the cells are divided into an induction period in which the cells hardly grow immediately after the start of production and a subsequent logarithmic growth phase, depending on the state of growth of the cells.
  • “cell growth reaches a steady state” means a state in which, in the logarithmic growth phase, the amount of cells extracted with the withdrawal of the culture solution is balanced with the amount of newly grown cells. .
  • the cell concentration in the culture tank is constant.
  • the time until the cell growth reaches a steady state varies depending on the cell concentration and state at the start of the culture, the volume of the culture solution, and the concentration of the supplied carbon source, but the cell concentration at the start of the culture is 0. 0.08 g-dry cell / L, carbon source concentration of 2 g / L, and culture medium volume of 0.5 L, it is generally 24 to 48 hours after the start of culture, so the isopropyl alcohol production phase is after the start of culture. It can be 24 hours or more, preferably 48 hours or more.
  • the cell growth condition means a condition for growing a cell after reaching the logarithmic growth phase. That is, in the culture system in the culture tank, at least the cell density of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, the substrate solution concentration, and the product concentration are maintained within a range that does not inhibit the growth of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli. It is necessary.
  • the growth of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is stagnant or inhibited when at least one of an excess of cell density or an increase in the number of killed isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, an excessive substrate solution concentration, or an excessive product concentration occurs. Therefore, the growth of isopropyl alcohol-producing E. coli cannot be maintained. As a result, the ability to produce isopropyl alcohol in the entire culture system is impaired.
  • the cell growth conditions are preferably conditions that give a specific growth rate of 0.015 / h or more from the viewpoint of maintaining a steady state. If the specific growth rate is 0.015 / h or more, the cell density, substrate solution concentration and product concentration of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli can be adjusted easily and effectively, and the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in the culture system can be adjusted. There is a tendency to maintain proliferation ability. From the viewpoint of increasing the production rate of isopropyl alcohol, the specific growth rate is more preferably 0.02 / h or more, further preferably 0.025 / h or more, and 0.03 / h or more. It is particularly preferred. Yes.
  • the upper limit of the specific growth rate is not particularly limited, but is preferably 4 / h or less, more preferably 1 / h or less, more preferably 0.5 / h or less in consideration of the generation time of E. coli. Is more preferable, and 0.2 / h or less is particularly preferable.
  • a numerical range comprised from the preferable upper limit mentioned above and a preferable lower limit what is necessary is just a combination of any one of the upper limits mentioned above and any lower limit.
  • This formula 1 is applied to the specific growth rate in the present invention.
  • ⁇ F / V ⁇ : Specific growth rate (h ⁇ 1 )
  • F Substrate liquid supply rate (L / h) ⁇ culture solution extraction rate (L / h)
  • V Liquid volume in the culture tank (L)
  • the supply rate of the substrate solution and the extraction rate of the culture solution vary depending on the amount of solution in the culture tank.
  • the amount of solution in the culture tank is 1 L, 0.015 L / h
  • it is preferably 0.02 L / h to 4 L / h, and more preferably 0.025 L / h to 1 L / h.
  • 0.015 m 3 / h can be a ⁇ 4m 3 / h, 0.02 m from the viewpoint of enhancing the production rate of isopropyl alcohol 3 / h to 4 m 3 / h is preferable, and 0.025 m 3 / h to 1 m 3 / h is more preferable.
  • capacitance (size) of the said culture tank The culture tank normally used for substance production is applicable. Further, the amount of the liquid filled in the culture tank can be appropriately set according to the capacity of the culture tank used.
  • the specific growth rate should just be in the said range in the isopropyl alcohol production period.
  • the specific growth rate in a period other than the isopropyl alcohol production period is not particularly limited, and may be the same as or different from the above-described range. In the case where the range is different from the above range, for example, it can be set to 0.015 / h or less.
  • the conditions other than the specific growth rate for maintaining the steady state include the sugar concentration of the substrate solution, the temperature in the culture tank, the pH, etc., but there is no particular limitation as long as the steady state can be maintained, and the person skilled in the art can easily guess. Conditions are acceptable.
  • isopropyl alcohol is preferably aerobic culture from the viewpoint of production efficiency.
  • the aerobic culture means culture performed in the presence of air or oxygen, and refers to a state of oxygen in which the oxygen uptake rate of the bacterial cells is 1 mmol / L / h or more.
  • Oxygen uptake rate (OUR) indicates the amount of oxygen consumed by cells per unit culture solution per unit time. OUR obtained from the following formula 2 by the exhaust gas analysis method is used.
  • OUR varies depending on the aeration amount, stirring rotation speed, temperature, pressure, pH, and the like because the amount of cells and the amount of oxygen consumed per cell change during the culture period. Therefore, in order to adjust the OUR within the above-described range, the air flow rate, the air pressure, etc. may be adjusted appropriately. A person skilled in the art can appropriately adjust the target OUR based on Equation 2 above.
  • OUR is preferably 10 mmol / L / h to 250 mmol / L / h, more preferably 20 mmol / L / h to 200 mmol / L / h, and 50 mmol / L / h to 200 mmol / L.
  • / H is more preferable, and 100 mmol / L / h to 180 mmol / L / h is still more preferable. If OUR is 10 mmol / L / h or more, by-products such as lactic acid and organic acids such as lactic acid and organic acid and ethanol can be reduced, and if it is 250 mmol / L / h or less, by-products such as carbon dioxide are reduced. There is a tendency to be able to.
  • each condition in the culture is as follows: (1) When the amount of the liquid in the culture tank is 1 L, the substrate liquid supply rate and the culture liquid extraction rate are 0.02 L / h to 4 L / h, and the specific growth rate is 0.02 / h. 4 / h or less, and OUR is 20 mmol / L / h to 200 mmol / L / h. (2) When the amount of the liquid in the culture tank is 1 L, the substrate solution supply rate and the culture solution withdrawal rate are 0.02 L / h to 1 L / h, and the specific growth rate is 0.02 / h.
  • the substrate liquid supply rate and the culture liquid extraction rate are 0.02 L / h to 0.5 L / h, and the specific growth rate is 0.02 / H or more and 0.5 / h or less, and OUR is 20 mmol / L / h to 200 mmol / L / h (4)
  • the supply rate of the substrate solution and the culture The liquid withdrawal rate is 0.02 L / h to 0.5 L / h
  • the specific growth rate is 0.02 / h to 0.5 / h
  • the OUR is 50 mmol / L / h to 200 mmol / L.
  • the substrate solution supply rate and the culture solution withdrawal rate are 0.02 L / h to 0.5 L / h, and the specific growth rate is Is 0.02 / h or more and 0.5 / h or less, and OUR is 100 mmol / L / h to 80 mmol / L / h (6)
  • the substrate solution supply rate and the culture solution withdrawal rate are 0.02 L / h to 0.2 L / h
  • the specific growth rate is 0.02 / h or more and 0.2 / h or less
  • the OUR is 20 mmol / L / h to 200 mmol / L / h (7)
  • the substrate solution supply rate and the culture solution withdrawal rate are 0.02 L / h to 0.2 L / h
  • the specific growth rate is 0.02 / h to 0.2 / h
  • the OUR is
  • the specific growth rate is 0.025 / h or more and 0.2 / h or less
  • the OUR is 20 mmol / L / h to 200 mmol / L / h (10)
  • the amount of liquid in the culture tank is 1 L
  • the substrate solution supply rate and the culture solution withdrawal rate are 0.025 L / h to 1 L / h
  • the specific growth rate is 0.025 / h to 0.2 / h
  • OUR (11) When the amount of the liquid in the culture tank is 1 L, the supply rate of the substrate solution and the extraction rate of the culture solution are 0.025 L / h to 1 L / h. h, and the specific growth rate is 0.025 / h. It is more than 0.2 / h and OUR is 100 mmol / L / h to 180 mmol / L / h.
  • the culture conditions of (1) above can be applied to isopropyl alcohol production using any of the following isopropyl alcohol-producing E. coli: (A) pIPA / B strain, pIaaa / B strain, (B) a strain in which the GntR activity of the pIa / B :: atoDAB strain is inactivated, (C) a strain in which the GntR activity and glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity of pIa / B :: atoDAB strain are inactivated and the glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity is enhanced, and (D) Inactivating the GntR activity, glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, and phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity of the pIa / B :: atoDAB strain to produce glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase ( Zwf) A strain with enhanced activity
  • the culture condition of (2) can be applied to isopropyl alcohol production using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of any one of (a) to (d).
  • the above (a) to (d) can be applied to isopropyl alcohol production using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, and the culture condition of (4) is any of the above (a) to (d).
  • the cultivating conditions of (5) above can be applied to the production of isopropyl alcohol using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of any one of (a) to (d) above. Can be applied.
  • the culture condition of (6) can be applied to isopropyl alcohol production using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of any one of (a) to (d), and the culture condition of (7) is The isopropyl alcohol-producing E. coli of any of the above (a) to (d) can be applied to the production of isopropyl alcohol, and the culture condition of (8) is the same as that of any of (a) to (d) above.
  • the culture condition of (9) is applied to isopropyl alcohol production using any of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli described in (a) to (d) above.
  • the isopropyl alcohol-producing E. coli according to any one of (a) to (d) above is used as the culture condition of (10) above.
  • the culture conditions of (11) can be applied in isopropyl alcohol production using either isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of (a) ⁇ (d).
  • the plant-derived raw material used in the production process is a carbon source obtained from a plant, and is not particularly limited as long as it is a plant-derived raw material.
  • it refers to organs such as roots, stems, trunks, branches, leaves, flowers, seeds, plants containing them, degradation products of these plant organs, and further from plant bodies, plant organs, or degradation products thereof.
  • the obtained carbon sources those that can be used as a carbon source in culture by microorganisms are also included in plant-derived materials.
  • Carbon sources included in such plant-derived materials generally include sugars such as starch, sucrose, glucose, fructose, xylose, and arabinose, and herbaceous degradation products and cellulose hydrolysates that contain a large amount of these components.
  • sugars such as starch, sucrose, glucose, fructose, xylose, and arabinose
  • herbaceous degradation products and cellulose hydrolysates that contain a large amount of these components.
  • glycerin or fatty acid derived from vegetable oil may be included in the carbon source in the present invention.
  • Examples of plant-derived raw materials in the present invention can preferably include crops such as cereals, corn, rice, wheat, soybeans, sugar cane, beet, cotton, and the like, and combinations thereof. There are no particular restrictions on raw products, juice, pulverized products, and the like. Moreover, the form of only the above-mentioned carbon source may be sufficient.
  • pH and temperature conditions are not particularly limited. For example, pH 4 to 9, preferably pH 6 to 8, temperature 20 ° C. to 50 ° C., preferably 25 ° C. to 42 ° C., pressure 0 to 5 MPa, preferably The culture can be performed while appropriately controlling the pH and temperature within the range of 0 to 3 MPa.
  • the substrate solution supplied to the culture tank may be only a solution containing a plant-derived raw material that becomes a carbon source, or may be a mixed solution of a solution containing a plant-derived raw material that becomes a carbon source and the medium. Good. In order to perform more efficient culture, it is preferable to use a medium containing the plant-derived raw material as a substrate solution.
  • the solutions in the culture tank in which continuous culture is performed may be simply referred to as “culture solution”.
  • the amount of the plant-derived raw material in the substrate solution can be 60% by mass or less as a carbon source from the viewpoint of the solubility of the raw material, and from 5% by mass to isopropyl alcohol productivity. It can be 50 mass%.
  • the amount of gas aeration into the culture solution is not particularly limited, but in the case of culturing in an aeration and stirring tank and using only air as the gas, generally 0.02 vvm to 3.0 vvm (vvm; aeration capacity) [ML] / liquid volume [mL] / hour [min]), preferably 0.1 vvm to 2.0 vvm.
  • the amount of aeration for adjusting to a suitable OUR differs depending on the type of culture apparatus, for example, adjustment to 0.02 vvm to 10.0 vvm is an example of the amount of aeration when culturing in a bubble column.
  • the method for producing isopropyl alcohol of the present invention includes a pre-culture step for bringing the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli to be used into an appropriate number of cells or a moderately active state before the culture step for isopropyl alcohol production. May be.
  • the pre-culture process may be a culture under the culture conditions normally used according to the type of isopropyl alcohol-producing bacterium.
  • isopropyl alcohol produced by isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is collected from a culture solution containing the product extracted from the culture tank (hereinafter also referred to as “extraction solution”).
  • extraction solution a culture solution containing the product extracted from the culture tank
  • the isopropyl alcohol which is a product can be collect
  • the method for recovering isopropyl alcohol contained in the extraction liquid is not particularly limited. For example, after removing bacterial cells from the extraction liquid by centrifugation or the like, isopropyl alcohol is extracted by a normal separation method such as distillation or membrane separation. A method of separating alcohol can be employed. When the recovered isopropyl alcohol is in an aqueous solution state, the method for producing isopropyl alcohol may further include a dehydration step in addition to the recovery step. Isopropyl alcohol can be dehydrated by a conventional method.
  • the culturing step may be a step of culturing isopropyl alcohol-producing Escherichia coli while supplying gas into the mixture containing the isopropyl alcohol-producing bacteria and the plant-derived raw material, and generating isopropyl alcohol using the Escherichia coli.
  • the recovery process includes a gaseous isopropyl alcohol collection process for collecting isopropyl alcohol in the gas volatilized from the culture medium by supplying gas, and a recovery process for isolating isopropyl alcohol from the collected gaseous isopropyl alcohol. Including both.
  • Examples of the method for collecting gaseous isopropyl alcohol include cooling condensation with a condenser, trapping with a scrubber or trap tube, and adsorption with a filter having a high isopropyl alcohol adsorption capability, such as an active fiber filter.
  • a recovery method for isolating isopropyl alcohol after collection the above-described recovery method can be used as it is, and can be appropriately selected based on the collection method.
  • the recovery step may include recovering not only gaseous isopropyl alcohol but also liquid isopropyl alcohol.
  • a culture tank As an apparatus applicable for culturing isopropyl alcohol-producing Escherichia coli while supplying gas to the mixture, a culture tank, a supply path connected to the culture tank and supplying gas into the mixed liquid in the culture tank, And a recovery path that is connected to the culture tank and recovers the gas in the culture tank.
  • the production apparatus shown in FIG. 1 of International Publication No. 2009/008377 can be given.
  • an infusion tube for injecting gas from the outside of the apparatus is connected to a culture tank in which a culture medium containing isopropyl alcohol-producing bacteria and plant-derived raw materials is accommodated, and aeration can be performed on the culture medium. Yes.
  • the trap tank in which the trap liquid as a capture liquid is accommodated is connected to the culture tank via a connecting tube. At this time, the gas or liquid moved to the trap tank comes into contact with the trap liquid and bubbling occurs. Thereby, the isopropyl alcohol produced
  • acetone which is a precursor of isopropyl alcohol
  • the obtained acetone is preferably converted to isopropyl alcohol by purification using a known method and then using a known method (for example, the method described in Japanese Patent No. 2786272). Thereby, the conversion efficiency from the sugar raw material to isopropyl alcohol can be further increased.
  • FIG. 1 shows an example of a manufacturing apparatus applicable to the present invention.
  • 10 is a production apparatus
  • 12 is a fermentation tank
  • 48 is a substrate liquid tank
  • 50 is a pump
  • 54 is a controller
  • 56 is a sampling liquid tank
  • 58 is a pump
  • 62 is a trap tank.
  • the production apparatus 10 includes a culture tank 12 as an aeration and agitation tank for containing microbial cells and plant-derived materials and producing isopropyl alcohol.
  • the production apparatus 10 includes a mass flow meter 14 for supplying air from the air inlet to the inside of the culture tank 12, and a capacitor 16 for discharging the air in the tank from the exhaust port.
  • An in-tank pressure gauge 18 and an exhaust gas analyzer 20 are connected between the condenser 16 and the exhaust port, and the pressure in the tank and the oxygen partial pressure at the outlet can be measured.
  • the exhaust port is guided into the trap tank 62 and opened in the trap liquid accommodated in the trap tank 62.
  • a temperature sensor 22 In the culture tank 12, a temperature sensor 22, a dissolved oxygen sensor 24 and a pH sensor 26 are arranged.
  • a disc turbine blade 28 as a stirrer is disposed in the culture tank 12, and the disc turbine blade 28 is stirred and controlled by a magnetic stirrer 44.
  • a band heater 38 is provided around the culture tank 12, and a cooling rod 36 is provided therein, and a circulating cooling device 40 and a cooling water channel control electromagnetic valve 42 are connected to the cooling rod 36.
  • a neutralizer tank 30 filled with a pH adjusting agent is provided outside the culture tank 12.
  • the neutralizer tank 30 is provided with a balance 34.
  • the neutralizer tank 30 can supply a pH adjuster to the culture tank 12 via a pump 32.
  • the culture tank 12 is provided with a controller 54 for controlling the whole.
  • the controller 54 is connected to the temperature sensor 22, the dissolved oxygen sensor 24 and the pH sensor 26, and can input information on the temperature, DO (dissolved oxygen) and pH in the reaction solution in the culture tank 12 from each sensor. It has become.
  • the controller 54 is connected to the band heater 38 and the cooling water passage control electromagnetic valve 42.
  • the controller 54 controls the temperature by operating the band heater 38 and the cooling water passage control electromagnetic valve 42 according to information from various sensors, and controls the pH of the pump 32 by operating.
  • the manufacturing apparatus 10 is provided with a substrate liquid tank 48 and a sampling liquid tank 56.
  • the substrate liquid tank 48 and the extraction liquid tank 56 are provided with balances 52 and 60, respectively.
  • the substrate liquid tank 48 contains a substrate liquid, and the substrate liquid tank 48 is connected to the culture tank 12 via a pump 50.
  • the substrate solution is fed from the substrate solution tank 48 to the culture tank 12 via the pump 50.
  • feed controls such as chemo stat and pH stat can be performed by the setting of the controller 54, and the pump 50 is operated by a signal from the controller 54.
  • the extraction liquid tank 56 is connected to the culture tank 12 via a pump 58, and the culture liquid is extracted from the culture tank 12 by the operation of the pump 58, guided to the extraction liquid tank 56, and stored.
  • the extraction port is fixed at a fixed position in the culture tank, and is controlled so that the liquid level in the culture tank is constant.
  • the trap tank 62 is filled with water (trap liquid), and is maintained at a predetermined temperature, for example, 5 ° C., for vaporizing the vaporized isopropyl alcohol. Isopropyl alcohol volatilized in the culture tank 12 by aeration and stirring is guided from the culture tank 12 to the trap tank 62 by the operation of the condenser 16 and trapped in the trap tank 62.
  • isopropyl alcohol can be produced over a long period of time. Isopropyl alcohol can be produced more efficiently than isopropyl alcohol.
  • the productivity of isopropyl alcohol of the present invention enables continuous culture for 240 h or more, for example. In this case, for example, a production rate of 0.7 g / L / h or more is possible, and a production rate of 1.0 g / L / h or more is preferable.
  • the Escherichia coli producing isopropyl alcohol is not limited to the cells used in the examples, and is not particularly limited as long as it is Escherichia coli producing isopropyl alcohol. In the description, “%” is based on mass unless otherwise specified.
  • GAPDH The glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (hereinafter referred to as GAPDH) derived from Escherichia coli described in 397-440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662 as the base sequence of the promoter necessary for expressing the above gene Promoter sequences) may be used.
  • GAPDH promoter the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was used as a template, and cgctcaattgcaatgattgaccacattttccg (SEQ ID NO: 1) and agagaattcgctattttgttgtgattagagt (SEQ ID NO: 2) were obtained by the PCR method.
  • a DNA fragment encoding the GAPDH promoter of about 100 bp was obtained by digestion with EcoRI.
  • the resulting DNA fragment was mixed with plasmid pUC19 (GenBank accession number X02514) digested with restriction enzyme EcoRI and further treated with alkaline phosphatase, and ligase was used for binding, followed by Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell ( Toyobo Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain transformants that grow on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL.
  • the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was used as a template to obtain cgaattcgctggtggagaatatatgaaaaaaaatgacatatacaagac (SEQ ID NO: 3), and the DNA fragment obtained by the gcggtactttatttttgtctctgtgtgtggt restriction method. Digestion with EcoRI and KpnI yielded an approximately 690 bp atoD fragment.
  • This DNA fragment was mixed with pUCgapP previously digested with restriction enzymes EcoRI and KpnI, ligated with ligase, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (Toyobo Co., Ltd. DNA-903), and ampicillin.
  • a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL was obtained.
  • a plasmid was recovered from the obtained cells, and it was confirmed that atoD was correctly inserted. This plasmid was named pGAPatoD.
  • Escherichia coli MG1655 strain can be obtained from the American Type Culture Collection.
  • a primer of SEQ ID NO: 4 prepared based on the sequence information of ggtctagagcaatgattagaacgagtccccg (SEQ ID NO: 7) prepared based on the sequence information of the GAPDH promoter of Escherichia coli MG1655 strain and atoD of Escherichia coli MG1655 strain was used. Then, PCR was performed using the expression vector pGAPatoD prepared earlier as a template to obtain a DNA fragment of about 790 bp consisting of the GAPDH promoter and atoD.
  • the fragments obtained above were digested with restriction enzymes PstI and XbaI, XbaI and KpnI, respectively, and this fragment was temperature-sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) [Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)] was mixed with a fragment obtained by digesting with PstI and KpnI, ligated with ligase, transformed into DH5 ⁇ strain, and applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C. A growing transformant was obtained. The obtained colony was cultured overnight at 30 ° C.
  • acetoacetate decarboxylase gene (adc) of Clostridium bacteria is described in GenBank accession number M55392, and the isopropyl alcohol dehydrogenase gene (IPAdh) is described in GenBank accession number AF157307.
  • IPAdh isopropyl alcohol dehydrogenase gene
  • a base sequence of a promoter necessary for expressing the above gene group glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase derived from Escherichia coli described in 397 to 440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662 Promoter sequence (sometimes referred to as GAPDH).
  • Cgagctatacatgcaatgattgacagattttccg (SEQ ID NO: 8) and cgcgcgcatgtctttttgttgatagaag (SEQ ID NO: 9) were obtained by PCR using the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain as a template, and amplified by the PCR method.
  • a DNA fragment corresponding to the GAPDH promoter of about 110 bp was obtained by digestion with SphI.
  • the resulting DNA fragment and the plasmid pBR322 (GenBank accession number J01749) were mixed with fragments obtained by digesting with restriction enzymes NdeI and SphI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo) Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pBRgapP was recovered from the obtained cells.
  • IPAdh * codon-modified isopropyl alcohol dehydrogenase gene
  • a isopropyl alcohol dehydrogenase gene that was codon-modified based on the amino acid sequence of the isopropyl alcohol dehydrogenase gene of Clostridium beijerinckii NRRL B-593 was designed, and DNA synthesis was performed to A DNA fragment (SEQ ID NO: 10) was prepared. The sequence is described below.
  • the prepared DNA fragment is used as a template, and is amplified by PCR using acatgcatgcatgaaaggtttttgcaatgctg (SEQ ID NO: 11) and acgcgtcgactataataactactgctttaa (SEQ ID NO: 12), and the obtained DNA fragment is digested with restriction enzymes SphI and SalI. A 1 kbp codon modified isopropyl alcohol dehydrogenase fragment was obtained.
  • the obtained DNA fragment and the fragment obtained by digesting plasmid pUC119 with restriction enzymes SphI and SalI were mixed and ligated using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.). And a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that the codon-modified IPAdh * was correctly inserted.
  • This plasmid was named pUC-I * .
  • a fragment containing IPAdh * obtained by digesting plasmid pUC-I * with restriction enzymes SphI and EcoRI and a fragment obtained by digesting plasmid pBRgapP with restriction enzymes SphI and EcoRI are mixed and ligated using ligase. Then, Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) were transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that the codon-modified IPAdh * was correctly inserted.
  • the plasmid was named pGAP-I * .
  • a codon-modified acetoacetate decarboxylase gene (adc * )
  • a codon-modified acetoacetate decarboxylase gene was designed based on the amino acid sequence of the acetoacetate decarboxylase gene of Clostridium acetobutylicum ATCC824 and A DNA fragment (SEQ ID NO: 13) was prepared. The sequence is described below.
  • the DNA fragment obtained by digesting the DNA by the digestion method b using the PCR method I obtained by digesting the DNA obtained by the PCR method with the DNA obtained by digesting the DNA with the digestion method b by the digestion method b with the enzyme method b A codon-modified acetoacetate decarboxylase fragment was obtained.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-I * were digested with restriction enzymes SalI and XbaI, mixed and ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell ( Toyobo Co., Ltd.
  • DNA-903 was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and it was confirmed that adc * was correctly inserted. It was named pI * a * .
  • Escherichia coli B strain genomic DNA (GenBank accession No. CP000819) was used as a template.
  • the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI to obtain an about 1500 bp glucose 6-phosphate 1-dehydrogenase fragment.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pI * a * were mixed with the fragments obtained by digesting with the restriction enzymes XbaI and BamHI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo Spinning Co., Ltd.
  • DNA-903 was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pI * a * z was recovered from the obtained cells.
  • nucleotide sequence region near the gene (1,650Bp) encoding pgi oligos shown in Shieijijiaattcgctatatctggctctgcacg (SEQ ID NO: 18), cagtctagagcaatactcttctgattttgag (SEQ ID NO: 19), cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc (SEQ ID NO: 20) and Jieishishitgcagatcatccgtcagctgtacgc (SEQ ID NO: 21) Four types of nucleotide primers were synthesized.
  • the primer of SEQ ID NO: 18 has an EcoRI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 have an XbaI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primer of SEQ ID NO: 21 has a PstI recognition site on the 5 ′ end side, respectively.
  • a genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19. (Hereinafter sometimes referred to as pgi-L fragment).
  • a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 (hereinafter sometimes referred to as pgi-R fragment).
  • a transformant was obtained that grew on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments, a 5 'upstream vicinity fragment and a 3' downstream vicinity fragment of the gene encoding pgi were correctly inserted into pTH18cs1.
  • the obtained plasmid was digested with XbaI, and then blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • This DNA fragment and the pUC4K plasmid (GenBank accession number X06404) (Pharmacia) digested with EcoRI and the kanamycin resistance gene further blunt-ended with T4 DNA polymerase were ligated using T4 DNA ligase. did. Thereafter, the cells were transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cells to obtain transformants that grew at 30 ° C. on LB agar plates containing chloramphenicol 10 ⁇ g / ml and kanamycin 50 ⁇ g / ml.
  • the plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene was correctly inserted between the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding pgi, and pTH18cs1-pgi and did.
  • B :: atoDAB ⁇ pgi strain The resulting Escherichia coli B strain, B :: atoDAB, was transformed with plasmid pTH18cs1-pgi, and cultured overnight at 30 ° C. on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and 50 ⁇ g / ml of kanamycin. Got the body. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml and cultured at 30 ° C. overnight.
  • ⁇ Preparation of plasmid pTH18cs1-gntR> The entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli B strain is known (GenBank accession No. CP000819), and the base sequence encoding GntR is GenBank accession No.
  • the genome sequence of Escherichia coli B strain described in CP000819 is described in 3509184 to 3510179.
  • a genomic DNA of Escherichia coli B strain (GenBank accession No. CP000819) was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and PCR was performed with a primer pair of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 to obtain about 1.0 kb.
  • a DNA fragment was amplified (hereinafter sometimes referred to as a gntR-L fragment).
  • a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 (hereinafter sometimes referred to as gntR-R fragment).
  • DNA fragments were separated and collected by agarose electrophoresis, and PCR was performed using the gntR-L and gntR-R fragments as a template and the primer pair of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 25 to obtain a DNA fragment of about 2.0 kb.
  • was amplified hereinafter sometimes referred to as a “gntR-LR fragment”.
  • the gntR-LR fragment was separated and collected by agarose electrophoresis, digested with EcoRI, mixed with an EcoRI digest of the temperature sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610), reacted with T4 DNA ligase, and then Escherichia coli.
  • DH5 ⁇ competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Toyobo Co., Ltd. were transformed to obtain transformants that grew at 30 ° C. on LB agar plates containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the gntLR fragment was correctly inserted into pTH18cs1, and this plasmid was designated as pTH18cs1-gntR.
  • the primer of SEQ ID NO: 26 has an NdeI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 have a SacI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primer of SEQ ID NO: 29 has a BamHI recognition site on the 5 ′ end side.
  • a genomic DNA (GenBank accession No. CP000819) of Escherichia coli B strain was prepared, and a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 (hereinafter referred to as gnd-). Sometimes called L fragment).
  • gnd-R fragment a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 (hereinafter sometimes referred to as gnd-R fragment).
  • the plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments of the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding gnd were correctly inserted into pTH18cs1, and pTH18cs1-gnd and did.
  • B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain The resulting Escherichia coli B strain, B :: atoDAB ⁇ pgi strain, was transformed with plasmid pTH18cs1-gnd, and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C. overnight. Obtained. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain The prepared B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain competent cell was transformed with the plasmid pTH18cs1-gntR, and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C. overnight to obtain a transformant. It was. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a strain capable of amplifying an about 2.0 kbp fragment due to deletion of the gntR gene was selected by PCR, and the obtained strain was selected as B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd. It was named ⁇ gntR strain.
  • Example 1 Continuous culture of isopropyl alcohol ⁇ Pre-culture> LB medium (Difco TM LB Broth Miller) was placed in an Erlenmeyer flask in an amount 1/5 of the flask volume, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. The autoclave-sterilized medium was inoculated with 0.1 vol% of the Escherichia coli pGAPIaa / B strain described in WO2009 / 008377. Shaking culture was performed for 16 hours in a constant temperature room at 35 ° C. to grow seed cells.
  • isopropyl alcohol was produced using the production apparatus 10 shown in FIG.
  • the culture tank 12 was 5 L, and the substrate liquid tank 48 and the extraction liquid tank 56 were 20 L.
  • the trap tank 62 was filled with 20 L of water and kept at 5 ° C.
  • a culture tank containing 750 mL of an autoclave-sterilized medium having the composition shown in Table 1 was inoculated with 38 mL of the preculture solution.
  • a substrate solution having the composition shown in Table 2 was fed at 11 g / h until 8 hours after the start of the culture, and thereafter at a feed rate of 22.5 g / h.
  • the extraction speed of the culture solution in the culture tank 12 was the same as the feed speed, and the amount of the culture solution in the culture tank 12 was controlled to 750 mL.
  • the specific gravity of the substrate solution is 1 g / cm 3 and the steady state specific growth rate is 0.03 / h.
  • the 48th hour after the start of the culture is the time when the number of bacteria was determined based on the turbidity by OD660 and the number of bacteria became constant, so that it was determined to be in the isopropyl alcohol production period.
  • the isopropyl alcohol concentration in the obtained culture broth was measured by gas chromatography according to a conventional method.
  • the cell mass was calculated as [g-drydcell]. The results are shown in FIGS.
  • Example 2 [Preparation of Isopropyl Alcohol Producing Escherichia coli] Pre-culture was performed in the same manner as in Example 1 using the pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain. Next, isopropyl alcohol was produced using the production apparatus 10 shown in FIG.
  • the culture tank 12 was a 1-L container, and the substrate liquid tank 48 and the extraction liquid tank 56 were 4 L-volume.
  • the trap tank 62 was filled with 4 L of water and maintained at 5 ° C.
  • a culture tank containing 500 mL of an autoclave-sterilized medium having the composition shown in Table 1 was inoculated with 25 mL of the preculture solution.
  • the amount of the culture solution was controlled to be 500 mL.
  • a substrate solution having the composition shown in Table 4 was fed at a rate of 5 g / h until 8 hours after the start of culture, and thereafter at a feed rate of 60.6 g / h.
  • the specific gravity of the substrate solution was 1 g / cm 3 and the steady state specific growth rate was 0.1212 / h.
  • the isopropyl alcohol concentration and the cell mass in the culture solution were obtained. The results are shown in FIGS. 4 and 5 and Tables 5 and 6.
  • LB Broth agar medium 1 and LB Broth agar medium 2 containing 100 ⁇ L / mL ampicillin were prepared, and the diluted culture solution in the culture tank was applied and kept at 30 ° C. The number of colonies after 24 hours was counted.
  • Example 3 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 2 except that the feed rate after 8 hours was changed to 23.5 g / h. At this time, the specific growth rate in the steady state was 0.0470 / h.
  • the isopropyl alcohol concentration and the cell mass in the culture solution were obtained, and in the same manner as in Example 2, the plasmid dropout rate was obtained. The results are shown in FIGS. 4, 5, 6, Table 5 and Table 6.
  • Example 4 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 2 except that the feed rate after 8 hours was changed to 12.4 g / h. At this time, the specific growth rate in the steady state was 0.0247 / h. In the same manner as in Example 1, the isopropyl alcohol concentration and the cell mass in the culture solution were obtained, and in the same manner as in Example 2, the plasmid dropout rate was obtained. The results are shown in FIGS. 4, 5, 6, Table 5 and Table 6.
  • the total mass of isopropyl alcohol is a value obtained by dividing the total mass of isopropyl alcohol by the amount of culture solution in the culture tank during the operation time (here, 0.5 L).
  • the production rate is an average isopropyl alcohol production rate calculated from the isopropyl alcohol integrated mass, and the same applies hereinafter.
  • FIG. 4 black circles indicate Example 2
  • white circles indicate Example 3
  • black triangles indicate Example 4
  • white triangles indicate Comparative Example 2.
  • FIG. 4 specific growth rate of 0.0147 [h ⁇ 1 ]
  • the number of bacterial cells in the culture tank was not maintained or propagated after 48 hours (FIG. 4), and the steady state was not reached. It was also found that isopropyl alcohol production stopped after 96 hours (FIG. 5). It is clear from FIG. 6 that the plasmid shedding rate at this time is 80% or more (see FIG. 6).
  • Example 2 to Example 4 in which the culture was performed under a condition where the specific growth rate was higher than 0.0147 [h ⁇ 1 ], the cell growth reached a steady state, and continuous operation for a long time was possible. Isopropyl alcohol could be produced stably.
  • Example 5 The substrate solution composition shown in Table 7 was changed, and the stirring rotation speed was changed to 500 rpm. Otherwise, continuous culture was performed in the same manner as in Example 2.
  • the value of the mass flow meter 14 was adopted as the air flow rate at the air inlet, and the value of the mass flow meter 14 was adopted as the range where the decrease due to oxygen consumption was negligible.
  • the values of the pressure gauge 18 in the tank were adopted for the air pressure at the air inlet and outlet.
  • the absolute temperature at the air inlet and outlet is the value of the temperature sensor 22 in the tank.
  • the oxygen mole fraction at the air inlet was 0.209, and the value of the exhaust gas analyzer 20 was adopted as the oxygen mole fraction at the outlet.
  • the value of the dissolved oxygen sensor 24 in the tank was adopted.
  • the air flow rate at the air inlet and outlet was 1.0 L / min
  • the air pressure at the air inlet and outlet was normal pressure
  • the temperature of the air inlet and outlet was 30 ° C.
  • OUR the average value in the steady state after the 24th hour of the value calculated according to the above-described equation 2
  • the calculated OUR of this example was 50 mmol / L / h.
  • the isopropyl alcohol concentration in the culture solution was obtained, and the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined.
  • the results are shown in FIGS. 7, 8, 9, 10, Table 8 and Table 9.
  • the specific growth rate was 0.1200 / h.
  • Example 6 The continuous rotation was performed in the same manner as in Example 5 except that the stirring rotation speed was changed to 600 rpm. At this time, the calculated OUR was 107 mmol / L / h. Further, in the same manner as in Example 5, the isopropyl alcohol concentration in the culture broth was obtained, and the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined. The results are shown in FIGS. 7 and 8 and Table 8. The steady state specific growth rate was 0.1203 / h.
  • Example 7 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 5 except that the stirring rotation speed was 700 rpm. At this time, the calculated OUR was 153 mmol / L / h. Further, in the same manner as in Example 5, the isopropyl alcohol concentration in the culture broth was obtained, the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined, and the dissolved oxygen concentration was obtained. The results are shown in FIGS. 7, 8, 9, 11, Table 8 and Table 9. The steady state specific growth rate was 0.1200 / h.
  • Example 8 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 5 except that the stirring speed was 800 rpm. At this time, the calculated OUR was 187 mmol / L / h. Further, in the same manner as in Example 5, the isopropyl alcohol concentration in the culture broth was obtained, and the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined. The results are shown in FIGS. The steady state specific growth rate was 0.1210 / h.
  • Example 9 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 5 except that the stirring rotation speed was 900 rpm. At this time, the calculated OUR was 196 mmol / L / h. Further, in the same manner as in Example 5, the isopropyl alcohol concentration in the culture broth was obtained, the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined, and the dissolved oxygen concentration was obtained. The results are shown in FIG. 7, FIG. 8, FIG. 9, FIG. The steady state specific growth rate was 0.1210 / h.
  • Example 10 Continuous culture was performed in the same manner as in Example 5 except that the stirring rotation speed was 400 rpm. At this time, the calculated OUR was 20 mmol / L / h. Further, in the same manner as in Example 5, the isopropyl alcohol concentration in the culture broth was obtained, and the isopropyl alcohol yield and the isopropyl alcohol production rate with respect to the calculated OUR were determined. The results are shown in FIGS. 7 and 8 and Table 8. The steady state specific growth rate was 0.1200 / h.
  • FIG. 9 the time-dependent change of the integrated mass of isopropyl alcohol is shown in FIG.
  • black circles indicate Example 5
  • black diamonds indicate Example 7, and black triangles indicate Example 9.
  • FIG. 10 The time-dependent changes in the dissolved oxygen concentration in the culture tank are shown in FIG. 10 for Example 5, FIG. 11 for Example 7, and FIG. 12 for Example 9.
  • the acetic acid production rate is low and the isopropyl alcohol production rate is kept high even if the dissolved oxygen concentration in the culture tank is 0 ppm or the dissolved oxygen concentration fluctuates around 0-1 ppm.
  • Example 11 The composition of the substrate solution was changed to Table 10, and the substrate solution was fed at 5 g / h until 8 hours after the start of culture, and thereafter fed at an average feed rate of 42 g / h.
  • the pHstat method was adopted in order to minimize the outflow of the substrate to the extraction liquid.
  • continuous culture was performed in the same manner as in Example 2.
  • OUR was 200 mmol / L / h.
  • the isopropyl alcohol concentration and the microbial mass in the culture solution were obtained, and the plasmid dropout rate was obtained in the same manner as in Example 2.
  • the results are shown in FIG. 13, FIG. 14, Table 11 and Table 12.
  • the specific growth rate was 0.083 / h.
  • the cell mass in the culture tank was constant after 24 hours, and the average cell concentration from 24 hours to 840 hours was 12 g-dry cell / L. From FIG. 14, it can be seen that 35 days of continuous operation is possible by optimizing the fermentation conditions.
  • the integrated mass of isopropyl alcohol was 1315 g / L / 840h, and the production rate was 1.57 g / L / h. Furthermore, the production rate was 2.40 g / L / h by the sixth day and 2.15 g / L / h by the tenth day.
  • the plasmid dropout rate of recombinant E. coli was as low as 20% or less until the 27th day, 47% on the 29th day and 77% on the 35th day, and the plasmid was retained for a long time. It has been found.
  • isopropyl alcohol can be produced easily and stably for a long time with high production efficiency by continuous culture using isopropyl alcohol-producing Escherichia coli.

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Abstract

　植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、を含むイソプロピルアルコール製造方法。

Description

連続培養によるイソプロピルアルコール製造方法
　本発明は、イソプロピルアルコール製造方法に関する。
　プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
　植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で温室効果ガス排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
　植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する微生物は既に知られている。
　例えば国際公開２００９／００８３７７号には、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを生産するように改変された大腸菌を用いて、基質液の逐次添加による半回分式培養を行いながらイソプロピルアルコールを生産することが開示されている。このイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールの選択性が高いことから工業生産用生体触媒として優れた性質を持つと記載されている。
　イソプロピルアルコールを培養法により工業レベルで生産するには、長時間の連続的な培養により効率的に生産することが求められている。
　このために、例えば、生物化学工学会誌，７１（１），ｐｐ．９－１４，（１９９３）には、土壌から分離したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する微生物を用いたブタノール・イソプロピルアルコールの連続培養が報告されている。ここでは、３０日間の連続培養を行っているが、本微生物は遺伝子組換えによる改変を行っておらず、イソプロピルアルコールの選択率は約２５％と低い。
　Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１０（６），ｐｐ．６９６－７０１，（２０１０）には、イソプロピルアルコールを生産するように改変された大腸菌を用いた長時間の半回分培養によるイソプロピルアルコールの生産が報告されている。ここでは、生成したイソプロピルアルコールをガスストリッピングにより培養液中からガス中へ追い出し、ガスに含まれるイソプロピルアルコールは水を捕捉液として回収している。培養槽には三角フラスコを使用し、フラスコ容量の１／１０以下のごく少量の培養液を仕込むことで比表面積を大きくしており、逐次添加による半回分式培養でありながら、生成イソプロピルアルコールに加え培養液も蒸散させているため培養液量は低下しており２４０時間と長い運転時間が可能となっている。
　一方、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４－８４４，（２００６）では、生産物はエタノールを生産するための遺伝子組換え大腸菌を用いた無通気によるエタノール連続培養が報告されている。ここでは、液循環型固定床による連続培養で、滅菌培地の培養槽へのフィード、培養槽からの培養液の抜き取りという一般的な連続培養に加え、培養槽内の液を循環させる連続培養が実施されている。
　大腸菌を用いた酸素ガス又は酸素を含むガスを通気する好気培養では、酢酸が副生することが知られているが、酢酸の蓄積濃度が高くなると、大腸菌の増殖阻害や目的物の生産効率低下を招く。そこで、酢酸の高蓄積を抑制するため、通気または攪拌速度をコントロールし、培養槽内の溶存酸素濃度が枯渇しないよう、数ｐｐｍに制御するＤＯ－Ｓｔａｔ法がよく知られている。Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３６，ｐｐ．７５０－７５８，（１９９０）では、酢酸の蓄積は、通常の半回分培養では４８時間目における酢酸濃度が３５ｇ／Ｌ、ＤＯ－Ｓｔａｔ法による制御では３６時間目における酢酸濃度が１７ｇ／Ｌ、溶存酸素濃度の制御に加え、半回分培養における基質液の添加速度のコントロールにより培養槽中のグルコースの濃度も制御するＢａｌａｎｃｅｄ　ＤＯ－Ｓｔａｔ法では酢酸が生成しないと報告されている。
　しかしながら、長期間の培養のために比表面積を大きくする方法は、過大な培養槽を使用することにつながり、工業レベルの規模では現実的ではない。また、通常の半回分式培養では、運転時間が長くなるほどイソプロピルアルコールの生産量は多くなるが、培養液量は増加し続けるため大型培養槽が必要となり、工業化した場合設備費、維持費、運転費が著しく高くなるため、汎用化学品の製造には向かない。
　菌体増殖の観点においても、半回分培養では１６時間から４８時間程度で菌体の増殖がほとんど停止し、培養時間が更に長くなるとイソプロピルアルコールの生産速度は低下することが知られている。Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１０（６），ｐｐ．６９６－７０１，（２０１０）に記載された技術においても、２４０時間以降は濃縮栄養培地を添加してもイソプロピルアルコールの生産が停止することが報告されている。
　一方、イソプロピルアルコールの生産には、酸素が必要であるが、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４－８４４，（２００６）に記載された技術では、液循環ラインに使用するチューブからの酸素透過により菌体の酸素摂取速度が1ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈになると、固定化されていない遊離菌体が保有するプラスミドは培養２日目以降脱落し始めることが記載されている。プラスミドが脱落し始めると、プラスミドを保有しない菌体の増殖が優位となることが一般的に知られており、増殖を長時間伴う培養には向いていない。また、酢酸の副生を抑制するためにＤＯ－ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ　ＤＯ－Ｓｔａｔ法で制御することは、複雑な制御のプログラムを組まなければならず、また、多くの場合にはコストの高い純酸素を使用しなければならない。
　このように、経済的に有利となる連続培養による効率の良いイソプロピルアルコールの製造が依然として望まれている。
　本発明は、連続培養によってイソプロピルアルコールを簡便にかつ長時間安定的に高い生産性で製造するイソプロピルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の各態様は、以下のイソプロピルアルコール製造方法を提供する。
　〔１〕　植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、を含むイソプロピルアルコール製造方法。
　〔２〕　前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０１５／ｈ以上となる条件である〔１〕記載の製造方法。
　〔３〕　前記培養を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの酸素摂取速度で行う〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
　〔４〕　前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０２／ｈ以上となる条件である〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、連続培養によってイソプロピルアルコールを簡便にかつ長時間安定的に高い生産性で製造するイソプロピルアルコールの製造方法を提供することができる。
本発明に使用可能な連続培養槽の一例の概略構成図である。 本発明の実施例１及び比較例１における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例１及び比較例１におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例２～実施例４及び比較例２における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例２～実施例４及び比較例２におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例２～実施例４及び比較例２におけるプラスミド脱落率の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例５～実施例１０におけるＯＵＲとイソプロピルアルコール収率の相関関係を示すグラフである。 本発明の実施例５～実施例１０におけるＯＵＲとイソプロピルアルコール生産速度の相関関係を示すグラフである。 本発明の実施例５、実施例７及び実施例９におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例５における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例７における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例９における培養槽内の溶存酸素の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例１１における培養槽内培養液中の菌体質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例１１におけるイソプロピルアルコール生産質量の経時変化を示すグラフである。 本発明の実施例１１におけるプラスミド脱落率の経時変化を示すグラフである。
　本発明のイソプロピルアルコール製造方法は、植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、を含むイソプロピルアルコール製造方法である。
　本発明によれば、培養槽内への基質液の供給及び培養槽内からの生産物を含む培養液の抜き取りを連続的に行いながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体数を維持し、且つイソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する。即ち、菌体数を維持しつつ、所定の菌体増殖条件でイソプロピルアルコール生産大腸菌を連続培養しながら、イソプロピルアルコールを生産するので、イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いた連続培養であっても、簡便に且つ長時間安定的に高い生産性でイソプロピルアルコールを製造することができる。
　これを更に説明すれば、例えば、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，ｐｐ．８３４－８４４，（２００６）に開示された技術では、大腸菌の安定的なプラスミド保持には、酸素摂取速度を０．６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下に抑制しなければならないことと記載されており、また、大腸菌を用いた酸素摂取速度が高い好気培養による長期連続培養は、これまでに報告例がない。これらのことから、酸素を供給する好気培養で遺伝子組み換え大腸菌を用いると、固定化しない場合、プラスミドの脱落した菌体が経時的に増えるため、長時間の連続培養では目的物の生産速度が低下していくことが示唆される。また固定化した菌体を使用する場合は、酸素と菌体との接触性が低下するため、酸素を必要とするような好気培養では目的物の生産速度が低下することが示唆される。
　また、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３６，ｐｐ．７５０－７５８，（１９９０）に開示された技術では、大腸菌を用いた運転時間２日の好気による半回分培養が行われている。酸素摂取速度に関する記載はないものの、ファーメンターを用いて空気又は純酸素を１ｖｖｍで通気、攪拌回転数は最大１３５０ｒｐｍであり、酸素摂取速度が高いことは当該業者であれば、容易に推測できる。培養２日程度ではプラスミドの脱落の影響はほとんどないものの、好気培養では酢酸の高蓄積による増殖阻害や目的物の生産速度が低下するため、ＤＯ－Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ　ＤＯ－ｓｔａｔ法などにより溶存酸素濃度を制御しなければならないことが記載されている。
　これに対して、本発明では、培養槽へのイソプロピルアルコール生産大腸菌の投入当初ではなく、培養開始からの所定時間後のイソプロピルアルコール生産期でのイソプロピルアルコール生産大腸菌の挙動に着目し、この時期の培養条件を、菌体が安定的に増殖する条件に調整するものである。これによりＤＯ－Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ　ＤＯ－ｓｔａｔ法による培養槽内の溶存酸素濃度やグルコース濃度の複雑な制御を行わなくても、好気培養においてイソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールの生産性を低下させることなく、簡便な培養方法で長期間にわたってイソプロピルアルコールを製造することができる。
　更に通気・攪拌条件をイソプロピルアルコール生産に適した範囲内に調整することによって、より効率よくイソプロピルアルコールを製造することができる。
　本発明において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　以下、本発明について説明する。
　本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールを生産するためのイソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌である。大腸菌は本来イソプロピルアルコールを生産する系を有していないため、本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌である。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。また、イソプロピルアルコール生産系の少なくとも一部が、遺伝子組み換えによる導入又は改変されていればよい。遺伝子組換えによる導入又は改変には公知の方法を用いることができ、例えばゲノムへの相同組換え、プラスミドによる導入等が挙げられる。
　本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性を強化した大腸菌である。「遺伝子組換えにより」とは、生来の遺伝子の塩基配列に対して異なる配列を有する外来の塩基配列の挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
　本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
　本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明におけるイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ／Ｂ株又はｐＩａａａ／Ｂ株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の増強は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の増強は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と呼ぶことがある）を含む。
　更に効果的にイソプロピルアルコール生産性を向上させた組換え大腸菌を使用してもよく、そのような例として不活化されたＧｎｔＲ活性、不活化されたグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、不活化されたホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性と強化されたグルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が挙げられる。これらの組み合わせにより、これ以外の各因子又は酵素の組み合わせと比してイソプロピルアルコールの生産性を驚異的に向上させることできる。
　本発明におけるグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ－グルコース－６－リン酸からＤ－フルクトース－６－リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明におけるグルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ－グルコース－６－リン酸からＤ－グルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　本発明において用いられるグルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。
　本発明におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４４に分類され、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸からＤ－リブロース－５－リン酸とＣＯ２を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌の好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ／Ｂ株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性を不活化した株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化し、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株又はｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性を不活化し、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株などが挙げられる。
　本発明のイソプロピルアルコール製造方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いた連続培養により植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させるものである。
　前記イソプロピルアルコール製造方法は、具体的には、植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養すること（以下、培養工程という）と、前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産すること（以下、「生産工程」という）と、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収すること（以下、回収工程という）と、を含む。
　前記製造方法におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌の培養は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を、菌体数を維持しつつ、安定的に増殖させる菌体増殖条件で行われる。菌体数の維持は、基質液の供給及び培養液の抜き取りと、菌体増殖条件下での培養とにより達成される。これにより、イソプロピルアルコール生産期でも前記大腸菌の増殖能が維持され、結果的に、連続培養であってもイソプロピルアルコールの生産を維持することができる。
　前記製造方法では、イソプロピルアルコールの生産を連続培養によって行うため、培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させてイソプロピルアルコールを生産する前記生産工程は、前記培養工程と同時に進行する。ただし、前記菌体増殖条件によらないイソプロピルアルコール生産大腸菌の成育又は維持のための単なる培養は、前記生産工程と同時に行われなくてもよい。
　また、前記回収工程は、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収するものであるため、前記培養工程及び生産工程と同時に行ってもよく、培養工程及び生産工程と同時でなくてもよい。
　前記培養工程は、培養初期の菌体濃度が、安定的に菌体数を維持できる菌体濃度に達した後に行われる。
　培養初期の「安定的に菌体数を維持できる菌体濃度」とは、連続培養開始後に前記大腸菌の増殖が維持できる菌体濃度であれば特に制限は無いが、例えば、乾燥質量として２．４ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌに相当する菌体濃度であれば十分である。
　本発明における「連続培養」とは、「発酵工学の基礎」（Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ著、学会出版センター、１９８８年、ｐ１４～ｐ１５、［Principles of Fermentation Technology (Stanbury,Peter F.;Whitaker,Allan)］）に記載されているように、上記基質液を培養槽へ連続的に供給（以下、「フィード」ということがある）し、生産物を含む培養液を連続的に抜取る方法により、菌体を培養し、該菌体により目的物を生産することを意味する。このとき、供給された基質液と等量の培養液を培養槽から抜取ることにより、培養槽内で液量はほぼ一定となる。
　フィードの方法は、特に限定されるものではなく、一定速度でフィードするｃｈｅｍｏ　ｓｔａｔ法や、炭素源（植物由来原料）のロスを少なくするために断続的にフィードする方法などが挙げられる。断続的にフィードする方法としては、例えば、ｐＨｓｔａｔ法が挙げられる。このｐＨｓｔａｔ法は、炭素源（植物由来原料）をフィードして一旦停止したときに培養槽内の炭素源（植物由来原料）が枯渇すると生ずるｐＨの上昇及び溶存酸素濃度の上昇、排気二酸化炭素濃度の低下を指標として、フィードを再開する方法である。
　本発明における「連続的な供給」又は「連続的な抜き取り」との用語には、培養槽内の液量がほぼ一定に維持されている限り、如何なる態様のフィード方法も包含される。なお、「培養槽内の液量がほぼ一定」とは、イソプロピルアルコール製造開始における培養槽内の液量と比較したときの液量の変動が０容量％～１０容量％の範囲内を意味し、連続運転の安定性の観点から好ましくは０容量％～５容量％の範囲内を意味する。
　ここで、「イソプロピルアルコール生産期」とは、菌体増殖が定常状態に達した後にイソプロピルアルコールが生産される期間を指す。前記培養工程では、菌体の増殖状況に応じて、製造開始直後の菌体がほとんど生育しない誘導期と、その後の対数増殖期とに分けられる。本発明において「菌体増殖が定常状態に達する」とは、前記対数増殖期において、前記培養液の抜き取りに伴って抜取られる菌体量と新しく増殖した菌体量とがつりあった状態を意味する。このような菌体増殖が定常状態に達したときには、培養槽内の菌体濃度が一定となる。菌体増殖が定常状態に達するまでの時間は、培養開始時の菌体濃度及び菌の状態、培養液の容量並びに供給される炭素源の濃度によって異なるが、培養開始時の菌体濃度が０．０８ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ、炭素源の濃度が２ｇ／Ｌ、培養液の容量を０．５Ｌとしたとき、一般には培養開始後２４～４８時間となるため、イソプロピルアルコール生産期は培養開始後２４時間以降とすることができ、好ましくは４８時間以降とすることができる。
　菌体増殖条件とは、対数増殖期に達した後に菌体を増殖させるための条件を意味する。即ち、培養槽内の培養系において、少なくとも、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度、前記基質液濃度、及び前記生産物濃度のいずれもが、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖を阻害しない範囲に維持することが必要である。イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度の過剰若しくは死滅数の増大、基質液濃度の過剰、及び生産物濃度の過剰の少なくとも１つが生じた場合には、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖が停滞又は阻害されるため、イソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖を維持することができない。この結果、培養系全体におけるイソプロピルアルコールの生産能が損なわれる。
　前記菌体増殖条件としては、定常状態を維持する観点から、比増殖速度０．０１５／ｈ以上となる条件であることが好ましい。比増殖速度が０．０１５／ｈ以上であれば、イソプロピルアルコール生産大腸菌の菌体密度、基質液濃度及び生産物濃度を簡便に且つ効果的に調整して、培養系内のイソプロピルアルコール生産大腸菌の増殖能を維持できる傾向がある。前記比増殖速度としては、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から、０．０２／ｈ以上であることがより好ましく、０．０２５／ｈ以上であることが更に好ましく、０．０３／ｈ以上であることが特に好ましい。い。また、比増殖速度の上限値はとくに制限されないが、大腸菌の世代時間を考慮すると４／ｈ以下であることが好ましく、１／ｈ以下であることがより好ましく、０．５／ｈ以下であることが更により好ましく、０．２／ｈ以下であることが特に好ましい。なお、上述した好ましい上限値及び好ましい下限値から構成される数値範囲としては、上述したいずれかの上限値と、いずれかの下限値とを組み合わせがものであればよい。
　前記比増殖速度とは、菌体あたりの増殖速度（＝単位菌体質量、単位時間あたりに菌体が増える質量）であり、「発酵工学の基礎」（Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ著、１９８８年、ｐ１４～ｐ１５）に記載されているように定常状態においては式１で表される。本発明における比増殖速度には、この式１を適用する。
　（式１）
　　　μ＝Ｆ／Ｖ
　　　μ：比増殖速度（ｈ－１）
　　　Ｆ：基質液の供給速度（Ｌ/ｈ）≒培養液の抜き取り速度（Ｌ／ｈ）
　　　Ｖ：培養槽中の液量（Ｌ）
　式１により、前記基質液の供給速度及び前記培養液の抜き取り速度としては、培養槽中の液量によって異なるが、例えば培養槽中の液量が１Ｌである場合には、０．０１５Ｌ／ｈ～４Ｌ／ｈとすることができ、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から０．０２Ｌ／ｈ～４Ｌ／ｈであることが好ましく、０．０２５Ｌ／ｈ～１Ｌ／ｈであることがより好ましい。同様に、例えば培養槽中の液量が１ｍ３である場合には、０．０１５ｍ３／ｈ～４ｍ３／ｈとすることができ、イソプロピルアルコールの生産速度を高める観点から０．０２ｍ３／ｈ～４ｍ３／ｈであることが好ましく、０．０２５ｍ３／ｈ～１ｍ３／ｈであることがより好ましい。
　前記培養槽の容量（大きさ）としては、特に制限はなく、物質生産に通常用いられる培養槽が適用可能である。また、培養槽に充填される液の液量は、用いられる培養槽の容量に応じて適宜設定可能である。
　なお、比増殖速度は、イソプロピルアルコール生産期において上記範囲内になっていればよい。イソプロピルアルコール生産期以外の時期における比増殖速度は特に制限されず、上述した範囲と同一であってもよく、異なっていてもよい。上述した範囲と異なる範囲とする場合には、例えば、０．０１５／ｈ以下とすることができる。
　また、定常状態を保つ比増殖速度以外の条件としては、基質液の糖濃度や培養槽内の温度、ｐＨなど挙げられるが、定常状態が維持できれば特に制限はなく、当該業者が容易に類推できる条件でよい。
　本発明において、イソプロピルアルコールの生産期における菌体数に特に制限はないが、イソプロピルアルコールを効率よく生産する観点から、培養槽内での菌総質量は１ｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌ～３０ｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌが好ましく、３ｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌ～２０ｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ／Ｌがより好ましい。「菌体数の維持」とは、所定の菌体数となる定常状態に達した後において、菌体数の変動率が３０％以内であることを意味し、好ましくは２０％以内の変動率であることを意味する。菌体数は、後述するように、分光光度計で６６０ｎｍの波長で測定し、１　ＯＤ６６０＝０．３ｇ－ｄｒｙｃｅｌｌ／Ｌとして算出する菌体濃度を用いることができる。
[規則91に基づく訂正 07.12.2012]　
　本発明に製造方法では、イソプロピルアルコールを生産効率の観点から、好気培養であることが好ましい。本発明において好気培養とは、空気または酸素がある状態で行う培養を意味し、菌体の酸素摂取速度が１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上となる酸素がある状態を指す。酸素摂取速度（ｏｘｙｇｅｎ　ｕｐｔａｋｅ　ｒａｔｅ：ＯＵＲ）とは、単位時間、単位培養液あたりに菌体が消費する酸素の量を示す。ＯＵＲは排ガス分析法によって以下の式２から求めたものを用いる。
　（式２）
　　ＯＵＲ＝７．２２×１０６／Ｖ×（ＱｉＰｉｙｉ／Ｔｉ－ＱｏＰｏｙｏ／Ｔｏ）
　　　　Ｖ：培養槽中の液量（Ｌ）
　　　　Ｑｉ及びＱｏ：空気入り口及び出口における空気流量（Ｌ／ｍｉｎ）
　　　　Ｐｉ及びＰｏ：空気入り口及び出口における空気圧（ＭＰａ）
　　　　Ｔｉ及びＴｏ：空気入り口及び出口における絶対温度（Ｋ）
　　　　ｙｉ及びｙｏ：空気入り口及び出口における酸素のモル分率
　なお上記式２に基づいてＯＵＲを求める際に、空気流量、空気圧、絶対温度の値が空気入り口及び出口で無視できる程度の差しかないときには１カ所での測定値を適用してもよい。また、本発明でいう圧力及び空気圧は、絶対圧力を指す。
　ＯＵＲは、菌体量や菌体あたりの酸素消費量が培養期間において変化するため、通気量、攪拌回転速度、温度、圧力、ｐＨなどによって変動する。従って、ＯＵＲを上述した範囲内に調整するには、空気流量、空気圧等を適宜調整すればよい。当業者であれば、上記式２に基づいて目的とするＯＵＲとなるように適宜調整可能である。
　本発明において、ＯＵＲは１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることが好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることがより好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることがより好ましく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであることが更に好ましい。ＯＵＲが１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上であれば、乳酸や有機酸などの有機酸やエタノールなどの副生物をより少なくでき、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下であれば、二酸化炭素などの副生物をより少なくできる傾向がある。結果として、ＯＵＲが１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下の範囲であれば、副生物の生成量の低減により、イソプロピルアルコール収率やイソプロピルアルコール生産速度が向上する傾向がある。
　前記本発明では、イソプロピルアルコールをより効率よく生産するために、培養時のおける各条件を以下の条件とすることが好ましい：
（１）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～４Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上４／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
（２）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上１／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
（３）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（４）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（５）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．５Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．５／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（６）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（７）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（８）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２Ｌ／ｈ～０．２Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（９）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ～１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（１０）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ～１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
（１１）　培養槽中の液量を１Ｌとしたときに、基質液の供給速度及び培養液の抜き取り速度が０．０２５Ｌ／ｈ～１Ｌ／ｈであり、前記比増殖速度が０．０２５／ｈ以上０．２／ｈ以下であり、ＯＵＲが１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである
　上記（１）の培養条件を、以下のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる：
（ａ）ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ／Ｂ株、
（ｂ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性を不活化した株、
（ｃ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化し、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株、及び
（ｄ）ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性を不活化し、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株。
　また同様に、上記（２）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（３）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（４）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（５）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる。
　また同様に、（６）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（７）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（８）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、（９）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（１０）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができ、上記（１１）の培養条件を、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産に適用することができる。
　前記生産工程で用いられる前記植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
　このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など、並びに、これらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
　本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
[規則91に基づく訂正 07.12.2012]　
　イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及びイソプロピルアルコールを生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
　本発明の培養に際して、ｐＨ、温度条件は特別の制限はなく、例えばｐＨ４～９、好ましくはｐＨ６～８、温度２０℃～５０℃、好ましくは２５℃～４２℃、圧力０～５ＭＰａ、好ましくは０～３ＭＰａの範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。
　培養槽へ供給される基質液は、炭素源となる植物由来原料を含む溶液のみであってもよく、また、炭素源となる植物由来原料を含む溶液と前記培地との混合液であってもよい。より効率的な培養を行うためには、前記植物由来原料を含む培地を基質液として供することが好ましい。本発明では、連続培養が行われる培養槽内の溶液を、単に「培養液」と総称する場合がある。
　培養槽へ供給される場合、基質液における植物由来原料の量は、該原料の溶解度の観点から、炭素源として６０質量％以下とすることができ、イソプロピルアルコール生産性の観点から５質量％～５０質量％とすることができる。
　前記培養液中への気体の通気量は、特に制限はないが、通気攪拌槽で培養し、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ～３．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、好ましくは０．１ｖｖｍ～２．０ｖｖｍである。培養装置の種類により、適したＯＵＲに調整するための通気量は異なるが、例えば気泡塔で培養する場合の通気量の一例として、０．０２ｖｖｍ～１０．０ｖｖｍに調整することが挙げられる。
　なお、本発明のイソプロピルアルコールの製造方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
　前記回収工程では、前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液（以下、「抜取り液」ともいう）から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収する。これにより、抜き取り後の前記生産物を含む培養液から、生産物であるイソプロピルアルコールを回収することができる。
　前記抜取り液中に含まれるイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば、前記抜取り液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの製造方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
　また、前記培養工程は、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養し、該大腸菌を用いてイソプロピルアルコールを生成する工程であってもよい。この場合の回収工程は、気体の供給により前記培養液から揮発したガス中のイソプロピルアルコールを収集するガス状イソプロピルアルコール収集工程と、収集されたガス状イソプロピルアルコールからイソプロピルアルコールを単離する回収工程と、の双方を含む。
　ガス状イソプロピルアルコールの収集方法の例としては、コンデンサーによる冷却凝縮やスクラバーやトラップ管での捕捉、イソプロピルアルコールの吸着能の高いフィルター、例えば活性繊維フィルターなどによる吸着などが挙げられる。収集後にイソプロピルアルコールを単離する回収方法の例としては、前述した回収方法をそのまま利用することができ、収集方法に基づいて適宜選択することができる。
　なお、この形態においては、ガス状イソプロピルアルコールを収集工程と共に、液状イソプロピルアルコールを収集する工程を含めてもよい。この場合には、前記回収工程は、ガス状イソプロピルアルコールのみならず液状イソプロピルアルコールを回収することを含むものであってもよい。
　前記混合物に気体を供給しながらイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養するために適用可能な装置としては、培養槽と、培養槽に連結されて培養槽内の混合液の内部に気体を供給する供給路と、前記培養槽に連結されて培養槽内の気体を回収する回収路を備えてものを挙げることができる。
　このような装置としては、例えば、国際公開第２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
　この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
　また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
　これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に捕捉される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
　また、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、イソプロピルアルコールの前駆体であるアセトンも同時に生産される。得られたアセトンは、公知の方法で精製後に、公知の方法（例えば特許第２７８６２７２号公報記載の方法）を用いることによって、イソプロピルアルコールに変換することが好ましい。これにより、糖原料からイソプロピルアルコールへの変換効率を更に高めることができる。
　図１には、本発明に適用可能な製造装置の一例を示す。なお、図１において、１０は製造装置、１２は発酵槽、４８は基質液槽、５０はポンプ、５４はコントローラ、５６は抜取り液槽、５８はポンプ、６２はトラップ槽である。
　製造装置１０には、菌体及び植物由来原料を収容してイソプロピルアルコールの生産を行うための、通気攪拌槽としての培養槽１２が備えられている。製造装置１０には、空気入り口から空気を培養槽１２の内部に供給するためのマスフローメータ１４と、槽内の空気を排気口から排出するためのコンデンサ１６が備えられている。コンデンサ１６と排気口との間には、槽内圧力計１８及び排ガス分析計２０が連結され、槽内の圧力及び出口の酸素モル分圧をそれぞれ測定可能になっている。また、排気口は、トラップ槽６２の内部に誘導されて、トラップ槽６２の内部に収容されたトラップ液中で開口している。培養槽１２には、温度センサ２２、溶存酸素センサ２４及びｐＨセンサ２６がそれぞれ配置されている。また、培養槽１２には、攪拌機としてのディスクタービン翼２８が配置されており、ディスクタービン翼２８はマグネッティックスターラ４４で攪拌・制御される。
[規則91に基づく訂正 07.12.2012]　
　また、培養槽１２の周囲にはバンドヒータ３８、内部には冷却棒３６が備えられており、冷却棒３６には循環冷却装置４０、冷却水路制御用電磁弁４２が接続されている。培養槽１２の外側には、ｐＨ調整剤を充填した中和剤槽３０が設けられている。中和剤槽３０には天秤３４が備えられている。中和剤槽３０は、ポンプ３２を介して培養槽１２へｐＨ調整剤を供給可能となっている。
　培養槽１２には、全体を制御するコントローラ５４が備えられている。コンロトーラ５４は、温度センサ２２、溶存酸素センサ２４及びｐＨセンサ２６に連結されて、それぞれのセンサから、培養槽１２内の反応液中の温度、ＤＯ（溶存酸素）及びｐＨの各情報が入力可能になっている。また、コントローラ５４は、バンドヒータ３８と冷却水路制御用電磁弁４２に連結されている。コントローラ５４は、各種センサからの情報に応じて、バンドヒータ３８、冷却水路制御用電磁弁４２を作動させて温度を制御すると共に、ポンプ３２を作動によりｐＨ制御するようになっている。
　また製造装置１０には、基質液槽４８及び抜取り液槽５６が備えられている。基質液槽４８及び抜取り液槽５６にはそれぞれ天秤５２、６０が備えられている。基質液槽４８には、基質液が収容されており、ポンプ５０を介して基質液槽４８が培養槽１２に連結されている。基質液は基質液槽４８からポンプ５０を介して培養槽１２へフィードされる。フィードの方法はコントローラ５４の設定により、ｃｈｅｍｏ　ｓｔａｔ、ｐＨ　ｓｔａｔなど各種フィード制御が可能であり、コントローラ５４からの信号により、ポンプ５０が作動する。
　抜取り液槽５６は、ポンプ５８を介して培養槽１２に連結されており、ポンプ５８の作動によって、培養槽１２から培養液が抜き取られ、抜取り液槽５６へ誘導されて収容される。抜取り口は培養槽内で定位置に固定されており、培養槽内の液面が一定となるように制御されている。
　トラップ槽６２には水（トラップ液）が充填されており、気化したイソプロピルアルコールが液化するための所定の温度、例えば５℃に維持されている。通気・攪拌により培養槽１２内に揮発するイソプロピルアルコールは、コンデンサ１６が作動することにより培養槽１２からトラップ槽６２に誘導されて、トラップ槽６２でトラップされる。
　本発明では、イソプロピルアルコール生産期に菌体を安定的に増殖させる条件下で且つ菌体数を維持して連続培養するので、長時間でのイソプロピルアルコールの生産が可能となり、半回分式培養によるイソプロピルアルコールの生産よりも効率よくイソプロピルアルコールを生産することができる。本発明のイソプロピルアルコールの生産性は、例えば、２４０ｈ以上の連続培養が可能となる。この場合、例えば、０．７ｇ／Ｌ／ｈ以上の生産速度が可能であり、好ましくは１．０ｇ／Ｌ／ｈ以上の生産速度が可能となる。
　以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。イソプロピルアルコールを生産する大腸菌についても実施例に使用した菌体に限定されず、イソプロピルアルコールを生産する大腸菌であれば、特に制限はない。
　なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
　［イソプロピルアルコール生産大腸菌の作製］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ　αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９～２３２２１３１に記載されている。
　上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７－４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。
　得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。
　さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号３）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
　なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
　上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号５）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号６）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
　また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号７）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
　上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢと命名した。
　なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
　＜プラスミドｐＩ＊ａ＊ｚの作製＞
　クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
　上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７－４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。
　ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号８）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。
　コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ－５９３のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号１０）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＧＴＡＴＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡ
　作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔｇ（配列番号１１）、及びａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＳａｌＩで消化することで約１．１ｋｂｐのコドン改変イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収して、コドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ－Ｉ＊と命名した。
　プラスミドｐＵＣ－Ｉ＊を制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるＩＰＡｄｈ＊を含むフラグメント、とプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しコドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉ＊と命名した。
　コドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号１３）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＴＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＡＡ
　作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｃｔｇａａａｇａｔｇａａｇｔｇａｔｔａ（配列番号１４）、及びｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｃｔｔｇａｇａｔａａｔｃｇｔａｔａｔｇａ（配列番号１５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩで消化することで約７００ｂｐのコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-Ｉ＊を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩ＊ａ＊と命名した。
　グルコース６リン酸－１－デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇｃｇｇｔａａｃｇｃａａａｃａｇｃｃｃａｇｇ（配列番号１６）、及びｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｃａａａｃｔｃａｔｔｃｃａｇｇａａｃｇａｃ（配列番号１７）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１－デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＩ＊ａ＊を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを回収した。
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｇｉの作製＞
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃａｇｇａａｔｔｃｇｃｔａｔａｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｇ（配列番号１８）、ｃａｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔａｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１９）、ｃａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｃｇｔｃｇａｔａｔｇｔａｇｇｃｃ（配列番号２０）及びｇａｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｔａｃｇｃ（配列番号２１）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１８のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号１９および２０のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号２１のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８と配列番号１９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ－Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２０と配列番号２１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ－Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ－Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ－Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｇｉとした。
　＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ株の作製＞
　作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｇｉを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をＢ株aｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。
　なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｔＲの作製＞
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）、ＧｎｔＲをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＰ０００８１９に記載のエシェリヒア・コリＢ株ゲノム配列の３５０９１８４～３５１０１７９に記載されている。ＧｎｔＲをコードする塩基配列（ｇｎｔＲ）の近傍領域をクローニングするため、ｇｇａａｔｔｃｇｇｇｔｃａａｔｔｔｔｃａｃｃｃｔｃｔａｔｃ（配列番号２２）、ｇｔｇｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇａａｇｇｔａｃａａａａｇａｇａｔａｇａｔｔｃｔｃ（配列番号２３）、ｃｔｃｔｔｔｔｇｔａｃｃｔｔｃａｇｇａｃｇｇｃｃｃａｃａａａｔｔｔｇａａｇ（配列番号２４）、ｇｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｇｃａａｇｇｃｃｇａｔｇｇｃ（配列番号２５）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２２および２５のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２２と配列番号２３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ－Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２４と配列番号２５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ－Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｔＲ－ＬとｇｎｔＲ－Ｒ断片を鋳型に配列番号２２と配列番号２５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ－ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｇｎｔＲ－ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｔＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｔＲとした。
＜プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｄの作製＞
　ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇｎｄ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃｇｃｃａｔａｔｇａａｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｇｔｇｇ（配列番号２６）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｇｔｔｔａｃｔｃｃｔｇｔｃａｇｇｇｇｇ（配列番号２７）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｃｔｇａｔｔｔａａｔｃａａｃａａｔａａａａｔｔｇ（配列番号２８）、ｃｇｇｇａｔｃｃａｃｃａｃｃａｔａａｃｃａａａｃｇａｃｇｇ（配列番号２９）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２６のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有し、配列番号２７および配列番号２８のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有している。また、配列番号２９のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、配列番号２６と配列番号２７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ－Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２８と配列番号２９のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ－Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｄ－Ｌ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで、ｇｎｄ－Ｒ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０１９６１０）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｄをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｄとした。
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株の作製＞
　作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株にプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｄを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株と命名した。
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞　
　作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株コンピテントセルにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｔＲを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株と命名した。
　＜ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
　作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルにプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ　Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリＢ株　ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。
　［実施例１］イソプロピルアルコールの連続培養
　＜前培養＞
　ＬＢ培地（ＤｉｆｃｏＴＭ ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｍｉｌｌｅｒ）を、三角フラスコにフラスコ容量の１／５量入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。オートクレーブ殺菌後の培地に、ＷＯ２００９／００８３７７に記載のエシェリヒア・コリ　ｐＧＡＰＩａａａ／Ｂ株を０．１ｖｏｌ％接種した。３５℃の恒温室にて１６ｈｒ振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。
＜培養＞
　次いで、図１に示される製造装置１０を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽１２は５Ｌ容のものを、基質液槽４８、抜取り液槽５６は２０Ｌ容のものを使用した。トラップ槽６２には、２０Ｌの水を充填し、５℃に保温した。
　表１に示す組成でオートクレーブ殺菌済みの培地７５０ｍＬが入った培養槽に、上記の前培養液３８ｍＬを接種した。培養は常圧、攪拌回転速度７００ｒｐｍ、空気通気量１．０ｖｖｍ、培養温度３０℃、ｐＨ＝７．０（アンモニア水で調整）に制御した。
　表２に示す組成の基質液を培養開始後８時間目までは１１ｇ／ｈでフィードし、それ以降はフィード速度２２．５ｇ／ｈでフィードした。培養槽１２内の培養液の抜き取り速度はフィード速度と同一とし、培養槽１２内の培養液量は７５０ｍＬに制御した。基質液の比重は１ｇ／ｃｍ３であり、定常状態の比増殖速度は０．０３／ｈである。
　なお、培養開始後４８時間目は、菌数をＯＤ６６０による濁度に基づいて測定した場合に菌数が一定状態となったことから、イソプロピルアルコール生産期であると判断された時間である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
　得られた培養液中のイソプロピルアルコール濃度をガスクロマトグラフィーで定法に従って測定した。菌体濃度は分光光度計で６６０ｎｍの波長で測定し、１　ＯＤ６６０＝０．３ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌとして菌体濃度を算出し、これに培養槽内の液量［Ｌ］を積した値を菌体質量［ｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ］として算出した。結果を図２、図３、表３に示す。
　＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
　カラム温度：３５℃７分、１２℃／ｍｉｎで昇温、２４０℃５分、インジェクション温度：２２０℃、検出器温度：２４０℃、検出器：ＦＩＤ、キャリアーガス：窒素、流速：６ｍＬ／ｍｉｎ、スプリットレス
［比較例１］　イソプロピルアルコールの半回分培養
　図１のポンプ５８を停止して抜取らないようにし、それ以外は実施例１と同様に培養を行った。１４４時間目の培養液量は３．８Ｌであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得た。結果を図２、図３、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
　図２及び図３において、黒丸は実施例１、白丸は比較例１を示す。図２より、半回分培養（比較例１）では４８時間目以降、培養槽内の菌体質量は一定であり菌体は増殖していないことがわかる。一方、連続培養（実施例１）では連続的に培養液を抜き取っているにも関わらず４８時間目以降槽内の培養槽内の菌体質量は一定であり、菌体増殖が定常状態に達していることが明らかである。その結果、図３より、半回分培養（比較例１）ではイソプロピルアルコールの生産が９６時間でほぼ止まり、イソプロピルアルコール生産量は５５ｇ／９６ｈであるのに対し、連続培養（実施例１）では、イソプロピルアルコール生産量は７６．６ｇ／９６ｈと半回分培養より生産量が高く、１７４時間でもイソプロピルアルコールを生産し続け、イソプロピルアルコール生産量は１２５ｇ／１７４ｈであった。以上より、半回分培養と比較して連続培養の方が長時間安定的にイソプロピルアルコールを生産できることが明らかである。
［実施例２］
　上記［イソプロピルアルコール生産大腸菌の作製］ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を用いて、実施例１と同様に前培養を行った。次いで、図１に示される製造装置１０を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽１２は１Ｌ容のものを、基質液槽４８、抜取り液槽５６は４Ｌ容のものを使用した。トラップ槽６２には、４Ｌの水を充填し、５℃に維持した。
　表１に示す組成でオートクレーブ殺菌済みの培地５００ｍＬが入った培養槽に、上記の前培養液２５ｍＬを接種した。培養は常圧、攪拌回転速度９００ｒｐｍ、空気通気量２．０ｖｖｍ、培養温度３０℃、ｐＨ＝７．０（アンモニア水で調整）に制御した。ここでは、培養液量が５００ｍＬとなるよう制御した。
　表４に示す組成の基質液を培養開始後８時間目までは５ｇ／ｈでフィードし、それ以降はフィード速度６０．６ｇ／ｈでフィードした。基質液の比重は１ｇ／ｃｍ３であり、定常状態の比増殖速度は０．１２１２／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得た。結果を図４、図５、及び表５、表６に示す。
　また、プラスミドの脱落率を調べるため、ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ寒天培地１と、１００μＬ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ　Ｂｒｏｔｈ寒天培地２を作製し、希釈した培養槽内培養液を塗布し、３０℃にて保温した。２４時間後のコロニー数をカウントした。アンピシリン耐性を持つプラスミドを保持した大腸菌はアンピシリン含有寒天培地でも生育できるが、プラスミドが脱落した大腸菌はアンピシリン含有寒天培地では生育できないことが知られている。これより、各寒天培地におけるコロニー数から、プラスミド脱落率を下記の式３に従って算出した。結果を図６に示す。
（式３）
プラスミド脱落率＝［（寒天培地１でのコロニー数）－（寒天培地２でのコロニー数）]／（寒天培地１でのコロニー数）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 
［実施例３］
　８時間目以降のフィード速度を２３．５ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき定常状態の比増殖速度は０．０４７０／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。
［実施例４］
　８時間目以降のフィード速度を１２．４ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき定常状態の比増殖速度は０．０２４７／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。
［比較例２］
　８時間目以降のフィード速度を７．４ｇ／ｈに変更する以外は実施例２と同様に連続培養を行った。このとき式１から算出される比増殖速度は０．０１４７／ｈであった。実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度と菌体質量を得て、また実施例２と同様にしてプラスミド脱落率を得た。結果を図４、図５、図６、表５及び表６に示す。
　なお表６中、イソプロピルアルコール積算質量とは、記載の運転時間までの単位液量あたりのイソプロピルアルコールの生産量の総和、つまり培養槽内の培養液、抜取られた培養液、トラップ槽に含まれる全イソプロピルアルコール質量の総和を該運転時間における培養槽内の培養液量（ここでは０．５Ｌ）で除した値である。生産速度は、イソプロピルアルコール積算質量から算出した平均イソプロピルアルコール生産速度であり、以下、同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 
　図４、及び図５及び図６において、黒丸は実施例２、白丸は実施例３、黒三角は実施例４、及び白三角は比較例２を示す。
　比較例２（比増殖速度０．０１４７［ｈ－１］）では４８時間目以降、培養槽内の菌体数は維持又は増殖されておらず（図４）、定常状態には至らなかった。また、イソプロピルアルコールの生産は９６時間で停止することが判明した（図５）。このときのプラスミドの脱落率が８０％以上であることが、図６より明らかである（図６参照）。
　一方、比増殖速度が０．０１４７［ｈ－１］より高い条件で培養を行った実施例２～実施例４では、菌体増殖は定常状態に至り、長時間の連続運転が可能であり、イソプロピルアルコールは安定的に生産できた。
［実施例５］
　表７に示す基質液組成に変更、攪拌回転速度を５００ｒｐｍに変更し、それ以外は実施例２と同様に連続培養を行った。
　ＯＵＲの算出には、空気入り口の空気流量はマスフローメータ１４の値を、また出口の空気流量も、酸素消費による減少分は無視できる範囲としてマスフローメータ１４の値を採用した。同様に空気入り口及び出口の空気圧は共に槽内圧力計１８の値を採用した。また空気入り口及び出口における絶対温度は共に槽内の温度センサ２２の値を採用した。空気入り口の酸素モル分率は０．２０９とし、出口の酸素モル分率は排ガス分析計２０の値を採用した。溶存酸素濃度は、槽内の溶存酸素センサ２４の値を採用した。
　本実施例では、空気入り口及び出口の空気流量は１．０Ｌ／ｍｉｎ、空気入り口及び出口の空気圧は常圧、空気入り口及び出口の温度は３０℃とした。ここでは１分ごとに記録した各値を用いて、上述した式２に従って算出した値の２４時間目以降の定常状態の平均値をＯＵＲとした。本実施例の算出ＯＵＲは５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、図９、図１０、表８及び表９に示す。比増殖速度は０．１２００／ｈであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 
［実施例６］
　攪拌回転速度を６００ｒｐｍに変更し、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。
　このとき算出ＯＵＲは１０７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８及び表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２０３／ｈであった。
［実施例７］
　攪拌回転速度７００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１５３ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求め、また溶存酸素濃度を得た。結果を図７、図８、図９、図１１、表８及び表９に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２００／ｈであった。
［実施例８］
　攪拌回転速度８００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１８７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２１０／ｈであった。
［実施例９］
　攪拌回転速度９００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは１９６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求め、また溶存酸素濃度を得た。結果を図７、図８、図９、図１２及び表８及び表９に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２１０／ｈであった。
［実施例１０］
　攪拌回転速度４００ｒｐｍで、それ以外は実施例５と同様に連続培養を行った。このとき算出ＯＵＲは２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例５と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度を得て、算出ＯＵＲに対するイソプロピルアルコール収率、イソプロピルアルコール生産速度を求めた。結果を図７、図８、及び表８に示す。定常状態の比増殖速度は０．１２００／ｈであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 
　低いＯＵＲでは副生物である乳酸が生成する傾向にあるため、イソプロピルアルコール生産速度が低下する傾向にある。また高いＯＵＲでは、グルコースは完全酸化に利用される割合が高くなる傾向にあるため、イソプロピルアルコール収率は低下する傾向にある。
　図７及び表８より、ＯＵＲを２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの範囲に制御することにより、イソプロピルアルコール収率がより一層高くなることがわかる。また、図８及び表８よりＯＵＲを２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの範囲に制御することにより、イソプロピルアルコール生産速度もより一層高くなることが判明した。
　また、図には示さないものの、実施例５～１０のいずれにおいても酢酸生産速度は０．６ｇ／Ｌ／ｈ以下、エタノール生産速度は０．１ｇ／Ｌ／ｈ以下であった。
　また、イソプロピルアルコールの積算質量の経時変化を図９に示す。図９において黒丸は実施例５、黒菱形は実施例７、黒三角は実施例９を示す。
　いずれの実施例の結果から明らかなように、１１日間の連続運転でも、生産速度は低下することなく連続的にイソプロピルアルコールを生産できることがわかる。
　培養槽内の溶存酸素濃度の経時変化を実施例５は図１０に、実施例７は図１１に、実施例９は図１２に各々示す。これにより、培養槽内の溶存酸素濃度が０ｐｐｍであっても、また、溶存酸素濃度が０～１ｐｐｍ付近で変動していても、酢酸生産速度は低く、かつ、イソプロピルアルコールの生産速度は高く維持されており、特に溶存酸素濃度を制御するＤＯ－Ｓｔａｔ法やＢａｌａｎｃｅｄ　ＤＯ－ｓｔａｔ法などの複雑な制御方法を採らなくても副生物の生成を抑制できることが分かった。
　また、図には示さないものの、実施例５～実施例１０において、培養槽内の菌体質量は２４時間目以降一定であり、定常状態に達していた。
［実施例１１］
　基質液の組成を表１０に変更し、基質液を培養開始後８時間目までは５ｇ／ｈでフィードし、それ以降は平均フィード速度４２ｇ／ｈでフィードした。ここでは基質が抜取り液へ流出するのを最小限にするため、ｐＨｓｔａｔ法を採用した。それ以外は実施例２と同様に連続培養を実施した。このときＯＵＲは２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈであった。また実施例１と同様にして、培養液中のイソプロピルアルコール濃度及び菌体質量を得て、また、実施例２と同様にプラスミド脱落率を得た。結果を図１３、図１４、表１１及び表１２に示す。比増殖速度は０．０８３／ｈであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 
　図１３より、培養槽内の菌体質量は２４時間以降一定であり、２４時間目～８４０時間目までの平均菌体濃度は１２ｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌであった。図１４より、発酵条件を最適化することにより３５日間の連続運転が可能となることがわかる。このとき、表１１より、イソプロピルアルコール積算質量は１３１５ｇ／Ｌ／８４０ｈ、生産速度は１．５７ｇ／Ｌ／ｈであった。更に６日目までにおいては２．４０ｇ／Ｌ／ｈ、１０日目までにおいては、２．１５ｇ／Ｌ／ｈという高い生産速度であった。また、図１５より組換え大腸菌のプラスミド脱落率は２７日目までは２０％以下という低い値で、２９日目で４７％、３５日目で７７％であり、長時間プラスミドが保持されていることが判明した。
　このように本発明によれば、イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて連続培養により、簡便に且つ長時間安定的に高い生産効率でイソプロピルアルコールを製造することができる。
　２０１１年８月１１日に出願された日本国特許出願第２０１１－１７６４０２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (4)

  1. 　植物由来原料を含有する基質液を培養槽に連続的に供給し且つ生産物を含む培養液を該培養槽から連続的に抜き取りながら、遺伝子組換えにより導入又は改変したイソプロピルアルコール生産能力を保有するイソプロピルアルコール生産大腸菌を、イソプロピルアルコール生産期に該大腸菌が安定的に増殖する菌体増殖条件で、且つ前記培養槽内の菌体数を維持して、培養することと、
    　前記培養槽内で前記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、イソプロピルアルコールを生産することと、
    　前記培養槽から抜き取られた前記生産物を含む培養液から、イソプロピルアルコール生産大腸菌により生産されたイソプロピルアルコールを回収することと、
    　を含むイソプロピルアルコール製造方法。
  2. 　前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０１５／ｈ以上となる条件である請求項１記載のイソプロピルアルコール製造方法。
  3. 　前記培養を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ～２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの酸素摂取速度で行う請求項１又は請求項２記載のイソプロピルアルコール製造方法。
  4. 　前記菌体増殖条件が、比増殖速度０．０２／ｈ以上となる条件である請求項１～請求項３のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール製造方法。
PCT/JP2012/070377 2011-08-11 2012-08-09 連続培養によるイソプロピルアルコール製造方法 WO2013022070A1 (ja)

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