JP2008533981A - 有益な化合物の微生物産生方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、微生物培養による、好ましくはタンパク質、または二次代謝産物またはバイオマスのようなものの有益な化合物の産生分野に関する。
有益な化合物の産生のための微生物の培養は、典型的には特に培養プロセスの産生フェーズにおいて、少なくとも1種の栄養素が、増殖の制限をもたらす量で培養物に提供される条件下で行われ得る。典型的には、栄養素制限は、培養されている微生物に対する窒素、炭素、または両方の制限をもたらす。
第一の態様において、本発明は、すべての栄養素が全培養期間にわたって過剰に提供される培地において微生物を培養するステップと、培養物を酸素制限条件下に維持するために、好適な量の酸素を培養物に供給するステップとを含む、微生物の培養による有益な化合物の産生方法を提供する。
クロカビ(Aspergillus niger)によるフィターゼの産業的製造
フィターゼを過剰発現するクロカビ(Aspergillus niger)CBS513.88を設計し、および国際公開第98/46772号パンフレットに基づいて構築した。ワーキングセルバンクを、−80℃でおよそ1mLのバイアル中に保管した。
1つのバイアルの内容物を前培養物培地に添加した:バッフル付2L−振盪フラスコ(20g/Lコーンスティープソリッド(Corn Steep Solid)、20g/Lグルコース、pH6.5(NaOHと共に)、300ml培地、121℃で30分間蒸気滅菌)。前培養物を40時間、34℃および220rpmで増殖させた。時間的調節は、当然、振盪フラスコ構成およびバイアル生存度に適用させることができる。
培地は、グルコースおよびマルトデキストリン、ならびに塩画分の混合物から組成されている。塩画分は、国際公開第98/37179号パンフレット、表1、第12ページに適合していた。この表からの偏差は:MgSO4 . 7aq 0.25g/L、CaCl2 . 2aq 0.22g/L、(NH4)2SO4 6g/L、クエン酸 . 1aq 0.2g/L(キレート化剤)であった。培地組成物は、回分および流加について同等であった。グルコース濃度は、それぞれ炭素制限または酸素制限について22.5または45g/Lであり、一方、マルトデキストリンはそれぞれ2.5または5.0g/Lであった。培地を2回の画分で蒸気滅菌し、その1つは糖質および塩化カルシウムを組み合わせていた。培地塩画分のpHは滅菌前は4.5(硫酸)であり、および発酵槽中にこの画分をプールした後にこの同一のpHに制御した(硫酸、アンモニア)。温度を34℃で制御した。空気流は、それぞれ炭素制限または酸素制限について1.0または0.5vvm(体積空気/体積ブロス/分)であった。バイオリアクターを6%種菌比で播種した。操作体積は10Lであった。炭素制限発酵について、DOTは、播種前のブロスのDOTの20%で制御した。用語「DOT」(溶存酸素張力)は、溶存酸素の尺度として定義され、および大気圧の空気と飽和した溶存酸素の割合として表され、すなわち100%DOTは、大気圧で溶解される最大酸素量である。発酵のDOTでの制御は、炭素制限発酵については典型的である。
図1〜図4に見ることができるとおり(グラフ中の各点は個別の定常状態を表す)、酸素制限は、炭素制限とは対照的に、グルコースおよび酸素で明らかにより高いバイオマス収量を提供する。より興味深いのは、低い酸素摂取速度にも関わらず、グルコースおよび酸素での酵素収量がまた増進されている。これは、発酵が酸素制限下で行われるときには、明らかに生産能がより高く、およびより経済的であるプロセスであると言い換えられる。
Claims (12)
- すべての栄養素が全培養期間にわたって過剰に提供される培地において微生物を培養するステップと、培養物を酸素制限条件下に維持するために、好適な量の酸素を培養物に供給するステップとを含む微生物の培養による有益な化合物の産生方法。
- 好適な量の酸素が、OTRが実質的にOURと同等であることを保証するよう培養物に供給される、請求項1に記載の方法。
- 好適な量の酸素が、さらに、OTRが可能な限り高いことを保証するよう培養物に供給される、請求項2に記載の方法。
- OTRが、以下の、攪拌、エアレーション、過圧、進入ガス流中の酸素割合、ブロス重量、総ブロス粘度からなる群から選択されるパラメータの少なくとも1つを調節することにより調節される、請求項2または3に記載の方法。
- 総ブロス粘度が、ブロスの温度を、至適な増殖が生じるレベルより上または下に、摂氏2〜6度間のレベルで変化させることにより調節される、請求項4に記載の方法。
- 総ブロス粘度が、ブロスの温度を、至適な増殖が生じるレベルより上に、摂氏2〜6度間のレベルで昇温させることにより減少される、請求項5に記載の方法。
- 総ブロス粘度が、ブロスの温度を、至適な増殖が生じるレベルより下に、摂氏2〜6度間のレベルで降温させることにより増加される、請求項5に記載の方法。
- 培養物が、産生フェーズ中に酸素制限条件下に維持される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が、糸状微生物であり、好ましくは糸状真菌類である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 得られる有益な化合物が、培養ブロスから回収される、および/または好適な組成物中に配合される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 有益な化合物が代謝生成物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 有益な化合物が、ポリペプチドであり、好ましくは酵素である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
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