CN113614221A - 乳酸杆菌生物转化过程 - Google Patents
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Abstract
一种通过在细胞培养物中培养乳酸杆菌细胞来生产细胞代谢物的方法,包括在生产阶段期间使用包含用于生物转化为细胞代谢物的碳源的补料培养基在好氧反应器***中饲养细胞培养物,并从所述细胞培养物中分离细胞代谢物,以及保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059和DSM 33060的乳酸杆菌菌株,或前述任何菌株的后代或衍生物。
Description
技术领域
本发明涉及培养乳酸杆菌(Lactobacillus diolivorans)产生细胞代谢物的方法,以及新的乳酸杆菌菌株。
背景技术
微生物对小分子的化学修饰通常称为生物转化或生物合成。为生产工业用的材料,人们对生物转化进行了广泛研究。醇类、糖类或有机酸的微生物生产是从可再生碳源(例如,用于聚合物合成的单体)获得最终产品或结构单元化学品(building-blockchemicals)的一种有前景的方法。生物转化过程产生的最常见的化学品有1,3-丙二醇、柠檬酸、乳酸或琥珀酸,以及糖醇,如甘露醇。甘油经生物技术转化为1,3-丙二醇通常是由细菌在厌氧条件下完成的。
Willke等人(Eur.J.Lipid Sci.Technol.2008,110,831-840)综述了不使用化石资源将甘油生物转化为1,3-丙二醇的过程。据报道,梭菌科、肠杆菌科和乳杆菌属的微生物是工业化生产1,3-丙二醇的有希望的候选者。
虽然从可再生资源中用微生物制备有价值的化学品的微生物过程是已知的,但是大多数生产生物依赖于一种或几种碳源,并且大多数已知的生产生物需要高纯度的碳源。因此,碳源是一个主要的成本因素。
WO 2013064682 A2公开了在生物转化过程中使用的乳酸杆菌,其中生物转化过程使用的原材料是有机碳源的复杂混合物,所述有机碳源包含纯度低于工业级的待生物转化的碳水化合物,例如粗甘油。在任何情况下,细胞培养都使用氮气来提供反应器中的厌氧条件。
期望降低在乳酸杆菌(L.diolivorans)细胞培养物中生产细胞代谢物的成本。
乳杆菌(Lactobacilli)已广泛应用于食品和饲料工业。WO2010/122165A1涉及通过共发酵选择的乳杆菌(例如布氏乳杆菌(L.buchneri)、类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)和乳酸杆菌(L.diolivorans))通过生物保藏来生产具有延长保质期的酸面团和焙烤食品的方法。
乳酸杆菌新种(L.diolivorans sp.nov.)(DSMZ 14421,LMG 19667)是从好氧稳定的玉米青贮料中分离出来的,并被鉴定为是一种1,2-丙二醇降解菌(Krooneman etal.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2002,52,639-646)。
WO2006/007395A1和WO2007/103032A2描述了使用包括乳酸杆菌在内的接种物给(甘蔗)青贮料添加细菌添加剂,尤其是为了降低青贮料的干物质含量。
Vivek等人(Bioresource Technology 2016,213:222-230)描述了使用短乳杆菌(Lactobacillus brevis)分离物在厌氧条件下纯甘油和粗甘油至1,3-丙二醇的生物再利用(valorization)。
Jolly等人(Journal of Bioscience and Bioengineering 2014,1182:188-194)公开了在厌氧条件下(吹扫氮气)用罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)从甘油生物合成1,3-丙二醇。
发明内容
本发明的目的是提供适用于在乳酸杆菌细胞培养物中产生细胞代谢物的生物转化过程,该过程简单且成本较低,特别是以高产率获得细胞代谢物。
所述目的通过所要求保护的主题解决,并在本文中进一步阐述。
本发明提供了通过在细胞培养物中培养乳酸杆菌细胞来生产细胞代谢物的方法,包括在生产阶段使用包含用于生物转化为细胞代谢物的碳源的补料培养基(feed medium)在好氧反应器***中饲养细胞培养物,并从所述细胞培养物中分离细胞代谢物。
根据一个具体方面,好氧反应器***不包括或不采用任何能够保护细胞培养物免受氧气供应的任何装置或方法。具体地,好氧反应器***不包括或不使用用于吹扫(或供应或以其他方式主动引入)氮气或任何厌氧气体(特别是空气或氧气以外的气体)的构件。尽管氧气可能存在于补料培养基中,并因此通过在生产阶段饲养细胞培养物而供应给细胞培养物,但结果证明,本文所述的方法不需要任何限制细胞培养物中氧气含量的装置就能以高产率成功地生产生物转化的产物。
具体地,细胞培养在没有防氧保护的情况下进行,例如在生产阶段期间没有厌氧气体供给。具体地,厌氧气体供给低于0.1(体积/体积/分钟(vol/vol/min))。
已经证实,尽管在反应器***中不存在限氧装置,但是本文所述方法中使用的乳酸杆菌细胞培养物通过生物转化碳源成功地产生细胞代谢物。尽管现有技术描述了在生产阶段使用在防氧保护下的生物体(在严格的厌氧条件下),但是发现本文所述的细胞培养物在生产阶段很容易消耗细胞培养物中存在的任何氧气,因此,在没有任何外部措施来限制氧气的情况下原位产生厌氧菌,并且对本文所描述的好氧反应器***中存在的任何这样的氧气都令人惊讶地不敏感,并且仍能够以高产率生产生物转化产物。
具体地,生产阶段细胞培养物中的溶解氧不超过氧饱和液相中溶解氧的80%(氧饱和度为100%),并且可能低于检测极限(根据制造商的说明书,如通过标准分析确定,例如采用发光猝灭的分析法,例如使用VisiFermTM OD Sensor HAMILTON)。在示例性的标准方法中,某些有机颜料(发光体)的发光在氧气存在下猝灭。发光体吸收激发光并通过发射荧光释放一部分吸收的能量。在氧气存在的情况下,能量从激发的发光体转移到氧气。发光体不发射荧光,可测量的荧光信号降低。
具体地,溶解氧在0.1-5%,优选0.1-1%的范围内。
根据一个具体方面,在生产阶段,细胞培养物保持pH值在4至7的范围内,同时温度在25至40℃的范围内。优选地,pH值为约5.7(“约”理解为+/-0.1),温度为约30℃(“约”具体理解为+/-1°)。
根据一个具体方面,生产阶段的持续时间在0.1-200小时的范围内。优选地,生产阶段的持续时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时中的至少任何一个。优选地,生产阶段的持续时间小于180小时,更优选地甚至小于100小时。
根据一个具体方面,包含在补料培养基中的碳源包括一种或多种选自甘油、糖和糖酸的碳水化合物。糖包括己糖和戊糖。优选的己糖是葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖,优选的戊糖是木糖、***糖和核糖。糖的D-形和-形均可使用;此外,糖还可以被衍生化,例如乙酰化。优选的糖酸是糖醛酸,例如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,或这类酸的衍生物,例如甲基葡萄糖醛酸。
根据一个具体方面,补料培养基中包含的碳源选自由以下项组成的组:甘油、粗甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉、生物质水解物、纤维素、木质纤维素、木质纤维素水解物、甜菜提取物、糖蜜、有机酸、有机盐以及任何前述物质的组合,优选地,其中碳源包括纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w)的甘油或碳水化合物。
本文所描述的方法具体采用原材料作为碳源,该原材料包括有机碳源的复杂混合物,所述有机碳源包括待生物转化的一种或多种碳水化合物以及杂质,例如纯度低于工业级的一种或多种碳水化合物。
具体地,原材料是有机碳源的复杂混合物,其包含至少0.1%(w/w),具体地至少0.2%或至少0.25%(w/w)的灰分含量。
具体实施方式中原材料是指选自由以下项组成的组:未加工的甘油(rawglycerol)(本文也称为粗甘油(crude glycerol))、甘蔗、甜菜、淀粉植物、纤维素、半纤维素、木质纤维素(包括木质纤维素植物材料或木质纤维素水解产物)和甲壳素(例如来自壳类水生动物的含有甲壳素的材料)中的。未加工的甘油可以从脂肪酸生产、从生物柴油生产、从生物乙醇生产或肥皂生产中得到。其他原材料可以来自于造纸工业、制糖工业或木材工业的废物流。
具体地,碳源为粗甘油并且在补料培养基中使用的浓度高达90%(w/w),具体地,在饲料中至少为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%(w/w)中的任何一个,优选在40%至60%的范围内,或为约50%。
具体地,粗甘油包含纯度低于工业级的甘油并且包含至少0.1%(w/w),具体至少0.2%或至少0.25%(w/w)的灰分含量。
具体地,粗甘油是作为脂肪酸生产、肥皂生产、生物乙醇生产或生物柴油生产的副产物获得的。
本发明所描述的方法具体产生了目标细胞代谢物。特别地,细胞代谢物不是组成性产生的(或初级代谢物),即支持细菌生长,而是次级代谢物或在培养中加入待生物转化的碳源通过生物合成产生的这种代谢物。
具体地,细胞代谢物为化学物质或低分子量有机分子(小分子)。
具体地,细胞代谢物选自以下项组成的组:1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯、乙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2,3-丁二醇、丁酮、乳酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙醛、3-羟基丙酸、丁酸、戊酸、己酸、己二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2,5-呋喃二甲酸、天冬氨酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、丁二醇、2,3-丁二醇、3-羟基丁内酯、木糖醇、***糖醇、山梨醇、甘露醇、维生素C、核黄素、硫胺素、生育酚、钴胺素、泛酸、生物素、吡哆醇、烟酸、叶酸、3-羟基丁内酯、二氨基己烷和二羟基丙酮。
具体地,化学物质是有机酸或醇;产生的示例性化学品是1,3-丙二醇、乳酸、3-羟基丙酸和甘露醇。
具体地,生物转化甘油(特别是粗甘油),至少产生1,3-丙二醇、3-羟基丙醛和/或3-羟基丙酸中的一种或多种。
具体实施方式涉及的方法,其中
(i)从粗甘油生产1,3-丙二醇;或者
(ii)从粗甘油生产3-羟基丙酸;或者
(iii)从粗甘油生产3-羟基丙醛;或者
(iv)从木质纤维素或木质纤维素生物质水解产物生产乳酸;或者
(v)从甜菜提取物或水解产物生产甘露醇。
根据一个具体方面,在生产阶段期间,将补料培养基连续添加到细胞培养物中。
根据一个具体方面,生产阶段以分批补料模式或连续模式进行。
具体地,在生产阶段之前,使用生长培养基以分批模式进行细胞培养以积累生物质。
具体地,允许生物质积累的生长培养基包含碳源、氮源、硫源和磷酸盐源。通常,这种培养基还包含微量元素、维生素以及氨基酸。
通常,生长培养基包含多于一种的碳源以获得高浓度的生物质,例如,至少5g/L,优选至少7.5g/L,甚至更优选的至少10g/L的生物质。
具体地,生长培养基包含从己糖、戊糖或庚糖中选择的碳源。具体的碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、***糖和甘露糖中的一种或多种。
具体地,生长培养基中的碳源选自原材料,例如选自以下项组成的组:未加工的甘油、淀粉植物原材料水解物或木质纤维素植物原材料水解物。
本发明所描述的具体方法包括:
a)将乳酸杆菌接种到发酵培养基中;
b)在生长培养基中培养乳酸杆菌以积累生物质;
c)在生产培养基中培养乳酸杆菌以产生细胞代谢物或化学物质;和
d)分离和纯化细胞代谢物或化学物质。
在具体的实施方案,发酵培养基可以是生长培养基,和/或在单个批次或分开的批次中采用培养步骤b)和c)。
根据一个具体方面,从未加工的甘油生产1,3-丙二醇的方法包括,
a)将乳酸杆菌接种到以未加工的甘油为碳源的发酵培养基中,
b)在生长培养基中培养乳酸杆菌以积累生物质,
c)在生产培养基中培养乳酸杆菌以生产1,3-丙二醇,以及
d)分离和纯化1,3-丙二醇。
根据一个具体的方面,乳酸是从源自木质纤维素或木质纤维素水解产物的葡萄糖和/或木糖生产的,包括
a)将乳酸杆菌接种到以木质纤维素或木质纤维素水解产物为碳源的发酵培养基中,
b)在生长培养基中培养乳酸杆菌以积累生物质,
c)在生产培养基中培养乳酸杆菌以生产乳酸,以及
d)分离和纯化乳酸。
根据一个具体方面,甘露醇由甜菜的果糖(例如提取物或水解产物)生产的,包括
a)将乳酸杆菌接种到以甜菜提取物或水解产物为碳源的发酵培养基中,
b)在生长培养基中培养乳酸杆菌以积累生物质,
c)在生产培养基中培养乳酸杆菌以生产甘露醇,以及
d)分离和纯化甘露醇。
具体地,本文所描述的方法提供了将细菌直接接种到生长培养基中。发酵培养基可用作生长培养基。
一个具体的实施方案是,将原材料(例如未加工的甘油、木质纤维素或木质纤维素水解产物)上生长的乳酸杆菌分批培养,从而积累生物质,随后以特定的补料速率加料纯化或未纯化的碳源(例如含有碳水化合物,诸如甘油),同时可选地加料或不加料葡萄糖和/或木糖,从而积累细胞代谢物或化学物质,例如1,3-丙二醇或乳酸。
具体地,乳酸杆菌菌株是一种天然菌株,其可以从自然来源分离或以其他方式从菌株群中分离获得。任何此类分离菌株均作为纯菌株提供,而没有可检测的不同来源的细胞。这种分离的菌株不是天然存在的,因此是人工的或人造的。
根据一个具体的方面,乳酸杆菌细胞是分离的天然存在的乳酸杆菌细菌、菌株、其后代或衍生物。
具体地,乳酸杆菌细胞是来自保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或任意前述的后代或衍生物。
具体实施方案涉及源自所选择的菌株的乳酸杆菌,包括DSM 14421菌株(莱布尼兹研究所(Leibniz Institut)DSMZ-德国微生物菌种保藏中心,德国布朗斯维克;(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig)Genbank登录号:AF264701(16S rRNA),例如AF264701.2),与LMG 19667、LMG 19668菌株(LMG来自BCCM/LMG荷兰根特大学(UGent)微生物学实验室(Laboratorium voor Microbiologie,Universiteit Gent(UGent))、G77菌株(CUPV:巴斯克大学收藏(Collección de laUniversidad del Pais Vasco)(西班牙),Journal of Food Protection(2006)69,161-169)、Electronic Journal of Biotechnology Volume 26,March 2017,60-63中描述的KKP 2057p(瓦茨瓦夫达布罗夫斯基农业和食品生物技术研究所,工业微生物保藏中心(Collection of Industrial Microorganism,Waclaw Dabrowski Institute ofAgricultural and Food Biotechnology))、Benef Microbes.2014 Dec;5(4):471-81中描述的菌株1Z相同,例如,使用天然细胞系或重组生产细胞系。
根据一个具体的实施方案,使用基因工程改造的或重组的乳酸杆菌菌株。具体实施方案指的是经过诱变并被选择用于改善生物转化的菌株。
具体地,乳酸杆菌用作基因工程改造的或重组的菌株,例如,将其修饰以生产包括化学物质在内的代谢物,优选加工原材料或废料,例如生产分离的发酵产物。
具体地,可以使用经基因工程改造的或重组的乳酸杆菌菌株,优选经修饰以过度表达同源序列和/或用包含异源序列的载体转化的宿主细胞,所述异源序列是特异性编码和/或非编码序列,例如过度表达同源和/或异源序列。具体地,所述宿主细胞经工程化以增加生物转化产物的产量或效价或生产率,例如,通过过度表达一种或多种形成目标细胞代谢物的基因。
更具体地,改造宿主细胞以增加从未加工的甘油生物转化的1,3-丙二醇的产量和/或宿主细胞的生产率,例如比生产率和/或体积生产率。
例如,宿主细胞经改造成过度表达NADPH-依赖性1,3-丙二醇氧化还原酶。
本发明还提供了乳酸杆菌(L.diolivorans)菌株,该菌株是保藏为DSM 33056、DSM33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或任意前述的后代或衍生物。
具体地,这些菌株的衍生物包含一个或多个突变用于过度表达同源序列和/或用包含异源序列的载体转化细菌以提高细胞代谢物的产量。
这些菌株、后代或衍生物具体用于本文所描述的方法中。
根据一个具体方面,本发明提供了利用乳酸杆菌细胞在细胞培养物中通过好氧补料发酵过程将碳源生物转化为细胞代谢物的方法。
具体地,碳源是纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w),具体地至少0.2%或至少0.25%(w/w)的甘油或碳水化合物。
具体地,本文所描述的乳酸杆菌细胞用于将甘油生物转化为1,3-丙二醇,优选地,其中甘油是生物柴油衍生的未加工的甘油或纯度低于工业级的甘油,并且包含至少0.1%(w/w),具体地至少0.2%或至少0.25%(w/w)的灰分含量。
根据一个具体方面,乳酸杆菌用于加工原材料或废料以生产分离的发酵产物,例如细胞代谢物或化学物质,例如由生物体的(天然的、野生型的或重组的)代谢途径产生的代谢物。
根据一个具体方面,细胞代谢物是通过细菌细胞培养物中碳源的生物转化产生的化学物质,并从细胞培养物或细胞培养物部分纯化。
此类化学品可以是最终产品、工业级化学品或更高纯度的化学品,例如USP级化学品,或用于生产衍生物(包括化学物质、溶剂或聚合物)的中间体。优选的化学品通过制备分离和/或提纯作为纯化的化学品生产,更优选以大规模或工业规模生产。具体地,化学品可以大量生产,称为大宗材料(bulk material)或大宗化学品。还可以生产化学品用作药物成分、杀菌剂和技术应用的特殊化学品。
细胞代谢物可在高浓度下获得。例如,在生产阶段或生产结束时的1,3-丙二醇浓度优选为至少40g/L,更优选至少60g/L,更优选至少80g/L,更优选至少100g/L。
本文所描述方法具体提供了高产率生产。具体地,化学品,例如1,3-丙二醇,以至少40%或50%的高产率生产,具体如下确定。
特别地,产物产率可以基于底物消耗来计算,换言之,用摩尔为基准生产的产物的量除以用摩尔为基准消耗的底物的量,产物产率优选至少为40%,更优选至少为50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%中任何的任何一个。
产物产率可以基于底物供应来计算,换言之,用摩尔为基准生产的产物的量除以用摩尔为基准加料到工艺中的底物的量,产物产率优选至少为40%,更优选至少为50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%中的任何一个。
优选地,细胞代谢物作为高纯度材料生产,具体地,纯度至少为95%,优选的纯度至少为96%,优选的纯度至少为97%,优选的纯度至少为98%,甚至更优选的纯度为99%,最优选纯度为99.5%(w/w)。
优选的纯度等级至少是工业级(通常认为纯度高于97%(w/w)。特别优选地,纯度等级是聚合物级(通常认为纯度高于98%(w/w))。
具体来说,优先考虑的是大规模生产和分离细胞代谢物,例如以工业规模。因此,本文使用的术语“分离”具体指从发酵***中制备分离和纯化足够量的细胞代谢物以供进一步使用。因此,这种制备分离与发酵产物的分析测定相反,发酵产物的分析测定仅用于分析目的。
优选的细胞系在产生细胞代谢物或化学物质(例如1,3-丙二醇)方面表现出最大的体积生产率和比生产率,分别为0.8g/L/h和0.15g/g细胞质量/h。优选的细胞系在产生细胞代谢物或化学物质(例如1,3-丙二醇)方面表现出的平均体积生产率和比生产率,分别为0.5g/L/h和0.1g/g细胞质量/h。
根据一个具体的实施方案,本发明涉及乳酸杆菌在一种一系列的生物转化过程中的用途,例如作为平台微生物,将来自至少两种不同碳水化合物源的原材料的碳水化合物(例如包括不同类型的低纯度碳水化合物)转化形成细胞代谢物或化学物质。已有证据表明所述乳酸杆菌能够忍受在不同的原材料上生长,同时可以利用各种碳源来生长和/或产生细胞代谢物或化学物质。
附图说明
图1为三种乳酸杆菌(DSM 14421;LMG 19668和沃吉尔布施1050(Vogelbusch1050)(保藏于DSM 33056下))菌株的基因组DNA的琼脂糖凝胶的制备。
具体实施方式
在整个说明书中使用的具体术语具有以下含义。
在本文中所使用的术语“好氧反应器***”具体指包含一个或多个反应器的生产单元,包括含有生产细胞培养物的生产反应器(其可以是例如,在补料分批过程或连续过程中使用的流通式反应器,或在批处理过程中使用的封闭容器),即生产阶段期间的细胞培养物。这种生产反应器可以是气密容器。气密容器可以具有一个或多个通风口,以排放待释放的废气并确保容器中积累的压力最小。好氧反应器***具体配备有一个或多个装置,用于将补料培养基引入生产反应器中,以在生产阶段期间饲养细胞培养物;并且分离或收集含有目标细胞代谢物的细胞培养基或上清液。
具体的反应器***提供商业规模的细胞培养。在一些实施方案中,培养物的尺寸为至少约100L,或至少约200L,或至少约500L,或至少约1000L,或至少约10000L,或至少约100000L,或至少约500000L。在一些实施方案中,培养物为约300L至约1000000L。
根据低成本的培养策略,所述细胞系在好氧培养条件下培养,以及任选地采用好氧补料发酵方案。为此,好氧反应器***通常不包括保护细胞培养物免受氧气影响的构件或装置,例如通过吹扫厌氧气体。
当在好氧反应器***中培养乳酸杆菌细胞培养物时,细胞培养物可能仍仅包含在生产阶段细胞培养基中测得的少量可检测的溶解氧,或低于检测极限量的溶解氧。这是因为乳酸杆菌可能具有在生产阶段消耗细胞培养基或饲料中所含氧气的能力。低氧水平通常表示氧的水平低于细胞培养物的氧饱和液相中的水平。低氧水平可以是液相中饱和溶解氧浓度(氧饱和度为100%)在约0.1%至约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%中的任何一个,或者低于检测极限。在一个具体实施方案中,细胞培养基包含例如培养基中约4ppb至约8ppb的溶解氧。
本文所描述的方法具体是指在好氧培养条件下的细胞培养,其与厌氧发酵的特别不同之处在于它使用不包括通风式生产反应器或发酵容器的好氧反应器***,其将引入惰性气体或厌氧气体用于吹扫,或从容器中清除空气(或氧气)。厌氧发酵通常包括将厌氧气体(例如选自氦气、氮气、惰性气体及其组合的气体)引入生产室来完成的净化步骤。这在好氧反应器***中要尤其避免。与厌氧发酵相比,通过避免使用这种通气式生产反应器或发酵容器,生产成本将显著降低。
根据现有技术方法,乳酸杆菌是在防氧保护下,利用氮气进行通风和吹扫,使用厌氧反应器***进行生物转化过程产生细胞代谢物。这是很必要的,因为在归属于乳酸杆菌属的厌氧菌的培养中,由于关键酶甘油脱水酶对氧气高度敏感,因而需要采用有利于厌氧菌增殖的生长条件,尤其是对于生产阶段。
已表明乳酸杆菌可以在好氧反应器***中培养,而无需使用惰性或厌氧气体通风,因此,乳酸杆菌可以在有氧且保持低氧的条件下培养。令人惊讶的是,当根据本文所描述的方法在好氧反应器***中培养时,乳酸杆菌可以承受这种条件。尽管为了防氧保护进行了通风,但生物转化还是非常有效的,并且以高产率产生了目标细胞代谢物。因而,可以提供一种低成本的生产方法,并且可以避免昂贵的通风设备和通风过程。
便利地使用特定的乳酸杆菌菌株,它们是新的分离株并如本文进一步描述的那样保藏,尤其是保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌(L.diolivorans)菌株。
已表明保藏的菌株易于处理,并且出人意料地对氧气不敏感,这意味着它们可以在完全通风的环境中处理,而不会丧失它们的生长或生产能力。在细胞培养中,当在生产阶段产生细胞代谢物时,这种氧不敏感性甚至更令人惊讶,这提供了显著的优势。保藏的菌株在所描述的条件下生长良好,并且易于将药用级或低于工业级的甘油转化为1,3-丙二醇。
本文使用的好氧反应器***可以采用静态发酵或连续发酵***的形式,这种***为本文所描述的方法提供了有利的环境,使得维持目标代谢物的最佳生物转化和合成。在特定情况下,要避免使用惰性气体或厌氧气体来吹扫细胞培养物或清除反应器。
通常,在这类细胞培养中使用的培养基,例如生长培养基或补料培养基能够采用水溶液或浆料的形式,并在不提供厌氧环境的情况下引入反应器。
如本文所使用的,“反应器”可包括发酵罐或发酵单元,或其他任何反应容器,并且术语“反应器”可与“发酵罐”互换使用。例如,生产反应器或生物反应器单元可以执行以下一种或多种,或全部:加料营养物和/或碳源,发酵或细胞培养基的入口和出口流量,分离气相和液相,维持反应温度,维持氧气和CO2水平,维持pH水平,搅动(例如搅拌),和/或清洁/消毒。在好氧反应器***中使用的示例性生产反应器通常不注入合适的惰性气体。例如,反应器***可以在***内包含多个反应器,同时设施内可能包含多个反应器***。在各种实施方案中,反应器可适用于分批、半分批补料、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。合适的反应器可以是多用途的、单一用途的、一次性的或非一次性的,并且可以由任何合适的材料(包括金属合金(例如不锈钢和因科内尔铬镍铁合金(Inconel)、塑料和/或玻璃)制备。
在实施方案中,本文所描述的装置、设施和方法还可以包括任何合适的单元操作和/或其他未提及的设备,例如用于分离、纯化和分离生物合成产物的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境,例如传统的构件式(stick-built)设施,、模块化、可移动的和临时的设施或者其他任何合适的结构、设施和/或布局。此外,除非另有说明,否则本文所描述的装置、***和方法可以在单个位置或设施中安置和/或执行,或者可选择在单独或多个位置和/或设施中安置和/或执行。
合适的培养技术可以包括从分批阶段开始在生物反应器中培养,随后是在高比生长速率下进行短指数补料阶段,接着是在低比生长速率下补料阶段。另一种合适的培养技术可以包括分批阶段,随后是在任何合适的比生长速率或比生长速率的组合下的分批补料阶段,例如,在生产阶段期间从高生长速率变为低生长速率。另一合适的培养技术可以包括分批阶段,随后是低稀释率的连续培养阶段。
如本文所使用的,术语“生物转化”理解为化合物例如有机碳源或碳水化合物向细胞代谢物的细胞生物合成过程。化合物可以由细胞培养物中的细胞进行生物转化。通过细胞培养物产生这种化合物也被称为“体内生产”或“体内生物转化”。据了解,细胞培养物中的这种生物转化是“离体”的,这意味着它不使用高等生物、动物或人类。如本文进一步描述的,在细菌细胞培养物中进行特定的生物转化过程以产生细胞代谢物,例如化学品,特别是本文进一步描述的化学物质。
如本文所使用的,术语“碳源”是指碳底物,特别是可发酵的碳水化合物,例如用于生物转化过程的碳水化合物,具体包括能够被宿主生物或生产细胞系代谢的源碳水化合物。如本文所使用的,术语“碳水化合物”是广义的,例如包括糖、糖酸以及它们的衍生物,例如,符合通式(CH2O)n的多羟基醛或酮以及它们的衍生物。具体包括醛类(例如甘油醛)、酮类(例如二羟基丙酮)和氢化衍生物(例如甘油)。具体包括多元醇,优选的至少三碳多元醇,例如山梨醇、甘露醇或甘油。用作碳源的特定碳水化合物是以纯化的形式或以原材料供应,选自单糖、低聚糖、多糖、多元醇以及它们的衍生物。
如本文所描述的用于生物转化的碳源可以是纯化的碳源或原材料(例如在含有杂质的混合物中包含碳水化合物的碳源),也可以理解为“可发酵碳源”或“可发酵碳水化合物”,因为它是通过发酵生物转化为细胞代谢物。
如本文所使用的,术语“细胞系”是指已获得长期增殖能力的特定细胞类型的既定克隆。术语“宿主细胞系”是指用于表达内源性或重组基因或代谢途径的产物以产生多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物的细胞系。“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常理解为在生物反应器中随时准备用于培养以获得生产过程产物的细胞系。适用的生产细胞系可以通过经发酵处理后的生物质材料糖化产生的低分子量糖类来生产一些有用的中间体和产品。适用的生产细胞系还可以在生产有用的中间体和产品的同时生产必要的酶来糖化处理过的生物质材料。例如,发酵或其他生物过程可以产生醇、有机酸、烃类、氢、蛋白质或任何这些物质的混合物。
如本文所使用的,与乳酸杆菌细胞相关的术语“细胞培养”或“培养”或“培育”是指依据本行业域已知的方法,将细菌细胞维持在人造的环境(例如体外环境中),维持在有利于细胞生长、分化或持续生存的条件下,维持在处于活性或静止状态,特别是处于受控的生物反应器中。
当使用合适的培养基培养细胞培养物时,在适于支持培养细胞培养中的细胞的条件下,将细胞与培养容器中的培养基或底物接触。如本文所描述的,提供了可用于细胞生长的培养基。标准的细胞培养技术是本领域公知的。
如本文所描述的细胞培养物特别使用了通过生物转化生产目标代谢物的技术,例如在细胞培养基中获得能够与细胞生物质分离的产物(本文中称为“细胞培养物上清液”),并且任选地可通过分离和纯化以获得纯度更高的产物。
细胞培养基提供了在受控、人工干预和体外环境中维持细胞存活和细胞生长所必需的营养物质。细胞培养基的特性和组成可以根据特定的细胞需求而变化。重要参数包括渗透压、pH和营养配方。营养物的加料可以根据本领域已知的方法以连续或不连续的方式完成。
分批培养是将培养细胞所需的所有营养物质都包含在初始培养基中,在发酵过程不需要额外供给其他营养物质的细胞培养模式,而在分批补料过程中,在分批培养阶段结束后,通过加料向培养物中供应一种或多种营养物质。尽管在大多数过程中,加料模式是至关重要的,但本文所描述的细胞培养和方法并不限于细胞培养的某种模式。
在某些实施方案中,细胞培养过程采用分批补料过程。
在另一个实施方案中,本文所描述的宿主细胞以连续模式培养。连续发酵过程的特征在于将新鲜培养基以限定的、恒定的和连续的速率加入生物反应器,同时培养液以相同限定的、恒定的和连续的速率从生物反应器中去除。通过将培养基,加料速率和移出速率保持在相同的恒定水平,生物反应器中的细胞培养参数和条件保持恒定。
如本文所描述的稳定细胞培养物是指维持细胞的遗传特性,特别是维持较高的生物合成速率和生产水平,例如甚至在培养约20代后,优选至少30代,更优选至少40代,最优选至少50代以后。具体地,本发明提供了稳定的乳酸杆菌细胞培养物,当用其以工业规模生产目标细胞代谢物时具有巨大的优势。
如本文所使用的,术语“细胞代谢物”或“目标细胞代谢物”是指细胞通过生物转化碳源产生的代谢物,例如,通过代谢途径产生初级或次级代谢物。
通过本文所描述的方法产生的生物转化产物具体是次级代谢物。次级代谢物是指由细胞(例如细菌)产生的有机化合物,它们不直接参与生物体的正常生长、发育或繁殖。与初级代谢物不同,次级代谢物的缺失并不会导致生物体立即死亡,而是会长期损害生物体的生存能力、繁殖能力或美观性,或者可能根本没有显著变化。具体的次级代谢物通常仅限于***发育组内的一组较窄的物种。
如本文所使用的,术语“化学品”是指化学物质或化合物,特别是低分子量的有机分子(称为“有机小分子”),例如用于化学工业、制药工业、农业、化妆品行业、食品行业和饲料行业。
根据本文所描述的方法具体生产的化合物可以包括少量或大量,低纯度或高纯度的化学品,包括大宗化学品、精细化学品和特种化学品。术语包括最终产品,也包括生产衍生物的中间体,例如反应产物,包括用于聚合物合成的单体。
如本文所使用的,术语“粗甘油”也称为“未加工的甘油”,它是来自脂肪酸、生物乙醇或生物柴油生产过程或来自肥皂生产过程的副产物,也称为来源(源自)生物柴油生产的工业甘油。粗甘油可用作原材料或源材料,也可在一些生物技术领域用作碳底物。它含有甘油(通常在40-88%的范围内,例如约50%(w/w),在某些情况下高达95%)以及盐、肥皂和其他杂质,包括水和甲醇。未加工的甘油的典型组成,例如由NOVAOL S.r.l.(意大利米兰)、来自产品中的未加工的甘油提供的从生物柴油生产过程获得的粗甘油,具有以下组成:甘油85-95%(w/w)、有机/无机酸5-10%(w/w)以及0-1.5%(w/w)的甲醇。粗甘油的另一个示例是稀酒糟(thin stillage)(由乙醇蒸馏产生的原料,或从生物乙醇蒸馏中得到的副产品),或浓酒糟(浓缩的稀酒糟,例如通过将稀酒糟蒸发成浓酒糟获得的酒糟)。
特别地,在本文所描述的方法中使用的未加工的甘油是从生物柴油、生物乙醇或脂肪酸生产的废料获得,例如,从不同的种子油原料获得,包括棕榈油、麻风树、芥菜、油菜籽、卡诺拉(canola)、海甘蓝、大豆和废弃食用油。
具体地,粗甘油从脂肪酸、生物柴油、生物乙醇或肥皂的产品中回收,而无需进一步加工,例如,分别从脂肪酸、生物柴油和肥皂中分离得到。尽管如此,术语“粗甘油”还包括经过分馏或加工的粗甘油,例如包括通过过滤、离子交换、化学添加和/或分级减压蒸馏以获得不同商业等级的材料。根据一个具体的实施方案,可以处理粗甘油以中和材料,例如获得范围在6和8之间的pH,优选约为7。从而获得含有脂肪酸的有机相和除杂质外还含有甘油的水相。尽管这种分馏的粗甘油仍然包含纯度低于工业级甘油的甘油,具体含有不需要的灰分,但仍可用作本文所描述的方法中的碳源。
根据某个实施方案,对粗甘油进行巴氏杀菌或灭菌处理,例如,在将其用作生物转化的碳源之前,将粗甘油在121℃下高压灭菌10至100分钟,例如约20分钟。根据另一个实施方案,在将粗甘油用作生物转化的碳源之前,通过将所述材料加热至至少80℃,并持续10至100分钟(例如,约15分钟(“约”是指+/-1或2℃))以进行巴氏灭菌。
工业级甘油的纯度通常大于97%(w/w)。
具体地,用作生物转化碳源的粗甘油的特征在于甘油纯度低于工业级甘油的纯度,例如纯度低于97%,或低于96%,具体地低于95%,更具体地低于94%,更具体地低于93%,更具体地低于92%,更具体地低于91%,更具体地低于90%(w/w)。
具体地,粗甘油使用的特征在于杂质含量,例如通过标准测定确定的灰分。
粗甘油中的灰分含量主要是来自生物柴油生产过程中使用的催化剂中的钠,并且根据油源和生物柴油生产过程的不同,粗甘油中的灰分含量通常在0.25%至5.50%之间,在某些情况下高达8%(Thompson et al.Applied Engineering in Agriculture 2006,Vol.22(2):261-265)。
如本文中所使用的,与乳酸杆菌菌株相关的术语“衍生物”是指通过例如诱变和选择或定向诱变从亲本菌株得到的菌株。
具体地,本文中涉及的乳酸杆菌菌株的衍生物可以通过有限诱变的方法产生,例如,在整个基因组中保持一定的序列相似性,例如至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性中的任一种。
应当理解,通过本文所描述的方法生产的生物转化产物是细胞代谢物或化学物质,或任何前述物质的衍生物,这些衍生物经分离和任选地纯化时方便地产生。细胞代谢物或化学物质的“衍生物”可以具体理解为从生物转化过程的产物中衍生出来的化合物,例如,通过化学、物理或生物合成,包括聚合、乙酰化、甲基化或磷酸化。
如本文所使用的,术语“乳酸杆菌(Lactobacillus diolivorans)”或“乳酸杆菌(L.diolivorans)”是指首先由Krooneman等人(International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology 2002,52,639-646)描述的分离菌株、野生型细菌或其衍生物(例如基因工程改造的生产细胞系)的乳杆菌属的物种。
本文所指的乳酸杆菌的“保藏菌株”如下。
以下乳酸杆菌(L.diolivorans)菌株已在奥地利分离,并由奥利地维也纳的沃吉尔布施有限公司于2019年2月26日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心,布朗斯维克(DE)38124,马斯切罗德韦格(Mascheroder Weg)1b/因荷夫街(inhoffenstraβe)7B。
保藏物涉及乳酸杆菌菌株和培养物,其特征如下。
DSM 33056(又称乳酸杆菌沃吉尔布施1050(Lactobacillus diolivoransVogelbusch1050))的特征如下:该菌株易于处理且对氧气不敏感,这意味着它可以在完全通风的环境中处理而不会丧失生长或生产能力。特别是在甘油与任一种或多种葡萄糖、果糖或甘露糖的混合物中,该菌株具有突出的1,3-丙二醇生产性能。
DSM 33057(又称乳酸杆菌HH)的特征如下:该菌株易于处理且对氧气不敏感,这意味着它可以在完全通风的环境中处理而不会丧失生长或生产能力。特别是在甘油与任一种或多种葡萄糖或果糖的混合物中,该菌株具有突出的1,3-丙二醇生产性。尤其是在甘油和蔗糖混合物中,该菌株是生产1,3-丙二醇性能最好的菌株之一。
DSM 33058(又称乳酸杆菌HM)的特征如下:该菌株易于处理且对氧气不敏感,这意味着它可以在完全通风的环境中处理而不会丧失生长或生产能力。特别是在甘油与任一种或多种葡萄糖、果糖或甘露糖的混合物中,该菌株具有突出的1,3-丙二醇生产性能。
DSM 33059(又称乳酸杆菌HS)的特征如下:该菌株易于处理且对氧气不敏感,这意味着它可以在完全通风的环境中处理而不会丧失生长或生产能力。特别是在甘油与任一种或多种葡萄糖或果糖的混合物中,该菌株具有突出的1,3-丙二醇生产性能。尤其是甘油与木糖的混合物中,该菌株在生产1,3-丙二醇性能上表现最佳。此外,它也在甘油和甘露糖的混合物中表现最佳。
DSM 33060(又称乳酸杆菌HF)的特征如下:该菌株易于处理且对氧气不敏感,这意味着它可以在完全通风的环境中处理而不会丧失生长或生产能力。特别是在甘油与任一种或多种葡萄糖、果糖或甘露糖的混合物中,该菌株具有突出的1,3-丙二醇生产性能。
如本文所使用的,术语“最终产品”是指为进一步制造或工业目的或作为消费品而制造并任选地加工成产品的细胞代谢物或质量可控的化学物质。
如本文所使用的,术语“基因工程改造”是指用于生产发酵产物的重组生物体。该生物体通常是生产细胞系,经工程改造以改进生产过程或能够生产新产品。该术语与“野生型”生物体形成对比,“野生型”生物体通常未经过基因工程改造,在本公开中使用的术语“野生型”通常是指“从天然来源中分离出来的”,例如乳酸杆菌(L.diolivorans)DSM 14424或DSM 14421,或乳酸杆菌(L.diolivorans)LMG 19668,或乳酸杆菌(L.diolivorans)G77,或任何保藏的菌株DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060,包括其任何后代。
如本文所使用的,术语“中间体”是指作为生物转化过程的产物形成的化学物质,其可以从发酵液中分离出来并进一步加工形成衍生物或最终产物。
如本文所使用的,涉及细胞代谢物、化学物质或生物合成或生物转化过程的术语“分离”是指从至少一种杂质中(尤其是通过制备方法)分离或纯化的物质,以获得与环境完全分离的产品(在分离之前,该产品与环境是相关联的),从而以“基本纯净”的形式存在。“分离的”并不一定意味着排除人工的或合成的与其他化合物或材料的混合物,或不干扰基本活性的杂质的存在,例如,由于不完全纯化而可能存在的杂质。
如本文所使用的术语“分离”是指细菌菌株。
如本文所使用的,术语“代谢途径”是指在生物体内发生的生物化学反应,例如,特定化合物的代谢或微生物酶途径产生细胞代谢物,尤其是有机小分子。代谢途径是指细胞内化合物的所有生物合成、修饰和降解途径。代谢工程是指具体通过采用合适的重组技术对微生物的代谢途径进行引入、删除和修饰,其被广泛应用于高效生产所需的代谢产物和生物分子。甚至可以通过宿主细胞的代谢工程获得新的合成产物。
如本文所描述的,术语“诱变”是指具有突变核酸的重组构建体或生物体,从而在非编码区或编码区至少有一个变化的情况下获得其变体。诱变可以通过随机、半随机或定点突变。
如本文所使用的,涉及宿主细胞,特别是重组宿主细胞使用的术语“过度表达”旨在包括将多肽或蛋白质(例如生物转化过程中使用的酶)的表达增加到高于细胞正常产生的水平。该术语旨在包括同源的(内源的)以及异源的序列或蛋白质的过度表达,特别是旨在提高细胞的生产率以产生生物转化产物,例如与相同类型的野生型宿主细胞相比至少1.5倍,优选至少2倍,更优选至少3倍。
如本文所使用的,术语“生产阶段”是指细胞培养产生生物转化产物的某个阶段。生产阶段可以具体地是在生长阶段之后,在生长阶段细胞培养物通过生长细胞来积累生物质。生长和生产阶段的培养可以通过分批、分批补料和连续培养过程便利地进行。适合用作生物转化为细胞代谢物的底物的碳源可以包含在分批补料过程的补料中,例如在碳底物受限的条件下,即在生长受限的条件下和在生产模式中使用有限量的碳源来维持生产细胞系。这种有限的量可用于分批补料过程,其中碳源包含在补料培养基中,并以低补料速率供应给培养物,以用于持续的能量递送,例如,在保持生物质处于低比生长速率下产生生物合成或发酵产物。在细胞培养的生产阶段,通常将补料培养基添加到发酵液中。
如本文所使用的,术语“原材料”具体是指任何复杂的碳源或碳水化合物材料,特别是富含碳水化合物的生物质,包括单体或以聚合形式存在的低纯度碳水化合物,例如来自生物能源作物、工业作物、农业残留物、城市废物、工业废物、庭院废物、木材、秸秆、含有来自壳类动物的残余物的甲壳素。具体的原材料例子有未加工的(粗)甘油、甘蔗、甜菜、淀粉植物、纤维素、半纤维素、木质纤维素、木质纤维素水解产物或甲壳素。
原材料中复杂的碳水化合物混合物通常包含至少两种不同的大量有机碳源,例如,每种碳源的含量至少为2%,具体地至少3%,更具体地至少4%,更具体地至少5%(w/w)。
具体地,本文所描述的方法中使用的原材料,其特点是可发酵碳水化合物含量的纯度低于工业级(工业级纯度>97%(w/w)),例如低于96%,具体地低于95%,更具体地低于94%,更具体地低于93%,更具体地低于92%,更具体地低于91%,更具体地低于90%纯度(w/w)。
具体地,本文所描述的方法中使用的原材料,其特点在于杂质,例如灰分的含量,通过标准方法测定。示例性的标准方法确定有机物点燃后留下的残留物。灰分通常被认为是生物质中矿物含量和其他无机物含量的近似量度。
用于确定原材料(例如粗甘油)中灰分含量的典型的标准方法是重量法,例如描述于国际纯粹化学和应用化学联合会(INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIEDCHEMISTRY),应用化学部(APPLIED CHEMISTRY DIVISION),石油委员会(COMMISSION ONOILS),脂肪和衍生物(FATS AND DERIVATIVES),油类、脂肪及其衍生物分析的标准方法("STANDARD METHODS FOR THE ANALYSIS OF OILS,FATS AND DERIVATIVES"),第6版,第1增补:第2部分(1980),第III节,甘油,由比利时新鲁汶,鲁汶天主教大学A.HAUTFENNE制备出版(6th Edition,1st Supplement:Part 2(1980),SECTIONⅢ.GLYCERINES,Prepared forpublication by A.HAUTFENNE,UniversitéCatholique de Louvain,Louvain-la-Neuve,Belgium)。
根据该方法,测试包括测试部分的燃烧,有机物质的点燃以及残留物的称重。灰分的含量定义为灰分的数量,以质量百分比(n/m)表示。
本文所描述的生物转化方法中具体使用的原材料,其特点是灰分含量至少为0.1%(w/w),具体地至少0.2%或至少0.25%,更具体地至少0.50%,更具体地至少0.75%,更具体地至少1%,甚至更具体地至少为2%(w/w)。
更具体地,所使用的原材料包括纯度低于工业级和有一定杂质含量(如本文进一步所描述的,例如灰分)的可发酵碳水化合物。
具体地,所使用的原材料是粗甘油,其特点是甘油纯度低于工业级甘油的纯度,且含有一定量的杂质(如本文进一步所描述的,例如灰分)。
具体地,如本文所描述的用于将碳源生物转化为细胞代谢物的原材料是从各种来源回收的无需进一步加工的粗材料。尽管如此,术语“原材料”还包括经过分馏或加工的粗材料,例如包括通过过滤、离心、离子交换、化学添加、酶处理和蒸馏(例如分级减压蒸馏)以获得不同商业等级的材料。优选地,在原材料使用前,采用本文所描述的方法进行加工和处理。优选的处理包括巴氏杀菌、灭菌(例如通过高压灭菌),用化学品(例如酸或碱)处理(例如获得6至8的pH,优选约7),或分馏(例如减少不需要的有机酸或醇的含量)。
这种分级分离或加工的粗材料还包含纯度低于工业级的可发酵碳水化合物和不需要的灰分,因此可用作本文所描述的方法中的原材料。
根据某个实施方案,对原材料进行巴氏杀菌或灭菌处理,例如,通过在80℃下热处理10至100分钟(例如,约15分钟(“约”是指+/-1或2℃)),或将材料在121℃下高压灭菌10至100分钟(例如,约20分钟(“约”是指+/-1或2℃))。
具体地,本文所描述的方法包括在向细胞培养物中加入原材料之前对原材料进行灭菌的额外步骤。
在本发明中,术语“序列同一性”表示两种或更多种核苷酸序列在相应位置上具有(在一定程度上,高达100%)相同或保守的碱基对。
基因或基因组核苷酸序列的“百分比(%)同一性”定义为在对齐序列和必要时引入间隙以达到最大百分数的序列同一性后,并在不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分的情况下,候选DNA序列中的核苷酸与候选DNA序列要比较的DNA序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。用于确定核苷酸序列同一性百分比的比对可以在本领域技术范围内以各种方式实现,例如,使用公开可获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所使用的,术语“重组”是指“通过基因工程改造制备的或基因工程改造的结果”。因此,“重组微生物”包含至少一种“重组核酸”。重组微生物可以是通过适当的方法诱变产生的突变体,和/或具体包括表达载体或克隆载体,或它已经被基因工程改造以包含重组核酸序列或重组代谢途径,以在高产率下产生细胞代谢物或者产生野生型细胞(重组前)不能大量产生的新型细胞代谢物。
如本文所描述的,乳酸杆菌出人意料地对好氧培养条件具有耐受性,因此即使没有氮气或其他防护气体,乳酸杆菌菌株也可以通过生物转化以高产率产生细胞代谢物。各种碳源都可以用作生物转化的底物,甚至是那些未加工的材料或废料以及低纯度的材料。因此,所述菌种可以作为生产细胞系,以经济且高效的方式生产生物转化过程的产品。提供了优选使用的特定乳酸杆菌菌株。具体地,乳酸杆菌菌株很容易代谢一系列底物糖或多元醇或其他碳水化合物,以转化(生物转化)为细胞代谢物或化学物质。特别优选的碳水化合物是甘油,尤其是粗甘油。
特别优选的方法包括以下步骤:
(i)对原材料进行纯化和/或灭菌的预处理,
(ii)用于细胞生长和细胞代谢或化学物质的积累的原材料发酵,
(iii)分离细胞代谢物或化学物质,以及
(iv)纯化细胞代谢物或化学物质。
具体地,从未加工的甘油生产1,3-丙二醇的生产工艺包括以下步骤:
(i)对未加工的甘油进行纯化和/或灭菌的预处理,例如,通过pH调整和分馏来分离水相,和/或通过高压灭菌法灭菌,
(ii)发酵未加工的甘油以促进细胞生长和1,3-丙二醇的积累,
(iii)分离1,3-丙二醇,和
(iv)纯化1,3-丙二醇。
具体地,原材料可用于培养乳酸杆菌使生物体生长,以在生物转化过程的制备中增加生物量,并且还可以在生产阶段进一步被使用,例如,作为生物转化的底物或与另一种碳源同时用于生物转化。通常生物质的积累和细胞代谢物的生产是连续或同时进行的。为生长生物体,任选地对原材料进行预处理,例如,去除脂质相,并可补充一种或多种其他碳源,例如葡萄糖、木糖、***糖、果糖、蔗糖或其他。
在特定情况下,通过发酵过程产生大量的一种以上的细胞代谢物,这些细胞代谢物可以被分离和纯化。因此,具体的实施方案涉及通过对原材料的可发酵碳水化合物进行生物转化,特别是在同一发酵过程中产生至少两种不同的细胞代谢物的纯化形式。
待转化的可再生资源包括甘油,例如未加工的(粗)甘油,例如稀酒糟(作为生物乙醇蒸馏的副产品获得的原材料)或浓酒糟(浓缩稀酒糟,例如通过蒸发成浓酒糟获得)。优选的,未加工的甘油在用于发酵过程之前进行处理,例如,通过高压灭菌和分离含有水相的甘油,从而降低脂肪酸的含量。
其他优选的可再生资源包括糖类。糖类的例子是己糖,例如葡萄糖以及戊糖,例如木糖或***糖。葡萄糖的可能来源可以是各种纯化等级的淀粉植物材料或甘蔗或甜菜。
纤维素葡萄糖是另一种优选的碳源。戊糖的优选来源是半纤维素植物材料。具体而言,半纤维素植物材料的纯化程度可以较低。
碳源的转化具体在液相中进行,优选在水相环境中。碳源的转化可以与微生物的生长同时进行,也可以与微生物的生长独立进行。因此,细胞代谢物可以在微生物生长时或在微生物停止生长后或两者同时在培养基中积累。
可以将微生物接种到发酵培养基中,或直接接种到生产培养基或饲料中。其中发酵培养基是为细菌生长提供的培养基,例如生长培养基。
生长和/或生产可以以分批模式、分批补料模式或连续模式适当的进行。
优选的实施方案包括分批培养以提供生物质,然后是分批补料培养以将碳源有效转化为所需产品。用于生物质生产的碳源可以,但不必与生产细胞代谢物的碳源相同。
例如,菌株可以在葡萄糖或木糖上生长以提供生物质,然后加料(未加工的)甘油或者未加工的甘油与葡萄糖,其被转化为1,3-丙二醇。
允许生物质积累的生长培养基通常包括碳源、氮源、硫源和磷酸盐源。通常,这种培养基还包含微量元素、维生素和氨基酸。培养基可以包含或者可以不包含消泡剂。
优选的氮源包括氨;铵盐,例如NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH4)2CO3;硝酸盐,例如NaNO3、KNO3;尿素;氨基酸。
优选的硫源包括硫酸或硫酸盐,例如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaHSO4、MgSO4、MnSO4、蛋氨酸、半胱氨酸。
优选的磷酸盐源包括磷酸或磷酸盐,例如Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4。
其他典型培养基成分包括酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、玉米浆粉或鱼粉。
优选地,培养基中补充有维生素B12。
乳酸杆菌的典型生长培养基包括酪蛋白胨(胰蛋白酶消化物)、肉类提取物、酵母提取物、吐温80(Tween 80)、K2HPO4、乙酸钠(Na-acetate)、(NH4)2H-柠檬酸盐、MgSO4×7H2O、MnSO4×H2O。
乳酸杆菌的另一个典型生长培养基包括K2HPO4、(NH4)2H-柠檬酸盐、KH2PO4、氯化钠、抗坏血酸、乙酸钾、吐温80、MgSO4×7H2O、MnSO4×H2O、CoSO4×7H2O、乳酸钙、DL-丙氨酸、DL-氨基丁酸、甘氨酸、L-组氨酸HCl、L-赖氨酸HCl、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、烟酸、泛酸钙、氰钴胺、对氨基苯甲酸、肌醇、盐酸吡哆醛(pyridoxal HCl)、核黄素、生物素、叶酸和FeSO4×7H2O。
典型的生产培养基包括用于生物转化的碳源,以及糖和任选的维生素。
发酵的补料通常是包含至多50wt%的碳水化合物的碳水化合物溶液。补料速率可以限制产品对细胞生长的抑制作用,因此基于底物供应的高产物产率是可能的。
发酵优选是在微酸性培养基中进行,例如,pH为5.5-6.0,优选地,pH约为5.7(“约”具体理解为+/-0.1)。
典型的发酵时间约为24至180小时,温度在26℃至40℃的范围内,优选地,温度为30℃(“约”具体理解为+/-1°)。
生产细胞系具体用于大规模或工业规模。
具体的生产规模优选采用的体积为至少50L,优选至少1m3,更优选至少10m3,更优选至少100m3,最优选至少500m3。
工业规模的生产条件是指例如在100L至100m3或更大体积的反应器中分批补料培养,并采用典型的数天工艺时间,或在约50-1000L或更大体积的发酵罐中的连续生产工艺,其中稀释率约为0.05-0.15h-1。
合适的培养技术可以包括在生物反应器中的培养,从分批阶段开始,随后是低比生长速率下的分批补料阶段。另一种合适的培养技术可以包括分批阶段,随后是低稀释率的连续培养阶段。
具体地,乳酸杆菌菌株可用于同源发酵过程,其中产生的细胞代谢物或最终产物(可以是细胞代谢物的衍生物)主要是一种化学物质,例如乳酸或乳酸盐。或者该过程可以是异源发酵,其中产生一些其他代谢途径的产物。乳酸杆菌的基因工程改造变体可以包括乳酸杆菌中天然不存在的代谢途径,这允许产生多种细胞代谢物。
在有氧条件下,介导碳源(例如甘油;己糖,例如葡萄糖、果糖、半乳糖或戊糖,例如木糖或***糖)在乳酸杆菌中的生物转化或代谢的可适用的代谢途径,提供了碳源或碳水化合物源向细胞代谢物的有效转化。这样产生的细胞代谢物可以是野生型菌株中代谢途径的典型可忽略的产物。可以通过过度表达参与碳水化合物源转化为所需细胞代谢物的途径,和/或阻断那些导致竞争性副产物合成的途径来设计同源发酵途径。
例如,涉及的具体酶的过度表达是甘油转运蛋白、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和磷酸丙糖异构酶。此外,可以通过敲除、删除或抑制相应的基因来最大限度地减少不需要的副产物(例如琥珀酸盐、乙酸盐和乙醇)的合成。
具体的例子涉及在分批补料阶段用野生型乳酸杆菌将葡萄糖和甘油发酵成1,3-丙二醇,例如,生物质在葡萄糖上生长时积累,在加料甘油时开始发酵。
另一个具体的例子涉及在分批补料阶段用野生型乳酸杆菌将葡萄糖和甘油发酵成1,3-丙二醇,其中生物质是在有甘油存在的情况下在葡萄糖上生长时积累,并在加料甘油和葡萄糖时开始发酵。
另一个具体的例子涉及用野生型乳酸杆菌将木糖和甘油发酵成1,3-丙二醇,例如,用木糖作为生长生物质的分批培养基,用甘油作为补料培养基来启动生物转化过程。
根据另一个具体的例子,野生型乳酸杆菌用葡萄糖和未加工的甘油进行分批培养,在分批培养基中同时使用葡萄糖和粗甘油来生长生物质并实现甘油到1,3-丙二醇的生物转化。
另一个例子涉及在分批阶段用葡萄糖培养野生型乳酸杆菌,使其生长生物质并将葡萄糖生物转化为乳酸。
然而,另一个例子涉及在分批阶段用木糖培养野生型乳酸杆菌,使其生长生物质并将木糖生物转化为乳酸。
进一步表明,在分批阶段可以用***糖发酵野生型乳酸杆菌,使其生长生物质并将***糖生物转化为乳酸。
根据另一个例子,在分批阶段用果糖发酵野生型乳酸杆菌,使其生长生物质,并将果糖生物转化为甘露醇。
根据进一步的实施例,
a、1,3-丙二醇可由工业甘油(粗甘油;来自脂肪酸、生物柴油、生物乙醇或肥皂生产的副产品)中的葡萄糖和/或甘露糖以各种混合物生产。1,3-丙二醇的生产并不局限于使用粗甘油作为原材料,也可以使用粗甘油和稀酒糟(由酒精蒸馏或浓酒糟(稀酒糟蒸发成浓酒糟))的混合物作为原材料进行生产。
b、3-羟基丙酸可以作为另一种化学物质生产,使用的原材料如粗甘油,粗甘油与稀酒糟或浓酒糟的混合物中的任意。
c、乳酸可以作为另一种化学物质生产,使用的原材料包括粗甘油,粗甘油和稀酒糟的混合物,浓酒糟或木质纤维素生物质水解物(芒草水解物(Miscantus hydrolysate))中的任意。
d、使用粗甘油为原材料,可以生产3-羟基丙醛作为另一种化学物质。
描述了采用表达构建体的乳酸杆菌LMG 19668的重组菌株,例如包含内源性遗传元件的质粒,包括用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶的乳酸杆菌基因的启动子和从乳酸杆菌的内源性质粒中分离的复制起点。重组的乳酸杆菌LMG 19668已经被工程改造为过度表达1,3-丙二醇氧化还原酶。因此,可以提高生物转化和1,3-丙二醇生物合成的产率。
根据一个具体的实施方案,对乳酸杆菌菌株进行诱变和/或选择程序,例如获得具有改善生产力,改善底物范围,改善产物或底物耐受性,改善产物范围或改善甘油摄取率的菌株。
优选的诱变方法包括将乳酸杆菌与诱变物质(例如亚硝基胍(NTG)、5-溴-脱氧尿苷(5BU)、甲烷磺酸乙酯(EMS)、甲烷磺酸甲酯(MMS)或二乙基硫酸酯(DES))接触。另一种优选的诱变方法包括对乳酸杆菌的培养物进行紫外线照射。
优选的选择方法包括将细菌培养物铺在显示选择性压力选项的琼脂板上。例如,选择可以是将细菌培养物铺在含有增加量的产物或底物杂质的琼脂板上,以选择对产物或底物杂质表现出增加耐受性的菌株。另一种选择所需细菌菌株的优选方法包括通过流式细胞仪的分选程序。
根据一个具体的方面,乳酸杆菌(L.diolivorans)菌株是经过基因工程改造的,例如生物体的自然基因设置已经被改变。
这包括,例如:
●生物体中天然存在的基因的缺失、失活或衰减
●生物体中天然存在的基因的过度表达
●生物体中天然存在的基因的突变
●生物体中天然不存的基因的添加或表达
●或它们的任意组合。
乳酸杆菌(L.diolivorans)的基因工程改造的具体方法包括:
●提供重组的DNA片段,和/或
●用所述DNA片段对生物体进行转化。
一般而言,本文所提到的重组核酸或生物体可以通过本领域技术人员熟知的重组技术产生。根据本发明,可以采用本领域技术中的分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在例如Maniatis,Fritsch&Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1982)中有详细解释。
用于乳酸杆菌基因工程改造的DNA片段的例子包括质粒、线性DNA片段,例如PCR产物,以及本领域熟知的其他。具体的质粒包含天然乳酸杆菌质粒的复制起点、天然启动子、可选择的标记和目的基因的表达盒。可用于工程改造细胞系的核苷酸序列可从多种来源获得,如本文所描述的方法中使用的核苷酸序列,将提供改进的生物转化过程。启动子的来源优选是来自乳酸杆菌DSM 14421、DSM 33056、DSM33057、DSM 33058、DSM 33059、DSM 33060、LMG 19668或G77的基因组DNA。
启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何合适的DNA序列,并且可以来自编码与宿主同源或异源的蛋白质的基因。启动子优选来自编码与宿主细胞同源的蛋白质基因。启动子可以是内源性启动子或者异源于宿主细胞。
适用于原核宿主细胞的启动子序列可以包括但不限于从乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、肠杆菌属(Enterobacteria sp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、酒球菌属(Oenococcus sp.)中获得的启动子。启动子不限于任何特定物种,条件是它们可以在原核宿主细胞,特别是在乳酸杆菌中发挥作用。
用于细菌宿主细胞的其他合适的启动子序列可以包括但不限于从编码代谢酶的基因中获得的启动子,这些代谢酶已知以高浓度存在于细胞中,例如,糖酵解酶,如甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸果糖激酶或烯醇酶。
在优选的表达***中,启动子是诱导型或组成型启动子。
合适的表达载体通常包含适合在原核宿主细胞中表达编码异源多肽或蛋白质的DNA的调控序列。调控序列的例子包括启动子、操作子和增强子、核糖体结合位点以及控制转录和翻译起始和终止的序列。调控序列可以与将要表达的DNA序列可操作地连接。例如,如果启动子控制编码序列的转录,那么启动子序列就称为与编码序列可操作地的连接。
优选的方法采用质粒,其为pSHM。表达载体可以包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体和具体设计的质粒。用于生产重组乳酸杆菌的优选表达载体可以是任何适合在细菌宿主细胞中表达重组基因的表达载体。重组表达载体可以是任何能够在宿主生物体的基因组中复制或整合的载体。
优选地,使用源自野生型乳酸杆菌的质粒作为表达载体。
为了允许重组核苷酸序列在宿主细胞中表达,表达载体可以为重组核苷酸序列提供与编码序列5’端相邻的功能性启动子。因此,转录是由这个启动子序列调节和启动的。
根据具体的实施方案,重组构建体是通过将相关基因连接到载体上获得的。这些基因可以稳定地整合到宿主细胞基因组中,或作为游离型质粒(episomal plasmid)进行复制。载体可以通过转化转移到宿主细胞中。微生物摄取重组DNA片段的优选转化方法包括化学转化、电穿孔或通过原生质粒转化。转化体可以通过将这样的载体DNA(例如质粒DNA),引入到宿主中,并选择以高产率表达相关蛋白质或宿主细胞代谢物的转化体来获得。
基因编码的多肽可以使用重组宿主细胞系通过培养转化体生产,从而在合适的培养基中获得,从培养物中分离出表达的产物或代谢物,并任选地通过合适的方法进行纯化。
使用本文所描述的菌株和方法生产一种或多种细胞代谢物有几种优选的方法。可以通过用具有携带编码相关蛋白质和至少一种上述调节元件的重组DNA的表达载体转化细菌生物体,制备转化生物体的培养物,生长培养物并发酵碳水化合物源以回收生物转化过程的产物,来表达、加工和分泌物质。
优选的宿主细胞系可以稳定地保持其遗传特性,并维持高生产水平,例如即使在大约20代培养之后,优选至少30代,更优选至少40代,最优选至少50代,生产水平至少在μg级保持不变。稳定的宿主细胞被认为是工业规模生产化学品时的一大优势。
通过本文所描述的方法或菌株产生的细胞代谢物或化学物质可以使用现有技术进行分离和纯化,包括提高所需细胞代谢物或化学物质的浓度和/或降低至少一种杂质的浓度。
以下的分离和纯化方法是优选的,特别是对于制备性分离:蒸馏、色谱法、结晶、过滤、离心、倾析、再沉淀或电渗析。细胞代谢物或化学物质可以例如从使用离心机澄清的发酵肉汤中获得。
可以生产出高度纯化的产品,该产品基本上不含污染性蛋白质,并且其纯度优选至少为90%,更优选至少为95%,或甚至至少为98%,高达约100%。纯化的产物可以通过纯化细胞培养物上清液或从细胞碎片中获得。
分离和纯化产物可以通过常规方法,例如HPLC、GC、MS、NMR、红外光谱进行鉴定。
参考以下实施例将更加充分地理解前述描述。然而这些实施例仅代表实践本发明的一个或多个实施方案的方法,并且不应被理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1:用于分离和培养乳酸杆菌的MRS-培养基的制备:
表1:MRS培养基
加入30g/L所需的碳源(通常是葡萄糖),如果需要,另外加入10g/L甘油。对于固体培养基,加入20g/L的琼脂。用浓盐酸(HCl)将培养基的pH值调整到5.7。然后将培养基进行无菌过滤或高压灭菌。
实施例2:用于分离乳酸杆菌的OS-培养基的制备:
表2:OS培养基
用浓盐酸(HCl)将培养基的pH值调整到5.5。然后将培养基高压灭菌。随后加入40g/L的葡萄糖,作为单独高压灭菌的10倍稀释液。
实施例3:乳酸杆菌的利福平(Rifampicin)选择:
乳酸杆菌(L.diolivorans)DSM14421在5ml MRS培养基(葡萄糖+甘油)+0.03125μg/ml利福平在无菌玻璃培养皿中培养过夜,在厌氧罐中于30℃振荡(180rpm)。这个量的利福平明显抑制了乳酸杆菌的生长。将细胞在MRS琼脂平板(MRS培养基+葡萄糖+1.5%琼脂)划线(streaked),并在厌氧罐中30℃培养3天。单菌落重新划线,再次在MRS琼脂平板上培养,然后接种到液体MRS培养基(+葡萄糖)中,使用Quiagen DNeasy Blood&Tissue Kit(货号/ID:69504)进行质粒分离。发现一个克隆(命名为乳酸杆菌(L.diolivorans)沃吉尔布施1050,保藏于DSM 33056),与亲本克隆(DSM 14421)相比,其DNA模式明显不同,如图1所示。
实施例4:分离新的乳酸杆菌菌株:
6份玉米青贮料样品,5份草料青贮料样品,两份来自奥地利不同地区的山地草药(mountain herbs)样品以及一份由扁豆和大米制成的发酵面团样品被用于细菌分离。为此,将30g(干重)的每种样品悬浮在含有100ml无菌0.9%NaCl溶液的摇瓶中。振荡两分钟后,使用无菌0.9%NaCl溶液将上清液稀释至10-9的系列稀释液。取每种稀释液100μL铺展到MRS和OS平板上,其中两种平板都含有50mg/L的万古霉素。平板在厌氧条件下培养3天,培养结束后,根据形态学上的表现来选择菌落。只选取边缘清晰、凸起、光滑、有光泽、不透明且无色素的小菌落(1-4mm),并在分离出它们的同类平板上重新划线。将平板在30℃的厌氧罐中培养3天,罐中添加了赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的OxoidTM AnaeroGenTM2.5L小药囊(Sachet),然后使用MALDI Biotyper(布鲁克公司(Bruker))通过MALDI-TOF质谱法进行物种分析。培养后立即进行鉴定,以便分析新鲜培养物并提高光谱的质量。为了制备HCCA基质溶液,将250μL标准溶剂(OS-溶液)加入到一管分装的HCCA未溶解基质(布鲁克公司,Nr.8255344)中。在室温下通过涡旋溶解HCCA基质,直到溶液变澄清。为了进行鉴定,将单个菌落的少量样品直接铺在MALDI靶板上的一个斑点上。斑点用1μL的70%甲酸(FA)覆盖,并在室温下晾干。然后,用1μL的HCCA溶液覆盖斑点并在室温下干燥。随后,在MALDI生物检测仪上使用细菌测试标准模式(BTS)对制备的目标物进行测量。在送去分析的大约786个菌落中,可以鉴定出579个,其中4个菌株被鉴定为乳酸杆菌。
这些菌株分别被命名为保藏号为DSM 33060的乳酸杆菌,保藏号为DSM33058的HM,保藏号为DSM 33057的HH和保藏号为DSM 33059的HS。
实施例5:利用乳酸杆菌(Lactobacillus
liolivorans)沃吉尔布施1050将葡萄糖
和甘油厌氧共发酵成1,3-丙二醇。
表3给出使用乳酸杆菌沃吉尔布施1050(保藏于DSM 33056下)将葡萄糖和甘油共同发酵将甘油转化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的情况。发酵以分批补料法进行,使用补充有5mg/L的维生素B12,30g/L的葡萄糖和10g/L的甘油的700ml MRS培养基作为分批培养基(见实施例1),使用补充有5mg/L的维生素B12和甘油浓度为500g/L的葡萄糖/甘油溶液(0.1mol葡萄糖/1mol甘油)作为补料培养基。从分批培养基中消耗葡萄糖和甘油后开始补料(t=20h)。使用2.4mL/h的起始速率将补料培养基添加到培养物中。按照式1不断降低补料速率,直至过程结束(t=188h)。
补料[ml/h]=0.0106*t[h]-2.61
式1
在整个过程中,用8M氢氧化钠(NaOH)将pH值调整至5.7。在发酵过程中使用氮气(N2)进行充气(2L/h),以避免氧气的污染和二氧化碳的积累。
表3:在分批补料过程中使用乳酸杆菌沃吉尔布施1050共发酵葡萄糖和甘油,将甘油转化为1,3-丙二醇(1,3-PD)
1,3-丙二醇的产率为62.8wt%(g 1,3-丙二醇/g甘油总量)和70.0wt%(g 1,3-丙二醇/g使用的甘油),并获得了滴度为81.1g/L的1,3-丙二醇。最大比生产率为每克生物质7.2g/L。
实施例6:在无氮气吹扫下,使用乳酸杆菌(Lactobacillus
liolivorans)沃吉尔
布施1050将葡萄糖和甘油共发酵成1,3-丙二醇。
表4给出了在没有氮气吹扫的情况下,使用乳酸杆菌沃吉尔布施1050(保藏于DSM33056下)将葡萄糖和甘油共发酵以将甘油转化为1,3-丙二醇(1,3-PD)。发酵以分批补料法进行,使用补充有5mg/L的维生素B12,30g/L的葡萄糖和10g/L的甘油的700ml MRS培养基作为分批培养基(见实施例1),使用补充有5mg/L的维生素B12和甘油浓度为500g/L的葡萄糖/甘油溶液(0.1mol葡萄糖/1mol甘油)作为补料培养基。当分批开始时,溶解氧值为80%(氧饱和度为100%)。溶解氧浓度连续下降16h达到0%(检测不到)。从分批培养基中消耗葡萄糖和甘油后开始补料(t=28h)。使用2.4mL/h的起始速率将补料培养基添加到培养物中。按照式1(见实施例5)不断降低补料速率,直至过程结束(t=185h)。在整个过程中,用8M氢氧化钠(NaOH)将pH值调整至5.7。培养物中没有任何吹扫气体。
1,3-丙二醇的产率为62.4wt%(g 1,3-丙二醇/g甘油总量)和69.6wt%(g 1,3-丙二醇/g使用的甘油),并获得了滴度为80.4g/L的1,3-丙二醇。最大比生产率为每克生物质7.9g/L。这些数值与传统工艺中使用氮气吹扫获得的数值非常相似(实施例5)。
表4:在没有氮气吹扫的情况下,于分批补料过程中使用乳酸杆菌沃吉尔布施1050
将葡萄糖和甘油共发酵以将甘油转化为1,3-丙二醇(1,3-PD)。
令人惊讶的是,该菌株在有氧条件且没有任何氮气吹扫下生长良好并产生1,3-丙二醇。滴度和产率相当(80.4g/L,相比于使用氮气吹扫时为81.1g/L;62.4%,相比于使用氮气吹扫时为62.8%)。特别令人惊讶的是,无氮气吹扫时的最大比生产率为每克生物质7.9g/L要高于有氮气吹扫时的最大比生产率(每克生物质7.2g/L)。
实施例7:乳酸杆菌(Lactobacillus
liolivorans)新分离株对不同糖类和甘油的
共发酵
表5给出了用新分离的乳酸杆菌菌株将葡萄糖、木糖、果糖、***糖、甘露糖或蔗糖分别与甘油共同发酵的情况。发酵是在玻璃试管(glass eprouvettes)中以分批法进行,使用补充有0.005mg/L的维生素B12,30g/L的相应的糖和10g/L的甘油的2ml MRS培养基作为分批培养基(见实施例1)。将试管(eprouvettes)在30℃的厌氧罐中振荡培养72h,然后用HPLC分析培养物上清液。其中厌氧罐补充有来自赛默飞世尔科技公司的OxoidTMAnaeroGenTM 2.5L小药囊。
表5:在具有指定碳源的MRS培养基上发酵72h后,1,3-丙二醇的浓度
所有的菌株在葡萄糖和甘油上生产1,3-丙二醇的效率相同。非常有趣的是在蔗糖和甘油上有明显差异。虽然沃吉尔布施1050(保藏于DSM 33056下)、HF(保藏于DSM 33060下)、HM(保藏于DSM 33058下)的效率较低,但菌株HS(保藏于DSM 33059下),特别是HH(保藏于DSM 33057下)在蔗糖和甘油上也能高效生产1,3-丙二醇。菌株HS(保藏于DSM33059下)在木糖和甘露糖上特别有效。所有的菌株都在***糖上生长,但它们在***糖和甘油上没有积累大量的1,3-丙二醇。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.通过在细胞培养物中培养乳酸杆菌细胞来生产细胞代谢物的方法,包括在生产阶段使用包含用于生物转化为细胞代谢物的碳源的补料培养基在好氧反应器***中饲养细胞培养物,并从所述细胞培养物中分离细胞代谢物;其中乳酸杆菌细胞是保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述好氧反应器***不采用使细胞培养物免受氧气的构件。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中包含在补料培养基中的碳源选自由以下项组成的组:甘油、粗甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉、生物质水解产物、纤维素、木质纤维素、木质纤维素水解产物、甜菜提取物、糖蜜、有机酸、有机盐以及前述项的任何组合。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述碳源包括纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w)的碳水化合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述细胞代谢物选自由以下项组成的组:1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-羟基丁酸酯、聚3-羟基丁酸酯、乙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2,3-丁二醇、丁酮、乳酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙醛、3-羟基丙酸、丁酸、戊酸、己酸、己二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2,5-呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、丁二醇、2,3-丁二醇、3-羟基丁内酯、木糖醇、***糖醇、山梨醇、甘露醇、维生素C、核黄素、硫胺素、生育酚、钴胺素、泛酸、生物素、吡哆醇、烟酸、叶酸、3-羟基丁内酯、二氨基戊烷、二氨基己烷和二羟基丙酮。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述生产阶段以分批补料模式和连续模式进行,优选地,其中所述补料培养基在生产阶段期间被连续添加到细胞培养物中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中在生产阶段之前,使用生长培养基以分批模式进行细胞培养以积累生物质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中乳酸杆菌细胞是天然存在的乳酸杆菌细菌、其后代或衍生物。
9.乳酸杆菌菌株,所述菌株是保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
10.根据权利要求9所述的乳酸杆菌菌株,其中所述衍生物包含一个或多个突变,所述突变用于过度表达同源序列和/或用包含异源序列的载体转化细菌,以提高细胞代谢物的产量。
11.乳酸杆菌细胞在细胞培养物中通过好氧补料发酵过程将碳源生物转化为细胞代谢物的用途。
12.根据权利要求11所述的用途,其中所述碳源是纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w)的甘油或碳水化合物。
13.根据权利要求12所述的用途,在用于将甘油生物转化为1,3-丙二醇中,优选地,其中甘油是生物柴油衍生的粗甘油。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的用途,其中乳酸杆菌细胞是保藏为DSM33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
1、将原权利要求9合并到权利要求1中,删除原权利要求9,其余地方作适应性修改。
根据PCT第19(1)条的声明
修改后的权利要求不同于现有技术至少在于:使用了保藏为DSM 33056、DSM33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌(Lactobacillus diolivorans)特定菌株中的任一种。令人惊讶的是,保藏的乳酸杆菌菌株对氧不敏感,这意味着它们可以在完全通风的环境中处理且不会失去生长或产生代谢物的能力。
现有技术乳酸杆菌(L.diolivorans)菌株的培养,例如在WO2013/064682A2中公开的菌株DSM 14421,采用厌氧或微厌氧条件,特别是在氮气吹气下。Pflügl等人(Bioresource Technology 2012,119:133-140)描述了乳酸杆菌DSM 14421的培养在厌氧条件下用氮气吹气。在微需氧或需氧条件下用氧气吹气得到较低的产物浓度并且不太优选。
Arasu等人(Journal of the Science of Food and Agriculture 2014,94(12):2429-2440)公开了从青贮料中回收的高细胞密度乳酸杆菌菌株产生乳酸。
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.通过在细胞培养物中培养乳酸杆菌细胞来生产细胞代谢物的方法,包括在生产阶段使用包含用于生物转化为细胞代谢物的碳源的补料培养基在好氧反应器***中饲养细胞培养物,并从所述细胞培养物中分离细胞代谢物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述好氧反应器***不采用使细胞培养物免受氧气的构件。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中包含在补料培养基中的碳源选自由以下项组成的组:甘油、粗甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉、生物质水解产物、纤维素、木质纤维素、木质纤维素水解产物、甜菜提取物、糖蜜、有机酸、有机盐以及前述项的任何组合。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述碳源包括纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w)的碳水化合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述细胞代谢物选自由以下项组成的组:1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-羟基丁酸酯、聚3-羟基丁酸酯、乙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2,3-丁二醇、丁酮、乳酸、柠檬酸、丙酸、3-羟基丙醛、3-羟基丙酸、丁酸、戊酸、己酸、己二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2,5-呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、丁二醇、2,3-丁二醇、3-羟基丁内酯、木糖醇、***糖醇、山梨醇、甘露醇、维生素C、核黄素、硫胺素、生育酚、钴胺素、泛酸、生物素、吡哆醇、烟酸、叶酸、3-羟基丁内酯、二氨基戊烷、二氨基己烷和二羟基丙酮。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述生产阶段以分批补料模式和连续模式进行,优选地,其中所述补料培养基在生产阶段期间被连续添加到细胞培养物中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中在生产阶段之前,使用生长培养基以分批模式进行细胞培养以积累生物质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中乳酸杆菌细胞是天然存在的乳酸杆菌细菌、其后代或衍生物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中乳酸杆菌细胞是保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
10.乳酸杆菌菌株,所述菌株是保藏为DSM 33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
11.根据权利要求10所述的乳酸杆菌菌株,其中所述衍生物包含一个或多个突变,所述突变用于过度表达同源序列和/或用包含异源序列的载体转化细菌,以提高细胞代谢物的产量。
12.乳酸杆菌细胞在细胞培养物中通过好氧补料发酵过程将碳源生物转化为细胞代谢物的用途。
13.根据权利要求12所述的用途,其中所述碳源是纯度低于工业级并且灰分含量至少为0.1%(w/w)的甘油或碳水化合物。
14.根据权利要求13所述的用途,在用于将甘油生物转化为1,3-丙二醇中,优选地,其中甘油是生物柴油衍生的粗甘油。
15.根据权利要求11至13中任一项所述的用途,其中乳酸杆菌细胞是保藏为DSM33056、DSM 33057、DSM 33058、DSM 33059或DSM 33060的乳酸杆菌菌株中的任一种,或前述任一种菌株的后代或衍生物。
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