WO2013005765A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

顕微鏡装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2013005765A1
WO2013005765A1 PCT/JP2012/067065 JP2012067065W WO2013005765A1 WO 2013005765 A1 WO2013005765 A1 WO 2013005765A1 JP 2012067065 W JP2012067065 W JP 2012067065W WO 2013005765 A1 WO2013005765 A1 WO 2013005765A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
image
light
sample
excitation light
fluorescent
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/067065
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰俊 金子
Original Assignee
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニコン filed Critical 株式会社ニコン
Publication of WO2013005765A1 publication Critical patent/WO2013005765A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a microscope apparatus. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2011-148229 for which it applied on July 4, 2011, and uses the content here.
  • STORM Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
  • STORM Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
  • an observation sample a fluorescent substance having the property of being activated when irradiated with an activation light having a predetermined wavelength and subsequently inactivating and emitting fluorescence when irradiated with an excitation light having a wavelength different from that of the activation light, or this fluorescence
  • a substance to which a substance is attached is used.
  • the fluorescent material is activated at a low density, and thereafter, excitation light is irradiated to cause the fluorescent material to emit light, thereby obtaining a fluorescent image.
  • fluorescent luminescent spots (fluorescent substance images) are arranged at low density and are separated individually. Therefore, the position of the center of gravity of each image of the fluorescent luminescent spot can be obtained.
  • a high-resolution sample image can be obtained by repeating such a step of obtaining a fluorescent image a plurality of times, for example, several hundred times to several tens of thousands times or more, and performing image processing for synthesizing the obtained plurality of fluorescent images. .
  • the step of obtaining the fluorescence image is repeated a plurality of times, and the obtained fluorescence image is synthesized, so that it takes time to obtain the sample image.
  • An object of an aspect of the present invention is to provide a microscope apparatus that can obtain a high-resolution image in a short time.
  • a fluorescent material that emits fluorescence when irradiated with excitation light in a state activated by activation light, or flashes spontaneously when irradiated with the excitation light having a predetermined wavelength.
  • a light source that irradiates at least one of the activation light or the excitation light to an observation region in which a sample containing a fluorescent substance to be placed is disposed, and at least one of the activation light and the excitation light is irradiated to the observation region
  • An image forming unit that generates a sample image from a plurality of fluorescent images acquired by repeating an operation including an operation a plurality of times, and the number of bright spots in at least a partial region of the acquired fluorescent image is the target number of bright spots
  • a microscope apparatus having an irradiation intensity adjusting unit that adjusts the irradiation intensity of the activation light or the excitation light is provided.
  • the target number of luminescent spots may be obtained by repeating the operation of irradiating the observation region with the activation light or the excitation light having different intensities a plurality of times. It is preferably set based on point information.
  • the image forming unit preferably uses the bright spot information for generating the sample image.
  • the image forming unit terminates the generation of the sample image based on the total number of bright spots of the acquired fluorescent image.
  • the image forming unit compares the number of bright spots of the fluorescent image acquired after adjusting the irradiation intensity with the target number of bright spots, and generates the sample image based on the comparison result. Is preferably terminated.
  • the image forming unit irradiates the observation region with the activation light, and irradiates the observation region with the excitation light after the activation light is irradiated. It is preferable to acquire a plurality of the fluorescence images obtained by alternately repeating the operation of acquiring the fluorescence images.
  • the light source is controlled so that the activation light and the excitation light are simultaneously irradiated onto the observation region in a predetermined period.
  • the activation light and the excitation light are applied to a sample containing a fluorescent substance that emits fluorescence when irradiated with excitation light in a state activated by the activation light.
  • An image acquisition unit that acquires an image of a bright spot due to the fluorescence generated by irradiating a sample, and an intensity control unit that adjusts the irradiation intensity of the activation light, the intensity control unit at a predetermined timing Based on the density of the bright spot in at least a partial region of the acquired image, the density of the phosphor in the activated state is determined based on the resolution limit of the image acquisition unit.
  • a microscope apparatus that adjusts the irradiation intensity of the activation light so as to achieve the set target bright spot density.
  • the image acquisition unit specifies the target bright spot density based on the bright spot density of the image acquired each time the sample is irradiated with the activation light having different intensities. It is preferable to do.
  • the intensity control unit adjusts the irradiation intensity of the excitation light so that it is equal to or less than the set target value.
  • the image acquisition unit uses the bright spot information to generate an image of the sample.
  • the activated state of the fluorescent substance and the state of emitting the fluorescence are the operation of irradiating the sample with the activation light, and the state after the activation light is irradiated. It is preferable that the operation of irradiating the sample with the excitation light is alternately repeated.
  • the activated state of the fluorescent material and the state of emitting fluorescence include an operation of irradiating the sample with the activation light and an operation of irradiating the excitation light. It is preferable to form by performing at the same time in at least a part of the period.
  • a bright spot due to fluorescence generated by irradiating the sample with the excitation light is emitted.
  • An image acquisition unit that acquires an image and calculates the density of the bright spot; and an intensity control unit that adjusts an irradiation intensity of the excitation light, wherein the intensity control unit includes the image acquired at a predetermined timing.
  • the density of the blinking fluorescent material is equal to or lower than the bright spot density determined based on the resolution limit of the image acquisition unit and set.
  • the image acquisition unit specifies the target bright spot density based on the density of the bright spot of the image acquired every time the sample is irradiated with the excitation light having different intensities. It is preferable.
  • the intensity control unit may irradiate the excitation light so that the blinking period of the fluorescent material is equal to or longer than a time during which the bright spot can be acquired and equal to or less than a set target value. It is preferable to adjust the strength.
  • the image acquisition unit uses the bright spot information to generate an image of the sample.
  • the image acquisition unit finishes generating the image of the sample based on the total number of bright spots obtained by cumulatively adding the number of bright spots of the acquired image.
  • a high-resolution image can be obtained in a short time.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating image generation steps subsequent to FIG. 4.
  • FIG. It is a schematic diagram of total reflection illumination. It is a figure which shows the structure which concerns on the modification of a 2nd display area. It is a figure which shows the structure which concerns on the modification of a 3rd display area.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a microscope apparatus according to this embodiment.
  • the microscope apparatus 10 includes a light source 12, a control unit 14, a microscope main body 15, a storage unit 16, and a display unit 17.
  • the microscope apparatus 10 is a microscope apparatus using super-resolution microscope technology (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy; STORM).
  • the microscope apparatus 10 uses a sample provided with a fluorescent substance that emits fluorescence and deactivates when irradiated with excitation light L1 in an activated state.
  • This fluorescent substance has a characteristic that it becomes inactivated again when it is irradiated with activation light L2 having a wavelength different from that of the excitation light L1 after it is inactivated by emitting fluorescence when irradiated with the excitation light L1. is doing.
  • the operation movement which observes the fluorescence distributed discretely by making only the one part fluorescent substance in a sample light-emit using excitation light L1 and activation light L2, and many fluorescence images acquired by this are repeated. To form a sample image.
  • the light source 12 includes an excitation illumination system 11 and an activation illumination system 13.
  • the excitation illumination system 11 includes a laser light source 21, a shutter 22, and a total reflection mirror 32, and the excitation illumination system 11 and the microscope main body 15 are connected via the total reflection mirror 32.
  • the laser light source 21 is a light source that supplies excitation light L1 for causing the fluorescent material applied to the sample to emit light to the microscope body 15.
  • the laser light source 21 only needs to emit the excitation light L1 having a wavelength suitable for the fluorescent material included in the sample.
  • a green laser wavelength 532 nm
  • a red laser wavelength 633 nm, 657 nm
  • a violet laser wavelength 405 nm
  • a blue laser wavelength 457 nm
  • the shutter 22 is a device that switches between supplying and stopping the excitation light L ⁇ b> 1 to the microscope body 15.
  • the shutter 22 may be configured to include a light shielding member that shields the excitation light L1 emitted from the laser light source 21, and a drive device that advances and retracts the light shielding member with respect to the optical path of the excitation light L1.
  • an AOTF Acoustic-Optic Tunable Filter
  • the total reflection mirror 32 is for totally reflecting the excitation light L1 emitted from the laser light source 21 toward the stage 31 of the microscope main body 15 to be described later. Based on such a configuration, the excitation illumination system 11 irradiates the entire observation visual field (observation region) on the stage 31 with the excitation light L1.
  • the activation illumination system 13 includes a laser light source 42, a scanner 43, and a dichroic mirror 33, and the dichroic mirror 33 is inserted into the optical path of the excitation light L1, thereby enabling the activation illumination system 13 and The microscope main body 15 is connected.
  • the dichroic mirror 33 is for reflecting the activation light L ⁇ b> 2 emitted from the laser light source 42 toward the stage 31 and transmitting the excitation light L ⁇ b> 1 toward the stage 31.
  • the laser light source 42 irradiates the microscope main body 15 with the activation light L2 for activating the fluorescent material.
  • the laser light source 42 only needs to emit the activation light L2 having a wavelength suitable for the fluorescent material included in the sample.
  • a green laser wavelength 532 nm
  • a red laser wavelength 633 nm, 657 nm
  • a violet laser wavelength 405 nm
  • a blue laser wavelength 457 nm
  • the scanner 43 scans the activation light L2 on the stage 31 of the microscope main body 15.
  • a biaxial galvano scanner can be used.
  • the activation illumination system 13 can irradiate the observation light field (observation region) on the stage 31 while scanning the activation light L ⁇ b> 2 by the scanner 43.
  • a laser light source device that includes the laser light source 21 and the laser light source 42 in one housing and is configured to emit a plurality of types of laser light may be employed.
  • an illumination system including the shutter 22 and the scanner 43 is configured together with the laser light source device, so that both the excitation light L1 and the activation light L2 are transmitted to the microscope body 15 by one illumination system. Supply is possible.
  • the microscope body 15 is composed of an inverted microscope, for example.
  • the microscope main body 15 includes a stage 31 on which a sample to be observed is placed.
  • the microscope body 15 is connected to a camera 34 that captures a fluorescent image of the sample placed on the stage 31.
  • the camera 34 for example, a CCD camera having a plurality of pixels is used.
  • the microscope main body 15 is supplied with an objective lens that irradiates the stage 31 with the excitation light L1 and the activation light L2, and fluorescence (observation light) emitted from a fluorescent substance in the sample.
  • An imaging lens to be coupled to the light receiving surface is provided.
  • the objective lens and the imaging lens constitute an imaging optical system for observing a sample placed on the stage 31.
  • the stage 31 is configured to be capable of total reflection illumination that totally reflects the excitation light L1 and the activation light L2 at the interface between the cover glass attached to the sample and the sample.
  • the sample can be illuminated with evanescent light that oozes out from the cover glass toward the sample side when the illumination light (excitation light L1 and activation light L2) is totally reflected.
  • the range in which evanescent light reaches is limited to a range of about 100 to 150 nm from the interface. Therefore, only the fluorescent substance located in the vicinity of the cover glass surface can emit light, and can be realized with a high S / N ratio by significantly reducing the fluorescence of the background.
  • microscope main body 15 of the present embodiment is configured to be usable by switching between the total reflection illumination and the normal epi-illumination.
  • the control unit 14 is a computer that comprehensively controls the microscope apparatus 10, and is connected to a light source (laser light sources 21 and 42) 12, a storage unit 16, a display unit 17, and a camera controller 19.
  • the control unit 14 has acquired at least a control signal generation function that generates a control signal for controlling these devices, and a fluorescence image acquisition function that acquires a fluorescence image via the camera controller 19. It has an image analysis function for analyzing a fluorescence image, a light source control function for controlling the driving of the light source 12, and an image forming function for generating a sample image from a plurality of fluorescence images. That is, the control unit 14 constitutes an image generation unit that generates a sample image as an overall function.
  • the light source control function includes an irradiation intensity control function for controlling the emitted light intensity of the light sources 42 and 21. Further, the control unit 14 includes a calculation function (details will be described later) for calculating the target number of bright spots and the bright spot density based on the bright spot information of the fluorescent image.
  • the storage unit 16 includes, for example, a semiconductor memory or a hard disk, and stores a program used in the control unit 14 and data (fluorescence image or the like) supplied from the control unit 14 in a state that can be read from the control unit 14.
  • the display unit 17 is, for example, a monitor (display device) or a printer (printing device), and provides a function of displaying and printing video based on image data output from the control unit 14.
  • a monitor is used as the display unit 17.
  • the camera controller 19 drives and controls the camera 34 connected to the microscope body 15.
  • the camera controller 19 operates the camera 34 based on the control signal input from the control unit 14, acquires an image of fluorescence emitted from the sample, and outputs the acquired fluorescence image to the control unit 14.
  • the microscope apparatus 10 displays predetermined information on the display unit 17.
  • predetermined information for example, initial setting at the time of image generation by STORM, which will be described later, information on a fluorescent image being generated, and the like can be exemplified.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of the image display window 23.
  • FIG. 2 shows an image display window 23 when the STORM image processing is performed on a sample containing one type of fluorescent material.
  • the image display window 23 includes a first display area 23A, a second display area 23B, a third display area 23C, and a fourth display area 23D, as shown in FIG.
  • the operation of irradiating the sample with the excitation light L1 is performed three times. Then, every time the excitation light L1 is irradiated, a fluorescent image emitted by the fluorescent material attached to the sample is captured by the camera 34.
  • a period during which the excitation light L1 is irradiated once and the camera 34 captures a fluorescent image is referred to as “one frame”.
  • the sample is irradiated with the activation light L2 every three frames, and the irradiation period of the activation light L2 on the sample and the period of three frames are collectively referred to as “one period”. .
  • a bar graph indicating the number of bright spots in the fluorescence image for three periods captured by the camera 34 during the STORM image processing is displayed. That is, a total of nine bar graphs are simultaneously displayed in the first display area 23A, three per period.
  • the bar graph for one period sequentially moves to the left side of the first display area 23A as time elapses, and a bar graph of a new period is displayed.
  • each bar graph has a function of displaying the numerical value of the number of bright spots in the fluorescent image being captured at the top.
  • the user can easily determine the measured value of the number of bright spots by viewing the bar graph.
  • the image display window 23 is provided with a sampling interval input box 25 in which a sampling interval for adjusting an interval for displaying a bar graph for one frame in the first display area 23A can be input.
  • a sampling interval input box 25 By inputting a desired numerical value into the sampling interval input box 25, it is possible to thin out the bar graph for one frame displayed in the first display area 23A. Thereby, the visibility of the bar graph displayed on the first display area 23A can be improved.
  • adjustment bars 61 and 62 for adjusting the outputs (intensities) of the laser light sources 21 and 42 of the light source 12 are displayed.
  • the adjustment bar 61 is for adjusting the intensity of the laser light source 21 that irradiates the excitation light L1.
  • the adjustment bar 62 is for adjusting the intensity of the laser light source 42 that irradiates the activation light L2 within a range of 0 to 100% in increments of 0.1%, for example.
  • the control unit 14 adjusts the intensity of the laser light sources 21 and 42 of the light source 12 based on the set values of the adjustment bars 61 and 62. That is, the user can adjust the intensity of the laser light sources 21 and 42 by moving the adjustment bars 61 and 62. In the vicinity of the adjustment bars 61 and 62, output display portions 61a and 62a indicating the output values of the current laser light sources 21 and 42 are provided.
  • the second display area 23B is provided with a bright spot number setting button 30 and an imaging end button 35.
  • the control unit 14 captures the bright spot number indicated by the first bar graph in the latest period displayed in the first display area 23 ⁇ / b> A into the storage unit 16.
  • the control unit 14 sets the number of bright spots stored in the storage unit 16 as a target number of bright spots described later.
  • the target bright spot number can be updated every time the bright spot number setting button 30 is clicked.
  • the imaging end button 35 is for the microscope apparatus 10 to end the STORM image acquisition operation when the user clicks. Thereby, the microscope apparatus 10 can appropriately terminate the STORM image processing at an arbitrary timing desired by the user as will be described later.
  • the third display area 23C is set adjacent to the first display area 23A and the second display area 23B.
  • a bar graph indicating the total number of bright spots for one period (the total number of bright spots for three frames) is displayed in the upper part of the third display area 23C.
  • This bar graph is displayed in units of four (4 periods).
  • the horizontal axis direction corresponds to the number of periods
  • the vertical axis direction corresponds to the total number of bright spots in each period.
  • the bar graph is updated and displayed as the bar graph of a new period is updated by sequentially moving to the left side of the third display area 23C as time elapses.
  • the numerical value of the total number of bright spots is displayed at the top of each bar graph. Thereby, the user can determine the measured value of the total number of bright spots instantaneously by viewing the bar graph.
  • a line graph indicating the total number of bright spots in each period (corresponding to the value of each bar graph) is displayed.
  • the horizontal axis of this line graph indicates the number of periods, and the vertical axis indicates the total number of bright spots. The user can easily discriminate the state of change over time of the total number of bright spots in each period by viewing the line graph.
  • the third display area 23C is provided with a first input box 63, a second input box 64, and an icon part 65.
  • the first input box 63 is for inputting a lower limit value of the number of bright points of the bar graph.
  • the second input box 64 is for inputting the upper limit value of the bar graph.
  • the icon part 65 is for making it possible to select execution or non-execution of auto-scrolling of the graph. The user can switch whether or not the automatic scrolling of the graph can be executed by clicking and selecting the icon part 65. As a result, the graph displayed in the third display area 23C can be updated at any time by automatically scrolling according to the user's request.
  • the fourth display area 23D is for displaying a STORM image G1 generated by a sample image generation step described later.
  • the bright spots of the captured fluorescence are indicated by + marks.
  • the STORM image G1 shows the shape of the display sample with high resolution with the same luminance at each bright spot (+). Since the bright image is added to the STORM image G1 as the sample image generation step proceeds, the fine shape of the sample can be displayed gradually.
  • the fourth display area 23D is provided with a bright spot number display section 50 for displaying the total bright spot number in the currently displayed STORM image G1.
  • the image display window 23 has an icon portion that can select display or non-display for each of the first display area 23A, the second display area 23B, the third display area 23C, and the fourth display area 23D. You may make it provide. In this way, the user selectively displays the image on the first display area 23A, the second display area 23B, the third display area 23C, and the fourth display area 23D by clicking the icon portion as necessary. Since it can be displayed on the window 23, only necessary information can be easily acquired.
  • a sample image generation method by STORM using the microscope apparatus 10 will be described.
  • a sample set on the stage 31 of the microscope apparatus 10 a sample provided with a fluorescent substance as a label is used.
  • the sample is, for example, a cell immersed in a culture solution.
  • the fluorescent material a fluorescent material that emits fluorescence and is inactivated when irradiated with excitation light L1 having a wavelength different from that of the activation light L2 in the activated state is used.
  • the fluorescent substance emits fluorescence by being irradiated with the excitation light L1, is deactivated, and is then activated again when the activation light L2 is irradiated again.
  • those described in US Patent Publication No. 2008/0032414 can be used.
  • a dye pair in which two kinds of cyanine dyes are combined (Cy3-Cy5 dye pair, Cy2-Cy5 dye pair, etc.) can be used as a fluorescent substance.
  • one dye forms a light emitting portion that emits light by excitation light
  • the other dye changes the first dye in response to light irradiation.
  • An activation portion is formed that functions as a switch that activates or switches the state of the first dye.
  • Cy5 is a light emitting moiety
  • Cy3 is an activating moiety capable of activating Cy5. Therefore, when a fluorescent material containing a Cy3-Cy5 dye pair is irradiated with a green laser (532 nm) corresponding to the absorption wavelength of Cy3, Cy5 which is a light emitting portion is activated, and Cy5 shifts to a fluorescent state.
  • Cy5 when a red laser (633 nm) corresponding to the absorption wavelength of Cy5 is irradiated to a fluorescent material in which Cy5 is in a fluorescent state, Cy5 emits light and returns to an inactive state (dark state).
  • STORM by controlling the switching operation between the fluorescent state and the dark state in the fluorescent material, only a small part of the fluorescent material applied to the sample is selectively emitted, and the fluorescent material can be detected at the level of one molecule. Yes.
  • the image generation process by STORM is performed by, for example, synthesizing a plurality of fluorescent images that are repeatedly captured several hundred to several tens of thousands of times. Therefore, it takes time to acquire an image compared to a normal microscope apparatus. Cost.
  • a microscope apparatus that performs image generation by STORM uses the total number of bright spots of fluorescent images constituting a sample image as a reference when ending the image acquisition process.
  • the microscope apparatus 10 is intended to perform image acquisition by STORM in a short time.
  • a method for shortening the image acquisition time for example, it is conceivable to increase the number of bright spots of a fluorescent image acquired by one imaging. In this way, by increasing the number of bright spots acquired by capturing a single fluorescent image, it is possible to acquire sample images having the same total number of bright spots with a small number of fluorescent images. Therefore, since the number of fluorescent images to be acquired can be reduced, the sample image can be acquired in a short time as a result.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the intensity of the activation light L2 irradiated to the sample and the number of bright spots in the fluorescent image of the sample.
  • the number of bright spots increases when the intensity of the activation light L2 is increased. This is presumably because the number of dyes that emit fluorescence in the sample increases as the intensity of the activation light L2 increases.
  • the number of bright spots obtained decreases when the intensity of the activation light L2 exceeds a predetermined value.
  • a region where bright spots are concentrated increases.
  • the detection pulses overlap within the imaging pixels of the camera 34, and therefore no bright spots are counted. That is, it is excluded as an invalid bright spot. Therefore, in order to maximize the number of bright spots in each fluorescent image, it is effective to adjust the intensity of the activation light L2 to an optimum value.
  • the target bright spot number is defined as 80% to 100%.
  • the dye that emits fluorescence in the sample deteriorates over time. Therefore, in order to maintain the same level of fluorescence intensity (number of bright spots), it is necessary to gradually increase the intensity of the activation light L2. That is, if the fluorescent image is repeatedly captured while the output of the laser light source 42 is kept constant, the number of bright spots that can be acquired from the fluorescent image decreases with time. In this case, the degree of deterioration of the dye over time can be obtained in advance, and the intensity of the activation light L2 can be automatically changed.
  • control unit 14 when performing image generation by STORM, controls the intensity of the laser light source 42 that irradiates the activation light L2 so that the number of bright spots of the fluorescent image becomes the target number of bright spots. Like to do.
  • FIGS. 4 and 5 are flowcharts showing image generation steps by the microscope apparatus 10.
  • the microscope apparatus 10 sets an end condition mode for ending an image measurement operation described later (step S1).
  • the end condition mode includes an auto mode in which the control unit 14 automatically determines the end and a mode in which the end is determined based on a user's manual input.
  • the set end condition mode is stored in the storage unit 16.
  • the control unit 14 sets the end condition and then starts image measurement (step S2). After starting the image measurement, the control unit 14 first sets the target number of bright spots (step S3).
  • the target number of bright spots is set in either the semi-auto mode or the full-auto mode.
  • the selection of the semi-auto mode or the full-auto mode may be selected in advance by default, or may be configured so that the user inputs each time the microscope apparatus 10 is driven.
  • the semi-auto mode refers to the calculation of the target number of bright spots used as an index when the control unit 14 controls the driving of the light source 12 (laser light source 42) based on a manual operation by the user, and then the image by STORM.
  • the generation process is automatically performed (step S4).
  • the full auto mode is a mode in which the control unit 14 automatically performs both the calculation of the target bright spot number and the image generation process (steps S5 to S8).
  • the semi-auto mode and the full-auto mode are different only in whether or not the target bright spot number calculation method is automatically performed.
  • step S3 When the semi-auto mode is selected (step S3: No), the control unit 14 acquires the target number of bright spots based on the manual setting by the user (step S4).
  • the user adjusts the adjustment bar 62 displayed in the second display area 23B while referring to the number of bright spots of the bar graph displayed in the first display area 23A described above, thereby adjusting the laser light source 42. Adjust the output.
  • the control unit 14 takes the bright spot number indicated by the first bar graph in the latest period displayed in the first display area 23 ⁇ / b> A into the storage unit 16. The control unit 14 calculates the number of bright spots stored in the storage unit 16 as the target number of bright spots.
  • control unit 14 can set the target number of bright spots by a manual operation by the user.
  • step S3 the control unit 14 automatically calculates the target number of bright spots (steps S5 to S8).
  • the control unit 14 sets the intensity of the laser light source 42 to a predetermined value (step S5). Note that only the output of the activation light L2 is adjusted in a state where the output of the excitation light L1 is fixed to the maximum value (100%). And the control part 14 performs the operation
  • control part 14 acquires the information regarding a bright spot number by analyzing this fluorescence image, and hold
  • the number of bright spots only the number of bright spots in the first frame of each period may be acquired, or the total number of bright spots for three frames may be acquired.
  • step S8 After acquiring the number of bright spots, the control unit 14 determines the end of auto setting (step S8). When the end determination is not OK (step S8: No), the control unit 14 returns to step S5. On the other hand, when the end determination is OK (step S8: Yes), the control unit 14 proceeds to step S9 shown in FIG.
  • step S5 the control unit 14 increases the intensity of the activation light L2 by a preset amount as compared to the previous fluorescence image measurement. That is, the control unit 14 moves the position of the adjustment bar 62 so as to increase the intensity of the activation light L2. Steps S6 to S7 are repeated until the end determination is OK (step S8: Yes).
  • step S7 the control unit 14 compares the number of bright spots acquired from the fluorescence image with the number of bright spots acquired immediately before being stored in the storage unit 16. When the number of bright spots increases with the output of the laser light source 42, the control unit 14 determines that the acquired number of bright spots is not the maximum value. Then, in order to continue the acquisition operation, the end determination is No, and the process returns to step S5 via step S8.
  • step S7 when the number of bright spots decreases against the increase in the output of the laser light source 42, that is, when the number of bright spots changes from an increasing tendency to a decreasing tendency, the control unit 14 reaches the vertex position of the graph of FIG. Judge that This is because although the number of bright spots in the fluorescent image increases in proportion to the output of the activation light L2, as described above, it has a characteristic that it decreases if the output of the activation light L2 is too strong, and therefore it tends to decrease from an increasing trend. This is because it is possible to estimate the number of bright spots at the boundary when changing to the maximum bright spot number. Then, the control unit 14 sets the maximum number of bright spots at this time to the target number of bright spots. Further, the control unit 14 acquires the intensity (output value) of the laser light source 42 that can output the activation light L2 from which the maximum number of bright spots can be obtained as an initial setting value when performing an image generation process described later.
  • the control unit 14 repeats Steps S5 to S8 to change the output of the laser light source 42 and analyze the change in the number of bright spots in the fluorescent image to obtain the target number of bright spots. Can be set automatically. Note that the control unit 14 uses the bright spots of the fluorescent image acquired during the period for setting the target bright spot number when generating a STORM image, which will be described later. Accordingly, the bright spot information acquired during the period for setting the target bright spot number can be used without waste, and the time for the STORM imaging process can be shortened.
  • step S9 is executed.
  • the intensity of the laser light source 42 is set so that the number of bright spots in each fluorescent image becomes the target number of bright spots. Details of step S9 will be described later.
  • the maximum value is the point where the increase in the number of bright spots when the intensity of the activation light source is increased, but it is not always necessary to take the maximum value. .
  • a value of 90% may be set as the maximum value with respect to the maximum value.
  • the predetermined value in this case can also be determined by the rate of increase of the number of bright spots with respect to the rate of change in the intensity of the activation light.
  • step S ⁇ b> 10 the activation light L ⁇ b> 2 emitted from the activation illumination system 13 is supplied to the microscope main body 15, and the sample on the stage 31 is irradiated with the activation light L ⁇ b> 2.
  • the excitation light L1 is blocked by closing the shutter 22 of the excitation illumination system 11, and only the activation light L2 enters the microscope body 15.
  • the activation light L ⁇ b> 2 is position-controlled by the scanner 43, enters the dichroic mirror 33, is reflected by the dichroic mirror 33, and is irradiated to a predetermined position in the observation field on the stage 31. That is, the activation light L2 is scanned over the entire observation visual field by the scanner 43, and the activation light L2 having a uniform intensity is irradiated onto the sample in the entire visual field. Thereby, the fluorescent substance contained in the sample is activated again over the entire visual field.
  • the activation light L2 may be applied to the sample in any form of total reflection illumination or epi-illumination.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram showing a case where the sample S is irradiated with the activation light L2 (or excitation light L1) by total reflection illumination.
  • the sample S is disposed on the cover glass 31a of the stage 31, and the activation light L2 is incident on the surface of the cover glass 31a obliquely from below the cover glass 31a. Then, the activation light L2 is totally reflected at the interface between the cover glass 31a and the sample S, and the evanescent light EV that exudes from the interface toward the sample side is irradiated onto the interface side surface layer of the sample S. Thereby, only the fluorescent substance located in the very surface layer part of the sample S is selectively activated.
  • the activation light L2 is incident in the normal direction of the cover glass 31a and the sample S is irradiated with the activation light L2 transmitted through the cover glass 31a. In this case, the activation light L2 is irradiated to the entire thickness direction of the sample S.
  • the activation light L2 is applied to the sample S as the evanescent light EV, and the fluorescence located in the very surface layer portion of the sample S. Only the substance is selectively activated.
  • the activation illumination system 13 does not emit the activation light L2
  • the shutter 22 of the excitation illumination system 11 is opened, and the excitation light L1 emitted from the laser light source 21 is totally reflected by the mirror 32.
  • the excitation light L1 is irradiated to the entire observation visual field, and only the fluorescent substance activated by the activation light L2 selectively emits light.
  • the irradiation with the excitation light L1 is performed three times as described above.
  • the fluorescent substance emitting fluorescence shifts to an inactive state.
  • the fluorescence emitted by the fluorescent material can be photographed by operating the camera 34 via the camera controller 19, and each fluorescent image can be acquired.
  • the captured fluorescent image is transmitted from the camera controller 19 to the control unit 14.
  • the control unit 14 acquires a fluorescent image.
  • the control unit 14 records the acquired fluorescent image in the storage unit 16.
  • the control unit 14 generates a STORM image G1 by combining a plurality of fluorescent images, and this STORM image G1 is displayed in the fourth display area 23D.
  • the fluorescent material contained in the sample is in an inactive state when irradiation with the activation light L2 is performed again. For this reason, the fluorescent substance activated upon irradiation with the activation light L2 is stochastically different, and the acquired fluorescent image shows a bright spot pattern different from the fluorescent image acquired in the previous cycle.
  • the control unit 14 determines whether or not to end the STORM image generation step in steps S11 to S13. First, the control unit 14 reads the end condition stored in the storage unit 16 in step S1, and determines whether or not the end condition is auto (step S11).
  • step S11 the control unit 14 proceeds to step S12.
  • step S12 the control unit 14 automatically determines whether or not a predetermined end condition is satisfied.
  • a predetermined end condition for example, when the output of the laser light source 21 is set to 100% and the number of bright spots per frame of the fluorescent image is equal to or less than the target number of bright spots (first end condition), or A case where conditions such as a case where the total number of bright spots acquired by the STORM imaging process reaches a preset setting value (second end condition) can be exemplified.
  • the control unit 14 can prevent the occurrence of a problem that the image generation time becomes uselessly long by stopping the STORM image generation. Further, in the case of the second end condition, the control unit 14 determines that the total number of bright spots indicating a high-definition image relating to the sample has been obtained, and ends the STORM image generation, so that the image generation is performed efficiently. be able to.
  • step S12: Yes When it is determined that the end condition is satisfied (step S12: Yes), the control unit 14 ends the STORM image generation step. On the other hand, if it is determined that the end condition is not satisfied (step S12: No), the control unit 14 returns to step S9 and repeatedly executes the above-described steps S9 and S10.
  • step S11: No If the end condition is not auto (step S11: No), the control unit 14 proceeds to step S13.
  • step S13 when the user's instruction, for example, the imaging end button 35 is clicked by the user (step S13: Yes), the STORM image generation is terminated.
  • step S13 when the imaging end button 35 is not clicked (step S13: No), the control unit 14 returns to step S9 and repeatedly executes the above-described steps S9 and S10.
  • the STORM image G1 is displayed in the fourth display area 23D, and the total number of bright spots of the STORM image G1 is displayed in the bright spot number display section 50. Therefore, the user can determine whether or not a desired image has been obtained based on the STORM image G1 or the total number of bright spots. That is, the control unit 14 determines that the user has issued a STORM image generation end command based on whether or not the imaging end button 35 is clickable.
  • the control unit 14 When returning to step S9 through step S11 to step S13 as described above, the control unit 14 resets the intensity of the laser light source 42 so that the number of bright spots in each fluorescent image becomes the target number of bright spots. Specifically, the control unit 14 compares the number of luminescent spots of the fluorescent image stored in the storage unit 16 at the time of the previous image acquisition with the target number of luminescent spots, and obtains a difference. Then, it is determined whether the previously acquired number of bright spots is higher or lower than the target number of bright spots. When the number of bright spots acquired last time is lower than the target number of bright spots, the control unit 14 sets the intensity of the laser light source 42 stronger than the previous set value in order to obtain the target number of bright spots.
  • control unit 14 sets the laser intensity to be lower than the previous set value. Moreover, the control part 14 maintains the setting value of a laser intensity
  • substantially the same includes a case where there is a difference within a predetermined threshold.
  • the control unit 14 irradiates the sample with the activation light L2 while adjusting the intensity of the laser light source 42, and irradiates the excitation light L1 to obtain a fluorescence image.
  • the operation is repeated hundreds to tens of thousands of times, hundreds to tens of thousands of fluorescent images with different bright spot positions are acquired, and a large number of acquired fluorescent images are combined to generate the STORM image G1. (Step S9 to Step S10).
  • the sample image generation method by STORM is completed.
  • the microscope apparatus 10 displays information other than the STORM image G1 as needed in the first display area 23A, the second display area 23B, the third display area 23C, and the fourth display area 23D when the STORM image G1 is generated. Has been.
  • the control unit 14 adjusts the intensity of the laser light source 21 so as to maintain the target number of bright spots as described above. Therefore, the total number of bright spots of the fluorescent image for one period indicated by the graph displayed in the lower part of the third display area 23C is maintained at a constant value M (see FIG. 2). This is an effect obtained by adjusting the intensity of the laser light source 24 so that the control unit 14 maintains the target number of bright spots.
  • the control unit 14 controls the driving of the laser light source 42 so that the number of bright spots of the fluorescent image becomes the target number of bright spots (maximum value). Therefore, for example, when generating an image by STORM for the same sample, a STORM image G1 having the same total number of bright spots can be obtained with a smaller number of fluorescent images than when the drive of the laser light source 42 is not controlled. That is, according to the microscope apparatus 10 according to the present embodiment, a high-definition STORM image can be acquired in a short time.
  • the microscope apparatus 10 can use a sample containing two or more types (for example, three types) of fluorescent substances in place of the sample containing one type of fluorescent substance during the STORM image processing.
  • the excitation illumination system 11 further includes two laser light sources that irradiate light having different wavelengths apart from the laser light source 21. This is because two or more types of fluorescent substances have different wavelengths of excitation light L1 that are compatible.
  • FIG. 7 is a diagram showing the configuration of the second display region 23B of the image display window 23 when the STORM image processing is performed on a sample containing three types of fluorescent substances.
  • three adjustment bars 61 and 62 are provided in the second display area 23B.
  • Each adjustment bar 61, 62 corresponds to a different fluorescent material.
  • the control unit 14 calculates the target number of bright spots corresponding to each laser light source automatically in the full auto mode based on the user setting in the semi auto mode.
  • FIG. 8 is a diagram showing the configuration of the third display region 23C of the image display window 23 when the STORM image processing is performed on a sample containing three types of fluorescent substances.
  • a bar graph indicating the total number of bright points for one period (the total number of bright points for three frames) is displayed in three stages.
  • Each bar graph corresponds to each of the three types of laser light sources (activation light L2).
  • activation light L2 When a sample containing three types of fluorescent substances is used, three graphs are displayed on the line graph indicating the total number of bright spots in each period. Each graph corresponds to each of the three types of laser light sources (activation light L2).
  • the control unit 14 corresponds to each of the laser light sources even if the light source 12 includes a laser light source that emits a plurality of types of activation light.
  • the control unit 14 calculates the target number of bright spots and controlling the drive of each laser light source based on the target number of bright spots, a STORM image of a sample containing three types of fluorescent substances can be acquired in a short time.
  • dSTORM direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
  • dSTORM direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
  • dSTORM it is possible to acquire images of only a small number of fluorescent materials based on the spontaneous blinking of the fluorescent materials without irradiating the activation laser unlike the conventional STORM.
  • the microscope apparatus of the second embodiment has a configuration to which this dSTORM is applied.
  • a configuration in which the activation illumination system 13 is omitted from the microscope apparatus 10 shown in FIG. 1 can be adopted.
  • a sample containing a fluorescent material that spontaneously blinks when irradiated with excitation light of a predetermined wavelength by the excitation illumination system 11 is arranged in the observation region on the stage 31 of the microscope body 15, and this observation region
  • the fluorescent material is blinked by irradiating excitation light from the excitation illumination system 11, and the fluorescent image is acquired by capturing the light emitted from the fluorescent material with the camera 34.
  • the control unit 14 acquires an operation of irradiating the observation region with excitation light having an irradiation intensity set for each portion and a fluorescence image excited with the excitation light in the observation region.
  • a plurality of fluorescence images are acquired by alternately repeating the operation to perform a plurality of times, and a sample image is generated from the plurality of fluorescence images.
  • the excitation illumination system 11 is used instead of the activation illumination system 13 as means for generating fluorescence from the sample.
  • control unit 14 adjusts the output of the laser light source that irradiates the excitation light so that the number of luminescent spots of the fluorescent image becomes the target number of luminescent spots, and synthesizes a plurality of acquired fluorescent images. An image can be generated.
  • the image generation is performed by adjusting the output of the laser light source so that the number of bright spots of the fluorescent image becomes the target number of bright spots. Even when dSTORM is used, a high-definition image can be acquired in a short time.
  • the microscopic technique (STORM) using a fluorescent substance that emits fluorescence and deactivates when irradiated with excitation light after activation has been described, but as a similar technique in which the type of fluorescent substance is different, PALM (Photoactivated Localization Microscopy) is also known (for example, Japanese translation of PCT publication No. 2008-542826, paper: Proposed method for molecular optical imaging, Optics Letters, vol.20, No.3, (Feb.1, 1995), pp.237-239.).
  • PALM Photoactivated Localization Microscopy
  • the procedure of the observation method of the first embodiment is applied as it is even when PALM is used for acquiring a sample image, and the configuration of the microscope apparatus 10 is not required to be changed.
  • the control unit 14 alternately performs a plurality of operations of irradiating the observation region with the activation light having the irradiation intensity set for each portion and the operation of irradiating the excitation light and acquiring the fluorescence image.
  • a plurality of fluorescence images are acquired by repeating the process, and a sample image is generated from the plurality of fluorescence images.
  • the fluorescent substance applied to the sample is changed.
  • the fluorescent material a fluorescent material that is activated when irradiated with activation light having a predetermined wavelength and emits fluorescence when irradiated with excitation light having a wavelength different from the activation light in an activated state is used. .
  • Such fluorescent substances include mutants of fluorescent proteins derived from jellyfish and coral.
  • PA-GFP which is a mutant protein of jellyfish-derived fluorescent protein
  • PS-CFP can emit fluorescence of other colors when irradiated with activating light.
  • Dronpa which is a mutant protein coral-derived fluorescent protein, can emit light by irradiating light with an excitation wavelength when irradiated with activating light, and Kaede changes its fluorescent color when irradiated with activating light.
  • control unit 14 adjusts the output of the laser light source that irradiates the activation light so that the number of luminescent spots of the fluorescent image becomes the target number of luminescent spots, and synthesizes a plurality of acquired fluorescent images to obtain a sample image Can be generated.
  • the image generation is performed by adjusting the output of the laser light source so that the number of bright spots of the fluorescent image becomes the target number of bright spots. Even when PALM is used, a high-definition image can be acquired in a short time.
  • this invention is not limited to the said embodiment, In the range which does not deviate from the meaning of invention, it can change suitably.
  • the case where the number of bright spots acquired for each of the fluorescent images is compared with the target number of bright spots and the output of the laser light source 42 is continuously controlled has been described as an example.
  • the configuration may be such that the output of the laser light source 42 is intermittently controlled by comparing with the target number of bright spots every time several hundred fluorescent images are taken.
  • the sample is irradiated with the excitation light L1 and the activation light L2 at different timings.
  • the sample may be configured to be irradiated with the excitation light L1 and the activation light L2 at the same time. Note that the irradiation start timing and the irradiation end timing of the excitation light L1 and the activation light L2 do not have to coincide with each other, and it is sufficient that they have at least a period of simultaneous execution.
  • the excitation light L1 may be irradiated at least once.
  • the first excitation light L1 irradiation period may be a simultaneous irradiation period with the activation light L2, and the excitation light L2 is irradiated twice during the irradiation period of the activation light L2. You may perform irradiation of L1.
  • the law of STORM image acquisition time depends on the density of the activated fluorescent material that forms the bright spot due to fluorescence. Points in at least a partial area of the image acquired at a predetermined timing so that the density is equal to or lower than the bright spot density determined based on the resolution limit of the image acquisition unit and the set target bright spot density.
  • the irradiation intensity of the activation light may be adjusted (feedback controlled) based on the density.
  • the time from the start of irradiation of excitation light to the start of the next activation is equal to or longer than the time during which a fluorescent bright spot can be acquired and is equal to or less than the set target value. In this way, the excitation light irradiation intensity may be adjusted (feedback controlled).
  • the density of bright spots in at least a part of the image corresponds to, for example, the density of the image in the image corresponding to the partial region where the density of the fluorescent substance (molecule) in the sample is high, and the selected partial region in the sample.
  • the density of bright spots in the image and the density of bright spots in the image corresponding to all the areas where the fluorescent substance exists in the specimen.
  • the selected partial area in the specimen is specified by acquiring an image of the specimen in advance with a microscope with normal optical resolution and specifying the area to be observed with super-resolution from the specimen in the image with a mouse or the like. To do.
  • the target bright spot density is set to a density when, for example, 0.1 to 1 bright spot exists in a region (area) in a circle whose radius is a general resolution limit determined by the fluorescence wavelength / numerical aperture.
  • a processing method that does not count any bright spots is not applied. It is desirable to count the bright spots.
  • the STORM image acquisition time rule depends on the density of the activated fluorescent substance that forms the bright spot due to the fluorescence, so that the density is determined based on the resolution limit of the image acquisition unit.
  • the irradiation intensity of the excitation light is adjusted based on the density of the points in at least a part of the image acquired at a predetermined timing so as to be equal to or lower than the point density and to the set target bright spot density (feedback) Control).
  • the blinking of the fluorescent substance is a state in which the fluorescent substance is activated, and the extinction is a state in which the fluorescent substance emits fluorescence by irradiation with excitation light and is deactivated.
  • the period of blinking is defined as one period from the activated state to the emission of fluorescence by irradiating the excitation light until the inactivated state.
  • the irradiation intensity of the excitation light is adjusted (feedback controlled) so that the blinking period of the fluorescent material is equal to or longer than the time during which a bright spot due to fluorescence can be acquired and equal to or less than the set target value. Good.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

　活性化光によって活性化された状態で励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質、或いは所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に対し、活性化光又は励起光の少なくとも一方を照射する光源と、観察領域に活性化光及び励起光の少なくとも一方を照射する動作を含む動作を複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像生成部と、を備える顕微鏡装置である。画像生成部は、取得される蛍光画像の輝点数が目標輝点数となるように活性化光又は励起光の照射強度を調整する。

Description

顕微鏡装置
　本発明は、顕微鏡装置に関する。   
　本願は、２０１１年７月４日に出願された日本国特願２０１１－１４８２２９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来から、超解像顕微鏡として、ＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば特許文献１参照）。この顕微鏡では、観察試料として、所定波長の活性化光を照射すると活性化し、後に活性化光とは異なる波長の励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する特性を有する蛍光物質又はこの蛍光物質を付着させたものが用いられる。このような観察試料に対して微弱な活性化光を照射することで低密度に蛍光物質を活性化させ、その後に励起光を照射して蛍光物質を発光させることで蛍光画像を取得する。このようにして取得した蛍光画像では、蛍光輝点（蛍光物質の像）が低密度に配置され、個々に分離されたものとなる。そのため、蛍光輝点の個々の像の重心位置を求めることができる。このような蛍光画像を得るステップを複数回、例えば数百回～数万回以上繰り返し、得られた複数の蛍光画像を合成する画像処理を行うことにより、高分解能の試料画像を得ることができる。
米国特許出願公開第２００８／００３２４１４号明細書
　しかしながら、従来のＳＴＯＲＭでは、蛍光画像を得るステップを複数回繰り返し、得られた蛍光画像を合成するため、試料画像を取得するまでに時間がかかるといった問題が生じていた。
　本発明の態様は、短時間で高解像度の画像を得ることができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様に従えば、活性化光によって活性化された状態で励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質、或いは所定波長の前記励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に対し、前記活性化光又は前記励起光の少なくとも一方を照射する光源と、前記観察領域に前記活性化光及び前記励起光の少なくとも一方を照射する動作を含む動作を複数回繰り返すことで取得された複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像形成部と、前記取得される前記蛍光画像の少なくとも一部の領域の輝点数が目標輝点数となるように前記活性化光又は前記励起光の照射強度を調整する照射強度調整部と、を有する顕微鏡装置が提供される。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記目標輝点数は、強度を異ならせた前記活性化光又は前記励起光を前記観察領域に照射する動作を複数回繰り返すことで取得した複数の前記蛍光画像の輝点情報に基づいて設定されることが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像形成部は、前記輝点情報を前記試料画像の生成に用いることが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像形成部は、取得した前記蛍光画像の総輝点数に基づいて前記試料画像の生成を終了することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像形成部は、前記照射強度を調整した後に取得した前記蛍光画像の輝点数と前記目標輝点数とを比較し、該比較結果に基づいて前記試料画像の生成を終了することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像形成部は、前記観察領域に対して前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光が照射された後の前記観察領域に前記励起光を照射して前記蛍光画像を取得する動作とを交互に繰り返すことにより得られた複数の前記蛍光画像を取得することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記光源は、前記活性化光と前記励起光とが観察領域に所定の期間において同時に照射されるように制御されることが好ましい。
　本発明の第２の態様に従えば、活性化光によって活性化された状態で励起光が照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料に対して、前記活性化光及び前記励起光を前記試料に照射することにより発生する前記蛍光による輝点の画像を取得する画像取得部と、前記活性化光の照射強度を調整する強度制御部とを備え、前記強度制御部は、所定のタイミングで取得された前記画像の少なくとも一部の領域における前記輝点の密度に基づいて、前記活性化された状態の前記蛍光物質の密度が、前記画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって、設定した目標輝点密度となるように、前記活性化光の照射強度を調整する顕微鏡装置が提供される。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像取得部は、強度が異なる前記活性化光を前記試料に照射する毎に取得した前記画像の前記輝点の密度に基づいて、前記目標輝点密度を特定することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記蛍光物質が前記活性化された状態で、前記励起光の照射開始から次の前記活性化光の照射開始までの時間が前記輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、前記強度制御部は、前記励起光の照射強度を調整することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像取得部は、前記輝点の情報を前記試料の画像の生成に用いることが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記蛍光物質の、前記活性化された状態及び前記蛍光を発する状態は、前記試料に前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光が照射された後の前記試料に前記励起光を照射して形成する動作とを交互に繰り返すことが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記蛍光物質の、前記活性化された状態及び前記蛍光を発する状態は、前記試料に対して前記活性化光を照射する動作と前記励起光を照射する動作とを少なくとも一部の期間において同時に実行することにより形成することが好ましい。
　本発明の第３の態様に従えば、励起光が照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料に対して、前記励起光を前記試料に照射することにより発生する蛍光による輝点の画像を取得し、前記輝点の密度を算出する画像取得部と、前記励起光の照射強度を調整する強度制御部とを備え、前記強度制御部は、所定のタイミングで取得された前記画像の少なくとも一部の領域における前記輝点の密度に基づいて、前記明滅する前記蛍光物質の密度が、前記画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって設定した目標輝点密度となるように、前記励起光の照射強度を調整する顕微鏡装置が提供される。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像取得部は、強度が異なる前記励起光を前記試料に照射する毎に取得した前記画像の前記輝点に密度に基づいて、前記目標輝点密度を特定することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記蛍光物質の前記明滅の周期が前記輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、前記強度制御部は、前記励起光の照射強度を調整することが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像取得部は、前記輝点の情報を前記試料の画像の生成に用いることが好ましい。
　また、上記顕微鏡装置においては、前記画像取得部は、取得した前記画像の前記輝点の数を累積加算した総輝点数に基づいて前記試料の画像の生成を終了することが好ましい。
　本発明の態様によれば、短時間で高解像度の画像を得ることができる。
顕微鏡装置の第１実施形態を示す構成図である。 本実施形態の画像表示ウインドウの構成を示す図である。 活性化光の強度と蛍光画像の輝点数との関係を示す図である。 顕微鏡装置による画像生成ステップを示すフローチャートである。 図４に続く画像生成ステップを示すフローチャートである。 全反射照明の模式図である。 第２表示領域の変形例に係る構成を示す図である。 第３表示領域の変形例に係る構成を示す図である。
　以下、図面を参照して顕微鏡装置の一実施形態について説明する。なお、本実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。
　（第１実施形態）
　図１は本実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略図である。
　顕微鏡装置１０は、光源１２と、制御部１４と、顕微鏡本体１５と、記憶部１６と、表示部１７とを備えている。
　本実施形態の顕微鏡装置１０は超解像顕微鏡技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy；ＳＴＯＲＭ）を用いた顕微鏡装置である。顕微鏡装置１０では、活性化状態で励起光Ｌ１が照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。この蛍光物質は、励起光Ｌ１が照射されることで蛍光を発して不活性化した後、励起光Ｌ１とは異なる波長の活性化光Ｌ２が照射されると再度活性化状態となる特性を有している。そして、励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返し、これにより取得した多数の蛍光画像を用いて試料画像を形成する。
　本実施形態に係る光源１２は、励起照明系１１と、活性化照明系１３と、を含む。励起照明系１１は、レーザ光源２１と、シャッタ２２と、全反射ミラー３２とを備えており、全反射ミラー３２を介して励起照明系１１と顕微鏡本体１５とが接続されている。
　レーザ光源２１は、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光Ｌ１を顕微鏡本体１５に供給する光源である。レーザ光源２１は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光Ｌ１を射出するものであればよい。例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などをレーザ光源２１として用いることができる。
　シャッタ２２は、顕微鏡本体１５への励起光Ｌ１の供給、停止を切り替える装置である。例えば、シャッタ２２は、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１を遮蔽する遮光部材と、この遮光部材を励起光Ｌ１の光路に対して進退させる駆動装置とを備えた構成とすることができる。あるいはシャッタ２２として、ＡＯＴＦ（Acousto-Optic Tunable Filter；音響光学フィルタ）を用いても良い。全反射ミラー３２は、レーザ光源２１から照射される励起光Ｌ１を後述する顕微鏡本体１５のステージ３１に向けて全反射させるためのものである。
　このような構成に基づき、励起照明系１１は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）の全域に対して励起光Ｌ１を照射する。
　一方、活性化照明系１３は、レーザ光源４２と、スキャナ４３と、ダイクロイックミラー３３とを備えており、ダイクロイックミラー３３が励起光Ｌ１の光路上に挿入されることで、活性化照明系１３と顕微鏡本体１５とが接続されている。ダイクロイックミラー３３は、レーザ光源４２から照射される活性化光Ｌ２をステージ３１に向けて反射させるとともに、励起光Ｌ１をステージ３１に向けて透過させるためのものである。
　レーザ光源４２は、蛍光物質を活性化するための活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５に向けて照射する。レーザ光源４２は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光Ｌ２を射出するものであればよい。例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などをレーザ光源４２として用いることができる。
　スキャナ４３は、活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５のステージ３１上で走査する。スキャナ４３としては、例えば、二軸のガルバノスキャナを用いることができる。
　このような構成に基づき、活性化照明系１３は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）に対して、活性化光Ｌ２をスキャナ４３により走査しながら照射可能になっている。
　なお、光源１２として、レーザ光源２１とレーザ光源４２とを１つの筐体内に備え、複数種のレーザ光を射出可能に構成されたレーザ光源装置を採用してもよい。このようなレーザ光源装置を備える場合、レーザ光源装置とともにシャッタ２２やスキャナ４３を備えた照明系を構成することで、１つの照明系により励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２の両方を顕微鏡本体１５に供給可能となる。
　上記顕微鏡本体１５は、例えば、倒立顕微鏡から構成されるものである。顕微鏡本体１５は、観察対象である試料を載置するステージ３１を備えている。また、顕微鏡本体１５には、ステージ３１に載置された試料の蛍光画像を撮像するカメラ３４が接続されている。カメラ３４としては、例えば複数の画素を有したＣＣＤカメラを用いている。
　また図示は省略しているが、顕微鏡本体１５には、ステージ３１に励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を照射する対物レンズや、試料内の蛍光物質から放射された蛍光（観察光）をカメラ３４の受光面に結合させる結像レンズなどが設けられている。上記対物レンズ及び結像レンズは、ステージ３１に載置される試料を観察する結像光学系を構成している。
　ステージ３１は、試料に貼り付けられたカバーガラスと試料との界面で励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を全反射させる全反射照明が可能に構成されている。全反射照明によれば、照明光（励起光Ｌ１、活性化光Ｌ２）が全反射する際にカバーガラスから試料側へにじみ出るエバネッセント光により試料を照明することができる。エバネッセント光が届く範囲は界面から１００～１５０ｎｍ程度の範囲に限られる。そのため、カバーガラス表面近傍に位置する蛍光物質のみを発光させることができ、バックグランウドの蛍光を著しく低減することで高いＳ／Ｎ比で実現することができる。
　なお、本実施形態の顕微鏡本体１５は、上記の全反射照明と、通常の落射照明とを切り替えて使用可能に構成されている。
　上記制御部１４は、顕微鏡装置１０を総合的に制御するコンピュータであり、光源（レーザ光源２１，４２）１２と、記憶部１６と、表示部１７と、カメラコントローラ１９とに接続されている。本実施形態において、制御部１４は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能と、カメラコントローラ１９を介して蛍光画像を取得する蛍光画像取得機能と、取得した蛍光画像を解析する画像解析機能と、光源１２の駆動を制御する光源制御機能と、複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像形成機能と、を有する。すなわち、制御部１４は、全体の機能として試料画像を生成する画像生成部を構成するものである。光源制御機能としては、光源４２，２１の射出光強度を制御する照射強度制御機能を含む。また、制御部１４は、蛍光画像の輝点情報に基づいて目標輝点数や輝点密度を計算する計算機能（詳細は後述）を含む。
　記憶部１６は、例えば半導体メモリやハードディスクなどからなり、制御部１４において使用されるプログラムや制御部１４から供給されるデータ（蛍光画像など）を、制御部１４から読出可能な状態で記憶する。
　表示部１７は、例えばモニタ（表示装置）やプリンタ（印刷装置）であり、制御部１４から出力される画像データに基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。本実施形態では、表示部１７としてモニタを用いている。
　カメラコントローラ１９は、顕微鏡本体１５に接続されたカメラ３４を駆動制御する。カメラコントローラ１９は、制御部１４から入力される制御信号に基づいてカメラ３４を動作させ、試料から放射された蛍光の画像を取得し、取得した蛍光画像を制御部１４に出力する。
　顕微鏡装置１０は、表示部１７に所定の情報が表示される。所定の情報としては、例えば後述のＳＴＯＲＭによる画像生成時の初期設定や画像生成中の蛍光画像の情報等を例示できる。ここで、顕微鏡装置１０が表示部１７に表示する画像表示ウインドウの構成について説明する。図２は画像表示ウインドウ２３の構成を示す図である。なお、図２は１種類の蛍光物質を含んだ試料についてＳＴＯＲＭ画像処理を行う場合の画像表示ウインドウ２３を示している。
　本実施形態に係る画像表示ウインドウ２３は、図２に示すように、第１表示領域２３Ａ、第２表示領域２３Ｂ、第３表示領域２３Ｃ、及び第４表示領域２３Ｄを含む。
　本実施形態に係るＳＴＯＲＭ撮影処理では、試料に対して活性化光Ｌ２を１回照射した後、励起光Ｌ１を試料に３回照射する動作を行っている。そして、励起光Ｌ１を照射するごとに試料に付着した蛍光物質が発した蛍光画像をカメラ３４で撮像している。ここで、励起光Ｌ１を１回照射するとともにカメラ３４が蛍光画像を撮像する期間を「１フレーム」と称す。この場合、ＳＴＯＲＭ撮影処理では３フレームごとに試料に対して活性化光Ｌ２を照射しており、試料に対する活性化光Ｌ２の照射期間と３フレーム分の期間とを合わせて「１ピリオド」と称す。
　第１表示領域２３Ａには、図２に示されるようにＳＴＯＲＭ画像処理中にカメラ３４が撮像した３ピリオド分の蛍光画像における輝点の数を示す棒グラフが表示されている。すなわち、第１表示領域２３Ａには、１ピリオドあたり３本、合計９本の棒グラフが同時に表示されている。ここで、１ピリオド分の棒グラフは時間の経過に伴って第１表示領域２３Ａの左側に順次移動し、新たなピリオドの棒グラフが表示される。
　また、各棒グラフは現在撮像中の蛍光画像における輝点数の数値を上部に表示する機能を有している。これにより、ユーザは棒グラフを目視することで輝点数の実測値を容易に判別できる。
　また、画像表示ウインドウ２３には、１フレーム分の棒グラフを第１表示領域２３Ａに表示する間隔を調整するサンプリング間隔を入力可能なサンプリング間隔入力ボックス２５が設けられている。サンプリング間隔入力ボックス２５に所望の数値を入力することで第１表示領域２３Ａに表示される１フレーム分の棒グラフを間引くことが可能となっている。これにより、第１表示領域２３Ａに表示される棒グラフの視認性を向上させることが可能となっている。
　第２表示領域２３Ｂには光源１２の各レーザ光源２１、４２の出力（強度）を調整するための調整バー６１、６２が表示されている。調整バー６１は、励起光Ｌ１を照射するレーザ光源２１の強度を調整するためのものである。調整バー６２は、活性化光Ｌ２を照射するレーザ光源４２の強度を、例えば０．１％刻みで０～１００％の範囲で調整するためのものである。制御部１４は、調整バー６１、６２の設定値に基づいて光源１２の各レーザ光源２１，４２の強度調整を行う。すなわち、ユーザは調整バー６１、６２を移動させることで、各レーザ光源２１，４２の強度を調整可能となっている。また、調整バー６１、６２の近傍には、現在のレーザ光源２１、４２の出力値を示す出力表示部６１ａ、６２ａが設けられている。
　また、第２表示領域２３Ｂには上記調整バー６１、６２に加え、輝点数設定ボタン３０及び撮像終了ボタン３５が設けられている。ユーザが輝点数設定ボタン３０をクリックしたタイミングで、例えば、第１表示領域２３Ａに表示される最新のピリオドにおける最初の棒グラフが示す輝点数を、制御部１４が記憶部１６に取り込む。制御部１４は、記憶部１６に記憶した輝点数を後述の目標輝点数として設定する。なお、上記目標輝点数は、輝点数設定ボタン３０をクリックする毎に更新可能である。
　また、上記撮像終了ボタン３５は、ユーザがクリックしたタイミングで、顕微鏡装置１０がＳＴＯＲＭの画像取得動作を終了させるためのものである。これにより、顕微鏡装置１０は、後述のようにＳＴＯＲＭ画像処理をユーザが望む任意のタイミングで適宜終了させることが可能である。
　また、第３表示領域２３Ｃは、第１表示領域２３Ａおよび第２表示領域２３Ｂに隣接して設定されている。第３表示領域２３Ｃの上段部には、１ピリオド分の総輝点数（３フレーム分の輝点数の合計）を示す棒グラフが表示されている。この棒グラフは、４本ずつ（４ピリオド分）を一単位として表示されている。横軸方向はピリオド数に対応し、縦軸方向は各ピリオドの総輝点数に対応している。なお、棒グラフは時間の経過に伴って第３表示領域２３Ｃの左側に順次移動することで新たなピリオドの棒グラフが更新されて表示される。なお、各棒グラフの上部には、各々の総輝点数の数値が表示される。これにより、ユーザは棒グラフを目視することで総輝点数の実測値を瞬時に判断できる。
　また、第３表示領域２３Ｃの下段部には、各ピリオドにおける総輝点数（上記の各棒グラフの値に相当）を示す折れ線グラフが表示される。この折れ線グラフの横軸はピリオド数を示し、縦軸は総輝点数を示している。ユーザは、この折れ線グラフを目視することで各ピリオドにおける総輝点数の経時的な変化の状況を容易に判別可能となっている。
　また、第３表示領域２３Ｃは、第１の入力ボックス６３、第２の入力ボックス６４、及びアイコン部６５が設けられている。第１の入力ボックス６３は棒グラフの輝点数の下限値を入力するためのものである。第２の入力ボックス６４は上記棒グラフの上限値を入力するためのものである。アイコン部６５は、上記グラフのオートスクロールの実行、或いは、非実行を選択可能とするためのものである。ユーザは、アイコン部６５をクリックして選択することでグラフのオートスクロールの実行の可否を切り替えることができる。これにより第３表示領域２３Ｃに表示されるグラフは、ユーザの要望に応じてオートスクロールすることで、随時更新させることが可能となっている。
　また、第４表示領域２３Ｄは、後述の試料画像生成ステップにより生成されるＳＴＯＲＭ画像Ｇ１を表示するためのものである。ここで、ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１では、撮影された蛍光の輝点を＋印で示している。ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１は各輝点（＋印）が同一の輝度で表示試料の形状を高解像で示している。ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１は、試料画像生成ステップの進行に伴って輝点が追加されていくため、次第に試料の微細形状を表示できる。また、第４表示領域２３Ｄには、現在表示しているＳＴＯＲＭ画像Ｇ１における総輝点数を表示する輝点数表示部５０が設けられている。
　なお、画像表示ウインドウ２３に対し、上記第１表示領域２３Ａ、第２表示領域２３Ｂ、第３表示領域２３Ｃ、及び第４表示領域２３Ｄの各々について表示、或いは、非表示を選択可能なアイコン部を設けるようにしても構わない。このようにすれば、ユーザは必要に応じてアイコン部をクリックすることで、第１表示領域２３Ａ、第２表示領域２３Ｂ、第３表示領域２３Ｃ、及び第４表示領域２３Ｄを選択的に画像表示ウインドウ２３上に表示可能となるので、必要な情報のみを容易に取得できる。
　続いて、顕微鏡装置１０によるＳＴＯＲＭによる試料画像生成方法について説明する。
　本実施形態では、顕微鏡装置１０のステージ３１上にセットする試料として、標識として蛍光物質を付与されたものを用いる。試料は、例えば培養液に浸漬された細胞などである。また、蛍光物質としては、活性化状態で活性化光Ｌ２とは異なる波長の励起光Ｌ１を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質が用いられる。また、この蛍光物質は、励起光Ｌ１が照射されることで蛍光を発して不活性化した後、再度活性化光Ｌ２が照射されると再び活性化状態となる。具体的には、米国特許公開第２００８／００３２４１４号明細書に記載されたものを用いることができる。例えば、２種類のシアニン染料を結合させた染料対（Ｃｙ３－Ｃｙ５染料対、Ｃｙ２－Ｃｙ５染料対など）を蛍光物質として用いることができる。
　上記の染料対において、一方の染料（第１の染料）が励起光により発光する光放射部分を形成し、他方の染料（第２の染料）が、光照射に応答して第１の染料を活性化するか、あるいは第１の染料の状態を切り替えるスイッチとして機能する活性化部分を形成する。例えば、Ｃｙ３－Ｃｙ５染料対では、Ｃｙ５が光放射部分であり、Ｃｙ３はＣｙ５を活性化可能な活性化部分である。したがって、Ｃｙ３－Ｃｙ５染料対を含む蛍光物質に、Ｃｙ３の吸収波長に対応する緑色レーザ（５３２ｎｍ）を照射すると、光放射部分であるＣｙ５が活性化され、Ｃｙ５が蛍光状態に移行する。そして、Ｃｙ５が蛍光状態にある蛍光物質に対してＣｙ５の吸収波長に対応する赤色レーザ（６３３ｎｍ）を照射すると、Ｃｙ５が発光するとともに、非活性状態（暗状態）に戻る。ＳＴＯＲＭでは、蛍光物質における蛍光状態と暗状態とのスイッチング動作を制御することで、試料に付与された蛍光物質のごく一部のみを選択的に発光させ、蛍光物質を１分子レベルで検出可能としている。
　ところで、ＳＴＯＲＭによる画像生成工程は、例えば数百回～数万回以上繰り返して撮像される複数の蛍光画像を合成することで行われるため、通常の顕微鏡装置に比べて画像を取得するまでに時間を要する。ＳＴＯＲＭによる画像生成を行う顕微鏡装置は、画像取得処理を終了させる際の基準として試料画像を構成する蛍光画像の総輝点数を使用している。
　本実施形態に係る顕微鏡装置１０は、ＳＴＯＲＭによる画像取得を短時間で行うことを目的とするものである。画像取得する時間を短縮する方法として、例えば１回の撮像で取得される蛍光画像の輝点数を多くすることが考えられる。このように１回の蛍光画像の撮像で取得する輝点数を多くすることで、少ない枚数の蛍光画像で同じ総輝点数の試料画像を取得できる。よって、蛍光画像の取得枚数が少なくて済むので、結果的に試料画像を短時間で取得することが可能となる。
　ここで、活性化光Ｌ２の強度と試料の蛍光画像の輝点数とは後述のような関係を有する。図３は試料に照射される活性化光Ｌ２の強度と試料の蛍光画像の輝点数との関係を示す図である。図３に示されるように、高い輝点数を得るには、活性化光Ｌ２の強度を強くすると輝点数が増加する。これは、活性化光Ｌ２の強度が強くなることで試料内にて蛍光を発する色素の数が増えるためと考えられる。
　一方、活性化光Ｌ２の強度が所定値を超えると得られる輝点数が減少することが確認できる。これは、活性化光Ｌ２の強度が高くなることで蛍光を発する輝点の数が増加すると、輝点が密集した領域が多くなることを意味する。このような輝点が密集した領域は、カメラ３４の撮像画素内で検出パルスが重なってしまうため、いずれの輝点もカウントされない。すなわち、無効な輝点として排除されてしまう。したがって、各蛍光画像における輝点数を最大とするためには、活性化光Ｌ２の強度を最適な値に調整するのが有効である。以下、各蛍光画像における輝点を最大とする輝点数を１００％とすると、８０％～１００％までを目標輝点数と定義する。
　また、試料内で蛍光を発する色素は時間の経過と共に劣化する。そのため、同程度の蛍光強度（輝点数）を維持するには活性化光Ｌ２の強度を徐々に強くする必要がある。すなわち、レーザ光源４２の出力を一定に保持したままで蛍光画像を繰り返し撮像すると、経時的に蛍光画像から取得できる輝点数が減少してしまうこととなる。この場合、予め色素の時間の経過に対する劣化度合いを求めておき、活性化光Ｌ２の強度を自動で変化させることも可能である。
　これに対し、本実施形態では、ＳＴＯＲＭによる画像生成を行う際、上記蛍光画像の輝点数が上記目標輝点数となるように制御部１４が活性化光Ｌ２を照射するレーザ光源４２の強度を制御するようにしている。
　以下、ＳＴＯＲＭによる試料画像生成方法について具体的に説明する。図４、５は、顕微鏡装置１０による画像生成ステップを示すフローチャートである。
　まず、顕微鏡装置１０はステージ３１上に試料が配置されて駆動を開始すると、制御部１４が後述の画像測定動作を終了させるための終了条件のモードをセットする（ステップＳ１）。終了条件のモードとしては、制御部１４が自動で終了を判定するオートモードと、ユーザのマニュアル入力に基づいて終了を判断するモードとがある。セットされた終了条件のモードは、記憶部１６に保存される。
　制御部１４は終了条件をセットした後、画像測定を開始する（ステップＳ２）。制御部１４は、画像測定を開始した後、まず目標輝点数の設定を行う（ステップＳ３）。目標輝点数の設定は、セミオートモード又はフルオートモードのいずれかにより行われる。セミオートモード又はフルオートモードの選択は、予め初期設定で選択されていてもよいし、顕微鏡装置１０を駆動させる毎にユーザがその都度入力する構成であっても構わない。
　ここで、セミオートモードとは、制御部１４が光源１２（レーザ光源４２）の駆動を制御する際に指標として用いる上記目標輝点数の算出をユーザによるマニュアル操作に基づいて行い、その後のＳＴＯＲＭによる画像生成処理を自動で行うモードである（ステップＳ４）。一方、フルオートモードとは、上記目標輝点数の算出及び画像生成処理の両方を制御部１４が自動で行うモードである（ステップＳ５～Ｓ８）。すなわち、セミオートモード及びフルオートモードは、上記目標輝点数の算出方法を自動的に行うか否かのみが異なるものである。
（セミオートモード）
　制御部１４は、セミオートモードを選択した場合（ステップＳ３：Ｎｏの場合）、ユーザによるマニュアル設定に基づいて上記目標輝点数を取得する（ステップＳ４）。ステップＳ４のマニュアル設定では、ユーザが上述した第１表示領域２３Ａに表示される棒グラフの輝点数を参照しつつ、第２表示領域２３Ｂに表示される調整バー６２を調整することでレーザ光源４２の出力を調整する。なお、本説明では、励起光Ｌ１の出力を最大値（１００％）に固定した状態で活性化光Ｌ２の出力のみを調整するものとする。具体的に、ユーザは、棒グラフの輝点数が最大となるまで調整バー６２を移動し、輝点数が最大となった位置で調整バー６２の移動を終了する。ユーザが輝点数設定ボタン３０をクリックしたタイミングで、第１表示領域２３Ａに表示される最新のピリオドにおける１つ目の棒グラフが示す輝点数を、制御部１４が記憶部１６に取り込む。制御部１４は、記憶部１６に記憶した輝点数を上記目標輝点数として算出する。
　以上のように、ステップＳ３に示したセミオートモードにおいて、制御部１４がユーザによるマニュアル操作によって上記目標輝点数を設定することができる。
（フルオートモード）
　続いて、フルオートモードの場合について説明する。制御部１４は、フルオートモードが選択された場合（ステップＳ３：Ｙｅｓの場合）、目標輝点数を自動で算出する（ステップＳ５～Ｓ８）。
　具体的に、制御部１４は、レーザ光源４２の強度を所定値にセットする（ステップＳ５）。なお、励起光Ｌ１の出力を最大値（１００％）に固定した状態で活性化光Ｌ２の出力のみを調整するものとする。そして、制御部１４は、試料に対して活性化光Ｌ２を１回照射する動作と、励起光Ｌ１を３回照射する動作を行う。このとき、制御部１４は、各励起光Ｌ１を照射した際に試料が発した蛍光画像をカメラ３４から取得する（ステップＳ６）。すなわち、１ピリオド分の蛍光画像を取得する。そして、制御部１４は、該蛍光画像を解析することで輝点数に関する情報を取得し、記憶部１６に保持する（ステップＳ７）。なお、輝点数としては、各ピリオドの１フレーム目の輝点数のみを取得してもよいし、３フレーム分を合計した輝点数を取得するようにしても構わない。
　制御部１４は、輝点数を取得した後、オート設定の終了判定を行う（ステップＳ８）。制御部１４は、終了判定がＯＫでない場合（ステップＳ８：Ｎｏの場合）、ステップＳ５へと戻る。一方、制御部１４は、終了判定がＯＫの場合（ステップＳ８：Ｙｅｓの場合）、図５に示すステップＳ９へと進む。
　ステップＳ５に戻った場合、制御部１４は、先に行った蛍光画像測定時に比べて活性化光Ｌ２の強度を予め設定した分だけ強くする。すなわち、制御部１４は活性化光Ｌ２の強度を強めるように調整バー６２の位置を移動させる。そして、ステップＳ６～Ｓ７を終了判定がＯＫ（ステップＳ８：Ｙｅｓの場合）となるまで繰り返す。
　制御部１４は、上記ステップＳ７において、蛍光画像から取得した輝点数を記憶部１６に保持された直前に取得した輝点数と比較する。制御部１４は、レーザ光源４２の出力と共に輝点数が増加する場合は、取得した輝点数は最大値ではないと判断する。そして、取得動作を継続すべく、終了判定をＮｏとし、ステップＳ８を介してステップＳ５へと戻す。
　制御部１４は、上記ステップＳ７において、レーザ光源４２の出力の増加に反して輝点数が減少した場合、すなわち輝点数が増加傾向から減少傾向に転じた際、図３のグラフの頂点位置に到達したと判断する。これは、蛍光画像の輝点数は上述のように活性化光Ｌ２の出力に比例して増加するものの、活性化光Ｌ２の出力が強すぎると減少するといった特性を有するため、増加傾向から減少傾向へと変化した際の境界の輝点数を最大輝点数と推定できるからである。そして、制御部１４は、このときの最大輝点数を上記目標輝点数に設定する。また、制御部１４はこの最大輝点数が得られる活性化光Ｌ２を出力可能なレーザ光源４２の強度（出力値）を、後述の画像生成処理を行う際の初期設定値として取得する。
　以上のように、フルオートモードでは、制御部１４がステップＳ５～ステップＳ８を繰り返すことでレーザ光源４２の出力を変化させつつ、蛍光画像の輝点数の変化を解析することで上記目標輝点数を自動で設定できる。
　なお、制御部１４は、上記目標輝点数を設定する期間において取得した蛍光画像の輝点についても、後述のＳＴＯＲＭ画像を生成する際に用いるようにしている。これにより、上記目標輝点数を設定する期間に取得した輝点情報を無駄なく使用でき、ＳＴＯＲＭ撮像処理の時間を短縮できる。
　このように上述のセミオートモード或いはフルオートモードにより目標輝点数が設定された後、ステップＳ９が実行される。ステップＳ９では、各蛍光画像における輝点数が目標輝点数となるようにレーザ光源４２の強度がセットされる。なお、ステップＳ９の詳細については後述する。
　なお、上述の説明では、目標輝点数を決める方法として、活性化光源の強度を増加させた時の輝点数の増加が０となる点を最大値としたが、必ずしも極大値を取る必要は無い。最大値に対して、例えば、９０％の値を最大値としてもよい。また、輝点数の増加が０ではなく、予め定めた所定値以下となった場合の輝点数を最大値であると判断しても構わない。この場合の所定値は活性化光の強度変化率に対する輝点数の増加率で決めることもできる。
　そして、制御部１４は、ステップＳ１０へと進み、ＳＴＯＲＭによる試料画像生成を行う。ステップＳ１０では、活性化照明系１３から射出される活性化光Ｌ２が顕微鏡本体１５に供給され、ステージ３１上の試料に対して活性化光Ｌ２が照射される。このとき、励起照明系１１のシャッタ２２が閉状態とされることで励起光Ｌ１が遮断され、顕微鏡本体１５には活性化光Ｌ２のみが入射する。
　活性化照明系１３では、活性化光Ｌ２がスキャナ４３により位置制御されてダイクロイックミラー３３に入射し、ダイクロイックミラー３３で反射されてステージ３１上の観察視野の所定位置に照射される。すなわち、スキャナ４３により活性化光Ｌ２が観察視野全域に対して走査され、視野全域の試料に対して均一な強度の活性化光Ｌ２が照射される。これにより、視野全域にわたって試料に含まれる蛍光物質が再度活性化される。
　なお、活性化光Ｌ２は全反射照明、落射照明のいずれの形態で試料に照射してもよい。
　図６は、全反射照明により活性化光Ｌ２（あるいは励起光Ｌ１）を試料Ｓに照射する場合を示す説明図である。図６に示すように、ステージ３１のカバーガラス３１ａ上に試料Ｓが配置されており、活性化光Ｌ２はカバーガラス３１ａの下方からカバーガラス３１ａの表面に対して斜めに入射する。そして、活性化光Ｌ２はカバーガラス３１ａと試料Ｓとの界面で全反射され、上記界面から試料側へにじみ出すエバネッセント光ＥＶが試料Ｓの界面側表層に照射される。これにより、試料Ｓのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。なお、落射照明の場合には、カバーガラス３１ａの法線方向に活性化光Ｌ２を入射させ、カバーガラス３１ａを透過させた活性化光Ｌ２を試料Ｓに照射する。この場合、試料Ｓの厚さ方向の全体に活性化光Ｌ２が照射される。
　ここで、顕微鏡装置１０が全反射照明モードにある場合には、図６に示したように、活性化光Ｌ２はエバネッセント光ＥＶとして試料Ｓに照射され、試料Ｓのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。
　次に、活性化照明系１３が活性化光Ｌ２を射出しない状態とされるとともに、励起照明系１１のシャッタ２２が開状態とされ、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１が全反射ミラー３２を介して顕微鏡本体１５に供給される。これにより、励起光Ｌ１が観察視野全域に照射され、活性化光Ｌ２で活性化されている蛍光物質のみが選択的に発光する。なお、励起光Ｌ１の照射は上述のように３回行われる。蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を動作させることで撮影し、各蛍光画像を取得できる。撮影された蛍光画像はカメラコントローラ１９から制御部１４に送信される。このようにして、制御部１４は蛍光画像を取得する。なお、制御部１４は取得した蛍光画像を記憶部１６に記録する。そして、制御部１４は、複数の蛍光画像を合成することでＳＴＯＲＭ画像Ｇ１を生成し、このＳＴＯＲＭ画像Ｇ１は第４表示領域２３Ｄに表示される。
　本実施形態では、発光した蛍光物質は発光後に不活性化されるため、活性化光Ｌ２の照射が再度行われる場合に試料に含まれる蛍光物質は不活性状態となっている。そのため、活性化光Ｌ２の照射時に活性化される蛍光物質は確率的に異なるものとなり、取得される蛍光画像は前のサイクルで取得された蛍光画像と異なる輝点パターンを示すものとなる。
　制御部１４は、ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１を生成したならば、ステップＳ１１～ステップＳ１３においてＳＴＯＲＭ画像生成ステップを終了させるか否かについて判定する。まず、制御部１４はステップＳ１により記憶部１６に保存された終了条件を読み出し、終了条件がオートか否かを判定する（ステップＳ１１）。
　終了条件がオートである場合（ステップＳ１１：Ｙｅｓの場合）、制御部１４は、ステップＳ１２へと進む。ステップＳ１２において、制御部１４が所定の終了条件を満たすか否かを自動で判定する。所定の終了条件としては、例えばレーザ光源２１の出力を１００％に設定した状態で蛍光画像の１フレームあたりの輝点数が上記目標輝点数以下となっている場合（第１の終了条件）、或いはＳＴＯＲＭ撮影処理により取得した総輝点数が予め設定した設定値に到達した場合（第２の終了条件）等の条件を満たしている場合を例示できる。
　制御部１４は、ＳＴＯＲＭ画像生成を中止することで画像生成時間が無駄に長くなるといった不具合の発生を防止できる。また、上記第２の終了条件の場合、制御部１４は試料に関する高精細な画像を示す総輝点数が得られたものと判断し、ＳＴＯＲＭ画像生成を終了させるので、効率的に画像生成を行うことができる。
　制御部１４は、終了条件を満たすと判定した場合（ステップＳ１２：Ｙｅｓの場合）、ＳＴＯＲＭ画像生成ステップを終了させる。一方、制御部１４は、終了条件が満たされないと判定した場合（ステップＳ１２：Ｎｏの場合）、ステップＳ９に戻り、上述したステップＳ９、Ｓ１０を繰り返し実行する。
　終了条件がオートでない場合（ステップＳ１１：Ｎｏの場合）、制御部１４は、ステップＳ１３へと進む。ステップＳ１３においては、ユーザの指示、例えばユーザにより撮像終了ボタン３５がクリックされた場合（ステップＳ１３：Ｙｅｓの場合）にＳＴＯＲＭ画像生成を終了させる。一方、ステップＳ１３において、制御部１４は上記撮像終了ボタン３５がクリックされない場合（ステップＳ１３：Ｎｏの場合）、ステップＳ９に戻り、上述したステップＳ９、Ｓ１０を繰り返し実行する。
　本実施形態に係る顕微鏡装置１０は、第４表示領域２３ＤにＳＴＯＲＭ画像Ｇ１が表示されるとともに、輝点数表示部５０にＳＴＯＲＭ画像Ｇ１の総輝点数が表示される。よって、ユーザはＳＴＯＲＭ画像Ｇ１、或いは、総輝点数に基づいて、所望の画像が得られたか否かについて判断できる。すなわち、制御部１４は、上記撮像終了ボタン３５のクリックの可否をもってユーザによるＳＴＯＲＭ画像生成の終了命令が出たと判断する。
　上述のようにステップＳ１１～ステップＳ１３を経てステップＳ９に戻った場合、制御部１４は各蛍光画像における輝点数が目標輝点数となるようにレーザ光源４２の強度を再セットする。具体的に、制御部１４は前回の画像取得時に記憶部１６に記憶した蛍光画像の輝点数と目標輝点数とを比較し、差分を取る。そして、前回取得した輝点数が目標輝点数よりも高いか低いかを判定する。制御部１４は、前回取得した輝点数が目標輝点数よりも低い場合、目標輝点数を得るべく、レーザ光源４２の強度を前回の設定値よりも強く設定する。また、制御部１４は、前回取得した輝点数が目標輝点数よりも高い場合、レーザ強度を前回の設定値よりも低く設定する。また、制御部１４は、前回取得した輝点数が目標輝点数とほぼ同じ場合、レーザ強度の設定値を維持する。ここで、ほぼ同じとは、所定閾値内の差がある場合も含む。
　このように、本実施形態に係る顕微鏡装置１０は、制御部１４がレーザ光源４２の強度を調整しつつ活性化光Ｌ２を試料に照射する動作と、励起光Ｌ１を照射して蛍光画像を得る動作とを、数百回から数万回繰り返し、輝点の位置が異なる蛍光画像を数百枚～数万枚取得し、取得した多数の蛍光画像を合成することで、ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１を生成できる（ステップＳ９～ステップＳ１０）。
　以上により、ＳＴＯＲＭによる試料画像生成方法が終了する。
　なお、顕微鏡装置１０は、ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１の生成時において、第１表示領域２３Ａ、第２表示領域２３Ｂ、第３表示領域２３Ｃ、及び第４表示領域２３Ｄに、ＳＴＯＲＭ画像Ｇ１以外の情報が随時表示されている。
　本実施形態では、制御部１４が上述のように目標輝点数を維持するようにレーザ光源２１の強度を調整している。そのため、第３表示領域２３Ｃの下段に表示されるグラフが示す１ピリオド分の蛍光画像の総輝点数は一定値Ｍを維持した状態となる（図２参照）。これは、制御部１４が目標輝点数を維持するようにレーザ光源２４の強度を調整したことによる効果である。
　本実施形態に係る顕微鏡装置１０によれば、制御部１４が蛍光画像の輝点数が目標輝点数（最大値）となるようにレーザ光源４２の駆動を制御する。そのため、例えば同一の試料についてＳＴＯＲＭによる画像生成を行う際、レーザ光源４２の駆動を制御しない場合に比べ、より少ない枚数の蛍光画像で同じ総輝点数のＳＴＯＲＭ画像Ｇ１を取得できる。すなわち、本実施形態に係る顕微鏡装置１０によれば、短時間で高精細なＳＴＯＲＭ画像を取得できる。
　なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１０は、ＳＴＯＲＭ画像処理時に１種類の蛍光物質を含んだ試料に代え、２種類以上（例えば、３種類）の蛍光物質を含んだ試料を用いることができる。このような２種類以上の蛍光物質を含む試料を用いる場合、励起照明系１１がレーザ光源２１とは別に異なる波長の光を照射するレーザ光源をさらに２つ備えた構成が必要となる。これは、２種類以上の蛍光物質はそれぞれ適合する励起光Ｌ１の波長が異なるためである。
　図７は３種類の蛍光物質を含んだ試料についてＳＴＯＲＭ画像処理を行う場合における画像表示ウインドウ２３の第２表示領域２３Ｂの構成を示す図である。図７に示すように、３種類の蛍光物質を含んだ試料を用いる場合、第２表示領域２３Ｂには調整バー６１、６２がそれぞれ３個ずつ設けられている。各調整バー６１、６２は、それぞれ異なる蛍光物質に対応するものである。この場合、制御部１４は、セミオートモードにおいてはユーザ設定に基づき、フルオートモードにおいては自動で各レーザ光源に対応した目標輝点数を算出する。
　図８は３種類の蛍光物質を含んだ試料についてＳＴＯＲＭ画像処理を行う場合における画像表示ウインドウ２３の第３表示領域２３Ｃの構成を示す図である。図８に示すように、３種類の蛍光物質を含んだ試料を用いる場合、１ピリオド分の総輝点数（３フレーム分の輝点数の合計）を示す棒グラフが３段に亘って表示されている。各段の棒グラフは、３種類のレーザ光源（活性化光Ｌ２）の各々に対応するものである。また、３種類の蛍光物質を含んだ試料を用いる場合、各ピリオドにおける総輝点数を示す折れ線グラフには、３本のグラフが表示される。各グラフは、３種類のレーザ光源（活性化光Ｌ２）の各々に対応するものである。
　このように本実施形態に係る顕微鏡装置１０によれば、光源１２として複数種類の活性化光を照射するレーザ光源を備えた構成であっても、制御部１４が、レーザ光源の各々に対応した目標輝点数を算出し、この目標輝点数に基づいて各レーザ光源の駆動を制御することにより３種類の蛍光物質を含む試料のＳＴＯＲＭ画像を短時間で取得できる。
　（第２実施形態）
　上記実施形態では、活性化用と励起用に波長の異なる２つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、１つの短波長レーザのみを用いる超解像顕微鏡技術として、ｄＳＴＯＲＭ（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば、論文：Applied Physics B(2008)93: 725-731, Photoswitching microscopy with standard fluorophores、 S.van de Linde・R.Kasper・ M.Heilemann・ M.Sauer）。ｄＳＴＯＲＭによれば、従来のＳＴＯＲＭのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光物質のみの画像を取得できる。
　第２の実施形態の顕微鏡装置は、このｄＳＴＯＲＭを適用した構成である。
　第２の実施形態の顕微鏡装置としては、図１に示した顕微鏡装置１０から活性化照明系１３を省略した構成を採用することができる。かかる構成の顕微鏡装置では、励起照明系１１によって所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料を顕微鏡本体１５のステージ３１上の観察領域に配置し、この観察領域に対して、励起照明系１１から励起光を照射することで蛍光物質を明滅させ、蛍光物質から放射される光をカメラ３４により撮像することで蛍光画像を取得する。
　第２実施形態に係る顕微鏡装置において、制御部１４は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の励起光を照射する動作と、観察領域の励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。このように本実施形態の場合、試料から蛍光を生じさせる手段として、活性化照明系１３ではなく、励起照明系１１が用いられる。
　したがって、本実施形態においても、蛍光画像の輝点数が目標輝点数となるように励起光を照射するレーザ光源の出力を制御部１４が調整し、取得した複数枚の蛍光画像を合成して試料画像を生成できる。
　以上に説明したように第２実施形態によれば、第１実施形態と同様に、蛍光画像の輝点数が目標輝点数となるようにレーザ光源の出力を調整して画像生成が行われるので、ｄＳＴＯＲＭを用いた場合であっても短時間で高精細な画像を取得できる。
　（第３実施形態）
　先の第１実施形態では、活性化後に励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を用いた顕微鏡技術（ＳＴＯＲＭ）に関して説明したが、蛍光物質の種類が異なる同様の技術として、ＰＡＬＭ（Photoactivated Localization Microscopy）も知られている（例えば、特表２００８－５４２８２６号公報、論文：Proposed method for molecular optical imaging, Optics Letters, vol.20, No.3, (Feb.1, 1995), pp.237-239.）。
　先の第１実施形態の観察方法の手順は、試料画像の取得にＰＡＬＭを用いる場合にもそのまま適用され、顕微鏡装置１０の構成変更も不要である。顕微鏡装置１０において、制御部１４は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の活性化光を照射する動作と、励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。
　ＰＡＬＭを用いる場合には、試料に付与される蛍光物質が変更される。具体的には、蛍光物質として、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質が用いられる。
　このような蛍光物質としては、クラゲやサンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種が挙げられる。例えば、クラゲ由来の蛍光タンパク質の変異種であるPA-GFPは、活性化光の照射により蛍光強度が大幅に上昇し、PS-CFPは、活性化光の照射により他の色の蛍光を発光可能に変化する。また、サンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種であるDronpaは、活性化光の照射により励起波長の光の照射による発光が可能になり、Kaedeは、活性化光の照射により蛍光色が変化する。
　本実施形態においても、蛍光画像の輝点数が目標輝点数となるように活性化光を照射するレーザ光源の出力を制御部１４が調整し、取得した複数枚の蛍光画像を合成して試料画像を生成できる。
　以上に説明したように第３実施形態によれば、第１実施形態と同様に、蛍光画像の輝点数が目標輝点数となるようにレーザ光源の出力を調整して画像生成が行われるので、ＰＡＬＭを用いた場合であっても短時間で高精細な画像を取得できる。
　なお、本発明は上記実施形態に限定されることは無く、発明の趣旨を逸脱しない範囲内において適宜変更可能である。例えば、上記第１実施形態では蛍光画像のそれぞれについて取得した輝点数と目標輝点数とを比較し、連続的にレーザ光源４２の出力を制御する場合を例として説明したが、所定枚数（例えば、数百枚）の蛍光画像を撮像する毎に目標輝点数との比較を行うことで断続的にレーザ光源４２の出力を制御する構成であっても構わない。
　また、上述した第１実施形態のＳＴＯＲＭ撮影処理、及び第３実施形態のＰＡＬＭ撮影処理において、励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２とを試料に対して異なるタイミングで照射する場合を例に説明したが、試料に励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を同時に照射する構成であっても構わない。なお、励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２の照射開始タイミング及び照射終了タイミングは一致している必要はなく、少なくとも同時に実行される期間を有していればよい。励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２が同時に照射されることで、蛍光物質の活性化、励起をほぼ同時に進行させ蛍光物質を発光させるので、先の実施形態に比べて画像取得に要する時間を短縮でき、効率良く超解像画像の測定及び作成を行うことができる。
　また、上記実施形態のように、１回の活性化光照射に対して、複数回の励起光照射及び画像取得が行われる場合には、試料に対して活性化光Ｌ２を照射している期間に、少なくとも１回の励起光Ｌ１の照射を行えばよい。例えば励起光Ｌ１の照射を３回行う場合に、最初の励起光Ｌ１の照射期間を活性化光Ｌ２との同時照射期間とすればよく、活性化光Ｌ２の照射期間中に２回の励起光Ｌ１の照射を行ってもよい。
さらに、第１実施形態から第３実施形態の例以外に、例えば、STORM画像取得時間の律則は、蛍光による輝点を形成する、活性化された状態の蛍光物質の密度に依存するので、その密度が、画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって、設定した目標輝点密度となるように、所定のタイミングで取得された画像の少なくとも一部の領域における点の密度に基づいて、活性化光の照射強度を調整する（フィードバック制御する）構成にしてもよい。
　また、蛍光物質が、活性化された状態で、励起光の照射開始から次の活性化の開始までの時間は、蛍光による輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、励起光の照射強度を調整する（フィードバック制御する）構成にしてもよい。
画像の少なくとも一部の領域における輝点の密度とは、例えば、標本中の蛍光物質（分子）の密度が高い部分領域に対応する画像中の像の密度、標本中の選択した部分領域に対応する画像中の輝点の密度、標本中の蛍光物質が存在する全ての領域に対応する画像中の輝点の密度である。
標本中の選択した部分領域は、予め標本を通常の光学分解能の顕微鏡で画像を取得しておき、画像中の標本のうち、超解像で観察すべき領域をマウスなどで指定することにより特定する。
目標輝点密度は、蛍光波長／開口数で決まる一般的な解像限界を半径とする円に領域（面積）に輝点が例えば０．１から１個存在する場合の密度に設定する。この場合、上記（ＰＣＴ出願時明細書の段落００６２）で述べたような、撮像画素内で検出パルスが重なった場合には、いずれの輝点もカウントしないような処理方法は適用せず、すべての輝点を計数することが望ましい。
さらに、STORM画像取得時間の律則は、蛍光による輝点を形成する、活性化された状態の蛍光物質の密度に依存するので、その密度が、画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって、設定した目標輝点密度となるように、所定のタイミングで取得された画像の少なくとも一部の領域における点の密度に基づいて、励起光の照射強度を調整する（フィードバック制御する）構成にしてもよい。
蛍光物質の明滅とは、明が蛍光物質が活性化された状態であり、滅が蛍光物質が励起光の照射により蛍光を発し、非活性化された状態である。明滅の周期は、活性化された状態から励起光に照射により蛍光を発し、非活性化された状態までを１周期とする。
　また、蛍光物質の明滅の周期が、蛍光による輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、励起光の照射強度を調整する（フィードバック制御する）構成にしてもよい。
なお、上述の各実施形態の要件は、適宜に組み合わせることができる。一部の構成要素を用いない場合もある。法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した全ての特許文献（公開公報及び米国特許を含む）の開示を援用して本文の記載の一部とする。
１０…顕微鏡装置、１４…制御部、１２…光源、４２…レーザ光源、Ｇ１…ＳＴＯＲＭ画像、Ｌ１…励起光、Ｌ２…活性化光

Claims (18)

  1. 　活性化光によって活性化された状態で励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質、或いは所定波長の前記励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に対し、前記活性化光又は前記励起光の少なくとも一方を照射する光源と、
    　前記観察領域に前記活性化光及び前記励起光の少なくとも一方を照射する動作を含む動作を複数回繰り返すことで取得された複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像形成部と、
    　前記取得される前記蛍光画像の少なくとも一部の領域の輝点数が目標輝点数となるように前記活性化光又は前記励起光の照射強度を調整する照射強度調整部と、
    を有する顕微鏡装置。
  2. 　前記目標輝点数は、強度を異ならせた前記活性化光又は前記励起光を前記観察領域に照射する動作を複数回繰り返すことで取得した複数の前記蛍光画像の輝点情報に基づいて設定される請求項１に記載の顕微鏡装置。
  3. 　前記画像形成部は、前記輝点情報を前記試料画像の生成に用いる、請求項２に記載の顕微鏡装置。
  4. 　前記画像形成部は、取得した前記蛍光画像の総輝点数に基づいて前記試料画像の生成を終了する、請求項１～３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  5. 　前記画像形成部は、前記照射強度を調整した後に取得した前記蛍光画像の輝点数と前記目標輝点数とを比較し、前記比較結果に基づいて前記試料画像の生成を終了する、請求項１～３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  6. 　前記画像形成部は、前記観察領域に対して前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光が照射された後の前記観察領域に前記励起光を照射して前記蛍光画像を取得する動作とを交互に繰り返すことにより得られた複数の前記蛍光画像を取得する、請求項１～５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  7. 　前記光源は、前記活性化光と前記励起光とが観察領域に所定の期間において同時に照射されるように制御される請求項１～５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  8. 　活性化光によって活性化された状態で励起光が照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料に対して、前記活性化光及び前記励起光を前記試料に照射することにより発生する前記蛍光による輝点の画像を取得する画像取得部と、
    前記活性化光の照射強度を調整する強度制御部とを備え、
    前記強度制御部は、所定のタイミングで取得された前記画像の少なくとも一部の領域における前記輝点の密度に基づいて、前記活性化された状態の前記蛍光物質の密度が、前記画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって、設定した目標輝点密度となるように、前記活性化光の照射強度を調整することを特徴とする顕微鏡装置。
  9. 　前記画像取得部は、強度が異なる前記活性化光を前記試料に照射する毎に取得した前記画像の前記輝点の密度に基づいて、前記目標輝点密度を特定する請求項８に記載の顕微鏡装置。
  10. 　前記蛍光物質が前記活性化された状態で、前記励起光の照射開始から次の前記活性化光の照射開始までの時間が前記輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、前記強度制御部は、前記励起光の照射強度を調整する請求項８又は９に記載の顕微鏡装置。
  11. 　前記画像取得部は、前記輝点の情報を前記試料の画像の生成に用いる請求項８～１０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  12. 　前記蛍光物質の、前記活性化された状態及び前記蛍光を発する状態は、前記試料に前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光が照射された後の前記試料に前記励起光を照射して形成する動作とを交互に繰り返す請求項８～１１のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  13. 　前記蛍光物質の、前記活性化された状態及び前記蛍光を発する状態は、前記試料に対して前記活性化光を照射する動作と前記励起光を照射する動作とを少なくとも一部の期間において同時に実行することにより形成する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
  14. 　励起光が照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料に対して、前記励起光を前記試料に照射することにより発生する蛍光による輝点の画像を取得し、前記輝点の密度を算出する画像取得部と、
    前記励起光の照射強度を調整する強度制御部とを備え、
    前記強度制御部は、所定のタイミングで取得された前記画像の少なくとも一部の領域における前記輝点の密度に基づいて、前記明滅する前記蛍光物質の密度が、前記画像取得部の解像限界に基づいて定まる輝点密度以下であって設定した目標輝点密度となるように、前記励起光の照射強度を調整することを特徴とする顕微鏡装置。
  15. 　前記画像取得部は、強度が異なる前記励起光を前記試料に照射する毎に取得した前記画像の前記輝点に密度に基づいて、前記目標輝点密度を特定する請求項１４に記載の顕微鏡装置。
  16. 　前記蛍光物質の前記明滅の周期が前記輝点を取得できる時間以上であって、設定した目標値以下となるように、前記強度制御部は、前記励起光の照射強度を調整する請求項１４又は１５に記載の顕微鏡装置。
  17. 　前記画像取得部は、前記輝点の情報を前記試料の画像の生成に用いる、請求項１４に記載の顕微鏡装置。
  18. 　前記画像取得部は、取得した前記画像の前記輝点の数を累積加算した総輝点数に基づいて前記試料の画像の生成を終了する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
PCT/JP2012/067065 2011-07-04 2012-07-04 顕微鏡装置 WO2013005765A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011148229 2011-07-04
JP2011-148229 2011-07-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013005765A1 true WO2013005765A1 (ja) 2013-01-10

Family

ID=47437112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/067065 WO2013005765A1 (ja) 2011-07-04 2012-07-04 顕微鏡装置

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2013005765A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568877A (zh) * 2014-12-25 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于led光源的随机光学重建显微成像***及方法
JP2019049756A (ja) * 2018-12-12 2019-03-28 株式会社ニコン 顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラム
CN113470167A (zh) * 2021-06-28 2021-10-01 平湖莱顿光学仪器制造有限公司 一种用于呈现三维显微图像的方法与设备

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005345764A (ja) * 2004-06-03 2005-12-15 Olympus Corp 走査型光学装置
JP2009115891A (ja) * 2007-11-02 2009-05-28 Univ Of Tokyo 走査型顕微鏡および標本画像取得方法
JP2011039247A (ja) * 2009-08-10 2011-02-24 Nikon Corp 顕微鏡、画像処理装置、及び画像処理方法。

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005345764A (ja) * 2004-06-03 2005-12-15 Olympus Corp 走査型光学装置
JP2009115891A (ja) * 2007-11-02 2009-05-28 Univ Of Tokyo 走査型顕微鏡および標本画像取得方法
JP2011039247A (ja) * 2009-08-10 2011-02-24 Nikon Corp 顕微鏡、画像処理装置、及び画像処理方法。

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568877A (zh) * 2014-12-25 2015-04-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于led光源的随机光学重建显微成像***及方法
JP2019049756A (ja) * 2018-12-12 2019-03-28 株式会社ニコン 顕微鏡装置、観察方法、及び制御プログラム
CN113470167A (zh) * 2021-06-28 2021-10-01 平湖莱顿光学仪器制造有限公司 一种用于呈现三维显微图像的方法与设备
CN113470167B (zh) * 2021-06-28 2024-04-19 平湖莱顿光学仪器制造有限公司 一种用于呈现三维显微图像的方法与设备

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5392406B2 (ja) 顕微鏡装置、観察方法
US8704196B2 (en) Combination microscopy
JP6587004B2 (ja) 装置、システム、方法、及びプログラム
JP5289768B2 (ja) 焦点位置決定方法、焦点位置決定装置、微弱光検出装置及び微弱光検出方法
JP5623278B2 (ja) 顕微鏡および顕微鏡の操作方法
US20110226965A1 (en) Increased resolution microscopy
JP6305012B2 (ja) 顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラム
JP5747690B2 (ja) 顕微鏡装置及び画像形成方法
JP6266302B2 (ja) 顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラム
JP2007114742A (ja) 観察装置
JP2007209219A (ja) 生体試料観察計測システムおよび生体試料観察計測方法
WO2009104719A1 (ja) レーザ走査顕微鏡
JP6234072B2 (ja) 非線形光学顕微鏡装置
JP2023052796A (ja) 顕微鏡システムの制御方法、顕微鏡システム
WO2013005765A1 (ja) 顕微鏡装置
JP6246555B2 (ja) 顕微鏡撮像装置、顕微鏡撮像方法および顕微鏡撮像プログラム
WO2012144515A1 (ja) 顕微鏡装置、及び画像処理方法
JP2015018085A (ja) 画像取得装置及び画像取得方法
JP4844157B2 (ja) 走査型顕微鏡
JP2009025632A (ja) 走査型顕微鏡
JP4468642B2 (ja) 共焦点レーザ走査型顕微鏡装置及び試料情報記録方法
WO2017109983A1 (ja) 微弱発光試料の解析方法及び解析システム
JP2019159341A (ja) 顕微鏡、観察方法、及び制御プログラム
JP2006030280A (ja) 顕微鏡用照明装置、方法およびコンピュータプログラム

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12807698

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12807698

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP