WO2012173097A1 - 癌細胞接着性向上剤 - Google Patents

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WO2012173097A1
WO2012173097A1 PCT/JP2012/064932 JP2012064932W WO2012173097A1 WO 2012173097 A1 WO2012173097 A1 WO 2012173097A1 JP 2012064932 W JP2012064932 W JP 2012064932W WO 2012173097 A1 WO2012173097 A1 WO 2012173097A1
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cancer cell
cells
substrate
cancer
polymer
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PCT/JP2012/064932
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French (fr)
Inventor
上原　寿茂
賢 田中
理美 八木
隆志 干場
万葉 二階堂
佐藤　一博
千香子 佐藤
Original Assignee
日立化成工業株式会社
国立大学法人山形大学
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption

Definitions

  • the present invention relates to a cancer cell adhesion improver. More specifically, the present invention relates to a cancer cell adhesion improver, a cancer cell concentration filter, and a cancer cell inspection method.
  • CTC cancer Tumor Cell
  • Non-Patent Documents 1 and 2 As another technique for separating and concentrating CTC, a method using a polycarbonate filter has been proposed (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2). In addition, techniques for separating and concentrating CTC using the difference in size have been proposed (see, for example, Non-Patent Documents 3 to 5 and Patent Document 1).
  • Cancer cells such as CTC are slightly larger in size than blood cells in blood, such as red blood cells, white blood cells, or platelets. Therefore, theoretically, it is possible to apply these mechanical filtration methods to remove these blood cell components and concentrate the cancer cells.
  • the membrane filters of Non-Patent Documents 1 and 2 include randomly distributed pores and the pore diameter is not uniform, the cancer cell recovery rate may be poor. Further, even in the filters of Non-Patent Documents 3 to 5 and Patent Document 1 in which the pore size and thickness are accurately controlled, it may be difficult to concentrate cancer cells with an accuracy that can be accurately analyzed.
  • the inventors of the present invention have improved the adhesion of cancer cells to the surface of the material coated with a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1), while the adhesion of blood cell components decreases. It was found for the first time and the present invention was completed.
  • the present invention provides a cancer cell adhesion improver comprising a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1).
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the cancer cell adhesion improving agent of the present invention By applying the cancer cell adhesion improving agent of the present invention to the surface of a cancer cell concentration filter, it is possible to increase the adhesion of cancer cells to the filter surface and improve the concentration rate of cancer cells.
  • the cancer cell adhesion improver of the present invention can simultaneously satisfy the characteristics in a trade-off relationship between the non-adhesiveness of blood cell components and the adhesion of cancer cells.
  • the present invention also provides a method for improving the adhesion of cancer cells to a substrate, comprising a step of coating the substrate with a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1).
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the present invention also provides use of a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1) for improving cancer cell adhesion.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the present invention also provides application of a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1) for improving cancer cell adhesion.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the present invention also provides an application of a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1) for producing a cancer cell adhesion improver.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the present invention also provides a cancer cell concentration filter comprising a substrate having a plurality of through-holes, wherein at least a part of the substrate is coated with a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1). To do.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl or ethyl group
  • m is 1-3.
  • the polymer may be composed of a structural unit represented by the general formula (1).
  • R 1 is preferably a hydrogen atom
  • R 2 is a methyl group
  • m is preferably 1.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • R 2 is an ethyl group
  • m may be 2
  • R 1 is a methyl group
  • R 2 is a methyl group
  • m is 2. Good.
  • the polymer preferably has a number average molecular weight of 10,000 to 300,000.
  • Such a polymer can further improve the adhesion of cancer cells.
  • the present invention also provides a cancer cell concentration filter comprising a substrate having a plurality of through-holes, wherein at least a part of the substrate is coated with the polymer.
  • cancer cells in a blood sample can be concentrated at a high concentration rate.
  • the above through holes preferably have an average pore diameter of 5 ⁇ m or more and less than 30 ⁇ m, an average aperture ratio of 5% or more and less than 50%, and are preferably formed by electroforming.
  • the substrate is preferably made of metal. Further, the metal is preferably selected from the group consisting of copper, nickel, an alloy of copper and nickel, and those whose surfaces are plated with gold.
  • cancer cells in a blood sample can be concentrated at a higher concentration rate.
  • the present invention also provides a method for detecting the presence of cancer cells, comprising a filtration step of filtering peripheral blood with the above-described cancer cell concentration filter.
  • the presence of cancer cells such as CTC in peripheral blood collected from a patient can be easily detected.
  • the inspection method may further include a step of analyzing the gene of the cells concentrated in the filtration step, and may further include a step of culturing the cells concentrated in the filtration step.
  • the method for detecting the presence of cancer cells of the present invention can more accurately detect the presence of cancer cells such as CTC in peripheral blood.
  • a cancer cell adhesion improving agent a cancer cell concentration filter whose surface is coated with a cancer cell adhesion improving agent, and a method for examining cancer cells comprising a step of filtering peripheral blood with the cancer cell concentration filter.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of a cancer cell concentration filter.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Experimental Example I-3. A: As a result of applying the polymer solution once, B: As a result of applying the polymer solution twice, C: Positive control.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example I-4.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example I-5.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Experimental Example II-4.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Experimental Example III-4.
  • the cancer cell adhesion improver comprises a polymer containing a structural unit represented by the following general formula (1).
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 2 is a methyl group or an ethyl group
  • m is 1 to 3.
  • the number average molecular weight of the polymer is preferably 10,000 to 300,000. When the number average molecular weight is 10,000 or less, the above polymer becomes liquid and may be difficult to handle. Moreover, it may be difficult to make the number average molecular weight of the above-mentioned polymer 300,000 or more by ordinary radical polymerization.
  • the above-mentioned polymer can be typically produced by adding an appropriate initiator to a monomer solution represented by the following general formula (2) and polymerizing by a general method.
  • the temperature for carrying out the polymerization reaction is preferably 40 ° C. to 100 ° C., more preferably 60 ° C. to 90 ° C., still more preferably 70 ° C. to 80 ° C.
  • the pressure for conducting the polymerization reaction is preferably normal pressure.
  • R 3 is a hydrogen atom or a methyl group
  • R 4 is a methyl or ethyl radical
  • n is 1-3.
  • a solvent that can dissolve the monomer represented by the general formula (2) can be used as the solvent.
  • an aliphatic or aromatic organic solvent more specifically, ether solvents such as dioxane, tetrahydrofuran, diethyl ether, halogenated aromatic hydrocarbons such as o-dichlorobenzene, N, N-dimethylformamide, etc.
  • the cancer cell adhesion improver is made of a polymer composed of a structural unit represented by the general formula (1).
  • R 1 , R 2 and m in the general formula (1) are preferably a combination of any of the following (a) to (h).
  • R 1 is a methyl group, R 2 is a methyl group, and m is 3.
  • G R 1 is a methyl group, R 2 is an ethyl group, and m is 1 to 2.
  • R 1 is a methyl group, R 2 is an ethyl group, and m is 3.
  • R 1 , R 2 and m are the above combinations, the adhesion of blood cells to the substrate coated with the cancer cell adhesion improver is lowered and the effect of improving the adhesion of cancer cells is further enhanced. be able to.
  • the cancer cell adhesion improver is a random copolymer, a block copolymer, or a graft copolymer of the monomer represented by the general formula (2) and another polymerizable monomer.
  • Monomers that can be polymerized with the monomer represented by the general formula (2) include alkyl acrylamides such as acrylamide, t-butyl acrylamide, n-butyl acrylamide, i-butyl acrylamide, hexyl acrylamide, heptyl acrylamide, N, N- N, N-dialkylacrylamides such as dimethylacrylamide and N, N-diethylacrylamide, aminoalkyl acrylates such as aminomethyl acrylate, aminoethyl acrylate and aminoisopropyl acrylate, diaminoalkyls such as diaminomethyl acrylate, diaminoethyl acrylate and diaminobutyl acrylate N, N-dials such as acrylate, methacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N, N-diethylmethacrylamide Aminomethacrylate such as methacrylamide, aminomethyl methacrylate, aminoethyl me
  • the monomer to be polymerized with the monomer represented by the general formula (2) is at least one selected from the group consisting of alkyl acrylate, alkyl methacrylate, alkoxy (meth) acrylate, alkoxyalkyl (meth) acrylate, glycidyl methacrylate and propylene. It may be a monomer.
  • the monomer represented by the general formula (2) and the copolymer with the polymerizable monomer may be any of a random copolymer, a block copolymer, and a graft copolymer. Random polymerization, ionic polymerization, polymerization using a macromer, etc. Can be manufactured.
  • the monomer represented by the general formula (2) is copolymerized with the polymerizable monomer, the monomer represented by the general formula (2) is 30 to 99% by mass in the copolymer. It is preferably 50 to 99% by mass.
  • the polymer containing the structural unit represented by the general formula (1) is typically an initiator suitable for a solution of the monomer represented by the general formula (2) and, optionally, the above-described polymerizable.
  • One or more monomers can be added and polymerized by a method such as random polymerization, ionic polymerization, photopolymerization, or polymerization using a macromer.
  • the temperature for carrying out the polymerization reaction is preferably 40 ° C. to 100 ° C., more preferably 60 ° C. to 90 ° C., still more preferably 70 ° C. to 80 ° C.
  • the pressure for conducting the polymerization reaction is preferably normal pressure.
  • a solvent that can dissolve the monomer represented by the general formula (2) and the polymerizable monomer can be used as the solvent.
  • a solvent is, for example, an aliphatic or aromatic organic solvent, and more specifically, an ether solvent such as dioxane, tetrahydrofuran or diethyl ether, a halogenated aromatic hydrocarbon such as o-dichlorobenzene, N Amides such as N, dimethylformamide, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, and aliphatic hydrocarbons such as hexane and pentane, and ether solvents such as dioxane are preferred.
  • a cancer cell adhesion improver When a cancer cell adhesion improver is applied to the surface of a substrate such as a cancer cell concentration filter, blood compatibility is imparted, so that activation of blood components can be suppressed during blood contact, and adhesion of blood cell components to the filter is prevented. It becomes possible to reduce. Moreover, since the cancer cell concentration filter to which the cancer cell adhesion improving agent is applied has good adhesion to various cancer cells, it can concentrate cancer cells efficiently.
  • the polymer containing the structural unit represented by the general formula (1) has an ether bond and an ester bond as polar groups in the molecule, and these polar groups include a nitrogen atom (amino group, imino group), a carboxyl group, and the like. Unlike the biological component, it does not have a strong electrostatic interaction. Moreover, since it does not have a large hydrophobic group, the hydrophobic interaction is small. For this reason, it is estimated that the polymer containing the structural unit represented by the general formula (1) has low activity against blood and exhibits excellent blood compatibility.
  • the protein is not adsorbed and denatured or activated.
  • hydrophobic interaction which is a large interaction between substances, is desirable. It is considered useful to reduce the action and electrostatic interaction.
  • the surface to which the cancer cell adhesion improving agent is applied can have a suitable surface structure.
  • the surface to which the cancer cell adhesion improving agent is applied has moderate hydrophilicity, even when it comes into contact with blood, the adhesion of platelets is slight and expresses excellent blood compatibility. Moreover, it is thought that the interaction with the biological component by the hydrogen bond resulting from the hydroxyl group, denaturation of the adsorbed protein, and the like are also suppressed.
  • a cancer cell adhesion improver By applying a cancer cell adhesion improver to the surface of a substrate such as a cancer cell concentration filter, adhesion of blood cell components such as red blood cells, white blood cells, and platelets to the filter is reduced, and at the same time, cancer cells are selectively and efficiently captured. It becomes possible to do. Although details about the mechanism of this function have not been clarified, the inventors presume that it can be explained by the concept of intermediate water.
  • the water in contact with the substrate to which the cancer cell adhesion improver is applied includes (1) free water that weakly interacts with the cancer cell adhesion improver and melts at 0 ° C., (2) Antifreeze water that has strong interaction with cancer cell adhesion improver and does not freeze even at -100 °C, (3) Interplay between free water and antifreeze water, and freezes below 0 °C Intermediate water is thought to exist.
  • Normal blood cells have a hydration shell and antifreeze water, intermediate water, free water, etc. that are in contact with the cancer cell adhesion improver, and are stabilized by this hydration structure.
  • the antifreeze water that strongly reflects the structure of the cell adhesion improver is camouflaged and adhesion to the substrate surface is suppressed.
  • cancer cells since the expression of sugar chains on the cell surface is different from that of normal cells, cancer cells are considered to have a disordered hydration structure compared to normal blood cells. Thereby, it is considered that the structure of the intermediate water on the substrate surface is disturbed and the adhesion to the substrate surface is improved.
  • the cancer cell adhesion improving agent can be applied to all types of cancer cells, but is preferably applied to cancer derived from epithelial cells that easily cause blood vessel invasion, and among them, CTC is considered to be large. It is particularly preferred to apply to digestive organ cancers such as lung cancer, colon cancer, stomach cancer or esophageal cancer, breast cancer and prostate cancer.
  • the present invention provides a cancer cell concentration filter comprising a substrate having a plurality of through-holes, wherein at least a part of the substrate is coated with a cancer cell adhesion improver.
  • This filter can concentrate cancer cells such as CTC in blood.
  • the opening shape of the through hole include a circle, an ellipse, a rectangle, a rounded rectangle, and a polygon.
  • a rounded rectangle is a shape composed of two long sides of equal length and two semicircles. From the viewpoint of efficiently capturing cancer cells, a circle, rectangle, or rounded rectangle is preferable. In addition, a rounded rectangle is particularly preferable from the viewpoint of preventing clogging of the filter.
  • FIG. 1 is a schematic view showing one embodiment of a cancer cell concentration filter.
  • the filter 100 includes a substrate 20 in which a plurality of through holes 10 are formed.
  • the opening shape of the through hole 10 is a rounded rectangle.
  • CTC is captured on the surface 30 of the substrate 20.
  • At least a portion of the surface 30 is coated with a cancer cell adhesion improver.
  • the cancer cell adhesion improver preferably covers the entire surface 30. Part or all of the surface opposite to the surface 30 may be coated with a cancer cell adhesion improver.
  • Coating is the most common method for applying a cancer cell adhesion improver to the surface of a substrate such as a cancer cell concentration filter.
  • the coating is performed by adhering a polymer solution containing the structural unit represented by the general formula (1) to the substrate surface by dipping, spraying, spin coating, or the like, and then removing (drying) the solvent. Done.
  • the film thickness after drying is preferably 0.01 ⁇ m to 1.0 mm, more preferably 0.1 to 100 ⁇ m, still more preferably 0.5 to 50 ⁇ m. If the film thickness is less than 0.01 ⁇ m, non-adhesiveness with blood cell components and adhesiveness with cancer cells may not be sufficiently developed. Further, when the film thickness exceeds 1.0 mm, the balance of these adhesive properties may be lost.
  • crosslinking it is possible to exemplify adding a crosslinking monomer to a polymer material in advance.
  • electron beam, ⁇ -ray, or light irradiation may be used.
  • a polymer layer containing the structural unit represented by the general formula (1) on the surface of the substrate by plasma graft polymerization about 1.3 ⁇ 10 ⁇ 1 Pa, preferably 1.3 to 133.3 Pa.
  • the monomer represented by the general formula (2) is supplied. Then, plasma-initiated polymerization may be performed.
  • the material and shape of the substrate are not particularly limited, and for example, a porous body, a fiber, a nonwoven fabric, a film, a sheet, and a tube can be used.
  • Substrate materials include natural polymers such as cotton and linen, nylon, polyester, polyacrylonitrile, polyolefin, halogenated polyolefin, polyurethane, polyamide, polysulfone, polyethersulfone, poly (meth) acrylate, and halogenated polyolefin ethylene-polyvinyl. Examples thereof include synthetic polymers such as alcohol copolymers and butadiene-acrylonitrile copolymers, or mixtures thereof.
  • a metal, ceramics, these composite materials, etc. can be illustrated and may be comprised from the some board
  • substrate can be illustrated and may be comprised from the some board
  • the metal examples include, but are not limited to, noble metals such as gold and silver, base metals such as copper, aluminum, tungsten, nickel and chromium, and alloys of these metals.
  • the metal may be used alone, or may be used as an alloy with another metal or an oxide of a metal in order to impart functionality. From the viewpoint of price and availability, it is preferable to use nickel, copper, and metals containing these as main components.
  • the main component refers to a component occupying 50% by weight or more of the material forming the substrate.
  • the general size of CTC is 10 ⁇ m or more in diameter.
  • the diameter of a cell means the length of the longest straight line connecting two arbitrary points on the outline of the cell when observed with a microscope.
  • the cancer cell concentration filter preferably has an average pore diameter of 5 ⁇ m or more and less than 30 ⁇ m and an average aperture ratio of 5% or more and less than 50%. Further, the average pore diameter is 5 ⁇ m or more and less than 15 ⁇ m, the average aperture ratio is more preferably 10% or more and less than 40%, the average pore diameter is 5 ⁇ m or more and less than 10 ⁇ m, and the average aperture ratio is 20% or more and less than 40%. It is particularly preferred.
  • the aperture ratio refers to the area occupied by the through holes with respect to the entire area of the filter.
  • the average aperture ratio is preferably as large as possible from the viewpoint of prevention of clogging. However, if the average opening ratio exceeds the above upper limit, the strength of the filter may be lowered or processing may be difficult. On the other hand, if it is less than 5%, the cancer cell concentration performance of the filter may decrease.
  • the hole diameter when the opening shape is other than a circle such as an ellipse, rectangle, or polygon is the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through each through hole.
  • the diameter of the through hole is, for example, the length of the short side of the rectangle when the opening shape is a rectangle, and the diameter of the inscribed circle of the polygon when the opening shape is a polygon.
  • the thickness of the filter substrate is preferably 3 to 100 ⁇ m, more preferably 5 to 50 ⁇ m, and particularly preferably 10 to 30 ⁇ m. If the thickness of the substrate is less than 3 ⁇ m, the strength of the filter may be reduced and handling may be difficult. On the other hand, if the thickness of the substrate exceeds 100 ⁇ m, more materials than necessary are consumed and processing takes a long time, which may be disadvantageous in cost and may make precision processing itself difficult.
  • the manufacturing method of the filter of this embodiment is not specifically limited, For example, it forms by the electrocasting method (electroforming method).
  • the electrocasting method is a method of peeling after performing thick electroplating on the mother die.
  • a photosensitive resist film photosensitive layer
  • a mask having a pattern of the opening shape of the through hole of the filter is fixed on the photosensitive layer.
  • light active light is irradiated from above the mask.
  • the photosensitive layer After light irradiation, if there is a support on the photosensitive layer, it is removed and the unexposed part is removed by wet development with a developer such as an alkaline aqueous solution, aqueous developer and organic solvent, or dry development. Development is performed to form a resist pattern. Subsequently, plating is performed on the exposed substrate without being masked using the developed resist pattern as a mask. Examples of the plating method include copper plating, solder plating, nickel plating, and gold plating. After the plating treatment, the plating layer is obtained by peeling the plating layer from the support and the photosensitive layer. By coating at least part of this plating layer with a cancer cell adhesion improver by the above method, a cancer cell concentration filter can be obtained.
  • a cancer cell concentration filter can be obtained.
  • the present invention provides a method for detecting the presence of cancer cells, comprising a filtration step of filtering a sample with the above-described cancer cell concentration filter.
  • a sample for concentrating cancer cells such as CTC
  • blood pooled in bone marrow, spleen, liver, etc., lymph, tissue fluid, umbilical cord blood, etc. can be used, but peripheral blood circulating in the body Is the simplest to use. Detecting the presence of CTC in peripheral blood is a useful means of determining the progression of cancer pathology.
  • the method for detecting the presence of cancer cells includes, for example, incorporating the above-described cancer cell concentration filter into a flow channel, concentrating cells containing CTC by introducing peripheral blood into the flow channel, and concentrated cells. It can be carried out by confirming whether or not CTC exists in.
  • Examples of the introduction of blood into the flow path include a method using pressurization from the flow path entrance direction, a method using pressure reduction from the flow path exit direction, and a method using a peristaltic pump.
  • the area of the filter to be used is suitably 1 to 10 cm 2 when, for example, CTC is concentrated from 1 mL of blood.
  • CTC When CTC is concentrated by the above method, not only CTC but also blood cells such as leukocytes are concentrated at the same time. For this reason, it is necessary to confirm whether or not cancer cells are contained in the collected cells. For example, after enriching CTC by the above method, it can be confirmed that it is a cancer cell by staining with an antibody against a fluorescently labeled cancer marker.
  • antibodies against cancer markers include anti-EpCAM antibodies.
  • the cells are cancer cells by analyzing the genes of the cells concentrated by the above method. For example, mutations in genes such as p53, K-RAS, H-RAS, N-RAS, BRAF, and APC can be analyzed to confirm that they are cancer cells. In addition, the results of these gene analyzes can also be used for the subsequent determination of the patient's treatment policy. Or it can also confirm that it is a cancer cell by measuring the telomerase activity etc. of the cell concentrated by said method.
  • the concentrated cells can be cultured for further detailed analysis.
  • the product was dissolved in tetrahydrofuran, further purified twice using n-hexane, and dried under reduced pressure overnight. A colorless, transparent and highly viscous polymer was obtained. The yield was 76%.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the molecular weight of the polymer was calculated as a standard polystyrene equivalent molecular weight under the following GPC measurement conditions.
  • Pump PU Intelligent HPLC Pump (manufactured by Jasco)
  • Column GPC K804 (Showa Denko, Shodex)
  • Eluent Chloroform Measurement temperature: Room temperature Flow rate: 1.0 mL / min
  • Detector Jasco RI-1530 RI (manufactured by Jasco)
  • Example I-2 (Production of nickel substrate) A commercially available titanium plate is immersed in an electrolytic bath for electrolytic nickel plating (nickel sulfamate 450 g / L, nickel chloride 5 g / L, boric acid 30 g / L, 55 ° C.) using the titanium plate as a cathode, and the anode is It was immersed in the same electrolytic bath. Nickel plating was performed by applying a voltage to both electrodes to a thickness of 10 ⁇ m, thereby preparing a nickel substrate.
  • electrolytic nickel plating nickel sulfamate 450 g / L, nickel chloride 5 g / L, boric acid 30 g / L, 55 ° C.
  • Example I-3 (Nickel substrate coating and confirmation)
  • the polymer synthesized in Experimental Example I-1 was dissolved in chloroform to obtain a plurality of polymer solutions having different concentrations in the range of 0 to 5% by mass.
  • Each polymer solution was applied (cast) onto the nickel substrate prepared in Experimental Example I-2, and the solvent was dried to coat the surface of the nickel substrate.
  • a substrate on which the polymer was applied once and a substrate on which the polymer had been applied twice were prepared.
  • a positive control a polyethylene terephthalate substrate coated with 40 ⁇ L of a polymer solution was used. The contact angle of water was measured on these substrates, and it was confirmed that they were coated with a polymer.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Experimental Example I-3.
  • the horizontal axis indicates the polymer concentration, and the vertical axis indicates the contact angle of water.
  • A is the result of applying the polymer solution once
  • B is the result of applying the polymer solution twice
  • C is a positive control.
  • Example I-4 Preparation of substrate
  • the polymer synthesized in Experimental Example I-1 was dissolved in chloroform to obtain a 4% by mass solution. This solution was applied onto the nickel substrate prepared in Experimental Example I-2, the solvent was dried, and the surface of the nickel substrate was coated with a polymer, whereby the nickel substrate of Example I-1 was prepared. The polymer solution was applied twice. The nickel peak derived from the nickel substrate was not observed by X-ray photoelectron spectroscopy (Shimadzu Corporation, ESCA-1000), and the carbon and oxygen peaks derived from the polymer were detected. Therefore, the nickel substrate was coated with the polymer. It was confirmed. Further, the nickel substrate prepared in Experimental Example I-2 was used as the nickel substrate of Comparative Example I-1.
  • Example I-1 Adhesion test of cancer cells
  • 1.0 mL of a cancer cell suspension adjusted to 10,000 cells / mL with a medium supplemented with 10% serum was dropped with a pipette, and the temperature was 37 ° C. For 60 minutes.
  • the human fibrosarcoma cell line HT-1080 was used as the cancer cell.
  • the cells were rinsed with physiological buffer saline and the number of cells adhered to the substrate was counted.
  • cells were fixed with formaldehyde, and then cell nuclei were stained with 4,6-diamino-2-phenylidole (DAPI). The number of cell nuclei was counted using a confocal laser microscope (Olympus FV-1000) to obtain the number of cells.
  • DAPI 4,6-diamino-2-phenylidole
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Experimental Example I-4. The experiment was performed 5 times, and the results were shown as mean ⁇ standard deviation. The number of adhering cancer cells was improved in the nickel substrate of Example I-1 as compared with the nickel substrate of Comparative Example I-1. Similar results were confirmed in many other cancer cells.
  • Example I-5 (Preparation of substrate) The experiment was conducted using the nickel substrates of Example I-1 and Comparative Example I-1 as in Experimental Example I-4.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example I-5. The experiment was performed 5 times, and the results were shown as mean ⁇ standard deviation. The nickel substrate of Example I-1 was found to have fewer adhered platelets than the nickel substrate of Comparative Example I-1.
  • Example I-1 has low adhesion of blood cell components despite the improved adhesion of cancer cells. It was. Therefore, by applying the cancer cell adhesion improving agent of the present invention to the surface of a cancer cell concentration filter, it is possible to enhance the adhesion of cancer cells to the filter and improve the concentration rate of cancer cells.
  • the product was isolated by dropping into n-hexane and precipitation.
  • the product was dissolved in tetrahydrofuran and further purified twice using n-hexane.
  • the purified product was dried under reduced pressure overnight.
  • a colorless and transparent syrupy polymer was obtained.
  • the yield (yield) was 11.4 g (76.0%).
  • the obtained polymer structure was confirmed by 1H-NMR.
  • the number average molecular weight (Mn) was 12,000 and the molecular weight distribution (Mw / Mn) was 3.9.
  • the molecular weight of the polymer was calculated as a standard polystyrene equivalent molecular weight under the same GPC measurement conditions as in Experimental Example I-1.
  • the product was isolated by dropping into n-hexane and precipitation.
  • the product was dissolved in tetrahydrofuran and further purified twice using n-hexane.
  • the purified product was dried under reduced pressure overnight.
  • a colorless and transparent syrupy polymer was obtained.
  • the yield (yield) was 8.2 g (82.0%).
  • the obtained polymer structure was confirmed by 1H-NMR.
  • the number average molecular weight (Mn) was 104,000, and the molecular weight distribution (Mw / Mn) was 4.6.
  • the molecular weight of the polymer was calculated as a standard polystyrene equivalent molecular weight under the same GPC measurement conditions as in Experimental Example I-1.
  • Poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-co-butyl methacrylate) (Synthesis of poly (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-co-butyl methacrylate))
  • X and Y are 1 to 10,000, and X: Y is 40:60 mol% to 1:99 mol%.
  • Example II-2 (Production of nickel substrate) The same treatment as in Experimental Example I-2 was performed to produce a nickel substrate.
  • Example II-4 Preparation of substrate
  • the four polymers synthesized in Experimental Example I-1 and Experimental Example II-1 were each dissolved in chloroform to obtain a 4 mass% solution. These solutions were applied onto the nickel substrate prepared in Experimental Example II-2, the solvent was dried, and the surface of the nickel substrate was coated with a polymer.
  • Example II-1 polymethoxyethyl acrylate
  • Example II-2 poly [2- (2-ethoxyethoxy) ethyl acrylate]
  • Example II-3 poly [2- (2-methoxyethoxy) ethyl methacrylate]
  • Comparative Example II-1 poly ( A nickel substrate of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-co-butyl methacrylate)) was prepared. The polymer solution was applied twice. The nickel peak derived from the nickel substrate was not observed by X-ray photoelectron spectroscopy (Shimadzu Corporation, ESCA-1000), and the carbon and oxygen peaks derived from the polymer were detected. Therefore, the nickel substrate was coated with the polymer. It was confirmed.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Experimental Example II-4. The experiment was performed 5 times, and the results were shown as mean ⁇ standard deviation.
  • the nickel substrate of Example II-1 captured 2000 or more cancer cells.
  • the nickel substrate of Example II-2 captured over 1500 cancer cells.
  • the nickel substrate of Example II-3 captured 500 or more cancer cells. Compared to these, the nickel substrate of Comparative Example II-1 was able to capture only about 140 cancer cells.
  • Initiator azobisisobutyronitrile (15.1 mg, 9.2 ⁇ 10 ⁇ 2 mmol) was dissolved in a small amount of 1,4-dioxane and polymerized at 75 ° C. for 2 hours and 10 minutes in a nitrogen atmosphere. Purification was performed using hexane. The reaction solution was dropped into 1500 mL of hexane, which is a poor solvent, and the solvent was removed by decantation. About 50 mL of tetrahydrofuran (THF) was added to the crude polymer to dissolve it, and the solution was dropped again into 1000 mL of hexane, and then the solvent was removed by decantation.
  • THF tetrahydrofuran
  • Example III-2 (Production of nickel substrate) The same treatment as in Experimental Example I-2 was performed to produce a nickel substrate.
  • Example III-4 (Preparation of substrate) Five types of polymers synthesized in Experimental Example I-1, Experimental Example II-1 and Experimental Example III-1 were dissolved in chloroform to obtain a 4 mass% solution. These solutions were applied onto the nickel substrate prepared in Experimental Example III-2, the solvent was dried, and the surface of the nickel substrate was coated with a polymer.
  • Example III-1 (polymethoxyethyl acrylate), Example III-2 (poly [2- (2-ethoxyethoxy) ethyl acrylate]), Example III-3 (poly [2- (2-methoxyethoxy) ethyl methacrylate]), Comparative Example III-1 (poly (2- A nickel substrate of methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-co-butyl methacrylate)) and Example III-4 (poly [2- (2-ethoxyethoxy) ethyl methacrylate]) was prepared. The polymer solution was applied twice.
  • the nickel peak derived from the nickel substrate was not observed by X-ray photoelectron spectroscopy (Shimadzu Corporation, ESCA-1000), and the carbon and oxygen peaks derived from the polymer were detected. Therefore, the nickel substrate was coated with the polymer. It was confirmed.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Experimental Example III-4. The experiment was performed 5 times, and the results were shown as mean ⁇ standard deviation.
  • the nickel substrates of Example III-1 and Example III-4 captured 6000 cells / cm 2 or more of cancer cells.
  • the nickel substrate of Example III-2 captured 5000 cells / cm 2 or more of cancer cells.
  • the nickel substrate of Example III-3 captured 2000 cells / cm 2 or more of cancer cells.
  • the nickel substrate of Comparative Example III-1 was able to capture cancer cells only at about 130 cells / cm 2 .

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Abstract

　下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、癌細胞濃縮フィルターの表面に適用することにより、癌細胞のフィルター表面への接着性を高め、癌細胞の濃縮率を向上させることができるため有用である。式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。

Description

癌細胞接着性向上剤
　本発明は、癌細胞接着性向上剤に関する。より詳細には、癌細胞接着性向上剤、癌細胞濃縮フィルター及び癌細胞の検査方法に関する。
　癌細胞濃縮の研究・臨床的意義は極めて大きく、血液中の癌細胞を濃縮することができれば、癌の診断に応用することができる。例えば、癌の予後および治療の最も重要な要因は、初診時および処置時における癌細胞の転移の有無である。癌細胞の初期の拡散が末梢血中に及んだ場合、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、場合により「ＣＴＣ」という。）を検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。
　しかしながら、転移が始まった一般的な癌患者の場合、血液中１００億個の血球細胞あたり、ＣＴＣはおよそ１個程度存在しているに過ぎない。これに対し、血液中には、赤血球や白血球等の血液成分が圧倒的に多く存在する。したがって、極低濃度のＣＴＣを濃縮し、高感度、高効率及び高特異的に解析することは非常に困難である。例えば、磁気ビーズ、密度勾配遠心分離、マイクロ流路、フローサイトメータを用いた方法でＣＴＣを濃縮する場合、煩雑な処理が必要であるうえ、回収率が悪い場合がある。
　ＣＴＣを分離・濃縮する他の技術として、ポリカーボネートフィルターを用いた方法が提案されている（例えば、非特許文献１及び２を参照）。また、サイズの違いを利用してＣＴＣを分離・濃縮する技術も提案されている（例えば、非特許文献３～５及び特許文献１を参照）。
　ところで、人工心肺等の医療用材料表面に血液が接触すると、補体系の活性化や血小板の活性化による血栓形成の誘発や溶血等の副作用が生じることが知られている。この問題を解決するために、所定の化合物で医療用材料表面を被覆することが有効であることが報告されている（例えば、特許文献２を参照）。
米国特許出願公開第２００１／００１９０２９号明細書 国際公開第２００４／０８７２２８号
Ｖｏｎａ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，　ｉｍｍｕｎｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｔａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｍａｔｅｒｎａｌ　ｂｌｏｏｄ"，　Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ．　１６０（１）：５１－８　（２００２） Ｋａｈｎ　ＨＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｓｔａｇｅ"，　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　ＲｅｓＴｒｅａｔ；８６（３）：２３７－４７　（２００４） Ｗｉｌｄｉｎｇ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ　Ｃｈａｍｂｅｒｓ"，　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５７（２）：９５－１００　（１９９８） Ｙｕｅｎ　ＰＫ，　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ　ｍｏｄｕｌｅ　ｆｏｒ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ"，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　１１（３）：４０５－１２　（２００１） Ｍｏｈａｍｅｄ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｒａｒｅ　ｃｅｌｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．"，　ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ　Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　３（４）：２５１－６　（２００４）
　ＣＴＣ等の癌細胞は、血液中の血球細胞、例えば赤血球や白血球、あるいは血小板等に比べてサイズが一回り大きい。したがって、理論的には、機械的濾過法を適用してこれらの血球成分を除去し、癌細胞を濃縮することが可能である。
　しかしながら、非特許文献１及び２のメンブレンフィルターは、ランダムに分布する孔を含み、孔径が不均一なため、癌細胞の回収率が悪い場合があった。また、非特許文献３～５及び特許文献１の、孔径や厚みが正確に制御されたフィルターであっても、正確に解析可能な精度で癌細胞を濃縮することは困難な場合があった。
　本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、癌細胞の接着性を向上させることができる、癌細胞接着性向上剤を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の癌細胞接着性向上剤で表面が被覆された癌細胞濃縮フィルターを提供することを目的とする。本発明はさらに、上記の癌細胞濃縮フィルターで末梢血を濾過する工程を含む、癌細胞の検査方法を提供することを目的とする。
　従来、人工心肺等の医療用材料表面に血液が接触すると、補体系の活性化や血小板の活性化による血栓形成の誘発や溶血等の副作用が生じることが問題となっていた。そして、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーで医療用材料表面を被覆すると、血液が接触した場合であっても、医療用材料表面への血球成分の接着性が低下し、血栓形成の誘発や溶血等の副作用が抑制されることが知られている。このような、血栓形成や溶血を抑制する性質のことを血液適合性という。
　本発明者らは、意外なことに、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーで被覆した材料表面は、血球成分の接着性が低下する一方で癌細胞の接着性が向上することを初めて見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーからなる癌細胞接着性向上剤を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　上記本発明の癌細胞接着性向上剤は、癌細胞濃縮フィルターの表面に適用することにより、癌細胞のフィルター表面への接着性を高め、癌細胞の濃縮率を向上させることができる。
　癌細胞の濃縮率を向上させるために、癌細胞濃縮フィルターの表面に、細胞の接着性を向上させるような表面処理を施すと、ＣＴＣ等の癌細胞だけでなく、血球成分の接着性も向上するのが通常である。このため、結果として癌細胞の濃縮率は向上せず、所望の濃縮性能が得られない。これに対し、上記本発明の癌細胞接着性向上剤は、血球成分の非接着性と、癌細胞の接着性というトレードオフの関係にある特性を同時に満たすことができる。
　本発明はまた、基板を下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーで被覆する工程、を含む、癌細胞の基板への接着性を向上させる方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　本発明はまた、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの、癌細胞接着性向上のための使用を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　本発明はまた、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの、癌細胞接着性向上のための応用を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　本発明はまた、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの、癌細胞接着性向上剤の製造のための応用を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　本発明はまた、複数の貫通孔が形成された基板からなり、基板の少なくとも一部が下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーで被覆されている、癌細胞濃縮フィルターを提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。
　上記のポリマーは、上記一般式（１）で表される構造単位からなるものであってもよい。また、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが１であることが好ましい。また、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが２であってもよく、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが２であってもよい。また、上記のポリマーは、数平均分子量が１０，０００～３００，０００であることが好ましい。
　このようなポリマーは、さらに癌細胞の接着性を向上させることができる。
　本発明はまた、複数の貫通孔が形成された基板からなり、当該基板の少なくとも一部が上記のポリマーで被覆されている、癌細胞濃縮フィルターを提供する。
　上記本発明の癌細胞濃縮フィルターによれば、血液サンプル中の癌細胞を、高い濃縮率で濃縮することができる。
　上記の貫通孔は、平均孔径が５μｍ以上３０μｍ未満であり、平均開口率が５％以上５０％未満であることが好ましく、電気鋳造法によって形成されたものであることが好ましい。また、上記の基板は金属からなることが好ましい。さらに、上記の金属は、銅、ニッケル、銅及びニッケルの合金並びにこれらの表面が金めっきされたものからなる群より選択されるものであることが好ましい。
　このような癌細胞濃縮フィルターによれば、血液サンプル中の癌細胞を、更に高い濃縮率で濃縮することができる。
　本発明はまた、上記の癌細胞濃縮フィルターで末梢血を濾過する濾過工程を含む、癌細胞の存在を検出する方法を提供する。
　上記本発明の方法によれば、患者から採取された末梢血中におけるＣＴＣ等の癌細胞の存在を容易に検出することができる。
　上記の検査方法は、上記の濾過工程で濃縮された細胞の遺伝子を解析する工程を更に含んでもよく、上記の濾過工程で濃縮された細胞を培養する工程を更に含んでもよい。
　上記の濾過工程は、細胞に対するダメージが小さいため、濃縮された細胞の遺伝子を解析する工程や、細胞を培養する工程を行うことが可能である。本発明の癌細胞の存在を検出する方法は、これらの工程を更に含むことにより、末梢血中におけるＣＴＣ等の癌細胞の存在をより正確に検出することができる。
　本発明により、癌細胞接着性向上剤、癌細胞接着性向上剤で表面が被覆された癌細胞濃縮フィルター、及び、当該癌細胞濃縮フィルターで末梢血を濾過する工程を含む癌細胞の検査方法が提供される。
図１は、癌細胞濃縮フィルターの一実施形態を示す概略図である。 図２は、実験例Ｉ－３の結果を示すグラフである。Ａ：ポリマー溶液を１回塗布した結果、Ｂ：ポリマー溶液を２回塗布した結果、Ｃ：陽性対照。 図３は、実験例Ｉ－４の結果を示すグラフである。 図４は、実験例Ｉ－５の結果を示すグラフである。 図５は、実験例ＩＩ－４の結果を示すグラフである。 図６は、実験例ＩＩＩ－４の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しながら、好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面は理解を容易にするため一部を誇張して描いており、寸法比率は説明のものとは必ずしも一致しない。
　一実施形態において、癌細胞接着性向上剤は、下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーからなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。上記のポリマーの数平均分子量は１０，０００～３００，０００であることが好ましい。数平均分子量が１０，０００以下の場合、上記のポリマーは液状となり、取り扱いが困難になる場合がある。また、通常のラジカル重合によって、上記のポリマーの数平均分子量を３００，０００以上とすることは困難な場合がある。
　上記のポリマーは、典型的には、下記一般式（２）で表されるモノマーの溶液に適切な開始剤を添加し、一般的な方法によって重合させることにより製造することができる。重合反応を行う温度は、４０℃～１００℃が好ましく、６０℃～９０℃がより好ましく、７０℃～８０℃が更に好ましい。重合反応を行う圧力は常圧であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記一般式（２）中、Ｒ３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ４はメチル基又はエチル基であり、ｎは１～３である。
　重合反応において、溶媒としては、上記一般式（２）で表されるモノマーを溶解可能な溶媒を使用できる。例えば脂肪族又は芳香族の有機溶媒であり、より具体的には、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、ｏ－ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等のアミド、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素が挙げられ、ジオキサン等のエーテル系溶媒が好ましい。
　一実施形態において、癌細胞接着性向上剤は、上記一般式（１）で表される構造単位からなるポリマーからなる。
　癌細胞接着性向上剤は、上記一般式（１）中のＲ１、Ｒ２及びｍが以下の（ａ）～（ｈ）のいずれかの組合せであることが好ましい。
　（ａ）Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが１～２である。
　（ｂ）Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが３である。
　（ｃ）Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが１～２である。
　（ｄ）Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが３である。
　（ｅ）Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが１～２である。
　（ｆ）Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが３である。
　（ｇ）Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが１～２である。
　（ｈ）Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが３である。
　Ｒ１、Ｒ２及びｍが上記の組合せであることにより、癌細胞接着性向上剤で被覆された基板への血球成分の接着性が低下すると共に癌細胞の接着性が向上する効果を更に高めることができる。
　一実施形態において、癌細胞接着性向上剤は、上記一般式（２）で表されるモノマーと他の重合可能なモノマーとのランダムコポリマー若しくはブロックコポリマー若しくはグラフトコポリマーである。
　上記一般式（２）で表されるモノマーと重合可能なモノマーとしては、アクリルアミド、ｔ－ブチルアクリルアミド、ｎ－ブチルアクリルアミド、ｉ－ブチルアクリルアミド、ヘキシルアクリルアミド、ヘプチルアクリルアミド等のアルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキルアクリルアミド、アミノメチルアクリレート、アミノエチルアクリレート、アミノイソプロピルアクリレート等のアミノアルキルアクリレート、ジアミノメチルアクリレート、ジアミノエチルアクリレート、ジアミノブチルアクリレート等のジアミノアルキルアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルメタクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキルメタクリルアミド、アミノメチルメタクリレート、アミノエチルメタクリレート等のアミノアルキルメタクリレート、ジアミノメチルメタクリレート、ジアミノエチルメタクリレート等のジアミノアルキルメタクリレート、メチルアクリレート、エチルアクリレート、イソプロピルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、２－エチルヘキシルアクリレート等のアルキルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート等のアルキルメタクリレート、メトキシ（メタ）アクリレート等のアルコキシ（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、プロピレン等が挙げられる。
　上記一般式（２）で表されるモノマーと重合させるモノマーは、アルキルアクリレート、アルキルメタクリレート、アルコキシ（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート及びプロピレンからなる群より選ばれる１種以上のモノマーであってもよい。
　上記一般式（２）で表されるモノマー及び上記の重合可能なモノマーとのコポリマーは、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマーのいずれでもよく、ランダム重合、イオン重合、マクロマーを利用した重合等の方法で製造できる。
　上記一般式（２）で表されるモノマーと、上記の重合可能なモノマーとを共重合させる場合、上記一般式（２）で表されるモノマーは、コポリマー中の３０～９９質量％であることが好ましく、５０～９９質量％であることが更に好ましい。
　上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、典型的には、上記一般式（２）で表されるモノマーの溶液に適切な開始剤、及び、場合により上記の重合可能な１種以上のモノマーを添加し、ランダム重合、イオン重合、光重合、マクロマーを利用した重合等の方法によって重合させることにより製造することができる。重合反応を行う温度は、４０℃～１００℃が好ましく、６０℃～９０℃がより好ましく、７０℃～８０℃が更に好ましい。重合反応を行う圧力は常圧であることが好ましい。
　重合反応において、溶媒としては、上記一般式（２）で表されるモノマー及び上記の重合可能なモノマーを溶解可能な溶媒を使用できる。このような溶媒は、例えば脂肪族又は芳香族の有機溶媒であり、より具体的には、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、ｏ－ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等のアミド、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素が挙げられ、ジオキサン等のエーテル系溶媒が好ましい。
　癌細胞接着性向上剤を癌細胞濃縮フィルター等の基板の表面に適用すると、血液適合性が付与されるため、血液の接触時に血液成分の活性化が抑制でき、血球成分のフィルターへの付着を低減することが可能となる。また、癌細胞接着性向上剤を適用した癌細胞濃縮フィルターは、種々の癌細胞に対する接着性が良好なため、癌細胞を効率よく濃縮させることができる。
　上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、分子内に極性基としてエーテル結合及びエステル結合を有するが、これらの極性基は窒素原子（アミノ基、イミノ基）やカルボキシル基等と異なり、生体成分と強い静電相互作用を持たない。また、大きな疎水性基を持たないため、疎水性相互作用も小さい。このため、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーは、血液に対して活性が低く、優れた血液適合性を発現するものと推測される。
　医療用材料表面と生体内組織や血液中のタンパク質との接触においては、タンパク質の吸着変性や活性化が起こらないことが好ましく、このためには、物質間に働く大きな相互作用である疎水性相互作用や静電的相互作用を小さくすることが有用であると考えられている。この点からも、癌細胞接着性向上剤が適用された表面は好適な表面構造を備え得る。
　また、癌細胞接着性向上剤が適用された表面は、適度な親水性を有しているため、血液と接触した場合においても血小板の接着が軽微であり、優れた血液適合性を発現する。また、水酸基に起因した水素結合による生体成分との相互作用や吸着タンパク質の変性等も抑制されると考えられる。
　癌細胞接着性向上剤を癌細胞濃縮フィルター等の基板の表面に適用することにより、赤血球、白血球、血小板等の血球成分のフィルターへの接着が軽減され、同時に癌細胞を選択的に効率良く捕獲することが可能となる。この機能の発現メカニズムについての詳細は明らかになっていないが、発明者らは、中間水の概念により説明できるものと推測している。
　すなわち、癌細胞接着性向上剤が適用された基板と接触している水には、（１）癌細胞接着性向上剤と弱い相互作用をしており０℃で融解する自由水、（２）癌細胞接着性向上剤と強い相互作用をしており－１００℃でも凍結しない不凍水、（３）自由水と不凍水の中間的な相互作用をしており０℃より低温で凍結する中間水、が存在すると考えられる。正常な血球細胞は、癌細胞接着性向上剤と接触している不凍水、中間水、自由水等と水和殻を持ち、この水和構造によって安定化しているが、中間水によって、癌細胞接着性向上剤の構造を強く反映した不凍水がカモフラージュされ、基板表面への接着が抑制されると考えられる。一方、癌細胞は、細胞表面の糖鎖の発現が正常細胞とは異なるので、正常な血球細胞と比較して、水和構造が乱れていると考えられる。これにより、基板表面の中間水の構造をかく乱し、基板表面への接着性が向上すると考えられる。
　癌細胞接着性向上剤は、あらゆる種類の癌細胞に適用可能であるが、血管への浸潤を起こしやすい上皮性細胞由来の癌に適用することが好ましく、その中でもＣＴＣが多いとされている、肺癌、大腸癌若しくは胃癌若しくは食道癌等の消化器癌、乳癌、前立腺癌に適用することが特に好ましい。
　一実施形態において、本発明は、複数の貫通孔が形成された基板からなり、当該基板の少なくとも一部が癌細胞接着性向上剤で被覆されている、癌細胞濃縮フィルターを提供する。このフィルターは、血液中のＣＴＣ等の癌細胞を濃縮することができる。貫通孔の開口形状としては、円、楕円、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。角丸長方形とは、２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。効率良く癌細胞を捕獲できる観点からは、円、長方形又は角丸長方形が好ましい。また、フィルターの目詰まり防止の観点からは、角丸長方形が特に好ましい。
　図１は、癌細胞濃縮フィルターの一実施形態を示す概略図である。フィルター１００は、複数の貫通孔１０が形成された基板２０からなる。貫通孔１０の開口形状は角丸長方形である。基板２０の面３０の表面にＣＴＣが捕獲される。少なくとも面３０の一部は癌細胞接着性向上剤で被覆されている。癌細胞接着性向上剤は、面３０の全体を被覆していることが好ましい。面３０とは反対側の面の一部若しくは全体は、癌細胞接着性向上剤で被覆されていてもよい。
　癌細胞濃縮フィルター等の基板の表面に癌細胞接着性向上剤を適用する方法としては、被覆が最も一般的である。被覆は、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの溶液を、浸漬法、スプレー法、スピンコート法等により基板表面に付着させた後、溶媒を除去（乾燥）することにより行われる。乾燥後の膜厚は、０．０１μｍ～１．０ｍｍが好ましく、０．１～１００μｍがより好ましく、０．５～５０μｍが更に好ましい。膜厚が０．０１μｍ未満であると血球成分との非接着性や癌細胞との接着性が十分発現しない場合がある。また膜厚が１．０ｍｍを超えるとこれらの接着特性のバランスが崩れる場合がある。
　基板に癌細胞接着性向上剤をより強固に固定化させるために、癌細胞接着性向上剤を被覆した後、基板に熱を加えてもよい。また、上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーを架橋してもよい。架橋する方法として、予めポリマーの材料に架橋性モノマーを添加することが例示できる。架橋には、電子線、γ線、光照射を用いてもよい。
　プラズマグラフト重合により基板の表面に上記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーの層を形成するには、約１．３×１０－１Ｐａ、好ましくは１．３～１３３．３Ｐａの減圧下で、アルゴン、窒素、空気、種々のモノマー等の雰囲気下に低温プラズマを１～３００秒間、好ましくは２～３０秒間照射した後、上記一般式（２）で表されるモノマーを供給してプラズマ開始重合を行えばよい。
　一実施形態において、基板の材質や形状は特に制限されることなく、例えば多孔質体、繊維、不織布、フィルム、シート、チューブを使うことができる。基板の材質としては、木綿、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ハロゲン化ポリオレフィンエチレン－ポリビニルアルコール共重合体、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミックス及びこれらの複合材料等も例示でき、複数の基板より構成されていてもよい。
　金属としては、金、銀等の貴金属、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム等の卑金属、及びこれらの金属の合金が例示できるがこれらに限定するものではない。金属は単体で用いてもよく、機能性を付与するために他の金属との合金又は金属の酸化物として用いてもよい。価格や入手の容易さの観点から、ニッケル、銅及びこれらを主成分とする金属を用いることが好ましい。ここで、主成分とは、上記基板を形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。これらの金属にフォトリソグラフィーなどの方法を使って、貫通孔を形成してスクリーンフィルターとすることもできる。
　一般的なＣＴＣの大きさは、直径１０μｍ以上である。ここで、細胞の直径とは、顕微鏡で観察した場合の細胞の輪郭上の任意の２点を結ぶ直線のうち最も長い直線の長さをいう。血液の透過性とＣＴＣの捕捉性能の観点から、癌細胞濃縮フィルターは、貫通孔の平均孔径が５μｍ以上３０μｍ未満であり、平均開口率が５％以上５０％未満であることが好ましい。また、平均孔径が５μｍ以上１５μｍ未満であり、平均開口率が１０％以上４０％未満であることが更に好ましく、平均孔径が５μｍ以上１０μｍ未満であり、平均開口率が２０％以上４０％未満であることが特に好ましい。ここで、開口率とは、フィルター全体の面積に対する貫通孔が占める面積をいう。平均開口率は、目詰まり防止の観点から、大きいほど好ましいが、上記上限値を超えると、フィルターの強度が低下したり、加工が困難になる場合がある。また５％より小さいとフィルターの癌細胞濃縮性能が低下する場合がある。
　本明細書において、開口形状が楕円、長方形、多角形等の円以外の形状における孔径とは、それぞれの貫通孔を通過できる球の直径の最大値とする。貫通孔の孔径は、例えば開口形状が長方形の場合には、その長方形の短辺の長さとなり、開口形状が多角形の場合には、その多角形の内接円の直径となる。開口形状が長方形や角丸長方形の場合、ＣＴＣや白血球が貫通孔に補足された場合であっても、開口部において、開口形状の長辺方向に隙間ができる。この隙間を通して液体が通過可能であるため、フィルターの目詰まりを防止することが可能になる。
　フィルターの基板の厚さは３～１００μｍであることが好ましく、５～５０μｍであることがより好ましく、１０～３０μｍであることが特に好ましい。基板の厚さが３μｍより薄いと、フィルターの強度が低下し、取り扱いが困難になる場合がある。また、基板の厚さが１００μｍを超えると、必要以上の材料を消費したり、加工に長時間かかったりするため、コスト的に不利になったり、精密加工そのものが困難になる場合がある。
　続いて、本実施形態の癌細胞濃縮フィルターの製造方法を説明する。本実施形態のフィルターの製造方法は、特に制限されるものではないが、例えば電気鋳造法（電鋳法）によって形成される。電気鋳造法とは、母型に厚い電気めっきを施した後に剥離する方法である。まず、ステンレス等からなる支持体上に感光性のレジストフィルム（感光層）を貼り合わせる。次に、フィルターの貫通孔の開口形状のパターンを有するマスクを感光層上に固定する。続いて、マスク上から光（活性光線）を照射する。光照射後、感光層上に支持体がある場合にはこれを除去し、アルカリ性水溶液、水系現像液及び有機溶剤等の現像液によるウエット現像、又はドライ現像等で未露光部を除去することによって現像し、レジストパターンを形成する。続いて、現像されたレジストパターンをマスクとして、マスクされずに露出している基板上にめっきを行う。めっきの方法としては、例えば、銅めっき、はんだめっき、ニッケルめっき、金めっきなどが挙げられる。めっき処理後、めっき層を支持体及び感光層から剥離すると、めっき層が得られる。上記の方法により、このめっき層の少なくとも一部を癌細胞接着性向上剤で被覆することにより、癌細胞濃縮フィルターが得られる。
　一実施形態において、本発明は、上記の癌細胞濃縮フィルターで試料を濾過する濾過工程を含む、癌細胞の存在を検出する方法を提供する。ＣＴＣ等の癌細胞を濃縮する試料としては、骨髄、脾臓、肝臓等にプールされている血液、リンパ、組織液、臍帯血等を利用することも可能であるが、体内を循環している末梢血を使うことが最も簡便である。末梢血中のＣＴＣの存在を検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。
　本実施形態の癌細胞の存在を検出する方法は、例えば上記の癌細胞濃縮フィルターを流路内に組み込み、流路に末梢血を導入することによりＣＴＣを含む細胞を濃縮し、濃縮された細胞の中にＣＴＣが存在するか否かを確認することにより実施することができる。流路への血液の導入には、流路の入り口方向からの加圧を用いる方法、流路の出口方向からの減圧を用いる方法、ぺリスタルティックポンプを使用する方法等が例示できる。また、使用するフィルターの面積は、例えば１ｍＬの血液からＣＴＣを濃縮する場合、１～１０ｃｍ２が適している。
　上記の方法でＣＴＣを濃縮した場合、ＣＴＣだけでなく白血球等の血球細胞も同時に濃縮される。このため、回収された細胞に癌細胞が含まれているか否かを確認することが必要である。例えば、上記の方法でＣＴＣを濃縮した後、蛍光標識された癌マーカーに対する抗体で染色し、癌細胞であることを確認することができる。癌マーカーに対する抗体としては、抗ＥｐＣＡＭ抗体等が例示できる。
　また、上記の方法で濃縮された細胞の遺伝子を解析することにより、癌細胞であることを確認することもできる。例えば、ｐ５３、Ｋ－ＲＡＳ、Ｈ－ＲＡＳ、Ｎ－ＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ等の遺伝子における変異を解析し、癌細胞であることを確認できる。また、これらの遺伝子解析の結果は、その後の患者の治療方針の決定等にも利用することができる。あるいは、上記の方法で濃縮した細胞のテロメラーゼ活性等を測定することにより、癌細胞であることを確認することもできる。
　上記の濾過工程は、細胞に対するダメージが小さいため、濃縮された細胞を培養し、更に詳細な解析を行うこともできる。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
（実験例Ｉ－１）
（ポリメトキシエチルアクリレートの合成）
　上記一般式（１）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが１である、ポリメトキシエチルアクリレートを合成した。具体的には、メトキシエチルアクリレート１５ｇを１，４－ジオキサン６０ｇ中でアゾビスイソブチロニトリル（０．１質量％）を開始剤として、窒素バブリングしながら７５℃で１０時間重合を行った。重合反応終了後、ｎ－ヘキサンに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をテトラヒドロフランに溶解し、さらにｎ－ヘキサンを用いて２回精製を行い、一昼夜減圧乾燥した。無色透明で高粘度のポリマーが得られた。収率は７６％であった。得られたポリマーをゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により解析した結果、数平均分子量が１５，０００で、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が３．４であった。
　ポリマーの分子量は、下記ＧＰＣの測定条件にて標準ポリスチレン換算分子量で算出した。
　ポンプ：ＰＵ　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　ＨＰＬＣ　Ｐｕｍｐ　（Ｊａｓｃｏ製）
　カラム：ＧＰＣ　Ｋ８０４（昭和電工製、Ｓｈｏｄｅｘ）
　溶離液：クロロホルム
　測定温度：室温
　流量：１．０ｍＬ／分
　検出器：Ｊａｓｃｏ　ＲＩ－１５３０型ＲＩ（Ｊａｓｃｏ製）
（実験例Ｉ－２）
（ニッケル基板の作製）
　市販のチタン板上に、チタン板を陰極として電解ニッケルめっき用の電解浴（スルファミン酸ニッケル４５０ｇ／Ｌ、塩化ニッケル５ｇ／Ｌ、ホウ酸３０ｇ／Ｌの水溶液、５５℃）中に浸し、陽極を同電解浴中に浸した。両極に電圧をかけて１０μｍ厚になるようにニッケルめっきを行い、ニッケル基板を作製した。
（実験例Ｉ－３）
（ニッケル基板の被覆及び確認）
　実験例Ｉ－１で合成したポリマーをクロロホルムに溶解し、０～５質量％の範囲で濃度の異なる複数のポリマー溶液を得た。各ポリマー溶液を、実験例Ｉ－２で作製したニッケル基板上に塗布（キャスト）し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基板の表面を被覆した。ポリマーの塗布を１回行った基板と、２回行った基板を作製した。陽性対照として、ポリエチレンテレフタレート基板上に、４０μＬのポリマー溶液を塗布したものを使用した。これらの基板上で水の接触角を測定し、ポリマーで被覆されていることを確認した。接触角の測定には、接触角測定装置（エルマ、ＭＯＤＥＬ　Ｇ－１－１００）を使用した。純水２μｌを各基板の表面に滴下し、３０秒後の静的接触角を測定した。図２は、実験例Ｉ－３の結果を示すグラフである。横軸はポリマーの濃度を示し、縦軸は水の接触角を示す。図２中、Ａはポリマー溶液を１回塗布した結果であり、Ｂはポリマー溶液を２回塗布した結果であり、Ｃは陽性対照である。
（実験例Ｉ－４）
（基板の準備）
　実験例Ｉ－１で合成したポリマーを、クロロホルムに溶解し４質量％溶液を得た。この溶液を、実験例Ｉ－２で作製したニッケル基板上に塗布し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基板の表面をポリマーで被覆し、実施例Ｉ－１のニッケル基板を作製した。ポリマー溶液の塗布は２回行った。Ｘ線光電子分光（島津製作所、ＥＳＣＡ－１０００）により、ニッケル基板由来のニッケルのピークが観測されず、ポリマー由来の炭素と酸素のピークが検出されたことから、ニッケル基板がポリマーで被覆されていることを確認した。また、実験例Ｉ－２で作製したニッケル基板を比較例Ｉ－１のニッケル基板として使用した。
（癌細胞の接着性試験）
　実施例Ｉ－１及び比較例Ｉ－１のニッケル基板上に、血清を１０％添加した培地で１０，０００個／ｍＬに調整した癌細胞懸濁液１．０ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。癌細胞として、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ－１０８０を使用した。続いて、生理緩衝食塩水を用いてリンスし、基板に接着した細胞の数をカウントした。カウントを容易にするために、ホルムアルデヒドで細胞を固定化後、４，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で細胞核を染色した。細胞核の数を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパスＦＶ－１０００）を用いてカウントし、細胞の数とした。
　図３は、実験例Ｉ－４の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例Ｉ－１のニッケル基板は、比較例Ｉ－１のニッケル基板と比較して、接着した癌細胞数が向上した。多数の他の癌細胞においても同様の結果が確認された。
（実験例Ｉ－５）
（基板の準備）
　実験例Ｉ－４と同様に、実施例Ｉ－１及び比較例Ｉ－１のニッケル基板を使用して実験を行った。
（血小板の接着性試験）
　実施例Ｉ－１及び比較例Ｉ－１のニッケル基板上に、クエン酸ナトリウムで抗凝固したヒト新鮮多血小板血漿０．２ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。続いてリン酸緩衝溶液でリンスし、グルタルアルデヒドで固定した後、基板を走査型電子顕微鏡で観察し、１×１０４μｍ２の面積に接着した血小板数をカウントした。
　図４は、実験例Ｉ－５の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例Ｉ－１のニッケル基板は、比較例Ｉ－１のニッケル基板と比較して、接着した血小板数が少ないことが示された。
　実験例Ｉ－４及びＩ－５の結果から、実施例Ｉ－１のニッケル基板は、癌細胞の接着性が向上しているにもかかわらず、血球成分の接着性は小さいことが明らかとなった。したがって、本発明の癌細胞接着性向上剤は、癌細胞濃縮フィルターの表面に適用することにより、癌細胞のフィルターへの接着性を高め、癌細胞の濃縮率を向上させることができる。
（実験例ＩＩ－１）
（ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート］の合成）
　上記一般式（１）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが２である、ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート］を合成した。具体的には、２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート１５ｇを１，４－ジオキサン６０ｇ中でアゾビスイソブチロニトリル（０．１質量％）を開始剤として、窒素バブリングしながら７５℃で１０時間重合を行った。重合反応終了後、ｎ－ヘキサンに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をテトラヒドロフランに溶解し、さらに２回ｎ－ヘキサンを用いて精製を行った。精製物を一昼夜減圧乾燥した。無色透明で水飴状のポリマーが得られた。収量（収率）は１１．４ｇ（７６．０％）であった。得られたポリマー構造は、１Ｈ－ＮＭＲによって確認した。ＧＰＣの分子量分析の結果、数平均分子量（Ｍｎ）が１２，０００であり分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が３．９であった。ポリマーの分子量は、実験例Ｉ－１と同様のＧＰＣの測定条件にて標準ポリスチレン換算分子量で算出した。
（ポリ［２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］の合成）
　上記一般式（１）において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが２である、ポリ［２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］を合成した。具体的には、２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート１０ｇを１，４－ジオキサン５０ｇ中でアゾビスイソブチロニトリル（０．１質量％）を開始剤として、窒素バブリングしながら８０℃で８時間重合した。重合反応終了後、ｎ－ヘキサンに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をテトラヒドロフランに溶解し、さらに２回ｎ－ヘキサンを用いて精製を行った。精製物を一昼夜減圧乾燥した。無色透明で水飴状のポリマーが得られた。収量（収率）は８．２ｇ（８２．０％）であった。得られたポリマー構造は、１Ｈ－ＮＭＲによって確認した。ＧＰＣの分子量分析の結果、数平均分子量（Ｍｎ）が１０４，０００であり分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が４．６であった。ポリマーの分子量は、実験例Ｉ－１と同様のＧＰＣの測定条件にて標準ポリスチレン換算分子量で算出した。
（ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート）の合成）
　下記一般式（３）で表される、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート）を合成した。ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート）は、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とブチルメタクリレート（ＢＭＡ）の共重合体であり、ＭＰＣ：ＢＭＡ＝４０：６０モル％～１：９９モル％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記一般式（３）中、Ｘ及びＹは１～１０，０００であり、Ｘ：Ｙは４０：６０モル％～１：９９モル％である。
　具体的には、エタノールにモノマーを溶解し、アゾビスイソブチロニトリル（０．１質量％）を開始剤として、窒素バブリングしながら７５℃で１０時間重合を行った。重合反応終了後、ジエチルエーテルに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をエタノールに溶解し、さらにジエチルエーテルを用いて２回精製を行い、一昼夜減圧乾燥した。白色パウダー状のポリマーが得られた。収率は５１％であった。得られたポリマーをゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により解析した結果、数平均分子量が２４０，０００で、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．９であった。ポリマーの分子量は、溶離液をエタノール／クロロホルム（２／８）にした点以外は、実験例Ｉ－１と同様のＧＰＣの測定条件にて標準ポリオキシエチレン換算分子量で算出した。
（実験例ＩＩ－２）
（ニッケル基板の作製）
　実験例Ｉ－２と同様の処理を行ってニッケル基板を作製した。
（実験例ＩＩ－３）
　（実験例Ｉ－３）と同様の処理を行ってニッケル基板にポリマーを被覆したときの水の静的接触角を測定した。その結果、ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート］については、０．２ｗｔ／ｖｏｌ％以上で接触角が２５°でほぼ安定した。また、ポリ［２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］については、０．５ｗｔ／ｖｏｌ％以上で接触角が３８°でほぼ安定した。また、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート）については、０．１ｗｔ／ｖｏｌ％以上で接触角が１０４°でほぼ安定した。
（実験例ＩＩ－４）
（基板の準備）
　実験例Ｉ－１及び実験例ＩＩ－１で合成したポリマー４種を、それぞれクロロホルムに溶解し４質量％溶液を得た。これらの溶液を、実験例ＩＩ－２で作製したニッケル基板上に塗布し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基板の表面をポリマーで被覆し、それぞれ、実施例ＩＩ－１（ポリメトキシエチルアクリレート）、実施例ＩＩ－２（ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート］）、実施例ＩＩ－３（ポリ［２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］）及び比較例ＩＩ－１（ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート））のニッケル基板を作製した。ポリマー溶液の塗布は２回行った。Ｘ線光電子分光（島津製作所、ＥＳＣＡ－１０００）により、ニッケル基板由来のニッケルのピークが観測されず、ポリマー由来の炭素と酸素のピークが検出されたことから、ニッケル基板がポリマーで被覆されていることを確認した。
（癌細胞の接着性試験）
　実施例ＩＩ－１～３及び比較例ＩＩ－１のニッケル基板上に、血清を１０％添加した培地で１０，０００個／ｍＬに調整した癌細胞懸濁液１．０ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。癌細胞として、ヒト乳腺癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を使用した。続いて、生理緩衝食塩水を用いてリンスし、基板に接着した細胞の数をカウントした。カウントを容易にするために、ホルムアルデヒドで細胞を固定化後、４，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で細胞核を染色した。細胞核の数を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパスＦＶ－１０００）を用いてカウントし、細胞の数とした。
　図５は、実験例ＩＩ－４の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例ＩＩ－１のニッケル基板は、２０００個以上の癌細胞を捕捉した。実施例ＩＩ－２のニッケル基板は、１５００個以上の癌細胞を捕捉した。また、実施例ＩＩ－３のニッケル基板は、５００個以上の癌細胞を捕捉した。これらに比べて、比較例ＩＩ－１のニッケル基板は、１４０個程度しか癌細胞を捕捉できなかった。
（実験例ＩＩＩ－１）
（ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート］の合成）
　上記一般式（１）において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが２である、ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート］を合成した。具体的には、２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート１５．０ｇ（７．４×１０－２ｍｏｌ）を１，４－ジオキサン５８．２ｍＬに溶解し、２時間Ｎ２パージを行った。開始剤アゾビスイソブチロニトリル１５．１ｍｇ（９．２×１０－２ｍｍｏｌ）を少量の１，４－ジオキサンに溶解して加え、窒素雰囲気下７５℃で２時間１０分重合した。精製はヘキサンを用いて行った。反応液を貧溶媒であるヘキサン１５００ｍＬ中に滴下し、デカンテーションによって溶媒を除いた。この粗ポリマーにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）約５０ｍＬを加えて溶解し、再びヘキサン１０００ｍＬに滴下して析出させたあと、デカンテーションによって溶媒を除いた。この操作をもう一度繰り返し、ポリマー中に含まれるモノマー及び開始剤を完全に除去した。一晩減圧乾燥し、質量を測定した。無色透明・水飴状のポリマー、ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート］が得られ、収量は５．３６ｇ、収率は３５．７％であった。ＧＰＣの分子量分析の結果から、数平均分子量（Ｍｎ）が１４２，０００であり分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が６．０６であった。ポリマーの分子量は、実験例Ｉ－１と同様のＧＰＣの測定条件にて標準ポリスチレン換算分子量で算出した。
（実験例ＩＩＩ－２）
（ニッケル基板の作製）
　実験例Ｉ－２と同様の処理を行ってニッケル基板を作製した。
（実験例ＩＩＩ－３）
　（実験例Ｉ－３）と同様の処理を行ってニッケル基板にポリマーを被覆したときの水の静的接触角を測定した結果、ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート］については、０．５ｗｔ／ｖｏｌ％以上で接触角が７８°でほぼ安定した。
（実験例ＩＩＩ－４）
（基板の準備）
　実験例Ｉ－１、実験例ＩＩ－１及び実験例ＩＩＩ－１で合成したポリマー５種を、クロロホルムに溶解し４質量％溶液を得た。これらの溶液を、実験例ＩＩＩ－２で作製したニッケル基板上に塗布し、溶媒を乾燥させて、ニッケル基板の表面をポリマーで被覆し、実施例ＩＩＩ－１（ポリメトキシエチルアクリレート）、実施例ＩＩＩ－２（ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルアクリレート］）、実施例ＩＩＩ－３（ポリ［２－（２－メトキシエトキシ）エチルメタクリレート］）、比較例ＩＩＩ－１（ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－コ－ブチルメタクリレート））及び実施例ＩＩＩ－４（ポリ［２－（２－エトキシエトキシ）エチルメタクリレート］）のニッケル基板を作製した。ポリマー溶液の塗布は２回行った。Ｘ線光電子分光（島津製作所、ＥＳＣＡ－１０００）により、ニッケル基板由来のニッケルのピークが観測されず、ポリマー由来の炭素と酸素のピークが検出されたことから、ニッケル基板がポリマーで被覆されていることを確認した。
（癌細胞の接着性試験）
　実施例ＩＩＩ－１～４及び比較例ＩＩＩ－１のニッケル基板上に、血清を１０％添加した培地で１０，０００個／ｍＬに調整した癌細胞懸濁液１．０ｍＬをピペットで滴下し、３７℃で６０分間静置した。癌細胞として、肺癌細胞株Ａ５４９を使用した。続いて、生理緩衝食塩水を用いてリンスし、基板に接着した細胞の数をカウントした。カウントを容易にするために、ホルムアルデヒドで細胞を固定化後、４，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で細胞核を染色した。細胞核の数を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパスＦＶ－１０００）を用いてカウントし、細胞の数とした。
　図６は、実験例ＩＩＩ－４の結果を示すグラフである。実験は５回ずつ行い、結果を平均値±標準偏差で示した。実施例ＩＩＩ－１及び実施例ＩＩＩ－４のニッケル基板は、６０００個／ｃｍ２以上の癌細胞を捕捉した。実施例ＩＩＩ－２のニッケル基板は、５０００個／ｃｍ２以上の癌細胞を捕捉した。また、実施例ＩＩＩ－３のニッケル基板は、２０００個／ｃｍ２以上の癌細胞を捕捉した。一方、比較例ＩＩＩ－１のニッケル基板は、１３０個／ｃｍ２程度しか癌細胞を捕捉できなかった。
　１０…貫通孔、２０…基板、３０…面、１００…フィルター。

Claims (14)

  1. 　下記一般式（１）で表される構造単位を含むポリマーからなる癌細胞接着性向上剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２はメチル基又はエチル基であり、ｍは１～３である。］
  2. 　前記一般式（１）で表される構造単位からなるポリマーからなる、請求項１に記載の癌細胞接着性向上剤。
  3. 　Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが１である、請求項１又は２に記載の癌細胞接着性向上剤。
  4. 　Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がエチル基であり、ｍが２である、請求項１又は２に記載の癌細胞接着性向上剤。
  5. 　Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメチル基であり、ｍが２である、請求項１又は２に記載の癌細胞接着性向上剤。
  6. 　数平均分子量が１０，０００～３００，０００である、請求項１～５のいずれか一項に記載の癌細胞接着性向上剤。
  7. 　複数の貫通孔が形成された基板からなり、当該基板の少なくとも一部が請求項１～６のいずれか一項に記載の癌細胞接着性向上剤で被覆されている、癌細胞濃縮フィルター。
  8. 　前記貫通孔は、平均孔径が５μｍ以上３０μｍ未満であり、平均開口率が５％以上５０％未満である、請求項７に記載の癌細胞濃縮フィルター。
  9. 　前記基板は金属からなる、請求項７又は８に記載の癌細胞濃縮フィルター。
  10. 　前記金属は、銅、ニッケル、銅及びニッケルの合金並びにこれらの表面が金めっきされたものからなる群より選択されるものである、請求項９に記載の癌細胞濃縮フィルター。
  11. 　前記貫通孔は、電気鋳造法によって形成されたものである、請求項９又は１０に記載の癌細胞濃縮フィルター。
  12. 　請求項７～１１のいずれか一項に記載の癌細胞濃縮フィルターで末梢血を濾過する濾過工程を含む、癌細胞の存在を検出する方法。
  13. 　前記濾過工程で濃縮された細胞の遺伝子を解析する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記濾過工程で濃縮された細胞を培養する工程を更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
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