JP5262708B2 - mRNA捕捉用担体及びmRNAの精製方法 - Google Patents
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Description
遺伝子の検出には、一般的には、トータルRNAを精製し、精製したトータルRNAからRT−PCR法により遺伝子を増幅し、電気泳動やマイクロアレイ法によりmRNAの検出を行って遺伝子の発現量をみる方法がとられる。マイクロアレイ法によれば、複数の遺伝子の発現量を同時にみることができる。しかしながら、より正確に遺伝子発現量をみるには、mRNAのみを精製し、精製したmRNAをRT−PCRにかけた方が良い。
mRNAの精製は、mRNA鎖が有するポリAテイル部分とdT配列とのハイブリダイゼーションを利用した方法が主流であり、mRNAを精製する手法として、磁気ビーズを用いた方法が特表2002−504348号公報(特許文献1)および特表2002−535012号公報(特許文献2)に記載されている。本方法は、磁気ビーズにオリゴdT鎖を固定化し、mRNAを含む検体溶液中に本磁気ビーズを投入し、ビーズ上にmRNAを捕捉し、磁石によりビーズを集め、検体溶液を捨て、磁石を遠ざけ洗浄液を加え、分散させ、再び磁石によりビーズを集める操作を繰り返し、mRNAを取り出すというものである。
本発明は、
(1)水に対して不溶性の担体表面にリン脂質の親水性部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記高分子物質が、前記第一単位として2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、前記第二単位としてp−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体であり、
前記p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基の全て又は一部に、オリゴdT配列の5'末端に導入されたアミノ基が共有結合していることにより、前記オリゴdT配列を含むDNAが前記不溶性の担体に固定化されており、
前記不溶性の担体の形態が、多孔質体である、mRNA捕捉用担体、
(2)前記オリゴdT配列の塩基数が5〜50である(1)のmRNA捕捉用担体、
(3)前記不溶性の担体の材質がプラスチックである(1)又は(2)のmRNA捕捉用担体、
(4)(1)〜(3)いずれか記載のmRNA捕捉用担体を用いて、
(a)mRNAを含む検体溶液を前記mRNA捕捉用担体に供給する工程、
(b)mRNAとオリゴdT配列を含むDNAをハイブリダイズさせる工程、
(c)洗浄液を供給し、洗浄する工程、
を含むことを特徴とするmRNAの精製方法、
(5)さらに(d)ハイブリダイズしたmRNAを溶出させる工程、を含む(4)のmRNAの精製方法、
(6)前記mRNAを含む検体溶液が細胞を可溶化した溶液である(5)のmRNAの精製方法、
である。
不溶性担体の材質として、プラスチックを用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラスのものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材質としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
容器としては、サンプリングチューブや、PCR用のチューブとすることができる。容量を1mL以下とすれば、好適に用いることができる。
また、複数のウェルを有するプレート類を好適に用いることもできる。
多孔質体としては、焼結体、不織布状のものを含み、多孔質を形成できるものであれば特に制限はないが、細孔表面を多くとれることを考慮すると焼結体が好適である。プラスチック製多孔質体は、ポリエチレンやポリプロピレンの微粒子を型に充填し、熱および圧力をかけることにより、容易に得ることが出来る。上記プラスチック製多孔体は、製造工程において加熱されることから、RNaseは失活させることが出来る。このことにより、RNAを扱う用途では有利である。また、RNaseを分解し問題となるRNaseの除去が容易に行えることとなり、本発明のmRNA捕捉用担体を製造管理において有利である。
2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基;
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基;
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
―Cl、−F等のハロゲン;
等の基を有することができる。
また、下記式(t)または下記式(v)とすることもできる。上記(1)において、Aは、窒素原子を含む置換基とすることができる。また、Aは、ハロゲン原子とすることができる。
下記式(t)に示される酸ハロゲン化物由来の基;
下記式(u)、式(w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式(v)に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
不溶性担体の形態が多孔質体の場合は、細孔表面にオリゴdT鎖が固定化されるが、この場合であっても、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、ホスホリルコリン基を含む第一単位が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がp−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
オリゴdT鎖の塩基数は、5〜50の範囲とすると、安定してmRNAを捕捉することができ、さらに、15〜35とすると、より好ましい。
また、不溶性担体として多孔質体を用いた場合は、細孔表面にオリゴdT鎖が固定化された担体が得られる。
この方法は、本実施形態のmRNA捕捉用担体を用いて、
(a)mRNAを含む検体溶液を上記mRNA捕捉用担体に供給する工程、
(b)mRNAとオリゴdT鎖をハイブリダイズさせる工程、
(c)洗浄液を供給し、洗浄する工程、
を含むことを特徴とする。
この方法は、更に(d)ハイブリダイズしたmRNAを溶出させる工程、を含むこともできる。
検体は、ポリAテイルを有するmRNAを含んでいれば、特に制限されない。例示するとすれば、動物由来細胞、植物由来細胞、細菌や菌類由来の細胞を用いることができる。また、組織や、血液をも用いることができる。続いて、準備したRNA鎖を含む検体から、検体溶液を調製する。検体溶液は、検体を溶媒に溶解したり、懸濁させたりして調製することができるが、好ましくは、グアニジンイソチオシアネート系やSDS−プロテアーゼ系の細胞可溶化液を用いて、細胞や組織を可溶化して調製することができる。
続いて、検体溶液を上記mRNA捕捉用担体に供給する。たとえば、担体の形態が容器の場合は、容器に分注する。また、上記担体の形態が多孔質体の場合は、多孔質体中に浸透させ放置する、あるいは、多孔質体の中を行き来させる。
本実施形態にかかる高分子物質上では、効率良くmRNAがハイブリダイズし、効率良く本実施形態の担体にmRNAを捕捉することができる。
具体的に説明すると、不溶性担体表面に導入されているオリゴdT鎖と、mRNAのポリAテイル部分が、ハイブリダイズする。本実施形態に用いている高分子物質上では、mRNAのポリAテイル部分とオリゴdT鎖とのハイブリダイゼーションが高効率で起こり、mRNAの高い捕捉量を確保することができる。
工程(b)は、所定の温度、例えば、37℃でのインキュベートを含んでいてもよい。
洗浄液としては、たとえば、オートクレーブ処理済みの超純水を用いることができる。
工程(b)によるmRNAの捕捉後、洗浄液中に上記担体を浸漬し、多孔質体内を行き来させて、担体を洗浄することもできる。これにより、本実施形態の担体の表面からハイブリダイズしたmRNA鎖以外のRNA鎖、DNA鎖、タンパク質、脂質などを取り除くことができる。
こうすることにより、本実施形態に用いる高分子上で、容易にハイブリダイゼーション後のRNAとDNA鎖を解離させることができ、mRNAを洗い出しにより溶出させて、mRNAを回収することが出来る。
(PMBN処理担体の作製)
多孔質体ポリエチレン樹脂の細粒を型中に供給し、加圧化加熱成形を行い、直径3mmの球形の多孔質体を得た。この多孔質体を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体(poly(MPC−co−BMA−co−NPMA)(PMBN)、各基は、モル%で25:74:1)の0.5重量%エタノール溶液に浸漬した。30分間放置した後、遠心処理により余分な溶液を除去し、乾燥を行い、細孔表面に、ホスホリルコリン基と、活性エステル基としてp−ニトロフェニル基を有する高分子物質を導入したプラスチック製多孔質体(PMBN処理担体)を得た。
ポリエチレン樹脂の細粒を型中に供給し、加圧化加熱成形を行い、直径3mmの球形の多孔質体を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により細孔表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に5重量%の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に2時間浸漬の後、遠心によりこの溶液を除去し、超純水中に浸漬し放置後、遠心により基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS(−)(カルシウムフリーリン酸緩衝生理食塩水、Phospate Buffered Saline)中に2重量%の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行った担体をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、4時間放置した後、遠心で溶液の除去を行い、超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、細孔表面にアルデヒド基を有する多孔質体(アルデヒド処理担体)が得られた。
ポリプロピレン製サンプリングチューブ(深江化成製 容量1.5ml)の内面を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体(poly(MPC−co−BMA−co−NPMA)(PMBN)、各基は、モル%で25:74:1)の0.5重量%エタノール溶液を分注し、30分間放置した後、吸引し余分な溶液を除去し、乾燥を行い、チューブ内面表面に、ホスホリルコリン基と、活性エステル基としてp−ニトロフェニル基とを有する高分子物質を導入したサンプリングチューブ(PMBN処理チューブ)を得た。
ポリプロピレン製サンプリングチューブ(深江化成製 容量1.5ml)に低温酸素プラズマ処理により親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に5容量%の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液をチューブ内に分注し2時間放置の後、吸引により溶液を除去し、超純水を分注し放置後、超純水を吸引除去し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS(−)中に2容量%の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行ったチューブ内に分注し、4時間放置した後、吸引により溶液の除去を行い、超純水をチューブ内に分注し洗浄、吸引後、乾燥した。これにより、容器内面にアルデヒド基を有するサンプリングチューブ(アルデヒド処理チューブ)が得られた。
5’末端がアミノ基で修飾された、配列TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(30塩基)のオリゴdT鎖を0.25M炭酸バッファ(pH9.0)を用いて溶解し、10μMのオリゴT溶液を調製した。この溶液中に、上記各々の多孔質体を浸漬し10分間放置後、乾燥しオリゴdT鎖を固定化した。その後、各々の担体について、ブロッキング処理を施した。
5’末端がアミノ基で修飾された、配列TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(30塩基)のオリゴdT鎖(dTプライマー)を0.25M炭酸バッファ(pH9.0)を用いて溶解し、10μMのオリゴT溶液を調製した。この溶液を、サンプリングチューブ内に分注し10分間放置後、乾燥しオリゴdT鎖を固定化した。その後、各々のチューブについて、ブロッキング処理を施した。
直径35mmの細胞培養用シャーレ中に、HeLa細胞をコンフルエントになるまで培養を行い。培地を除去した後、PBS(−)で軽く洗い、氷冷下、付着細胞からのRNA抽出培養液を捨て、PBSで数回洗う。ディッシュに3mlのGTC溶液を入れ、セルスクレーパーで細胞を掻き取る操作を行って細胞を溶解させ、ピペットでサンプリングチューブ中集めた。集めた溶液を18Gの針をつけた注射筒に内容物を出し入れし、良く混合し、RNA溶液として、評価実験に供した。
オリゴdT鎖を固定化した、各々の多孔質体を、容量1mlのディスペンサーチップの先端をカットし、各々の多孔質体を嵌め込み固定した。
容量1.5mlのサンプリングチューブに、上記RNA溶液を100μl程分注し、上記ディスペンサーチップ先端に固定した多孔質体をRNA溶液中に保持し、ディスペンサーの吸引操作により、RNA溶液を多孔質体中で出し入れを繰り返したのち、多孔質体内にRNA溶液を保持したまま室温で放置した。その後別のサンプリングチューブにPBS(−)を500μl程取り、この中に、上記多孔質体を保持し、ディスペンサー操作により、PBS(−)を多孔質体中で出し入れし、多孔質体内を洗浄した。
別のサンプリングチューブ中に、オートクレーブ処理済みの超純水を100μlとり、90℃に加温し、上記洗浄済み多孔質体を保持し、ディスペンサー操作によりオートクレーブ処理済みの超純水の出し入れを繰り返しし、多孔質体内に保持されていたmRNAを洗い出し、採取した。
採取した溶液の260nmでの吸光度を比較し、採取した溶液中のmRNA量を、各多孔質体について比較した。結果を表1に示す。
オリゴdT鎖を固定化した、各々のチューブに上記RNA溶液を100μl程分注し、RNA溶液を保持したまま室温で15分間放置した。その後RNA溶液を吸引除去した後、PBS(−)で2回洗浄した。オートクレーブ処理済みの超純水を100μlとり、90℃に加温し、別のサンプリングチューブにmRNAを含む溶液採取した。
採取した溶液の260nmでの吸光度を比較し、採取した溶液中のmRNA量を、各チューブについて比較した。結果を表2に示す。
(1)多孔質体の細孔表面にリン脂質の親水性部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、前記カルボン酸誘導基の全て又は一部にオリゴdT配列を含むDNA鎖がオリゴdT配列の5'末端にて結合していることを特徴とするmRNA捕捉用担体。
(2)前記オリゴdT配列の塩基数が5〜50である(1)記載のmRNA捕捉用担体。
(3)前記多孔質体の材質がプラスチックである(1)又は(2)記載のmRNA捕捉用担体。
(4)(1)〜(3)いずれか記載のmRNA捕捉用担体を用いて、
(a)mRNA鎖を含む検体溶液を前記mRNA抽出用担体に供給する工程、
(b)mRNAとオリゴdT鎖をハイブリダイズさせる工程、
(c)洗浄液を供給し、洗浄する工程、
を含むことを特徴とするmRNAの精製方法。
(5)更に(d)ハイブリダイズしたmRNAを溶出させる工程、
を含む(4)記載のmRNAの精製方法。
また、本発明は以下の態様を含む。
[1]不溶性担体表面にリン脂質の親水性部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、前記カルボン酸誘導基の全て又は一部にオリゴdT配列を含むDNAがオリゴdT配列の5'末端に結合していることを特徴とするmRNA捕捉用担体。
[2]前記オリゴdT配列の塩基数が5〜50である[1]記載のmRNA捕捉用担体。
[3]前記不溶性担体の形態が、容器又は複数のウェルを有するプレートである[1]または[2]記載のmRNA捕捉用担体。
[4]前記不溶性担体の形態が、多孔質体である[1]または[2]記載のmRNA捕捉用担体。
[5]前記不溶性担体の材質がプラスチックである[1]〜[4]いずれか記載のmRNA捕捉用担体。
[6][1]〜[5]いずれか記載のmRNA捕捉用担体を用いて、
(a)mRNAを含む検体溶液を前記mRNA捕捉用担体に供給する工程、
(b)mRNAとオリゴdT配列を含むDNAをハイブリダイズさせる工程、
(c)洗浄液を供給し、洗浄する工程、
を含むことを特徴とするmRNAの精製方法。
[7]更に(d)ハイブリダイズしたmRNAを溶出させる工程、を含む[6]記載のmRNAの精製方法。
[8]前記mRNAを含む検体溶液が細胞を可溶化した溶液である[7]記載のmRNAの精製方法。
Claims (6)
- 水に対して不溶性の担体表面にリン脂質の親水性部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記高分子物質が、前記第一単位として2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、前記第二単位としてp−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基を有する、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体であり、
前記p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート基の全て又は一部に、オリゴdT配列の5'末端に導入されたアミノ基が共有結合していることにより、前記オリゴdT配列を含むDNAが前記不溶性の担体に固定化されており、
前記不溶性の担体の形態が、多孔質体である、mRNA捕捉用担体。 - 前記オリゴdT配列の塩基数が5〜50である請求項1記載のmRNA捕捉用担体。
- 前記不溶性の担体の材質がプラスチックである請求項1または2記載のmRNA捕捉用担体。
- 請求項1〜3いずれか記載のmRNA捕捉用担体を用いて、
(a)mRNAを含む検体溶液を前記mRNA捕捉用担体に供給する工程、
(b)mRNAとオリゴdT配列を含むDNAをハイブリダイズさせる工程、
(c)洗浄液を供給し、洗浄する工程、
を含むことを特徴とするmRNAの精製方法。 - 更に(d)ハイブリダイズしたmRNAを溶出させる工程、を含む請求項4記載のmRNAの精製方法。
- 前記mRNAを含む検体溶液が細胞を可溶化した溶液である請求項5記載のmRNAの精製方法。
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